KR20090024034A - 정자의 성 선별방법 및 특정 성별을 갖는 포유동물의생산방법 - Google Patents
정자의 성 선별방법 및 특정 성별을 갖는 포유동물의생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 정자의 성을 선별하고, 선별한 정자를 ICSI를 통해 인공 수정시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 정자의 성 염색체에 상보적으로 결합하는 프로브를 이용하는 FISH/CISH 분석을 통해 정자를 성 선별하고, 선별된 정자를 난자의 세포질 내로 주입하는 ICSI를 통해 성-선택적으로 인공 수정시키는 것이다.또한 본 발명은 미토콘드리아의 효소 작용에 기초한 MTT 환원분석을 사용하여 선별된 정자의 생존율을 측정하고, MTT 물질 처리와 생성되는 포마잔의 독성 여부 그리고 흡광계를 사용하여 발생할 수 있는 DNA 상의 손상 여부를 단세포전기영동법을 사용하여 측정하는 것을 포함한다.
본 발명의 FISH/CISH 방법을 이용하면 기존의 성 선별법에 비해 효율성과 안정성 문제를 동시에 극복할 수 있다. 또한 FISH/CISH 과정을 거쳐 선별된 정자를 ICSI함에 따라 특정한 성을 가지도록 유도할 수 있고, 상기 정자의 성 선별을 통해 특정 성별을 갖는 포유동물을 생산할 수 있다. 따라서 본 발명을 통해 궁극적으로는 바이오 장기 생산용 돼지의 대량생산이 가능해질 수 있을 것이다.
정자, 성 선별, 인공수정, FISH, CISH, ICSI, MTT
Description
본 발명은 정자의 성을 선별하는 방법 및 성 선별된 정자를 인공 수정시키는 방법에 대한 것이다.
기존의 정자의 성을 분류하는 방법으로서 FACS( Fluorescence Activated Cell Sorting)는 X염색체와 Y염색체의 DNA량의 차이에 따라 정자를 분리해 낼 수 있다. FACS 분석법은 기계를 사용하기 때문에 많은 양의 정자를 분석할 수 있으며 그 유효성이 입증된 바 있다(Cordelli E. 2005). 그러나 1991년 이미 X-, Y- 정자의 DNA량의 차이에 따른 FACS 분류방법은 L.A.Johnson에 의해 특허가 출원되어 그 이용방법에 다소 제한이 따른다. 이러한 제한 외에도 FACS 분류기를 통과하는 동안 염색, 레이저에 의한 노출, 분리액에 의한 고농도의 희석, 압력, 분류과정에 있어서 사용된 배양액의 조성변화 등의 다양한 기계적 정자 손상 요인이 존재하고 있어 FACS 분류기를 통과한 대부분의 정자는 꼬리가 잘려나가거나 핵을 둘러싼 세포막에 심각한 손상을 받는다 (Maxwell 1999; Guthrie 2002; Vazquez 2002; Seidel 2003).
한편, FISH(fluorescence in situ hybridization)나 CISH(chromogenic in situ hybridization)와 같은 ISH ( in situ hybridization )분석은 tag이나 label을 포함하고 있는 프로브를 표적 염색체의 특정 뉴클레오티드 서열에 상보적으로 결합시켜 유전자의 존재 여부를 결정하는데 사용된다. ISH 분석을 통한 성 선별은 FACS로 인한 정자의 손상을 막아 수정능과 같은 생물학적 활성을 높이고, 선별에 필요한 절차를 현격하게 간소화시킬 수 있다.
특히 CISH는 ISH 분석의 새로운 변형법으로써 FISH에 비해 3가지 중요한 이점을 가지고 있다. 첫 번째는 조직병리학적인 검사뿐만 아니라 잠재적인 형태학적 특징까지 동시에 확인할 수 있다는 것이고, 두 번째는 표준 광시야 현미경 하에서 수행될 수 있어서 별도의 장비가 필요치 않다는 것이다. 그리고 마지막 세 번째는 형광이 쉽게 사라지는 FISH와는 달리 샘플에서 염색된 신호가 영구적으로 보존될 수 있어서 장기간 보관할 수 있다는 점이다 (Amina Vocaturo. the Oncologist. 2006; Minna Tanner. American Journal of Pathology. 2000).
정자를 인공 수정하는 기술에는 IVF(in vitro fertilization), ICSI 등이 사용되어져 왔는 바, 인공 수정의 결과는 분리된 정자의 수정능을 대변해줄 수 있다. 하기의 [표1]에서 알 수 있듯이, IVF는 정자와 난자를 일정 비율로 섞어 혼합액 내에서 무작위로 수정시키는 방법으로 수정에 성공하는 확률이 낮은 반면, ICSI (intracytoplasmic sperm injection)는 미세한 유리관으로 정자를 흡입한 다음 난자의 세포질에 주입하여 수정시키는 방법으로 IVF보다 효율적이며, 단 하나의 정자가 있더라도 수정을 시킬 수 있고, 운동성이 없는 정자를 이용한 체외수정 또한 가능하게 하는 기술이다.
| No. of | IVF | ICSI |
| Cycles | 465 | 1007 |
| Retrieved oocytes | 6414 | 11042 |
| Injected oocytes (%) | 8725 (79.0) | |
| Fertilized oocytes (%) | 3590 (56.0) | 6552 (75.1) |
| ET cycles | 423 | 950 |
| Pregnancies (%) | 122 (28.9) | 266 (28.0) |
본 발명의 목적은 기존의 정자의 성 선별 방법들의 단점인 성 선별된 정자에 심각한 손상을 준다는 것, 실험이 복잡하여 숙련된 기술을 요하고 고가의 장비를 사용해야 한다는 것 등의 문제점을 극복하기 위해서 FISH/CISH 분석 실험으로 안정하고, 값이 싸면서도 그 효율이 높은 성 선별 방법을 제공하려는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 FISH를 정자에 적용한 연구는 진행되었으나 CISH를 정자에 적용한 연구는 진행되어 있지 않기 때문에 CISH에 의한 정자의 성 선별 방법을 확립하려는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 기존의 복잡한 과정과 장시간이 소요되는 단점을 극복하기 위해서 FISH/CISH로 성 선별된 정자를 곧바로 ICSI하는 방법을 도입하여 성 선별과 인공수정에 필요한 절차를 현격하게 간소화시킴으로써 빠르고 간편하며 정확한 실험이 가능하도록 하여 특정 성별을 갖는 포유동물을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 기타 목적은 MTT 환원 분석과 단세포전기영동법 (Commet assy)을 이용하여 위의 과정으로 선별된 정자의 생존율과 DNA 손상 여부를 미리 파악함으로써 ICSI 했을 때 수정율과 수정된 난자의 발생단계에서의 분할율을 향상시키는데 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 정자의 성 염색체에 상보적으로 결합하는 프로브를 이용하는 FISH/CISH 분석을 통해 정자를 성 선별하고, 선별된 정자를 난자의 세포질 내로 주입하는 ICSI를 통해 성-선택적으로 인공 수정시킴으로써 특정 성별을 갖는 포유동물을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 미토콘드리아의 효소 작용에 기초한 MTT 환원분석을 사용하여 선별된 정자의 생존율을 측정하고, MTT 물질 처리와 생성되는 포마잔의 독성 여부 그리고 흡광계를 사용하여 발생할 수 있는 DNA 상의 손상 여부를 단세포전기영동법을 사용 하여 측정하고자 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일견지에 의하면,
⑴ 포유동물의 수컷 종으로부터 정자 세포를 수집하는 단계; ⑵ 상기 복수의 정자 세포를 ISH (In situ hybridization)분석을 이용하여 분류하는 단계; ⑶ 상기 성 선별된 정자를 상기 포유동물의 난자의 세포질 내에 주입하여 인공수정시키는 단계; 및 ⑷ 목적하는 성별의 포유동물 산자(産子)를 생산하는 단계; 를 포함함을 특징으로 하는, 특정 성별을 갖는 인간을 제외한 포유동물의 생산방법이 제공된다.
상기 특정성별을 갖는 포유동물의 생산방법에 있어서, 성 선별된 정자의 생존률을 측정하는 단계를 더 포함하며, 상기 성 선별된 정자의 DNA 손상 여부를 확인하는 단계를 더 포함함을 특징으로 한다.
상기 생존률 측정은 MTT 환원분석을 사용하여 측정하는 단계임을 특징으로 하고, 상기 DNA 손상여부 확인은 MTT 환원 분석법으로 생존이 확인된 정자를 겔 속에 넣고 굳힌 후, 겔 속의 세포를 용해액 속에 넣어 용해시킨 뒤, 전기영동을 한 다음, DNA 염색을 하여 관찰함으로써 DNA 손상여부를 확인하는 단계로 이루어짐을 특징으로 한다.
상기 ⑵단계는, ISH 분석이 FISH (Fluorescence in situ hybridization) 또는 CISH (Chromogenic in situ hybridization)인 것을 특징으로 하고, 바람직하게 는 상기 ⑵단계는 CISH 분석을 통해 성별이 분류됨을 특징으로 하고, 정자와 프로브의 비율을 8:2, 5:5, 2:8로 구성된 군으로부터 선택된 수정용 샘플을 만드는 단계와 샘플을 도포한 슬라이드를 씰링 (sealing)하는 단계를 포함하여 성별이 분류됨을 특징으로 한다. 또한 상기 ⑵단계는 정자 두부(頭部)의 첨체에 치우친 전방에서 프로브를 탐지하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 상기 ⑴단계는 돼지, 소 및 말로 구성된 군으로부터 선택된 포유동물의 수컷 종으로부터 정자 세포를 수집하는 단계임을 특징으로 하는 특정성별을 갖는 포유동물의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 제 2견지에 의하면,
원 정액으로부터 정자 용액을 제조하는 단계; 상기 정자 용액에서 정자핵을 탈 응축시킨 후 변성시키는 단계; 정자의 X- 또는 Y- 염색체에 특이적인 절편을 증폭하고, 상기 절편으로 표지한 프로브 (DNA-labelled probe)를 제작하는 단계; 상기 변성된 정자와 상기 프로브를 혼성화시키는 단계; 혼성화 후 대조염색하여 검출하는 단계;를 포함하는 정자의 성 선별방법을 제공한다.
상기 정자는 돼지의 정자인 것을 특징으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2를 갖는 1번 염색체 및 서열번호 3 및 서열번호 4를 갖는 Y-염색체에 특이적인 절편을 증폭함을 특징으로 한다.
상기 대조염색은 DAPI, FITC, RHOD 중 어느 하나에 의해 이루어짐을 특징으로 하는 방법인 것을 포함하고, 상기 정자용액은 정액을 원심분리시킨 후 부유시킴 으로써 얻음을 특징으로 한다. 상기 정자핵의 탈 응축은 상기 부유한 정자용액을 슬라이드에 도포한 뒤 탈 수화 (dehydrate)하여 건조시켜 DTT 용액에 담가 37℃에서 15분 동안 배양시킴으로써 정자핵을 탈 응축시킴을 특징으로 한다.
본 발명의 제3견지에 의하면,
정자를 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 X- 또는 Y-염색체에 특이적인 서열을 갖는 비오틸레이티브 프로브 (biotinylated probe)를 떨어뜨리고 커버슬립을 씰링 (Sealing)하여 배양함으로써 프로브를 변성시키는 단계; 변성된 슬라이드를 챔버안에서 배양시키킨 후 씰링된 커버슬립을 제거하는 단계; HRP-Streptavidin (Horseradish peroxidase-Streptavidin)과 반응시킨 후 세척하는 단계; DAB (Diaminobenzidine)과 반응시키는 단계; 헤마톡실린 (hematoxylin)으로 대조염색시켜 확인하는 단계;를 포함하는 정자의 성 선별방법을 제공한다.
상기 프로브와 정자의 비율은 8:2, 5:5, 2:8로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 상기 프로브와 정자의 비율은 1:1인 것을 특징으로 한다.
상기 커버슬립의 씰링은 노란색 팁(yellow tip)을 장착한 써린지(suringe)를 사용하여 고무시멘트 (rubber cement)로 씰링함을 특징으로 하고, 슬라이드와 커버슬립을 테이프로 가장자리만을 눌러 씰링함을 특징으로 하는 것을 더 포함한다.
상기 프로브의 변성은 상기 슬라이드를 Dri-Bath 위에서 94~95℃에서 5분동안 배양시킴을 특징으로 하고, 변성된 슬라이드는 37℃ 습도 챔버 안에서 10시간 이상 배양시킴을 특징으로 한다.
바람직하게는 상기 정자의 성 선별방법은 돼지, 소 및 말로 구성된 군으로부터 선택된 포유동물의 수컷 종으로부터 얻은 정자에 대한 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하여 FISH/CISH 분석 실험으로 안정하고, 값이 싸면서도 그 효율이 높은 성 선별 방법 특히, CISH에 의한 정자의 성 선별 방법을 확립할 수 있고, FISH/CISH로 성 선별된 정자를 곧바로 ICSI하는 방법을 도입하여 인공수정에 있어서 기존의 복잡한 과정과 장시간이 소요되는 단점을 극복하여 빠르고 간편하며 정확한 실험이 가능하도록 한, 특정 성별을 갖는 포유동물을 생산할 수 있다. 즉, 선별과정에 의한 정자의 손상없이 정자를 성 염색체에 따라 간편하게 분리하고, 이렇게 분리된 정자를 ICSI함으로써 특정 성(X 또는 Y)에 선택적인 수정을 가능하게 할 것으로 기대된다. 또한 FISH/ CISH로 분리된 정자의 생존율은 MTT 환원 분석으로 측정하고, Comet분석을 통해 MTT 환원 분석이 정자의 DNA에 미치는 손상 여부까지 검토하여 본 발명에 따르는 전 과정에 대한 안정성을 파악하고 효율을 증대시킬 수 있을 것으로 기대되고, 궁극적으로는 바이오 장기 생산용 돼지의 대량생산이 가능해질 수 있을 것이다.
이하, 본 발명의 실시예를 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로 본 발명을 이에 한정하려는 것은 아니다.
<
실시예1
>
본 실시예는 FISH를 이용하여 돼지 정자의 X- 또는 Y-염색체를 염색하여 분리하고자 한 것으로서, PCR로 1번 염색체와 Y 염색체에 특이적인 절편을 증폭하여 염기서열의 크기와 반복적인 마커 유무 등을 파악하였다. 이를 바탕으로 chromesome 1 labelled probe와 Y chromosome labelled probe를 제작하였다. 이 두 가지의 프로브를 이용하여 선별한 정자와 중합 반응을 일으킨 후에 표지된 정자를 관찰하였다.
미분리 정액 5㎖ (3×107 spermatozoa/㎖) 또는 분리된 정액 10~15㎖ (0.5×106 spermatozoa/㎖)을 5분간 1200 g에서 원심분리시킨 후, KCl 저농도용액 ( 75mmol/L) 6㎖로 부유시키는 과정을 2번 반복하였다. 상층액은 버리고 pellet은 새로 만든 차가운 fixative 용액(methanol: glacial acetic acid = 3:1) 4~6㎖로 부유시켰다(정자의 농도에 따라 부피를 조절한다). 부유한 정자 용액을 깨끗한 슬라이드에 도포 (spreading)시키고 공기 중에서 건조시켰다.
혼성화 (hybridization)전에, 슬라이드는 2xSSC로 세척하여 고정 (fixative) 용액을 제거하고 70%, 85%, 100% 에탄올에 통과 (passing)시켜 탈수 (dehydrate) 시킨 뒤 공기 중에서 건조시키고, 건조시킨 슬라이드를 DTT solution(pH 7.4)에 담 가 37℃에서 15분 동안 배양시켰다(이 과정에서 단백질의 이황화 결합이 풀리게 되어 정자의 핵이 탈 응축된다). 슬라이드를 2xSSC에 다시 세척하고, 일련의 에탄올에 다시 넣어 탈수 (dehydrate) 한 후 공기 중에서 건조한 다음, 70%(v/v) formamide/2xSSC solution에서 75℃, 5분으로 변성시켰다. 새로 만든 70%, 85%, 100% 에탄올에 슬라이드를 담갔다가 빼서 탈수 (dehydrate)시킨 후 RT에서 건조하였다.
다음 과정으로 nick translation에 의해 표지된 DNA direct probes의 준비과정을 수행하였다. PCR로 1번 염색체, Y-염색체에 특이적인 절편을 증폭하였고, 1번 염색체, Y-염색체에 특이적인 프라이머는 Rube 등(1999)의 방법에서와 같이 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 서열을 묘사한 것을 따라 디자인하였다. PCR 증폭결과, 377 bp와 244 bp의 생산물이 나왔는데, 이는 Y와 1 번 염색체의 특이적인 절편이고, 1번 염색체의 서열(X51555)은 313 뉴클레오티드의 길이를 가지고 2n=3000-6000의 copy numder를 가지며 (Jantsch, 1989), Y 염색체(X12696)는 3832 뉴클레오티드의 길이를 가지고 내부에 반복적인 마커가 없다(McGraw, 1988).
올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
Chromosome 1
Forward: 5'-GTT GCA CTT TCA CGG ACG CAG C-3'(서열목록1)
Reverse: 5'-CTA GCC CAT TGC TCG CCA TAG C-3'(서열목록2)
Chromosome Y
Forward: 5'-AAT CCA CCA TAC CTC ATG GAC C-3'(서열목록3)
Reverse: 5'-TTT CTC CTG TAT CCT CCT GC-3'9(서열목록4)
FISH의 마지막 과정으로 혼성화과정 (Hybridization)과 검출 과정을 수행하였다. 3㎕의 Y-염색체 특이적 프로브와 3㎕의 1번 염색체 특이적 프로브를 냉각된 ethanol과 sodium acetate와 함께 3시간동안 반응시킨 후 -80℃나 -20℃에서 하룻밤 (overnight)동안 촉진시켰다. 촉진 후에 프로브를 70%(v/v) 에탄올에서 세척하고 23000g에서 30분 동안 원심분리시키고, 이때 생성된 DNA pellet은 10㎕ 혼성화용액으로 부유시켰다. 이 부유액을 75℃에서 5분 동안 사전에 변성시킨 슬라이드에 도포하여 변성과정을 거친 후 그 위에 커버슬립을 덮었다. 슬라이드는 고무로 된 것으로 봉해지고 어둡고 습한 챔버에서 37℃, 72시간동안 보관하였다. 혼성화 (hybridization)한 후에, 0.4xSSC 용액에서 75℃, 2분 동안 세척하고 2XSSC에 0.1% tween 20을 넣은 용액으로 RT에서 2분간 세척하였다. 그 다음 일련의 에탄올로 탈수 (dehydrate)한 뒤 건조시켰다. 마지막으로 슬라이드는 DAPI 용액 6㎕로 대조 염색하였다. 염색된 슬라이드를 도 1에서 보는 바와 같이 DAPI, FITC, RHOD 세 가지의 필터를 이용하여 현미경 하에 관찰하였다.
FISH 분석으로 나온 결과를 FACS 분석법으로 나온 기존의 성 선별 결과와 비교해 본 결과, FISH 분석이 정자 선별에 더 높은 효율을 가질 뿐만 아니라 정자의 손상도 적은 것을 알 수 있었다. 이는 FISH 분석이 정자의 성 선별에 쓰이는 기존의 방법들을 효과적으로 대체할 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
<
실시예2
>
본 실시예는 CISH 분석으로 성염색체를 분석하여 돼지 정자를 선별하고자 한 것이다.
CISH 분석에서는 HRP/DAB 시스템을 사용하여 biotinylated probe를 위치 결정(localization) 시킨다. DAB는 샘플의 항원/항체/효소 복합체의 위치에 영구적이고 강렬한 갈색 침전물을 생성할 수 있기 때문에 CISH 분석은 조직, 세포, 염색체의 특정한 핵산 서열을 탐지하기 위해 사용된다. 이 분석의 특이성은 프로브에 의해서 제공된다. 이러한 프로브는 샘플의 핵산(DNA, mRNA, tRNA)의 뉴클레오티드 서열에 상보적으로 anneal하거나 hybridize할 수 있는 특이적 서열을 가지고 있다. 프로브는 표적으로 하는 핵산의 존재를 위치화하기 위해 사용될 수 있도록 tag이나 label을 포함하고 있다. CISH localization은 보통 형광 현미경 하에서 형광 표지자로 수행되거나, 광시야 현미경(투과현미경) 하에서 염색체 표지자로 수행된다. CISH 분석을 통해 유전자의 존재 여부를 결정할 수 있다. 예를 들면, 유전자 증폭이나 결실 또는 polysomy와 같은 염색체의 수의 변화나 전좌와 같은 염색체 재배열을 들 수 있다.
<그림1> CISH 분석원리
| 정자 | 8㎕ | 5㎕ | 2㎕ |
| probe | 2㎕ | 5㎕ | 8㎕ |
인공 수정 센터에서 공급받은 정자를 bubble이 생기지 않도록 슬라이드 위에 떨어뜨린 후, 그 위에 x-probe(또는 y-probe)를 떨어뜨리고 커버슬립을 덮었다.
배양하는 동안 증발을 방지하기 위해서 커버슬립을 씰링 (sealing)하였다. 씰링하는 방법에는 두 가지가 있다. 첫 번째는 yellow tip을 장착한 5㎖ suringe를 사용하여 rubber cement로 씰링하는 방법이다. 커버슬립의 가장 자리를 rubber cement로 조심스럽게 씰링한 후 20~30분 상온에서 충분히 굳힌다. 고무 시멘트 (rubber cement)가 잘 굳지 않았을 경우 변성 (denature)단계에서 타버려 실험을 계속할 수 없으므로 시멘트가 굳었는지 확인하여 다음 단계를 수행하여야만 한다. 두 번째는 슬라이드와 커버슬립을 테이프로 씰링하는 방법이다. 이때에 커버슬립의 중앙을 누르지 말고 가장자리만을 눌러 씰링을 확실하게 한다. 두 가지 방법 모두 실험의 결과에는 큰 차이를 보이지 않지만 테이프를 사용할 경우, 건조 과정이 필요치 않고 벗겨내기 용이하다는 장점이 있다.
슬라이드를 Dri-Bath 위에서 94~95℃에서 5분 동안 배양시킴으로써 프로브를 변성시켰다(Dri-Bath는 미리 예열시켜 두었다). 변성된 슬라이드를 37℃ 습도 챔버 (humidity chamber) 안에서 10시간 이상 배양시켰다.
0.5x SSC buffer가 담긴 2개의 Coplin jar를 준비하였다. 둘 중 하나는 RT에 두고, 다른 하나는 큰 비커 안에서 중탕시켜 75℃로 유지하였다 (coplin jar 내부의 온도와 비커 안의 온도에는 차이가 있으므로 온도계를 coplin jar 안에 두고 온도를 확인하였다). 두 번째 Coplin jar의 온도는 2개의 슬라이드마다 1℃씩 올리되, 80℃는 넘지 않도록 하였고, 씰링했던 고무시멘트나 테이프를 벗겨내고 커버슬립을 용액이 마르지 않도록 유의하면서 제거하였다. 슬라이드를 RT SSC가 들어있는 Coplin jar에 담갔다가 곧바로 75℃ SSC가 담긴 Coplin jar로 옮겨 5분간 담근 상태로 둔 후, 슬라이드를 3차 D.W.가 담긴 dish에서 2분씩 3번 세척하였다.
3% H2O2가 담긴 Coplin jar에서 10분간 반응시킨 후, 0.025% PBS/Tween20에서 2분씩 3번 세척한 다음, RT에서 CAS-BlockTM을 1방울 떨어뜨린 후 10분간 반응시키고 나서, CAS-BlockTM을 Kim's wipes에 흘리거나 빨아들여서 제거하였다.
HRP-Streptavidin을 1방울 떨어뜨리고 30분간 반응시킨 후, 0.025% PBS/Tween20으로 세척한 다음, Substance-Chromogen Solution(DAB)을 1방울 떨어뜨리고 다시 30분을 반응시키고 나서, 3차 D.W.가 담긴 dish에서 2분간 세척하였다.
hematoxylin(1㎎/㎖)으로 대조염색을 1분간 실시한 후, 3차 D.W.가 담긴 dish에서 2분간 세척한 다음, dish에 담긴 70%, 85%, 95%, 100%, 100% EtOH에서 단계별로 2분씩 탈수시켰다. 탈수 후 슬라이드를 자일렌 (Xylene)에 2분씩 2번 담근 후, 자일렌은 dish가 아닌 Coplin jar를 이용하여 반응시켰다. HistomountTM Mounting Solution을 슬라이드 위에 1방울 떨어뜨리고 커버슬립을 덮었다.
40x의 광학현미경 하에서 슬라이드를 관찰하였다. 도 2, 도 3에서와 같이 정자 두부(頭部)의 첨체에 치우친 전방에서 biotin: streptavidin: reporter enzyme(HRP): ligand(DAB) 복합체를 확인할 수 있었다.
CISH 분석을 통해 얻어진 결과를 분석해 본 결과 정자와 프로브의 비율이 1:1일 때 가장 효과적이라는 것을 알 수 있었다. 또한 기존의 FACS나 FISH를 대체해서 CISH 분석이 돼지 정자의 성 선별을 위해 효율적으로 쓰일 수 있다는 것을 증명할 수 있었다.
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실시예3
>
본 실시예는 FISH/CISH분석을 통해 성 선별된 돼지 정자를 ICSI를 이용하여 수정시키고자 한 것이다.
ICSI의 과정은 간략히 직경 3~4 μm의 유리관에 정자를 흡인한 후 정자의 꼬리를 자극해 활성화시키고, 활성화한 정자가 안에 들어간 상태로 유리 바늘로 난자의 투명대를 관통하여 난자 안에 정자를 직접 주입하는 것이다. 24시간 후 수정여부를 확인하고 배양하다가 채란 후 2~3일의 4~8 분할배를 자궁에 되돌리면 ICSI의 전 과정을 마치게 된다.
먼저 ICSI용 난자를 준비하였다. 즉, 40~44시간 체외 성숙된 난자에서 난구세포를 제거하기 위하여 0.1% hyaluronidase가 첨가된 D-PBS 배양액으로 vortexing 및 repipetting한 후, 제 1 극체가 선명하게 나타나고 세포질이 균질한 난자를 선별하여 사용하도록 하였다.
ICSI를 위한 정자의 준비는 신선 정자를 이용하여 Swim-up방법으로 실시하였다. Swim-up 방법은 2.5mM caffeine과 0.4% BSA가 첨가된 modified Tris-buffered medium으로 활력이 높은 정자를 채취하기 위하여 5％ CO2, 98∼99％ 습도, 39℃ 상태의 CO2 인큐베이터에서 실시하였다. Swim-up의 유도는 15 ㎖ conical plastic tube에 농후 정자와 체외수정용 배양액이 층을 이루도록 하기 위해서 tube의 아래층에 정자를 놓고 그 위의 층에 modified Tris-buffered medium을 섞이지 않도록 조심스럽게 분주한 후 45°의 각도로 눕혀서 1 시간 동안 활력 정자의 부유를 유도하였다. Swim-up을 유도하여 부유된 상층액의 정자를 채취한 후 500 g에서 2회 5 분간 원심 분리하여 정자를 세척하였다.
ICSI용 피펫의 준비는 외경 1 ㎜ capillary tube (Narishige Co., Japan)를 이용하여 정자주입용 피펫은 내경 3~4 μm, 외경 8∼9 μm로 제작하여 사용하였고, 난자고정용 피펫은 외경을 100∼120 μm로 조절하고 내경은 10∼15 μm로 제작하여 사용하였다.
세포질 내 정자의 주입은 micromanipulator (Narishige Co., Japan)가 부착되어 있는 200배 도립현미경 (Nikon Co., Japan)을 이용하여 Kim 등(1998)의 방법을 약간 수정하여 이용하였다.
한 마리의 정자를 주입용 피펫에 흡인, 장착하기 위해서 정자의 운동성을 저하시켜야 하는데 이는 10% polyvinylptrrolidone(PVP)이 첨가된 10 ㎕ 정자용 D-PBS drop에서 정자의 꼬리를 먼저 주입용 피펫으로 흡인하여 0.4% BSA가 첨가된 20 ㎕ 난자용 D-PBS drop으로 이동함으로써 수행되었다. 체외 성숙된 난자의 난구세포를 제거하여 도립현미경의 stage 위에 준비된 0.4% BSA가 첨가된 ICSI용 D-PBS drop으로 옮겨 제 1극체가 6시 또는 12시 방향으로 향하게 하여 고정용 피펫으로 난자를 고정시킨 후, 정자가 들어있는 주입용 피펫을 고정된 난자의 적도부근(3시 방향) 약간 아래에서 난자의 세포질 속으로 진입시킨 다음 세포질의 내용물을 약간 흡인하여 정자용 피펫의 진입여부를 확인한 후 흡인된 세포질의 내용물과 함께 정자를 세포질 속으로 진입시켰다. 이때 정자를 진입시킴과 동시에 10% polyvinylptrrolidone (PVP)이 첨가된 정자용 D-PBS 배양액의 최소량을 함께 주입한 후 주입용 피펫을 빨리 후퇴시켰다. 난자의 세포질 내 정자의 주입은 난자가 도립현미경 stage의 ICSI용 drop에서 노출되는 시간을 최소화하기 위해 10개의 난자를 이용하여 20분 이내에 작업을 완료하도록 하였다. ICSI하는 과정은 도 4와 같다.
ICSI 후 0.4% BSA가 첨가된 체외배양액 NCSU 23에 3∼4회 세척한 후 20∼30개의 수정란을 50㎕ drop에 넣어 39℃, 5％ CO2 incubator에서 배양한다. 수정 후 48시간에 수정율을 조사하였으며, 144시간째에는 배반포기 상태의 수정란을 조사하도록 하였다. ICSI 후 배발생 과정을 관찰한 결과는 도 5와 같다.
표 1에서도 알 수 있듯이 ICSI는 난형질(ooplasm)로의 정자의 접근을 방해하는 장애물들을 극복할 수 있으므로 IVF에 비해 난자의 수정율이 높다. 따라서 FISH/CISH를 통해 선별된 특정 성의 정자를 ICSI로 인공 수정시킬 경우 더 높은 수정율과 배아발생단계를 기대해 볼 수 있다.
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실시예4
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본 실시예는 MTT 환원 분석을 사용하여 FISH/CISH로 분류된 정자의 생존율을 측정하고자 한 것이다.
MTT 환원 분석은 정액에 MTT를 첨가하여 살아있는 정자의 중편에 있는 미토콘드리아의 효소 작용으로 환원 반응이 일어나 보라색의 포마잔이 생성되면서 변하게 되는 흡광도의 차이를 흡광계로 측정하여 정자의 생존율을 조사하는 것이다. 살아있는 정자가 많을수록 포마잔이 더 많이 생성되므로 흡광도가 더 높아지게 되므로 흡광도를 측정함으로써 정자의 생존율을 측정할 수 있다.
FISH/CISH 분석을 거친 정자를 800g로 10분간 17℃에서 원심 분리하였다(L. Fraser et al. 2005). 아래층에 생긴 펠렛을 남기고 상층액을 버린 후 남은 펠렛을 PBS(Phosphate Buffered Saline, NaCl 10.00g/L+KCl 0.24g/L+Na2HPO4 1.44g/L+KH2PO4 0.25g/L)로 부유하여 세척하는 것을 3회 반복하였다. 세척한 정자의 최종 농도가 3.0x106개/㎖가 되도록 BTS로 부유시켰다. 여기에 쓰이는 BTS의 조성은 다음과 같다(Kim, I. C. et al., 2002).
| BTS 조성 | 용량 (g/L) |
| Glucose | 37.00 |
| Sodium hydrogen bicarbonate | 1.25 |
| EDTA | 1.25 |
| Sodium citrate | 6.00 |
| Potassium chloride | 0.75 |
| pH | 7.24 |
| 삼투압 (mOsm) | 308 |
위와 같은 방법으로 준비된 정자를 두 개의 튜브로 20㎖씩 나눠서 옮긴 후, 한 튜브는 17℃에서 보관하였다. 다른 한 튜브는 -150℃의 액체질소 통에서 10분간 정치시킨 후 빼내어 37℃ 항온기에 옮겨 녹였다. 이와 같은 과정을 3회 반복하여 정자를 완전히 사멸시켰다. 이렇게 사멸된 정자는 17℃에서 10분간 보관되어 살아있는 정자와 온도를 같게 맞추었다. 살아있는 정자와 사멸된 정자를 각각 다음과 같은 비율로 혼합하였다.
| 살아있는 정자 | 10(5㎖) | 8(4㎖) | 6(3㎖) | 4(2㎖) | 2(1㎖) | 0(0㎖) |
| 사멸된 정자 | 0(0㎖) | 2(1㎖) | 4(2㎖) | 6(3㎖) | 8(4㎖) | 10(5㎖) |
96-Microwell (F96 MicroWellTM Plates, Nunc)에 MTT 10㎕(5㎎ MTT/PBS ㎖)를 넣고 위와 같이 비율을 맞춘 정자 100㎕를 넣었다.
첨가 직후, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 간격으로 용해액 (lysis buffer, 20% SDS, 50% Dimethylformamide)을 처리하여 정자 내에 축적된 포마잔이 고루 퍼지도록 한 후, 흡광계(uQuant, Wolf Laboratories)를 이용하여 560 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 1시간 간격의 측정시간 외에는 17℃에서 보관하여 정자의 활성을 높게 유지시켰다.
정자에 대한 MTT 환원 분석법의 효율성을 비교하기 위해서 동시에 비율에 맞춰 섞어 놓은 50 ㎕정자에 에오신, 니그로신 용액 50㎕을 섞고 30분간 실온에서 정치하였다. 정치시킨 용액의 8㎕를 슬라이드글라스에 도말 한 후 x400배 광학현미경으로 살아있는 무색의 정자와 죽은 분홍색 정자의 수를 임의로 최소 200개 이상 세어 생존율을 구하였다.
아래 그래프에서 확인할 수 있듯이, MTT 환원 분석 결과 각각의 비율에서 MTT 환원은 시간이 지나면서 증가하였다. 또한 죽은 정자의 비율이 증가할수록 MTT 환원율이 급격하게 낮아졌다. MTT 환원 분석의 효율성을 확인하기 위해서 각각 1시간 후와 4시간 후에 측정한 MTT 환원율과 에오신, 니그로신 염색법을 통해 측정한 정자 생존율 간의 관계를 나타낸 회귀곡선(y=1.7545x-0.1684 at 1hr, y=0.8268x-0.0804 at 4hr)이 얻어졌다.
<그림2> MTT 환원분석법으로 정자의 생존율 측정
| 희석비율 | MTT 실험 | 에오신 니그로신 염색 | |||||
| MTT흡광도 측정값 | 정자 생존율 | 정자 개수 | 정자 생존율 | ||||
| 1시간 후 | 4시간 후 | 1시간 후 | 4시간 후 | 살아있는 것 | 죽은 것 | ||
| 10:0 | 0.528 | 1.014 | 75.80% | 75.80% | 175 | 81 | 68% |
| 8:2 | 0.440 | 0.834 | 60.36% | 60.92% | 181 | 114 | 61% |
| 6:4 | 0.367 | 0.671 | 47.55% | 47.44% | 138 | 93 | 59% |
| 4:6 | 0.319 | 0.545 | 39.13% | 37.02% | 90 | 131 | 41% |
| 2:8 | 0.220 | 0.416 | 21.76% | 26.35% | 62 | 183 | 25% |
| 0:10 | 0.178 | 0.236 | 14.39% | 11.47% | 12 | 226 | 5% |
MTT 환원 기법으로 나온 결과를 에오신, 니그로신 염색법으로 나온 결과와 연관계수를 비교해 본 결과 1시간대에는 0.949248, 4시간대에는 0.956378로 유의적이라는 것을 알 수 있었다. 이는 MTT 환원 기법이 정자의 생존율을 측정하는데 효율적으로 쓰일 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
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실시예5
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본 실시예는 단세포전기영동법(Comet assay)을 통하여 MTT 환원 분석이 정자의 DNA에 미치는 손상 여부를 확인하고자 한 것으로, MTT 물질 처리와 생성되는 포마잔의 독성 여부 그리고 흡광계를 사용하여 발생할 수 있는 DNA 상의 손상 여부를 단세포전기영동법을 사용하여 측정한다.
단세포전기영동법은 MTT 환원 분석법으로 생존이 확인된 정자를 겔 속에 넣고 굳힌 후, 겔 속의 세포를 용해액 속에 넣어 용해시켜 핵단백질을 빠져나가게 하고 알칼리인 용액 상태에서 DNA 가닥을 푸는 것으로부터 시작되고, 이어서 전기영동을 한 뒤, DNA에 붙는 염색약을 통해 염색한 다음 현미경으로 관찰하는 분석법이다. 손상 입지 않은 정자는 기존의 핵 모양을 유지하며 손상 입은 정자의 DNA의 경우는 DNA의 음극이 외부로 노출되어 전기영동 시 양극 쪽으로 이동되어 원래의 핵 모양에서 벗어나 확장된 꼬리 모양을 하게 되기 때문에 확인이 가능하다.
살아있는 정자를 1x105세포/㎖의 농도로 PBS를 이용하여 희석하였다. 희석시킨 정자 40㎕와 MTT 10㎕(5㎎ MTT/PBS ㎖)를 섞고 4시간 동안 정치시켰다. 혼합된 용액을 단세포전기영동 겔(LMAgarose, TREVIGENⓡ) 500㎕와 섞고 슬라이드글라스(Comet슬라이드, TREVIGENⓡ)에 75㎕를 떨어뜨리고 4℃에서 1시간 굳혔다.
겔이 굳혀진 슬라이드를 용해액 속에 넣어 세포막을 용해시키고 핵단백질을 제거하였다. 용해 방법은 아래의 내용과 같다.
(가) 슬라이드를 50㎖ 용액(2.5M NaCl, 100mM N-EDTA, 10mM Tris(pH10),1% Triton X-100, 1% Lauryl Sarcosine)에 담가 4℃에서 하루 동안 정치시켰다.
(나) 슬라이드를 두 번째 용해액(2.5M NaCl, 5mM Tris(pH7.4), 0.5% Lauryl Sarcosine, 10ug/㎖ RNase A)으로 옮겨 37℃에서 4시간 정치시켰다.
(다) 슬라이드를 세 번째 용해액(Proteinase K 1㎎/㎖, 2.5M NaCl, 5mM Tris(pH10)에 옮겨 37℃에서 15시간 정치시켰다.
(라) 슬라이드를 마지막 용해액(1% β-mercaptoethanol solution, 2.5M NaCl)에 옮겨 실온에서 1시간 동안 정치시켰다.
용해 과정을 마친 슬라이드를 알칼리인 용액(NaOH 0.6g, 200mM EDTA 250㎕, H2O 49.75㎖)에 넣어 실온에서 한 시간 정치시켰다(DNA 이중나선 풀림). 알칼리인 전기영동 용액(NaOH 12g, 500mM EDTA 2㎖, 1L가 될 때까지 dH2O로 채움)에 20분간 정치시킨 후 전기영동(300mA, 150W, 16Volt, 1시간)시킨 후 슬라이드에 염색액 (Hoechst 33342) 75㎕를 떨어뜨리고 37℃에서 30분간 정치시킨 다음, 형광현미경(ZEISS, AXIOVERT200)으로 관찰하였다.
한편, 대조구로서 실험상에서 실제로 DNA에 손상 없어 DNA 끌림이 일어나지 않은 것을 확인하기 위해서 다른 슬라이드에 똑같이 희석된 정자 40㎕를 넣고 MTT 대신에 PBS를 동량 첨가시켰다. 알칼리인 용액에 넣고 난 후 알칼리인 전기영동 용액에 넣기 전에 30% 과산화수소수에 1시간 넣어 DNA에 손상을 임의적으로 준 것을 제외하고는 상기와 동일한 실험 과정을 반복하였다.
<그림 3> 과산화수소수로 처리한 정자의 DNA(좌)와 MTT로 처리한 정자의 DNA(우)
그림 3에서 보는 바와 같이 과산화수소수를 처리하여 임의적으로 DNA에 손상을 준 정자의 DNA에서는 확장된 끌림이 관찰되었으나, MTT를 처리한 정자의 DNA에는 끌림이 생기지 않은 것으로 보아 실시예4에서와 같은 MTT 처리가 DNA상의 손상을 야기하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
도 1은 FISH 분석 후 정자의 형광 현미경 관찰을 도시한 도면이다.
도 2는 y-probe로 표지된 y-sperm을 도시한 도면이다.
도 3은 x-probe로 표지된 x-sperm을 도시한 도면이다.
도 4는 세포질 내 정자주입(ICSI) 과정을 도시한 도면이다.
도 5는 ICSI 후 배발생 과정의 관찰을 도시한 도면이다.
<110> GACHON UNIVERSITY OF MEDICINE AND SCIENCE INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> Sorting of sperm through FISH/CISH and method for producing the
mammal having a specific sex
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for Chromosome 1
<400> 1
gttgcacttt cacggacgca gc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for Chromosome 1
<400> 2
ctagcccatt gctcgccata gc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for Chromosome Y
<400> 3
aatccaccat acctcatgga cc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for Chromosome Y
<400> 4
tttctcctgt atcctcctgc 20
Claims (19)
- ⑴ 포유동물의 수컷 종으로부터 정자 세포를 수집하는 단계;⑵ 상기 복수의 정자 세포를 ISH (In situ hybridization)분석을 이용하여 분류하는 단계;⑶ 상기 성 선별된 정자를 상기 포유동물의 난자의 세포질 내에 주입하여 인공수정시키는 단계; 및⑷ 목적하는 성별의 포유동물 산자 (産子)를 생산하는 단계; 를 포함함을 특징으로 하는, 특정 성별을 갖는 인간을 제외한 포유동물의 생산방법.
- 제1항에 있어서상기 성 선별된 정자의 생존률을 측정하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제2항에 있어서,상기 성 선별된 정자의 DNA 손상 여부를 확인하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제2항에 있어서,상기 생존률 측정은 MTT 환원분석을 사용하여 측정하는 단계임을 특징으로 하는 방법.
- 제 3항에 있어서,상기 DNA 손상여부 확인은 MTT 환원 분석법으로 생존이 확인된 정자를 겔 속에 넣고 굳힌 후, 겔 속의 세포를 용해액 속에 넣어 용해시킨 뒤, 전기영동을 한 다음, DNA 부착 염색을 하여 관찰함으로써 DNA 손상여부를 확인하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 ⑵단계는, ISH 분석이 FISH (Fluorescence in situ hybridization) 또는 CISH (Chromogenic in situ hybridization)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서,상기 ⑵단계는 CISH 분석을 통해 성별이 분류됨을 특징으로 하고, 상기 성별 의 분류에 있어 정자와 프로브의 비율을 8:2, 5:5, 2:8로 구성된 군으로부터 선택된 수정용 샘플을 만드는 단계와 샘플을 도포한 슬라이드를 씰링 (sealing)하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, ⑵단계는 정자 두부(頭部)의 첨체에 치우친 전방에서 프로브를 탐지하는 단계를 포함하는, 특정성별을 갖는 포유동물의 생산방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,상기 ⑴단계는 돼지, 소 및 말로 구성된 군으로부터 선택된 포유동물의 수컷 종으로부터 정자 세포를 수집하는 단계임을 특징으로 하는 특정성별을 갖는 포유동물의 생산방법.
- 원 정액으로부터 정자 용액을 제조하는 단계;상기 정자 용액에서 정자핵을 탈 응축시킨 후 변성시키는 단계;정자의 X- 또는 Y- 염색체에 특이적인 절편을 증폭하고, 상기 절편으로 표지한 프로브 (DNA-labelled probe)를 제작하는 단계;상기 변성된 정자와 상기 프로브를 혼성화시키는 단계;혼성화 후 대조염색하여 검출하는 단계;를 포함하는 정자의 성 선별방법.
- 제10항에 있어서,상기 정자는 돼지의 정자인 것을 특징으로 하고, 서열목록 1 및 서열목록 2를 갖는 1번 염색체 및 서열목록 3 및 서열목록 4를 갖는 Y-염색체에 특이적인 절편을 증폭함을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서,상기 대조염색은 DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindole) , FITC (fluorescein isothiocyanate), RHOD 중 어느 하나에 의해 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서,상기 정자핵의 탈 응축은 상기 정자용액을 슬라이드에 도포한 뒤 탈수 (dehydrate)하여 건조시킨 후 DTT 용액에 담가 37℃에서 15분 동안 배양시킴으로써 정자핵을 탈 응축시키는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 정자와 X- 또는 Y-염색체에 특이적인 서열을 갖는 비오틸레이티브 프로브 (biotinylated probe)를 같이 슬라이드 상에 배양함으로써 프로브를 변성시키는 단계;상기 슬라이드를 다시 배양하여, HRP-Streptavidin (Horseradish peroxidase-Streptavidin)과 반응시킨 후 세척한 다음 DAB (Diaminobenzidine)와 반응시키는 단계;헤마톡실린 (hematoxylin)으로 대조염색시켜 확인하는 단계;를 포함하는 정자의 성 선별방법.
- 제14항에 있어서,상기 프로브와 정자의 비율은 8:2, 5:5, 2:8로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서,상기 프로브와 정자의 비율은 1:1인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14항에 있어서,상기 프로브의 변성 단계는 고무시멘트 또는 테이프를 이용하는 것을 포함한 씰링 방법으로 슬라이드를 씰링하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서,상기 확인 단계는 정자 두부(頭部)의 첨체에 치우친 전방에서 프로브를 탐지하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항 내지 제18항에 중 어느 한 항에 있어서,상기 정자는 돼지, 소 및 말로 구성된 군으로부터 선택된 포유동물의 수컷 종으로부터 얻은 정자인 것을 특징으로 하는 방법.
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| KR1020070089220A KR100991168B1 (ko) | 2007-09-03 | 2007-09-03 | 정자의 성 선별방법 및 특정 성별을 갖는 포유동물의생산방법 |
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| KR (1) | KR100991168B1 (ko) |
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| KR20200113352A (ko) * | 2019-03-25 | 2020-10-07 | 중앙대학교 산학협력단 | 신규한 정액보존액을 이용한 암컷 수태율 증진방법 |
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2007
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