KR101360185B1

KR101360185B1 - 돼지 정액에서 ｍｔｔ 환원 분석을 통한 정자 생존율 측정및 단세포전기영동법에 의한 ｄｎａ 손상 여부 확인 방법

Info

Publication number: KR101360185B1
Application number: KR1020060076046A
Authority: KR
Inventors: 김대영; 황유진
Original assignee: 가천의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2006-08-11
Publication date: 2014-02-12
Also published as: KR20080014398A

Abstract

본 발명은 MTT 환원 분석법을 이용하여 돼지 정자의 생존율을 신속하고　정확하게 측정하는 방법과 단세포전기영동법을 이용하여 MTT 환원 분석 시 돼지 정자 DNA에 미칠 수 있는 손상 여부 측정 방법에 관한 것이다. 돼지 정액에서의 MTT 환원 분석은 살아있는 돼지 정자의 미토콘드리아 효소반응으로 인해 노란색의 MTT (3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)가 보라색의 포마잔 (formazan)으로 환원됨으로써 변화하는 흡광도의 차이를 분석하여 정자의 생존율을 측정한다.

단세포전기영동법은 손상 입은 DNA에 절단이 있을 경우 전기영동 시 핵 모양이 혜성 모양처럼 끌리는 현상을 관찰한다. 본 연구에서 발명한 MTT 환원 분석 방법을 돼지 정자 생존율 측정에 이용하면 기존의 방법인 정자를 염색하여 현미경으로 실험자가 직접 살아있는 정자를 세는 방법과 기계를 이용하여 측정하는 유체 세포측정법(flow cytometry)의 단점을 보안할 수 있다. 현재 돼지 정자에서의 MTT 환원 분석법의 효율성과 안정성에 대한 여부가 입증되지 않은 현실을 감안할 때 이번 방법의 발명은 이용 가치가 매우 높다.

돼지 정액, 환원 분석, DNA, 단세포전기영동법

Description

돼지 정액에서 ＭＴＴ 환원 분석을 통한 정자 생존율 측정 및 단세포전기영동법에 의한 ＤＮＡ 손상 여부 확인 방법{Survival rate of Pig Sperm by MTT Reduction Assay and DNA Damage by Single Cell Gel Electrophresis upon MTT Reduction Assay}

도 1은 살아있는 정자와 죽은 정자 비율과 시간에 따른 MTT 환원율을 도시한 그래프이다.

도 2는 MTT 1시간후와 에오신, 니그로신 생존율간 회귀 분석 상관관계를 도시한 그래프이다.

도 3은 MTT 4시간 후와 에오신, 니그로신 생존율간의 회귀분석 상관관계를 도시한 그래프이다.

도 4는 MTT 환원 처리한 돼지 정자 DNA를 도시한 도면이다.

도 5는 과산화수소수를 처리하여 DNA에 손상 입은 돼지 정자를 도시한 도면이다.

본 연구는 농림부 바이오장기 생산 연구사업의 연구비 (번호 200508020701) 지원을 받아 수행되었습니다.

본 발명은 정자의 생존율 측정과 정자 DNA의 손상 여부를 확인 할 수 있는 방법에 대한 것으로서 측정의 효율성과 안정성 검증 방법을 실험하는 것이다.

먼저 정자의 생존율을 측정하는 방법으로 현미경을 이용하여 실험자가 여러 종류의 염색을 통해 직접 세는 방법, 저삼투압 팽창검사(Hypo-Osmotic Swelling Test(HOST)), 컴퓨터 기반 정자 분석(Computer Assited Sperm Analysis(CASA)), 형광발색 세포 분리(Fluorescence Activated Cell Sorting(FACS))등이 있다.

현미경을 이용한 방법은 DNA에 살아있는 정자와 죽은 정자를 구분하여 염색할 수 있는 시약을 통해 염색한 후 현미경을 사용하여 관찰자가 직접 수를 파악하는 것이다. 현미경 사용에는 실험자의 주관이 많이 반영된다는 것, 측정할 수 있는 정자 수의 제한되어 있다는 것, 그리고 시간이 많이 걸리는 단점이 있다. 또한 정자 DNA에 직접 붙어서 발현하는 염색약을 사용하기 때문에 DNA에 직접적으로 영향을 미친다(McNiven et al.,1992).

저삼투압 팽창검사(Hypo-Osmotic Swelling Test(HOST)) 실험은 살아있는 정자는 저장액 조건에 노출 시키면 물이 세포막 안으로 주입되어 세포질이 부풀어 오르고 꼬리 부분이 꼬이게 된다. 최적의 농도와 시간이 많은 실험들에 의해서 확립 되었다(J.F. Fonseca1., 2005). 하지만 실험 동안에 정자가 저농도 조건에 있게 됨으로써 지속적으로 정자에 손상을 입힌다(Tsai YL., 1997).

컴퓨터 기반 정자 분석(Computer Assited Sperm Analysis(CASA))을 이용 방법은 정자의 운동성을 검사하기 위해 정자의 총수, 정자의 농도, 회전운동속도, 직선운동속도, 평균운동속도를 측정하며 정자의 형태적 이상여부는 정자 두부의 넓이, 길이, 폭 등과 정자 중편부의 넓이, 정자두부의 비대칭성 등을 판단한다(C.Arman et.al, Asian J Androl 2006; 8 (4): 411-418). 그렇지만 컴퓨터를 사용한 분석 방법으로 이용하기 위해서는 프로그램에 대한 지식이 있어야 하며 고가의 분석 기계가 있어야 한다.

그림 1. 컴퓨터 기반 정자 분석(Computer Assited Sperm Analysis(CASA))을 이용 형태학적 검사를 준비하는 정자

형광발색 세포 분리(Fluorescence Activated Cell Sorting(FACS))는 살아있는 정자와 죽은 정자를 각각 염색 할 수 있는 시약을 사용하여 염색한 후 노즐을 통해 정자를 흘리면서 전하를 걸어 염색 종류에 따른 전하량의 차이로 분리해 낼 수 있다. 기계를 사용하기 때문에 많은 양의 정자를 분석할 수 있으며 정확성이 입증 되었다(Cordelli E., 2005). 하지만 기계가 고가이며 기계를 다루는데 어려움이 많으며 결과를 분석하는 데에도 지식이 필요로 하기 때문에 쉽게 이용하기가 어렵다.

그림 2. 형광발색 세포 분리(Fluorescence Activated Cell Sorting(FACS)) (Becton Dickinson FACS VantageTM SE)

DNA의 손상을 측정하는 기술에는 중합효소연쇄반응법”(Polymerase Chain Reaction(PCR); 이하, PCR 이라고 함), 미예정 DNA 합성(Unscheduled DNA Synthesis(UDS); 이하, UDS 라고 함)방법 등이 사용되어 왔다.

PCR법은 손상 입은 DNA를 증폭 시킨 후 전기 영동 하였을 경우 손상 입지 않았을 경우 한 밴드만 나와야 할 것이 절편이 생겨서 여러 개의 밴드가 생기는 것으로 확인 할 수 있다(San Gabriel M., 2006) 하지만 DNA 추출, 증폭, 전기영동까지의 과정이 시간이 많이 걸린다는 단점이 있다.

UDS 기술은 분명한 종류의 DNA 손상의 절제 복구 동안 DNA 복제에 기초를 두고 있다. 이 방법은 각각의 세포 수준에 정보를 제공하지만 자외선을 사용하기 때문에 민감성이 떨어진다(R.R.Tice., 2000)

본 발명의 목적은 기존의 돼지 정자 생존율 측정 방법들의 단점인 주관이 많 이 기인한다는 것, DNA에 직접적인 손상을 준다는 것, 기계를 사용하기 때문에 실험이 복잡하며 고가의 장비를 사용해야 한다는 것 등의 문제점을 극복하기 위해서 MTT 환원 반응 실험으로 시간을 줄이고 값이 싸며 정확한 생존율 측정 방법을 제공하려는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 MTT 환원 반응 실험에 의한 소, 말, 닭, 사람에 정자 생존율에 대한 연구는 진행되었으나 돼지 정자에 대한 연구는 진행되어 있지 않기 때문에 MTT 환원 반응 분석으로 돼지 정자에 대한 생존율 측정 방법을 확립하려는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 방법이 정자의 DNA에 손상을 주는지 검사함에 있어 기존의 복잡한 과정과 장시간이 소요되는 단점을 극복시키기 위해서 단세포전기영동법을 도입하여 빠르고 간편하며 정확하게 측정하고자 하는데 있다.

본 발명의 일견지에 의하면,

돼지 정액에 3-(4,5-디메틸 티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT); 이하 MTT라 함)를 첨가하는 제1 단계; 및

돼지 정액으로부터 흡광도의 차이를 측정하는 제2 단계; 를 포함하여 이루어지는 돼지 정자 생존율 측정을 위한 MTT 환원 분석법이 제공된다.

본 발명의 제2견지에 의하면,

상기 일견지에 의해 얻어진 생존이 확인된 돼지 정자가 제공된다.

본 발명의 제3견지에 의하면,

돼지 정자에 대한 DNA 손상 여부를 측정함에 있어서,

상기 돼지 정자는 제1항 내지 제4항중 어느 한항에 의한 MTT 환원 분석법을 통해 생존이 확인된 제5항의 돼지 정자이며, 그리고

상기 DNA 손상 여부 측정은 단세포전기영동법에 의해 수행됨을 특징으로 하는 돼지 정자의 DNA 손상 여부 측정 방법이 제공된다.

본 발명의 제4견지에 의하면,

상기 제3견지에 의한 단세포전기영동법으로 DNA 손상 여부가 확인된 돼지 정자가 제공된다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명은 정액에 MTT를 첨가하여 살아있는 정자의 중편에 있는 미토콘드리아의 효소 작용으로 환원 반응이 일어나 보라색의 포마잔이 생성되면서 변하게 되는 흡광도의 차이를 흡광계로 측정하여 정자의 생존율을 조사하는 것이다. 살아있는 정자가 많을수록 포마잔이 더 많이 생성되므로 흡광도가 더 높아지게 되므로 흡광도를 측정함으로써 정자의 생존율을 측정한다.

MTT 물질 처리와 생성되는 포마잔의 독성 여부 그리고 흡광계를 사용하여 발생할 수 있는 DNA 상의 손상 여부를 단세포전기영동법을 사용하여 측정한다. 단세포전기영동법은 MTT 환원 분석법으로 생존이 확인된 정자를 겔 속에 넣고 굳힌다. 겔 속의 세포를 용해 액 속에 넣어 용해시켜 핵 단백질을 빠져나가게 하고 알칼리인 용액 상태에서 DNA 가닥을 푼다. 이어서 전기영동을 하고 DNA에 붙는 염색약을 통해 염색하고 현미경으로 관찰한다.

손상 입지 않은 정자는 기존의 핵 모양을 유지하며 손상 입은 정자의 DNA의 경우는 DNA의 음극이 외부로 노출되어 전기영동 시 양극 쪽으로 이동되어 원래의 핵 모양에서 벗어나 확장된 꼬리 모양을 하게 되어 확인이 가능하다.

이하, 본 발명의 실시예를 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로 본 발명을 이에 한정하려는 것은 아니다.

<실시예 1>

본 실시예는 MTT 환원분석법으로 돼지 정자의 생존율을 측정하고자 한 것이다.

인공 수정 센터에서 공급받은 정자를 800g로 10분간 17℃에서 원심분리하였다(L. Fraser et al. 2005). 아래층에 생긴 펠렛을 남기고 상층액을 버린 후 남은 펠렛을 인산염 완충 식염수 (Phosphate Buffered Saline; PBS(이하, PBS 라함), NaCl 10.00g/L+KCl 0.24g/L+Na₂HPO₄ 1.44g/L+KH₂PO₄ 0.25g/L)로 부유하여 세정하는 것을 3회 반복하였다.

세정한 정자의 최종 농도가 30x10⁶개/ml가 되도록 BTS로 부유한다. 여기에 쓰이는 BTS의 조성은 다음과 같다(Kim, I. C. et al., 2002).

BTS 조성

BTS 조성	용량 (g/L)
Glucose	37.00
Sodium hydrogen bicarbonate	1.25
EDTA	1.25
Sodium citrate	6.00
Potassium chloride	0.75
pH	7.24
삼투압 (mOsm)	308

위와 같은 방법으로 준비된 정자를 두 개의 튜브로 20ml씩 나눠서 옮긴 후, 한 튜브는 17℃에서 보관하였다. 다른 한 튜브는 -150℃의 액체질소 통에서 10분간 정치 시킨 후 빼내어 37℃ 항온기에 옮겨 녹였다. 이와 같은 과정을 3회 반복하여 정자를 완전히 사멸시켰다. 이렇게 사멸된 정자는 17℃에서 10분간 보관되어 살아있는 정자와 온도를 같게 맞추었다. 살아있는 정자와 사멸된 정자를 각각 다음과 같은 비율로 혼합하였다.

살아있는 정자와 사멸 정자의 혼합 비율

살아있는 정자	10(5mL)	8(4mL)	6(3mL)	4(2mL)	2(1mL)	0(0mL)
사멸된 정자	0(0mL)	2(1mL)	4(2mL)	6(3mL)	8(4mL)	10(5mL)

96-마이크로웰 (F96 MicroWell^TMPlates, Nunc)에 MTT 10ul(5mg MTT/PBS ml)를 넣고 위와 같이 비율을 맞춘 정자 100ul를 넣었다. 첨가 직후, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 간격으로 용해액(lysis buffer, 20% 황산도데실나트륨(sodium dodecyl sulfate(SDS); 이하, SDS 라함, 디메틸포름아미드(dimethylformamide(DMF); 이하 DMF라함)을 처리하여 정자 내에 축적된 포마잔이 고루 퍼지도록 한 후, 흡광계(uQuant, Wolf Laboratories)를 이용하여 560nm에서의 흡광도를 측정하였다. 1시간 간격의 측정시간 외에는 17℃에서 보관하여 정자의 활성을 높게 유지시켰다.

돼지 정자에 대한 MTT 환원 분석법에 효율성을 비교하기 위해서 동시에 비율에 맞게 섞어 놓은 50ul정자에 에오신, 니그로신 용액 50ul을 섞고 30분간 실온에서 정치하였다. 정치 시킨 용액의 8ul를 슬라이드글라스에 도말 한 후 x400배 광학현미경으로 살아있는 무색의 정자와 죽은 분홍색 정자의 수를 임의로 최소 200개 이상 세어 생존율을 구하였다.

도 1의 그래프에서 확인할 수 있듯이, MTT 환원 분석 결과 각각의 비율에서 MTT 환원은 시간이 지나면서 증가하였다. 또한 죽은 정자의 비율이 증가할수록 MTT 환원율이 급격하게 낮아졌다. MTT 환원 분석의 효율성을 확인하기 위해서 각각 1시간 후와 4시간 후에 측정한 MTT 환원율과 에오신, 니그로신 염색법을 통해 측정한 정자 생존율 간의 관계를 나타낸 회귀곡선(y=1.7545x-0.1684 at 1h, y=0.8268x-0.0804 at 4h)이 얻어졌다.

MTT와 에오신, 니그로신 염색을 통한 결과값의 분석

희석비율	MTT 실험				에오신 니그로신 염색
	MTT흡광도 측정값		정자 생존율		정자 개수		정자 생존율
	1시간 후	4시간 후	1시간 후	4시간 후	살아있는 것	죽은 것	정자 생존율
10:0	0.528	1.014	75.80%	75.80%	175	81	68%
8:2	0.440	0.834	60.36%	60.92%	181	114	61%
6:4	0.367	0.671	47.55%	47.44%	138	93	59%
4:6	0.319	0.545	39.13%	37.02%	90	131	41%
2:8	0.220	0.416	21.76%	26.35%	62	183	25%
0:10	0.178	0.236	14.39%	11.47%	12	226	5%

MTT 환원 기법으로 나온 결과를 에오신, 니그로신 염색법으로 나온 결과와 연관계수를 비교해 본 결과 1시간대에는 0.949248, 4시간 대에는 0.956378로 유의 하다는 것을 알 수 있었다. 이는 MTT 환원 기법이 돼지 정자의 생존율을 측정하는데 효율적으로 쓰일 수 있다는 것을 나타내는 것이다.

<실시예 2>

본 실시예는 MTT 환원 분석 후에 DNA 상에 손상 여부 측정을 위해서 단세포전기영동법을 시행한 것이다.

살아있는 정자를 1x10⁵세포/ml로 PBS를 이용하여 희석하였다. 희석 시킨 정자를 40ul와 MTT 10ul(5mg MTT/PBS ml)를 섞고 4시간 동안 정치시켰다. 이 혼합된 용액을 단세포전기영동 겔(LMAgarose, TREVIGEN^ⓡ 500ul와 섞고 슬라이드글라스(Cometslide, TREVIGEN^ⓡ에 75ul를 떨어뜨리고 4℃에서 1시간 굳혔다. 겔이 굳혀진 슬라이드를 용해액 속에 넣어 세포막을 용해 시키고 핵 단백질을 제거하였다. 용해 방법은 슬라이드를 50ml 용액(2.5M NaCl, 100mM N-EDTA, 10mM 하이드록시메틸(hydroxymethyl(Tris) 이하 Tris 라함; pH10), 1% 트리톤 X-100(Triton X-100), 1% 라우릴 사코신 (Lauryl Sarcosine))에 담가 4도에서 하루 동안 정치시켰다.

슬라이드를 두 번째 용해액(2.5M NaCl, 5mM Tris(pH7.4), 0.5% 라우릴 사코신, 10ug/ml RNA 분해효소 (RNase A; 이하 RNase A라함)으로 옮겨 37℃에서 4시간 정치시켰다. 슬라이드를 세 번째 용해액(프로테아제 K(Proteinase K) 1mg/ml, 2.5M NaCl, 5mM Tris(pH10)에 옮겨 37℃에서 15시간 정치시켰다. 슬라이드를 마지막 용해액(1% β-머캅토에탄올 (β-mercaptoethanol solution), 2.5M NaCl)에 옮겨 실온에서 1시간동안 정치시켰다. 용해 과정을 마친 슬라이드를 알칼리인 용액(NaOH 0.6g, 200mM EDTA 250ul, H₂O 49.75ml)에 넣어 실온에서 한 시간 정치시켜 DNA 이중나선을 풀고 알칼리인 전기영동 용액(NaOH 12g, 500mM EDTA 2ml, 1L가 될 때까지 dH₂O로 채움)에 20분간 정치 시킨 후 전기영동(300mA, 150W, 16Volt, 1시간) 시켰다. 전기영동 후 슬라이드를 염색액(Hoechst 33342) 75ul를 떨어뜨리고 37도에서 30분간 정치시킨 후 형광현미경(ZEISS, AXIOVERT200)으로 관찰하였다.

한편, 대조구로서 실험상에서 실제로 DNA에 손상 없어 DNA 끌림이 일어나지 않은 것을 확인하기 위해서 다른 슬라이드에 똑같이 희석된 정자 40ul를 넣고 MTT 대신에 PBS를 동량 첨가시켰다. 알칼리인 용액에 넣고 난 후 알칼리인 전기영동 용액에 넣기 전에 30% 과산화수소수에 1시간 넣어 DNA에 손상을 임의적으로 준 것을 제외하고는 상기와 동일한 실험 과정을 반복하였다.

그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 과산화수소수를 처리하여 임의적으로 DNA에 손상을 준 정자의 DNA에서는 확장된 끌림이 관찰되었으나 도 4에서 MTT를 처리한 정자의 DNA에는 끌림이 생기지 않은 것으로 보아 실시예 1에서와 같은 MTT 처리가 DNA 상의 손상을 야기하지 않는 것을 확인할 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의하면 정자의 효소작용을 이용하여 정액과 MTT만을 섞어 흡광도를 단순 측정하는 것에 의해 돼지 정자의 생존율을 신속하게 파악할 수 있다. 즉, 돼지 정자의 생존율을 측정하는데 신속하고 비싸지 않으며 간단하므로 돼지 정자의 생존율을 이용한 수정에 크게 기여할 것으로 기대된다.

또한 다른 기존의 생존율 측정 방법에서의 DNA 손상 여부와는 달리 MTT 처리에서는 DNA 상에 손상을 주지 않기 때문에 안정성에서 향상된 방법으로 많은 사용이 기대된다.

Claims

(a) 돼지의 정액을 원심분리한 후 상층액을 버리고 침전물을 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)로 부유하여 세정하는 단계;

(b) 상기 (a)단계 에서 세정된 정자의 최종 농도가 30x10⁶개/ml가 되도록 부유시킨 정액에 3-(4,5-디메틸 티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT))를 첨가하는 단계;

(c) 상기 3-(4,5-디메틸 티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 첨가 돼지 정액에 용해액(Lysis buffer)을 처리하는 단계; 및

(d) 상기 돼지 정액으로부터 흡광도의 차이를 측정하는 단계;를 포함하여 이루어지는 돼지 정자 생존율 측정을 위한 MTT 환원 분석법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 (a)단계의 부유시 포도당 37.00g/L, 탄산수소나트륨 1.25g/L, EDTA 1.25g/L, 시트르산 나트륨 6.00g/L, 및 염화칼륨 0.75g/L으로 이루어지며, 그 pH는 7.24인 BTS 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 돼지 정자 생존율 측정을 위한 MTT 환원 분석법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 용해액은 20% 황산도데실나트륨(sodium dodecyl sulfate(SDS)), 50% 디메틸포름아미드(dimethylformamide(DMF))를 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지 정자 생존율 측정을 위한 MTT 환원 분석법.
삭제
삭제
(a) 돼지 정자를 겔 속에 넣고 굳히는 단계;

(b) 겔 속의 세포를 용해액 속에 넣고 용해시켜 핵 단백질을 빠져나가게 하는 단계;

(c) 상기 용해 과정을 마친 세포를 NaOH 0.6g, 200mM EDTA 250μL, 물 49.75mL를 포함하는 알칼리 용액에 넣어, 세포에서 빠져나온 핵 속의 DNA 가닥을 푸는 단계; 및

(d) 상기 DNA에 대하여 전기 영동을 수행하고, DNA를 염색하여 현미경으로 관찰하는 단계: 를 포함하는, 돼지 정자의 DNA 손상 여부 측정 방법.
제7항에 있어서, 상기 용해액으로는 2.5M NaCl, 100mM N-EDTA, pH10의 10mM 하이드록시메틸(hydroxymethyl(Tris)), 1% 트리톤 X-100(Triton X-100), 1% 라우릴 사코신(Lauryl Sarcosine)으로된 50ml 용액과; 2.5M NaCl, pH7.4의 5mM 하이드록시메틸, 0.5% 라우릴 사코신(Lauryl Sarcosine), 10ug/ml RNA 분해효소 A(RNase A)으로 된 용액과; 단백질분해효소 K(Proteinase K) 1mg/ml, 2.5M NaCl, 5mM pH10의 하이드록시메틸로된 용액의 3가지 용액을 순차적으로 사용하는 것을 특징으로 하는, 돼지 정자의 DNA 손상 여부 측정 방법.
삭제
제7항에 있어서, 상기 전기영동은 알칼리인 전기영동 용액으로서 NaOH 12g, 500mM EDTA 2ml, 1L가 될 때까지 dH₂O로 채운 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 돼지 정자의 DNA 손상 여부 측정 방법.
삭제