JP2001521617A

JP2001521617A - 臨床学的診断方法

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Publication number: JP2001521617A
Application number: JP54127398A
Authority: JP
Inventors: ハルテン，マジ
Original assignee: シメグリミテッド
Priority date: 1997-03-27
Filing date: 1998-03-27
Publication date: 2001-11-06
Also published as: EP0972193A1; AU6509698A; GB9706395D0; WO1998044345A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、研究または臨床学的診断の目的のいずれかのために、特に、染色体異常の診断のために、染色体を分析するための方法に関する。本発明は、染色体の分析を容易にするために、細胞周期の中期段階における細胞の割合を増加する改善された方法を提供する。方法は、細胞と、有糸分裂刺激剤、例えば、オカダ酸（OA）のようなタンパク質ホスファターゼ阻害剤とを、接触する工程を含む。

Description

【発明の詳細な説明】臨床学的診断方法発明の分野本発明は、研究または臨床学的診断の目的のいずれかのために染色体を分析するための、改善された方法に関する。具体的には、排他的ではないが、本発明は、染色体の分析を容易にするために、細胞周期の中期段階における細胞の割合を増加するための、材料および方法に関する。発明の背景細胞における大多数の染色体異常の正確な分析のために、細胞周期の中期段階における細胞を分析することが必要であり、ここでは、染色体は、構造学的に凝縮される（図１）。この段階で、染色体は、着色された色素で染色され得るか、または個々の染色体の特定の特徴を試験するために、例えば、特定の染色体セグメントの転座の欠失を探すために、蛍光DNAプローブでのハイブリダイゼーションに供され得る。高分離能染色体染色法およびDNAプローブの範囲の利用可能性によって、ヒト疾患に関連する染色体の分析は、一般的になってきた。しかし、細胞周期の中期段階は、一過性であり、そして通常、分裂する哺乳動物細胞の周期時間の２%未満であることが示される。従って、任意の前処理がなければ、哺乳動物細胞の典型的な調製物は、中期段階における細胞をほとんど含まず、それゆえ、可能である染色体分析のレベルを制限する。分裂細胞について、有糸分裂ブロッキング剤（例えば、コルヒチン、コルセミド、およびビンブラスチン）の使用は、有糸分裂における細胞のパーセント（「有糸分裂指数」）を、特にヒト抹消血リンパ球の染色体分析において増加するために、非常に価値あるものを提供した。しかし、多くの臨床学的サンプルについて、細胞周期速度は、非常にゆっくりであり、および有糸分裂ブロッキング剤の使用を伴ってでさえ、有糸分裂細胞はほとんど見ることができない。これは、細胞周期が、細胞分裂および周期に対して強力な制御を提供する、いくつかの生化学的な「チェック−ポイント」を有するからである。中期においてブロックされ得る、分裂における十分な細胞を蓄積するために、細胞のインビトロの培養が、一般に使用される。これは、染色体異常の臨床学的診断において、避けられない遅延を引き起こす。従って、フィトヘマグルチニン（PHA）で特異的に刺激されたヒト血液リンパ球であっても、インビトロ培養において、48〜72時間、羊水細胞において、平均16.7日（Ntl．Qual ．Ass．Scheme、Clin．Cytogenet、1995）、および皮膚線維芽細胞において、数週間を必要とする。従って、インビトロ培養において、遅延を伴わず、および長期間の必要性を伴わないで行われる有効な臨床学的診断分析を可能にするため、中期指数を増加するために、このような細胞を、それらの生化学的なチェック− ポイントから解放するための方法についての必要性が存在する。精子形成は、２倍体精原細胞が１倍体精子に成熟する間のプロセスである（図３）。大多数の精原細胞（Ａ型）は、必要とされる非常に多数の幹細胞を維持するために、増幅する有糸分裂更新経路を受ける。少数（Ｂ型）のみが、減数分裂前の有糸分裂を介してさらなる分化を開始し、これは、２倍体の第１精母細胞を生じる。このような細胞は、減数分裂の第１（減数）分裂にはいり、その間、後期Ｉでの、反対の極への相同体の分離に起因して、染色体数は半分に減少する。得られる嬢細胞は、続いて減数分裂の第２（均等）分裂を受け、これは、後期II で染色分体が分離されるので、有糸分裂様である。減数分裂のこれらの２つの分裂は、４つの１倍体の円形精子細胞を生成し、これは後に、精子形成の間に生化学的におよび形態学的に分化される精子に成熟する（Amelar、1966；Infertilit y in Man：Diagnosis and treatment、２〜30頁、F A Davis Company、Philadel phia）。減数分裂経路は、数時間で測定され得る有糸分裂細胞周期とは対照的に、完了されるのに数日かかる。例えば、雄性減数分裂の前期Ｉは、ヒトにおいて約40日かかり、および最も長い亜段階のパキテン期は、単独で、ヒトにおいて約16日間続く。しかし、第二分裂は、非常に速く生じ、そして精母細胞が、輸精上皮においてよりめったに見られない理由である。精子の形成および成熟の全体のプロセスは、ヒト雄性において、約74〜76日かかり、そして、通常、約２億個の精子の生成が、毎日生じる。減数分裂細胞経路は、有糸分裂細胞周期と共通して、専門化されたおよび非常に調節された一連の事象からなり、これは、互いの完了に依存する。従って、より後の事象の開始は、より早い事象の完了に依存する。この依存は、チェックポイントとして知られる機構によって、モニターされる。この調節系は、広範に多様な増殖制御シグナルを受け、そしてこれをプロセシングした後にのみ、各細胞周期の移行を開始し、およびまた、至適な条件が、細胞において達成されることを保証する。真核生物の細胞周期は、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）の大きなファミリーのメンバーの周期的な活性によって制御される（図４）。CDKは、ヘテロ二量体の複合体であり、タンパク質キナーゼ触媒性サブユニット、単量体 CDK、およびサイクリン活性化サブユニットからなる。CDK複合体は、各細胞周期の相に重要な、あるタンパク質基質のリン酸化を触媒する（BusenbergおよびTan g 1994、J Math Biol 32,573-596）。タンパク質のリン酸化および脱リン酸化は、真核生物における主要な調節性の細胞プロセスの１つであり、および通常の様式におけるその出現は、正常な細胞分裂に必須である。細胞周期の間にリン酸化プロセスを刺激または阻害する、基質または化学化合物はまた、CDK複合体の活性、そして続いて細胞分裂を影響する。オカダ酸（OA）は、これらの化合物の１つであり、これは、インビトロで核タンパク質のリン酸化を刺激する。OAは、ポリエーテルのカルボキシル基を１つ有する脂肪酸であり、これは、海洋のクロイソカイメン（Halicondria okadaic ）から単離された。これは、タンパク質ホスファターゼ（PP）、PP1（ATP-Mg2+ 依存性ホスファターゼ）、および関連のPP2A（ポリカチオン刺激化ホスファターゼ）の両方の阻害剤である（BialojianおよびTakai、1988、Biochem J 256,283- 290）。迅速に分裂する体細胞株において、OAは、有糸分裂様事象を誘導することが報告されている。これらとしては、例えば、（１）ゴールデンハムスターの線維芽細胞株BHK21における、成熟前の染色体凝縮、核ラミナの破壊、および有糸分裂星状体の形成（Yamashitaら、1990、EMBO J 9，4331-4338）、（２）ヒト白血病細胞株における、有糸分裂の停止、染色体過剰凝縮、およびクロマチン分解（Zh engら、1991、J Biol Chem 266、10031-10034）、（３）ヒト骨髄白血病細胞株（Ishidaら、1992、J Cell Physiol 150、484-492）およびHeLa細胞（Ghoshら、 199 6、Exp Cell Res 227、165-169）における、G1/S移行での未成熟な染色体凝縮、ならびに（４）ブタ腎臓細胞株LLC-PKにおける、有糸分裂の停止および紡錘体の脱重合化（VandreおよびWill、N1992、J Cell Sci、1101、79-91）が挙げられる。 OAはまた、卵母細胞のマイクロインジェクション後に、類似の影響を誘導することが報告されている。このような染色体凝縮は、アフリカツメガエル、ヒトデ、およびマウスの卵母細胞において見られた（Doreeら、1989、J Cell Sci増刊1 2、39-51；Rimeら、1990、Cell Differ Dev 29、47-58；Picardら、1989、J Cel l Bio 109、3347-3354；Alexandreら、1991、Develpoment 112、971-980；Gavin ら、1991、Exp Cell Res 192、75-81）。これらの系の卵母細胞における減数分裂成熟および胚ベシクルの破壊のOA誘導は、MI紡錘体の脱重合化と関連すること（例えば、Picardら、1989、J Cell Bio 109、3347-3354；Alexandreら、1991、 Develpoment 112、971-980）、または異常なMI紡錘体の存在と関連すること（例えば、Gavinら、1991、Exp Cell Res 192、75-81）が示されている。OAはまた、ラットおよびマウスMII卵母細胞において、紡錘体組成を影響することによって、MII停止を誘導し得る；（De Pennartら、1993、Dev Biol 157、170-181）。発明の要旨雄性マウスから単離されたパテキン期細胞の最近の研究は、精母細胞が、OAに感受性であり、そして短期間（２〜6時間）の刺激後にインビトロでMIに成熟することをさらに示した。本発明者らは、この技術の改変を、ヒトおよびマウス（比較の目的のために）の精巣細胞粗懸濁液に対して応用した。本研究の目的は、 OAが、ヒト精母細胞に対して有効であるか否かを決定することであり、およびそうである場合、前期IからMIへのこの迅速なインビトロ成熟が、交叉の頻度および分布にどの程度影響するのかを決定することであった。特に、雄性不妊症と関連する減数分裂組換え／交叉において、精子形成成熟の停止および変化の特異的な診断のための補助として使用され得るインビトロ刺激系を得ることが望ましいことが理解される。本発明者らの知見は、MIへの減数分裂パキテン期細胞の迅速な移行に加えて、OA刺激がまた、非常に高い頻度の精原中期およびMII:sを、ヒトおよびマウスの両方において導くことを実証する。これらの驚くべき観察は、 OAが、減数分裂前の精原有糸分裂、MI、およびMIIを含む精子形成の全ての３つの相で、哺乳動物細胞周期のチェックポイントを無効にすることを示唆する。本発明は、薬剤オカダ酸（OA）が、精巣生検からの粗抽出物において、特に減数分裂の前の有糸分裂の精原細胞において、細胞の中期指数の十分な増加を引き起こし得るという発見に基づく。重要なことに、この効果は、インビトロ刺激の６時間以内に見られる。本発明はまた、OAと同じ方法で、細胞周期における生化学的なチェックポイントを無効にする試薬が、臨床学的な診断アッセイにおいて有糸分裂指数を増加するために一般に使用され得ることを、最初に、認識する。それゆえ、最も一般に、本発明は、有糸分裂刺激剤を使用して染色体を分析するための細胞の調製物に関する、材料および方法を提供する。好ましくは、薬剤は、細胞周期の相の部分または全てから中期に、間期の細胞を分裂し得、例えば、OA、またはCa²⁺改変培地中のアフリカツメガエル卵からの無細胞抽出物のようなタンパク質ホスファターゼ阻害剤である。このような分析は、例えば、白血病および他の血液学的な状態、ならびに固形ガンと関連する、染色体の構成的または後天性、構造的、および数的異常についての細胞の臨床学的診断のために重要となり得る。さらに、これは、環境因子（染色体異常を引き起こすことが知られるか、または予測される、放射線および化学物質）に対する曝露後に重要であり得る。さらに、中期染色体の染色体分析は、多くの異なる供給源、例えば、ヒト、動物、または植物に由来するの細胞を使用して、多様な他の理由のために重要である。本発明の第１の形態において、染色体分析用の細胞サンプルを調製するための方法が提供され、細胞のインビトロ培養物と、タンパク質ホスファターゼ阻害剤のような有糸分裂刺激剤、または細胞周期進行を刺激する薬剤とを接触して、中期における細胞の集団を増加する工程を含む。好ましくは、この方法は、有糸分裂刺激剤との接触の前に、細胞周期進行を刺激するために、細胞の表面に存在するゲートキーパータンパク質を、バイパスする工程をさらに含む。ゲートキーパータンパク質が各細胞型に特異的な増殖因子についての表面レセプターである場合、バイパス化は、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、リゾレシチン、または不活性化されたセンダイウイルスを使用して、細胞を脱膜化（demembrana ti ng）することによって達成され得る（Banerjee S.ら（1994）Molec．Reprod．De v．37:305-317）。１つの周知のゲートキーパータンパク質は、網膜芽腫タンパク質（Geradtら（ 1994）J．Cancer 58(2)161-167）である。これは、G1からS期への細胞の移行における、有糸分裂細胞周期の主要なゲートキーパータンパク質である。好ましくは、このゲートキーパータンパク質は、市販の抗網膜芽腫タンパク質抗体の使用における、またはアンチセンスRNA技術（Salaら；1994：Cancer Research 54:14 02-1406）の使用のいずれかで、バイパスされる。次いで、細胞は、OAと接触されて、有糸分裂／中期促進因子を活性化する。本発明の方法は、細胞を分析するための、インビトロ細胞培養についての必要性を回避するといった、驚くべき利点を有する。かかる理由のために、この方法は、例えば、１）十分な中期細胞を蓄積するために、通常、インビトロ培養が48〜72 時間かかる血液リンパ球；２）高い有糸分裂指数が、白血病および他の関連の悪性腫瘍を導く染色体異常が診断され得る速度に主要な利点を提供する、骨髄細胞；３）分析のために、通常、培養において７〜28時間必要とする胎児細胞を含有する羊水、の分析に理想的である。より迅速な染色体の診断は、例えば、ダウン症候群を導く異常が診断され得る速度を加速し；４）診断するために、通常、培養において数週間かかる皮膚線維芽細胞；５）培養において増殖することが非常に困難である固形腫瘍は、中期指数がよりすぐに上昇され得る場合、より正確におよびより速く診断され得る。それゆえ、本発明の方法は、染色体における、構成的なまたは後天性の、構造的な、および数の異常についての診断を含む臨床学的診断のために、細胞を提供する。本発明の方法は、細胞周期のG0、G1、S、G2期を通過する細胞を診断するための、細胞増殖アッセイを含む。この診断は特に、白血病および他の血液学的悪性状態について、ならびに固形腫瘍について、重要である。さらに、本発明の方法は、細胞の悪性度分類を決定するために使用され得る。非常に単純に、潜在的に悪性な細胞がG0、S、G1、およびG2期を通過する容易さは、これが潜在的危険性を漸増する段階であるので、決定され得る。現在、悪性腫瘍／細胞増殖の危険性の状態を診断するインビトロ試験は存在しない。現在の手順は、あまり正確でない細胞学および組識学のような技術を包含する。さらなる形態として、本発明は、細胞サンプルの悪性度分類を決定するためのインビトロ細胞増殖アッセイを提供し、細胞と、タンパク質ホスファターゼ阻害剤とを接触する工程、および細胞周期のG0、G1、S、G2期を通過する細胞における異常を決定する工程、を含む。このアッセイは、以下に記載されるように、白血病および固形ガン細胞について特に有用である。ガン細胞は、それらの正常なDNA複製および細胞周期制御から逸脱した細胞である。それゆえ、これらの細胞は、無差別に増殖し得る。増加された細胞増殖が、元来の腫瘍部位に制限されおよび局在化される限り、これは比較的少ない害である。問題は、ガン細胞が実質的に増殖し得、そして身体の他の部位に広がり得るる場合に、主に生じる。それらが全身性化されたガン疾患を引き起こすのはこの段階である。悪性腫瘍の診断は、通常、組識学的および細胞学的な調製物における細胞の形態学的分析によって行われる。本発明者らは、悪性度分類、換言すれば、腫瘍細胞が、通常の細胞周期制御、およびこの制御に関与するチェックポイントからどの程度逸脱し得るのかの診断における改善についての緊急の必要性が存在することを理解した。ガン細胞は、増殖する傾向がよりあるので、細胞核の正常よりも高い割合で、「休止する」G0期ではなく、細胞周期のG1、S、G2、およびM期において予測される。 G0、G1、S、およびG2期で、細胞は、全て細胞周期の間期にあり、伝統的な組識学的および細胞学的な染色技術によって区別することは、非常に困難であるか、または不可能である。しかし、重要な細胞周期タンパク質に対する抗体を使用する免疫細胞化学および免疫細胞学的技術によって、間期のそれらの異なる相における細胞核を同定することは可能である。従って、例えば、G1後期での細胞核は、非常に高い量のcdc6タンパク質を示すことが予測され（Piatti S.ら（1996 ）Genes and Development 10:1516-1531；およびHardy，C.F.ら（1997）PNAS US A 94:3151-3155；S期での核は、非常に高い量のRb（網膜芽腫）タンパク質を示すことが予測され；およびG2期での細胞は、優先的に増加されたレベルのcdc25C タンパク質を示すことが予測される（Lucibello F.C．(1995)The EMBO Journal 14(1) :132-142。本発明に従って、OAは、精液学的に間期の細胞核の、M期への迅速な移行を引き起こすために使用され得、それゆえ、細胞増殖潜在性および悪性度の程度を評価するための、新規なインビトロの診断デバイスが提供される。この有糸分裂加速化アッセイ（MAA）は、図10に記載される。このようなMAAは、範囲から、生検の形態における組識学的サンプルを採取し、以下の工程を行うことによって、本発明に従って行われ得る。生検は、任意のガンであることが疑われる範囲由来（例えば、白血病上体が疑われる場合の頸部スメア、骨髄サンプルのような採取された細胞）、または乳腫瘍からの吸引もしくは針生検であり得た。細胞核は、細胞周期の異なる相にあり、細胞周期のG1、S、およびG2期のそれぞれに豊富なタンパク質に対する一連の試験抗体によって同定され得る。細胞サンプルの部分は、細胞培養において、有糸分裂刺激剤（例えば、タンパク質ホスファターゼ阻害剤（例えば、OA、もしくはCa²⁺改変された培地中のアフリカツメガエル卵からの無細胞抽出物（Morinら（1994）The EMBO Journal 13（ 18）4343-4352；Lohka、M.J.ら（1983）Science 220、719-721；およびNewport 、J.ら（1987）Cell 48、219-230）もしくはRbタンパク質の不活性化後のOA））に曝露され、インビトロにおいて、どのくらいの傾向で、これらの核がM期に通過されるのかを決定する。細胞調製物は、細胞遺伝学の実験室において日常的に行われるような診断的なガン染色体分析、および免疫細胞学の両方のために作製される。どれくらいの割合の細胞核が、それぞれの試薬でのインビトロ有糸分裂刺激後に、G1、G2、またはMでの細胞核に関してG0期になお存在するかを同定する。中期指数は、G0、G1、S、G2指数とともに、悪性度分類の予後的な指標として、およびインビトロ増殖潜在性、従って予後として使用され得る。本発明者はさらに、本明細書中に記載されるように、MAAは、悪性細胞核が、化学療法的な化学物質のような阻害剤の後に、増殖におけるインビトロ阻害に感受性である程度をチェックするために使用され得る。精子形成細胞について、本発明は、精子形成成熟指数を決定するための臨床学的分析を提供する。上述の形態の全てにおいて、タンパク質ホスファターゼ阻害剤は、好ましくは OAである、残りの明細書は、OAの使用に集中されるが、当業者は、上記のうような他の類似の試薬が、置換され得ることを理解する。体細胞 OAは、実験系において、有糸分裂細胞周期制御についてより理解する手段として利用されてきた。図２は、細胞周期を例示する。中期（M）後、ギャップ（G1 ）、次いで、DNA合成（S）、および、次いで、再度ギャップ（G2）か続く。連続的にインビトロ増殖する細胞株のような人工的な細胞系に添加されるOAは、いくつかのクロマチン凝縮を引き起こし得ることが注目された。これらの刊行物において、OAで誘導されたクロマチン凝縮が、臨床学的診断価の染色体の明確な分化を許容するという明確な指摘はない。従って、染色体は、ある程度凝縮されるが、一般に、有糸分裂ではなく「有糸分裂様」として記載される。このような染色体形態学は、臨床学的診断の目的のために十分なほど良好ではない。染色体異常の臨床的な細胞遺伝学的診断についての現在の方法論に対する、補助としてのOA の潜在的な使用は、本発明者が知る限り、これまで考慮されなかった。文献において、任意の供給源（ヒト、動物、または植物材料）からの中期染色体の一般的な分析における、このような使用の指摘もまたない。生殖系列細胞 OAはまた、生殖系列における特異的な減数分裂の細胞周期制御を研究するために使用されてきた。実験的な系において、OAが、マウスを含むいくつかの種の卵母細胞のG2/M移行を伴って、減数分裂成熟を誘導することが実証された。より最近、OAが、単離された減数分裂マウス精巣細胞（すなわち、パキテン期精母細胞）の培養物において、未成熟なG2/M移行を誘導し得ることがまた実証された（Wi lt shireら、Dev．Biol．169、557-567、1995）。これらの細胞は、第１減数分裂前期段階にある。DNA複製は、すでに生じている。OA処理は、第１減数分裂の通常、長いおよび複雑なプロセスを維持する細胞周期チェックポイントを排除するようである。ここで行われる特異的なプロセスは、母方および父方の相同染色体の減数分裂特異的対合、ならびにそれらの間の相互組換え／交差／交叉形成を誘導する。第１減数分裂の中期で、父方および母方の相同染色体は、交叉によって共に保持される。第１減数分裂中期で、父方および母方相同染色体は、交叉によってともに保持される。少なくとも１つの交叉は、定型的な後期分離を課せられると考えられる。第１減数分裂後期で、染色体数の還元が行われる。嬢細胞は、ぞれぞれ、通常、元来の染色体数の半分を含む。第２減数分裂時に、染色体は、体細胞有糸分裂に類似するプロセスにおいて分離する。卵母細胞または精母細胞のいずれかのOA誘導性のクロマチン凝縮を扱う刊行物のいずれも、インビトロ培養された血液リンパ球、皮膚線維芽細胞、または羊水細胞の分析によって現在日常的に行われるように、OAが、構成的なまたは後天性の体細胞染色体異常の臨床学的診断おいて使用するための潜在性を有することを含意しなかった。本発明者は、OAの短期（６時間）の曝露が、マウスおよびヒトの精巣生検サンプルからの粗細胞懸濁液おいて、十分なクロマチン凝縮を伴って、減数分裂前の、精原有糸分裂指数に対して、劇的な効果を誘導し得ることを見出した。達成される染色体形態学は、非常に高い質であり、日常的な臨床学的実施において使用されるサンプル（例えば、血液リンパ球、皮膚線維芽細胞、および羊水細胞）に対して外挿される場合、臨床学的診断を許容する。以前の経験からは、粗精巣懸濁液における精原細胞の増加された有糸分裂指数に関するそれらの結果は、予測されない。さらに、本発明者は、精巣細胞懸濁液において、中期Iの細胞（以前に示されるように）のみでなく、中期IIの細胞でも、劇的な増加を見出した。OA はまた、増加された運動性を誘導する精巣精子への迅速な成熟を誘導し得るようである。本発明者はさらに、OAが骨髄細胞の成熟を、間期／前期から中期に誘導し得ることを示した。細胞周期に対するOAの効果および臨床学的な含意細胞周期の完了は、多くの異なるおよび複雑なプロセスの協調に依存する。サイクリン依存性キナーゼ（CDK）における一連の変化が含まれることが一般に受け入れられる。CDKの不活性な形態は、２つのタンパク質、すなわち、キナーゼおよびサイクリンから、主に構成される。その機能が未だ十分には理解されていない他のタンパク質がまた、含まれ得る。複合体は、それらのキナーゼおよびサイクリンの成分の変化を受け、これは、細胞サイクルの一方の段階から、他方の段階に細胞を導くと考えられる。特定の細胞周期段階は、それぞれのタンパク質によって決定され、このタンパク質は、その段階の間のCDKの活性から生じるリン酸化によって活性化または不活性化される。オカダ酸（OA）は、タンパク質ホスファターゼの特異的な阻害剤であることが知られる、ポリエーテルの１つのカルボキシル基からなる酸である。オカダ酸は、２Ａ型および１型ホスファターゼの両方を阻害し得、それによってcdc25cに対するその活性を介して、不活性な成熟− 促進−因子MPFを活性なMPFに活性化し得る。本発明者は、マウスおよびヒト雄性生殖系列における、減数分裂前の精原有糸分裂の調節因子のいくつかが、細胞体の有糸分裂細胞周期におけるのと同じ方法において、機能することを理解した。それゆえ、本発明者は、精巣細胞集団におけるOAの効果に関してこれらの観察は、血液リンパ球、皮膚線維芽細胞、および羊水細胞のような体細胞を使用して、染色体異常の臨床学的診断についての新規なアプローチの基礎を形成し得る。このアプローチは、長期の細胞培養を不必要にする。精原細胞のみでなく第１および第２の両方の減数分裂中期の成熟に対する刺激が、精原細胞の成熟停止に起因する減少された受精能力についての判断の評価における診断的な補助として使用され得る。本発明者は、OA刺激された細胞が、中期Iでの交叉頻度および分布によって測定されるように、正常な組換えパターンを実証することを示した。意図されることは、OAアッセイが、例えば、精原細胞成熟の停止と関連することが考えられる、減数分裂組換え変異の改善された診断のために使用され得ることである。本発明者はまた、OAが、精子運動性を増加し得、これは受精能力の処置に関する改善のために使用され得ることを見出した。オカダ酸が、それらの細胞周期制御チェックポイントから、細胞を解放するために使用され得る、いくつかの潜在的な有糸分裂刺激剤のうちの１つであることは、当業者には明らかである。それゆえ、他の薬剤が、染色体異常の臨床学的診断および一般の中期染色体の分析、ならびに減少された受精能力の評価およびおそらくまた処置について、OAに関して概説されるのと同様に、使用され得ることが可能である。本発明の範囲の中に含まれるものはまた、臨床学的分析について細胞を調製するためのキットであり、１つ以上の以下のものを含有する。１）有糸分裂刺激剤（例えば、タンパク質ホスファターゼ阻害剤（例えば、オカダ酸、Ca²⁺が補充された培地中のアフリカツメガエルからの無細胞抽出物、Rbタンパク質の不活性化後のOA、もしくは網膜芽腫タンパク質抗体）；２）リゾレシチンもしくはポリエチレングリコール（PEG）のような脱膜化剤；３）細胞周期のG1、S、およびG2期における核についての細胞学的マーカーとして使用される特異的な活性を有する抗体；ならびに／または４）中期染色体の細胞遺伝学的分析についての染色体調製物を作製するための、細胞培養培地、特定の緩衝液、および他の薬剤。図面の簡単な説明本発明の改変、およびさらなる形態、および実施態様は、当業者に明らかである。本明細書中で言及される全ての書類は、参考として援用される。本発明の実験的な基礎および実施態様は、添付の図面に関して、例示のみの手段として、ここでより詳細に記載され；図１は、有糸分裂の染色体の凝縮、ならびに間期、前期、および中期の間の差異を示す；図２は、細胞周期を示す。中期（M）後に、ギャップ（G1）期、次いでDNA合成（S）期、次いでギャップ（G2）が続く；図３は、２倍体の精原細胞が１倍体の精子に成熟する間の、精子形成のプロセスを示す；図４は、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）の大きなファミリーのメンバーの周期的な活性化によって制御される、真核生物細胞周期を模式的に示す。CDK複合体は、各細胞周期の相に重要な、あるタンパク質基質を触媒する；図５〜８は、表１〜４に示される結果を反映する。図９は、３つの懸濁液（未刺激、OA刺激化、およびコントロール（OAなしで培養された）から調製された精巣細胞を示す；ならびに図10は、減数分裂加速化アッセイ（MAA）に関与する工程を示す。Ａにおいて、工程は、以下を含む；１）生検材料から直接的に細胞学的調製物を作製する；２）特異的に蛍光標識された抗体を使用して、細胞周期特異的マーカーに調製物を曝露し、そして従来の免疫蛍光技術によって同定する；３）個々の核のサンプルに対して細胞周期の相を評価し、そして細胞周期指数（すなわち、G1、S、およびG2における核の相対数）を算定する。Ｂにおいて、工程は、以下を含む；１）生検物質から細胞懸濁液をさらに作製する；２）リゾレシチンまたは代替物によって細胞を脱膜化する；３）有糸分裂刺激剤、あるいはOA、Rb抗体後のOA、またはカルシウム改変された培地中のアフリカツメガエル卵の無細胞抽出物を添加する；４）工程Ｂの１〜３によって得られた、それぞれの最終的な細胞懸濁液から、細胞学的調製物を作製し、工程Ａにおけるように、特異的な抗体染色を使用して、細胞周期指数を評価する；５）伝統的な染色技術後、中期染色体の分析による診断のために、細胞遺伝学の実験室における日常的な手順に従って、伝統的な染色体調製物を作製し、そしてさらに中期指数を算定する。詳細な記載実施例１−ヒトおよびマウスの粗精巣懸濁液における減数分裂前の精原細胞、第１減数分裂、および第２減数分裂の中期の、短期のインビトロのOA刺激方法および材料ヒト精巣生検材料（約２mm³）を、逆精管切除を受けた２人の患者から得た。B alb/c系統のマウス精巣材料を、バーミンガム大学の動物飼育室から得た。精巣材料の３分の１を、ばね付弓ばさみを使用して即座に切断し、そして１％クエン酸三ナトリウム中においた。細胞を、一対の湾曲された鉗子を使用して、管状の材料から取り出した。風乾した調製物を、Hultenらに従って作製した。ヒトまたはマウス精巣材料について、それぞれ、Human Cytogenetics、A Practica l Approach、Rooney DE、Czepuldouski、BH編、IL Press、193-221頁、1992、またはEvansら、Cytogenetics 33、289-294、1964。材料の残りの３分の２を、CO₂ 独立培地（GIBCOBRL）に置き、そして精巣の管から解離された細胞を、２つの等しいアリコートに分割した。一方のアリコートを、最終濃度２μMのOA（Sigma）とともに、他方をOAなしで、培養した。両方のアリコートを、35℃（ヒト）または37℃（マウス）で６時間培養した後、従来の風乾調製を、記載されるように行った。細胞を、リーシュマン染色で染色し、そして明視野顕微鏡下でスクリーニングした。各中期細胞の位置を、イングランドファインダー（Graticules、Lond on）を使用して記録した。細胞の画像を、捕獲し、そしてスマートキャプチャーソフトウェア（Digital Scientific）を利用して、パワーマッキントッシュ8100 /80システムに保存した。これらの画像を、交叉および染色体配座をスコアするために後に使用した。精子形成の異なる段階における細胞の頻度を、４つの細胞型（ａ）精原中期（SpM）、ｂ）レプトテン期、合糸期、およびパキテン期を含む前期（PI）、ｃ）異動期および中期Ｉを含む中期Ｉ（MI）、ならびにｄ）中期 II（MII））の合計からの細胞のパーセントに関して記録した（図９を参照のこと）。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）を、いくつかの改変を伴って、BarlowおよびHulten、Chromosome Research 4、562-573に従って行った。浸漬油を、４×SSC Tween20中、10分間で、スライドから除去した。次いで、スライドを、それぞれ、10分間、３：１（MetOH:酢酸）中に２回おいて、リーシュマン染色を除去した。３つのヘテロクロマチンDNAプローブ（PUC1.77（1qh）、pMR 9A（９ph）、およびD15Z1）を使用して、第１、９、および15染色体を、それぞれ同定した。プローブを、製造業者の指示に従って、ニック転写キット（Boerin ger Mannheim）を使用して、ジゴキシゲニン-11-dUTPまたはビオチン-11-dUTP（ Boeringer Mannheim）で処理した。スライドを、Pinkel番号１フィルターセットおよび冷却荷電結合化デバイス（Photometrics）を備えたZeiss Axioskop上蛍光（epifluorescence）顕微鏡を使用して、スクリーニングした。ハイブリダイズされた細胞の画像を、リーシュマン染色化細胞における染色体の比較および同定のために、電子的に捕獲した（上記されるように）。精子形成の異なる段階における細胞の頻度を評価するために、細胞を、４つのカテゴリーに分類した；ｉ）精原中期（SpM）、ii）レプトテン期、合糸期、およびパキテン期を含む前期I（PI）、iii）異動期および中期Ｉを含む中期Ｉ（MI ）、ならびにiv）中期II（MII）。各カテゴリーについての指数を、全てのカテゴリーの合計からの細胞のパーセントに関して算定し、すなわち、他の細胞型は無視した。結果１）総体的な記載染色体形態学、配座、および交叉頻度を、OAとともにまたはOAなしでの粗精巣細胞懸濁液の６時間のインキュベーション後に、生殖系列細胞の風乾化調製物において研究した。最も顕著な観察は、OAなしで培養された細胞（これは、停止された前期I細胞を主に含んだ）に比較して、OA刺激された培養物における、多様な細胞型であった。OA刺激された培養物の大多数の細胞は、未成熟な染色体凝縮を示し、そして中期指数は、劇的に増加された。精原中期、減数分裂中期IおよびIIでの染色体の詳細な研究は、OA刺激された細胞と未刺激の細胞との間において、それらの形態学においても、クロマチン凝縮のそれらの程度においても、何の差異も示さなかった。２）細胞型頻度最終濃度２μMでのOAとの、粗精巣細胞懸濁液の短期間のインビトロ培養（６時間）は、未培養の材料に比較して、前中／中期細胞の数の劇的な増加を導いた。この効果は、ヒトおよびマウスの両方の粗精巣細胞懸濁液について観察された（それぞれ、表１および２、ならびに図５および６）。第１減数分裂のMI期での細胞の平均数は、OA刺激された細胞において、2.8%から57%に、および4.2から64.9%に、ヒトおよびマウスにおいて、それぞれ、劇的に増加された。興味深いことに、第２減数分裂、MII細胞の頻度はまた、OA刺激によって、ヒトにおいてほぼ６倍およびマウスにおいてほぼ３．３倍に増加された。最も驚くべきおよび予期されなかった観察は、有糸分裂前の頻度に対するOA の効果であった。従って、OAによってインビトロで刺激された粗精巣細胞材料は、精原中期（SpM）の数の大きな増加を示した。細胞のこの型の頻度は、1.8から 12.3%に、および3.4%から12.3%に、ヒトおよびマウスの精巣材料において、それぞれ増加した。対照的に、減数分裂前期細胞（PI）の頻度は、OAでの細胞のインビトロの刺激の後に、劇的に減少した。OAとともに培養された精巣細胞懸濁液と、新鮮に調製された精巣細胞との比較は、ヒトについて前期I細胞の数の６倍の減少、およびマウスについて7.2倍の減少を示した。表１および表２、ならびに図５および６は、上述の観察を説明する。全体の比較を、細胞型および頻度に関して、ヒトおよびマウスについて、それぞれ、３つの異なる細胞懸濁液間で行った。OA刺激された培養物における中期の頻度の大きな上昇が、両方の系において明らかである。対照的に、６時間、OAなしで培養された細胞は、細胞型における変化を何も示さず、およびほとんど全ての細胞は、減数分裂前期（PI）で停止されるようであった。これらの細胞の大多数は、パキテン期段階であり、減数分裂および減数分裂前の有糸分裂の他の段階は、観察されなかった。表１：ヒト精巣細胞についての細胞指数合計のパーセントにおいて示されるデータ＾＝新鮮な生検から即座に調製された細胞＾＾＝２μMのOAを含有する培地中の６時間の培養後に調製された細胞 * ＝OAなしの培地中の６時間の培養後に調製された細胞表２：−マウス精巣細胞についての細胞指数合計のパーセントとして示されるデータ＾＝新鮮な生検から即座に調製された細胞＾＾＝２μMのOAを含有する培地中の６時間の培養後に調製された細胞 * ＝OAなしの培地中の６時間の培養後に調製された細胞３）交叉頻度および分布中期Iでの交叉の形成に対する、精巣細胞懸濁液の６時間のインビトロ培養後のOAの効果を、未培養の細胞との比較において研究した。OAを伴う細胞の短期間の培養は、ヒトおよびマウスのいずれにおいても、交叉の頻度および分布に対して、効果を有しなかった。表３は、OA刺激したおよび未刺激のヒト精巣材料の平均交叉頻度を示す。細胞当たりの平均交叉頻度に関して、２個体間で有意な変化はなく、OAでの細胞のインビトロの刺激は、平均交叉頻度に有意に影響しないことを示す。未培養の材料における、細胞当たりの平均交叉頻度は、48.3であり、およびOA刺激された細胞において48.4であった。第１、９、および15染色体は、FISHによって同定された。これは、特定の染色体当たりの交叉の頻度を試験する可能性を提供し、従って、交差／交叉頻度および分布に対する、OAの効果のより詳細な絵を得る。OAとともに培養された精巣細胞におけるヒトの第１、９、および15染色体当たりの平均交叉頻度は、それぞれ、3.9、2.6、および1.8であり、ならびに未培養の材料の頻度（それぞれ、3.8、2.6、および1.7）と異ならなかった。交叉頻度および分布に対するOAの効果は、ヒト精巣細胞について、図７において棒状図で示される。細胞当たりでも、選択された２価染色体当たりでも、平均の平均交叉頻度間の明らかな差異はなかった。表３：−未培養の、および６時間OAとともに培養されたヒト雄性中期I細胞の交叉頻度および分布表４は、OA刺激された細胞および未刺激のマウス精巣材料における、細胞当たりの交叉の頻度、および異なる数の交叉を有する２価染色体の頻度を説明する。ヒトの交叉の頻度のパターンに類似の交叉頻度のパターンが、観察された。従って、細胞当たりの交叉の平均頻度は、OA刺激によって影響されなかった。OAとともに培養された細胞は、平均23.6個の交叉を有する未培養の細胞に比較して、平均23.3個の交叉を示した。全ての常染色体は、主に１または２個の交叉を有する２価染色体を形成した。３個の交叉を有する２価染色体を含む細胞が、数個観察された。これらの細胞は、OA刺激された細胞および未刺激の細胞の両方に存在した。図８は、マウスについての交叉の頻度および分布を説明する。細胞当たりの交叉の数における有意な差異は、なかった。１、２、または３個の交叉を有する２価染色体はまた、両方の条件において類似の頻度を示した。表４：−未培養の、および６時間OAとともに培養された雄性マウス中期I細胞の交叉頻度および分布上述の観察によれば、OAでの細胞の刺激および中期Iへの細胞の迅速な移行は、交叉の頻度も分布も影響しないと結論することは、妥当である。実施例２−ヒト骨髄実験白血球病状態を伴う２人の患者からの骨髄細胞のサンプルを、Ham F10培地中に懸濁し、そしてOAを、２μMの最終濃度に添加した。これらの患者は、反対の性別のドナーからの骨髄での骨髄移植を有した。OA細胞懸濁液およびコントロールを、37℃で16時間、インキュベートした。調製物を、20分間の低浸透圧前処理を含む細胞遺伝学的分析についての日常的な手順に従って作製した。有糸分裂指数を、OA処理した細胞培養物およびコントロール細胞培養物から評価した。OA培養物からの大多数の細胞は、前中期または中期にあり、未処理の細胞培養物において、細胞は、これらの段階においてほとんど見られなかった。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション技術を、骨髄細胞の性染色体構成を決定するために使用し、それらが、ドナー細胞の子孫であったことを証明した。本発明者らが気付いた限り、OAが、ヒト体細胞の通常（非細胞株）の間期／初期の前期段階の、中期への進行を誘導することは、首尾良く実証されていなかった。実施例３−MPFでの中期染色体の生成。方法論：本発明者の目的は、細胞周期のG1期から、できるだけ迅速に、S期から、中期（Ｍ期）に、細胞を分裂する最も有効なおよび効率的な方法を同定することであった。このことが達成されれば、細胞培養の長期のおよび、しばしば、要求の厳しいプロトコルの全てを欠く、中期における細胞を生成する仕事が、達成される。このことを達成するために、本発明者は、中期への細胞の迅速な進行を妨げる主要な２つのチェックポインを解明することを可能にするストラテジーを開発しなくてはならなかった。この点に介して２つの位置が、本質的であり、および重要である、すなわち：（１）G1/S期でのチェックポイント、および（２）G2/M期でのチェックポイント。チェックポイントでの現在の計画。 G1/Sチェックポイント特異的な生化学的分子は、細胞周期のG1からS期への細胞の通過の成功を決定する。本発明の以前に行われた研究は、Cdk2-サイクリンEおよびCdk4/6サイクリンD複合体を、G1/Sチェックポイントを介する細胞の分裂における重要な実行者として同定した（Zavits、H.T.ら（1997）Curr．Opin．Cell Biol．9:773-781）。これらのタンパク質の活性は、Dapおよびその相同体のCIP/KIPの役割から独立し、チェックポイントを介する細胞の通過を妨害する役割の分子が、証明されている（Lane，M.E.ら（1996）Cell 87:1225-1235；De Nooji，J.C.ら（1996）Cel l 87:1237-1247）。 Cdk4/6-サイクリンDおよびCdk-サイクリンEは、網膜芽腫（Rb）ファミリーの「ポケットタンパク質」のメンバー（pRb、p107、およびp130）をリン酸化する。これらのリン酸化されたタンパク質は、その産物がS期に入るために必要である遺伝子の転写を活性化するE2Fファミリーの転写因子（E2F1〜5）を放出する。 Cdk2-サイクリンEはまた、DNA合成を開始するために必要とされる他の重要な物質をリン酸化すると考えられる（Zavits、H.T.ら（1997）Curr．Opin．Cell．Bi ol．9:773-781）。 Rb群の任意のタンパク質（pRb、p107、およびp130）の過剰発現は、E2Fファミリーの転写因子（E''F1〜E2F5）を結合し、そしてその活性を阻害することによって、それによって、細胞がS期に入るために必要な遺伝子の転写を妨げることによって（Bartek，J.ら（1996）Curr Opin Cell Biol 8:805-814）、細胞を、G 1期において停止する（Zhu，L.ら（1993）Genes Dev．7:111-1125；Claudio P.P .ら（1994）Cancer Res 54:5556-5560）。最近の研究はまた、Cul-1（発生の間のG1/S期チェックポイントのネガティブな調節因子の別のクラス）を同定した（ Kipreos，E.T.ら（1996）Cell 85:829-839）。ストラテジー（G1/S期チェックポイント）：主な病巣は、網膜芽腫タンパク質に対する市販のモノクローナル抗体（Geradt s，J.ら（1994）International of Cancer．58(2)161-167）が存在するので、網膜芽腫タンパク質で直接的に妨げられる。別の代替の方法は、Rb群のタンパク質をリン酸化し、そして活性化するCdKサイクリン複合体のような前駆体分子の活性で、妨げられる。これらの前駆体分子の機能は、次いで、CIP／KIPおよびINK4ファミリーのCKIに結合することによって、排除され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．染色体分析用の細胞サンプルを調製する方法であって、細胞のインビトロ培養物と有糸分裂刺激剤とを接触させて、中期の細胞の集団を増加させる工程を含む方法。２．前記有糸分裂刺激剤との接触の前に、前記細胞の表面にある細胞表面レセプターをバイパスする工程をさらに含む請求項１記載の方法。３．前記細胞表面レセプターが前記細胞の脱膜化によってバイパスされる請求項２記載の方法。４．前記細胞にあるゲートキーパー（チェックポイント）タンパク質を不活性化する工程をさらに含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。５．前記ゲートキーパータンパク質が、網膜芽腫タンパク質である請求項４記載の方法。６．前記網膜芽腫タンパク質が、網膜芽腫特異的抗体によって不活性化される請求項５記載の方法。７．前記ゲートキーパータンパク質が、RNAアンチセンス技術を使用して不活性化される請求項４または請求項５に記載の方法。８．前記細胞が、血液リンパ球、骨髄細胞、胎児細胞を含有する羊水、皮膚線維芽細胞、または固形ガン細胞である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。９．前記染色体分析が、染色体における、構成的または後天性、構造的、および数的異常を診断するためのものである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。１０．前記染色体分析が、細胞周期のG1、S、G2期からM期へと通過する細胞を診断するための臨床的な細胞増殖アッセイを含む請求項１〜８のいずれかに記載の方法。１１．前記細胞が、精巣の精子形成細胞であり、さらに前記染色体分析が精子形成成熟指数を決定するためのものである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。１２．中期の染色体異常について、インビトロで細胞サンプルを分析する方法であって、前記細胞を脱膜化して、細胞膜における表面レセプターを無効にする工程と、ゲートキーパー（チェックポイント）タンパク質を不活性化する工程と、該細胞と、有糸分裂刺激剤とを接触することによって、有糸分裂／中期促進因子を活性化する工程と、該染色体を分析する工程とを含む方法。１３．前記ゲートキーパー（チェックポイント）タンパク質が、網膜芽腫タンパク質である請求項１２に記載の方法。１４．前記ゲートキーパー（チェックポイント）タンパク質が、特異的な抗体によって、またはRNAアンチセンス技術によって、不活性化される請求項１２または１４に記載の方法。１５．前記有糸分裂刺激剤が、間期細胞から中期へと推進することができる、タンパク質ホスファターゼ阻害剤である請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。１６．前記タンパク質ホスファターゼ阻害剤がオカダ酸（OA）である請求項１５に記載の方法。１７．前記有糸分裂刺激剤が、Ca²⁺改変培地を使用したアフリカツメガエル卵の無細胞抽出物である請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。１８．請求項１から１７に記載の方法であって、OAが、有糸分裂ブロッキング因子と組合わせて使用される方法。１９．細胞サンプルの悪性度分類を決定するためのインビトロの細胞増殖アッセイであって、該細胞と有糸分裂刺激剤とを接触する工程と、細胞周期のG1、S、G 2、およびM期の部分または全てを通過する細胞の頻度を決定する工程とを含むアッセイ。２０．前記細胞を脱膜化して、その細胞表面レセプターをバイパスする工程をさらにふくむ請求項１９に記載のインビトロの細胞増殖アッセイ。２１．前記有糸分裂刺激剤がOAである請求項１９または２０に記載のアッセイ。２２．前記有糸分裂刺激細胞が、Ca²⁺改変培地を使用したアフリカツメガエル卵の無細胞抽出物である請求項１９または請求項２０に記載のアッセイ。２３．請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞サンプルを調製するためのキットであって、細胞および有糸分裂刺激剤を培養するための材料を含有するキット。２４．細胞表面レセプターおよび／またはゲートキーパータンパク質をバイパスするための物質をさらに含有する請求項２３に記載のキット。２５．請求項１９〜２１のいずれかに記載のインビトロの細胞増殖アッセイを行うためのキットであって、有糸分裂刺激剤を含有するキット。