KR100949923B1 - 번식능력이 불량한 수퇘지 선별법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 정자의 CTC (chlortetracycline)염색에 의한 정자의 생사 여부 및 두부 막 변화상태를 관찰하여 돼지 정자의 산자 생산능력을 예측하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 체외에서 정자의 CTC 염색을 통한 정자의 두부 막 변화 상태의 검사를 통하여, 염색된 정자의 패턴에 따라 Dead, Live-Non capacitated, Live capacitated 및 Acrsome reaction으로 상태를 분류하고, 수정능획득 (Live capacitated)이 일어난 생존 정자의 비율과 산자수 사이의 상관관계가 높음을 이용하여 돼지 정자의 산자 수를 예측하여 번식성적이 불량한 수퇘지를 구별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 방법에 의하여 돼지 정자가 8두 미만의 산자 및 10두 이상의 산자의 생산능력을 가짐을 보다 정확하게 예측할 수 있어, 번식능력이 불량한 수퇘지를 구별할 수 있게 된다.
돼지, 정자, CTC (chlortetracycline) 염색, 산자수
Description
본 발명은 정자의 CTC 염색에 의한 정자의 생사여부 및 두부 막 변화상태를 관찰하여 돼지의 산자 수 생산에 있어 번식성적이 불량한 개체를 보다 정확하게 예측하는 방법에 관한 것이다.
돼지 인공수정은 양돈시장에서 개량을 촉진시키기 위한 수단이며, 번식성적 향상, 경영비용 절감, 노동력 감소, 질병전파 방지의 목적을 가지며 지난 15년간 그 이용률이 약 3배 이상 상승하였다. 그러나 이용실적에 비해 성적이 저조하며, 특히 번식성적에 대한 결과가 매우 변이가 크며, 인공수정의 양적인 보급률은 급속 증가하였으나, 효율적 이용과 개량을 위한 효과적 활용이 미흡한 실정이다. 양적인 보급률에만 치중된 발달에 의해 센터에서 판매되는 정액의 품질에 대한 불만으로 인해 농가에서는 자연종부를 시키는 빈도가 늘어나고 있다. 따라서 인공수정의 효율적 이용과 효과적 활용을 위해 우수한 품질의 정액 확보가 시급한 문제로 대두되 고 있다.
그러나 기존의 품질 검사를 위한 방법중 가장 보편적으로 사용되고 있는 정자의 운동성 검사는 그 방법이 매우 주관적이며 정확도를 기대하기 어려운 현실이다. 실험실적 방법인 체외수정이나, 햄스터 난자를 이용한 정자의 난자 침투력 검사는 민감도가 높은 방법이나 과정이 매우 복잡하고 기술이 까다로우며, 비용과 시간이 많이 소모되는 검사법으로 일부 전문가나 특정 기관만이 시행하기 적합하다. 따라서 현재 열악한 돼지 인공수정센터에서는 일상적인 방법으로 이용하기에 제한점이 크다. 그러므로 간단히 시행할 수 있는 주관적인 검사만으로 품질검사를 수행하여 생산, 판매되고 있으며, 평가방법의 부재로 인한 정자의 품질이 떨어지는 정액을 생산하여도 확인할 방법이 없다.
따라서 신속, 정확하고 가시적으로 번식능력이 불량한 개체를 검사할 수 있는 정자의 기능적 검사 방법이 매우 필요한 실정이다.
또한 인공수정시 정자의 수정능력의 예측은 개체의 번식효율에 있어 매우 중요하다 (Gadea, 2005). 정자의 운동성 검사는 정자의 형태적, 기능적인 정상범주를 확인하는 좋은 지표이나, 운동성과 수정능 사이의 관련성은 명확하지 않다 (Galli et al., 1988; ; Selles et al., 2003). 또한 정자 운동성 검사는 가장 쉽게 정자를 평가할 수 있으나, 정자의 능력에 관한 관련성을 입증하기는 어렵다 (Darszon et al., 2007). CASA는 돼지를 포함한 다양한 종에서 정자의 운동성을 측정하는 파라미터를 가지고 정자의 운동성을 평가하는데 이용되고 있다 (Holt et al., 1997). 또한 Vizcarra 와 Ford (2006)는 정자 운동성 평가가 수정능획득 상태를 평가하는 것이 아니라, 전체적인 기능을 보여준다고 보고했다.
수정능획득과 연속적인 첨체 반응은 정자의 정상 수정에 있어서 필수적이며, CTC 염색방법은 돼지 정자를 포함한 수많은 종에서 수정능획득 상태의 정자를 관찰하는데 성공적으로 사용되어 왔다 (Mattioli et al., 1996). 또한 Collin 등 (2000)은 CTC 패턴이 동결보존된 소 정액의 수정능과 관련이 있다고 보고한 바 있다.
이에 본 발명자는 수퇘지에서, 정자 수정능획득 상태 및 생체 내 수태율 사이의 관계에 대한 연구를 계속한 결과, 정자의 CTC 염색을 이용한 정자의 두부 막 변화 검사를 이용하여 염색된 정자의 패턴에 따라 Dead, F (Live-Non capacitated), B (Live capacitated) 그리고 AR (Acrsome reaction)로 분류하고, 수정능획득 (Live capacitated; B)이 일어난 정자의 비율과 산자수 사이의 상관관계가 높음을 이용하여, 낮은 산자수 예측 범위를 설정하였으며 이러한 결과를 이용하여 수정능력이 불량한 개체를 예측하는 기술을 고안하였다.
이러한 본 발명의 연구는 대한민국 경기도 "GRRC"에 의해 지원되었다.
REFERENCES
1. Gadea J. Sperm factors related to in vitro and in vivo porcine fertility. Theriogenology 2005;63:431-44.
2. Galli, A. & Bosisio, M. (1988) Quality of semen stored at +15/16 8C is related to fertility of artificially inseminated swine. Theriogenology 30,p.1185-1190
3. Selles, E., Gadea, J., Romar, R., Matas, C. & Ruiz, S. (2003) Analysis of in vitro fertilizing capacity to evaluate the freezing procedures of boar semen and to predict the subsequent fertility. Reprod. Domest. Anim. 38,p.66-72
4. Darszon A, Trevino CL, Wood C, Galindo B, Rodriguez-Miranda E, Acevedo JJ, Hernandez-Gonzalez EO, Beltran C, Martinez-Lopez P, Nishigaki T. 2007. Ion channels in sperm motility and capacitation. Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 2007;65:229-44
5. Holt, C., Holt, W. V. & Moore, H. D. (1997) Reed HC, Curnock RM. Objectively measured boar sperm motility parameters correlate with the outcomes of on-farm inseminations: results of two fertility trials. J. Androl. 18,p.312-323
6. Vizcarra, J. A. & Ford, J. J. (2006) Validation of the sperm mobility assay in boars and stallions. Theriogenology. 15;66(5):1091-7.
7. Mattioli, M., Barboni, B., Lucidi, P & Seren, E. (1996) Identification of capacitation in boar spermatozoa by chlortetracycline staining. Theriogenology 45,p.373-318
8. Collin, S., Sirard. M. A., Dufour, M. & Bailey, J. L. (2000) Sperm calcium levels and chlortetracline fluorescence patterns are related to the in vivo fertility of cryopreserved bovine semen. J. Androl. 21.p.938-943
본 발명의 목적은 번식성적이 불량한 수퇘지를 선별하는 방법을 제공하는데 있다. 보다 구체적으로 정자 막에 염색되어 형광으로 발광하는 CTC 염색을 이용, 염색된 정자의 패턴을 관찰하여 체외에서 돼지 정자의 산자 생산능력을 예측함으로써 번식능력이 불량한 수퇘지를 선별하는 방법의 제공을 목적으로 한다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 정자의 CTC 염색을 통하여 정자의 생사여부 및 정자의 수정 전 형태적 변화를 관찰함으로써 염색된 정자의 패턴에 따라 수정능획득이 일어난 정자의 비율을 이용하여 돼지 정자의 산자 생산능력을 예측하여 정자 또는 수퇘지의 번식능력을 예측하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명은 수퇘지로부터 채취한 정액 시료로부터 얻은 정자세포를 H33258 용액에 첨가하여 배양하는 제1단계; 과잉 염색을 제거하는 제2단계; 상층액을 제거하고, 다시 현탁한 후 CTC 용액을 첨가하여 염색하는 제3단계; 상기 염색된 정자의 두부 막 변화 상태에 따라 패턴을 분류하여 돼지 정자의 산자 수를 예측하는 제4단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 정자 또는 수퇘지의 번식능력을 예측하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 제1단계의 정자세포는 2x106cells/ml의 농도로 희석된 것임을 특징으로 한다. 또한 더욱 바람직하게는 39℃에서 10분 동안 빛을 차단한 수조 (light shield water bath)에서 배양됨을 특징으로 한다. 또한 바람직하게는 상기 CTC (chlortetracycline)염색에 있어, CTC를 첨가한 뒤 20초후에, 글루탈알데히드 (glutaraldehyde)를 첨가하여 염색반응을 정지시킨다.
본 발명에 있어서, 상기 제4단계는 관찰된 정자 중 수정능이 획득된 생존 정자 (Live/capacitated spermatozoa)가 35% 초과이면 10두 이상의 많은 산자 생산능력을 가지는 수퇘지 또는 정자인 것으로 예측하고,관찰된 정자 중 수정능이 획득된 생존 정자가 30% 이하이면 8두 미만 적은 산자 생산능력을 가지는 수퇘지 또는 정자인 것으로 예측할 수 있다. 즉, 본 발명은 상기와 같은 예측을 통하여 보다 정확하게 정자 또는 수퇘지의 번식능력을 예측함으로써 번식능력이 불량한 수퇘지를 선별하는 방법에 관한 것이다.
상기와 같이 본 발명은 체외에서 정자의 CTC 염색법을 통하여 정자의 생사여부 및 정자의 수정전 생리적 변화를 관찰하여, 수정능이 획득된 (capacitated) 정 자의 비율을 이용하여 돼지 정자의 산자 생산능력이 불량한 개체를 보다 정확하게 예측할 수 있다. 따라서 이를 이용하여 번식능력이 불량한 개체를 용이하게 예측할 수 있게 되는 효과가 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
실험예
1. 정자 운동학 분석
(1) 정자의 준비
듀록 수컷으로부터 사출된 정액 샘플을 사용하였다. 샘플은 gloved hand technique으로 1 주 간격 (weekly interval)으로 채취되었고, 면 거즈 (cotton gauze)로 필터하여 25℃로 예열된 플라스크에 담았다. 모든 정액은 80%이상의 운동성을 보여주었다. 수컷의 정액 샘플은 BTS (Beltsville thawing solution)용액으로 희석되었고, 17도에서 보관되었다.
(2) 정자 운동성 분석
정자 운동성 분석은 sperm analyzer (SAIS plus Version 10.1, Medical Supply, Korea)프로그램을 이용한 컴퓨터를 사용하여 평가되었다. 분석을 위하여 시료 (2 X 106 cells/ml) 10μl를 Makler counting chamber (Makler, Israel)에 두고, 채워진 챔버를 38.5 ℃ 가열된 스테이지 위에 올린 후, 위상차현미경에서 10 배 대물렌즈를 사용하여 SAIS software program에 의하여 분석하였다.
실험예
2 정자의
두부막
분석
-
CTC
염색에 의한
정자막의
형광분석 (
Combined
Hoechst
33258/
chlortetracycline
fluorescence
assessment
of
spermatozoa
)
정액 시료(2 X 106cells/ml) 135 μL 를 H33258 용액 (150 μM/l in D-PBS phosphate buffered saline) 15 μL에 첨가하여, 39℃에서 10 분간 빛을 차단한 수조(light shield water bath)에서 배양하였다.
과잉 염색은 PBS에 대한 2% (w/v) 폴리비닐피롤리딘 (polyvinylpyrolidone) 250 μL을 첨가한 후, 400 X g 로 10분간 원심분리 후 상층액을 제거한 다음 펠렛은 PBS 700 μL 에서 다시 현탁하였다. 상기 용액 500 μL는 신선하게 준비된 CTC(chlortetracycline) 용액 (750 μM CTC in 5ml buffer: 20 μM Tris, 130 μM NaCl, 5μM cystein) 500 μL에 첨가되었다. 20초 후에 1M 트리스 완충용액에 대한 12.5% (v/v) 글루타르알데히드 (glutaraldehyde) 10uL 을 첨가하여 반응을 정지시키고 정자의 염색된 패턴을 관찰, 분석하였다. 염색 후 24시간 이내에 평가 완료하 여야 하며, 보관하는 동안의 온도는 4℃를 유지하였다.
시료는 H33258 및 CTC 각각에 대하여 UV BP 340-380/LP 425 및 BP 450-490/LP 515 excitation/suppression 필터를 사용하여 에피플루오레센스 조명 하에서 Nikon microphot-FXA로 관찰하였다.
또한 관찰된 정자는 다음과 같이 분류하였다.
D- pattern (dead, 정자 두부가 밝은 파란 형광을 띄는 경우)
F- pattern (live/noncapacitated, 정자의 적도 부분에 더 강한 형광띠가 있거나 없으며, 정자 두부 전체 표면에 균일하게 밝은 초록 형광이 도포되는 경우)
B- pattern (live/ capacitated, 첨체 부위 위, 적도면 윗부분에 초록 형광 및 적도면 아래 부분이 흑색인 경우)
AR - pattern (live arcrosome reacted, 정자 두부 위에 반상무늬 초록형광, 적도면 아랫부분에 초록 형광 또는 두부에 형광이 없는 경우)
정자의 형태 관찰 및 분석시 샘플당 두 개의 슬라이드가 평가되었고, 상기 슬라이드당 최소한 200개의 정자를 평가하였다.
통계분석
통계분석은 통계 소프트웨어 프로그램 SPSS 버전 12.0 (USA)을 사용하여 수행되었다. 피어슨 상관 계수는 정자 운동학, 수정능획득상태 및 수퇘지 생체 내 수정능사이의 관계를 결정하기 위하여 계산되었다.
실험결과
1. 표 1은 산자수와 정자의 기능을 분석한 정액변수 (정자 수, 운동성 등) 사이의 상관관계를 나타낸 것으로, 산자수는 F 패턴과 부의 상관관계를 가지며 (r = -0.481; p < 0.05), B 패턴과 SFI (Sperm fertility index)와는 양의 상관관계를 가진다 (r = 0.751, r = 0.726; p < 0.01).
본 연구에 포함된 변수 중에서 산자 수와 B-패턴의 정자 (live/capacitated spermatozoa)와의 관련성에 있어 가장 높은 유의성을 가지고 상관관계를 나타내었다.
정자 운동학, 수정능획득 상태 및 수퇘지 생체 내 수정능의 상관관계
2. 도 1을 참고하면, 도 1은 정자의 두부를 CTC 염색하여 구분된 네 개의 패턴 중 B-패턴 (Live-Capacitated spermatozoa)에 대한, 많은 산자수의 하한점의 결정을 나타낸 것이다. 많은 산자수의 하한점은 B-패턴≥35%를 기준으로 10 보다 크거나 같다 (≥10)로 결정되었다.
또한 표 2는 B-패턴 (Live-Capacitated spermatozoa)과 많은 산자 수 사이의 상관관계를 나타낸다. B-패턴 (Live-Capacitated spermatozoa)이 35% 초과일 때, 10마리 이상의 많은 산자 수의 산자 생산능력을 가질 확률이 높음을 예측할 수 있다.
| litter size ≥10 | litter size <10 | |
| B pattern >35% (n=9) | 6 | 3 |
| B pattern ≤35% (n=15) | 1 | 14 |
| sensitivity | 86% | |
| specificity | 82% | |
| predictive positive value | 67% | |
| predictive negative value | 93% | |
| overall accuracy | 83% | |
B-패턴과 산자 수 사이의 관련성을 평가하는데 있어서 네 개의 중요 요소들이 검사의 질을 평가하는데 관여하는데, 그것은 민감도, 정확도, 양성 예측치, 그리고 음성 예측치이다 (Evans et al., 2002)
민감도 (Sensitivity)는 비율을 결정하는 것이다. 그 비율은 적은 수 혹은 많은 수의 산자를 생산할 수 있는 모든 수컷을 정확하게 확인될 수 있다. 정확도 (Specificity)는 진짜 음성 수컷들의 비율이 테스트를 해서 음성으로 얼마의 비율이 나오는 가를 결정하는 것이다. 양성 테스트 결과를 가지고 있는 모든 수컷들 중에서, 적은 수 혹은 많은 수의 산자 수를 실제로 가지고 있는 비율 또한 중요한데, 이것인 양성 예측치 (positive predictive value)이다. 음성 예측치 (negative predictive value)는 실제로 적은 수 혹은 많은 수의 산자를 가지고 있는 음성 테스트 결과를 가진 수컷들의 비율을 말한다.
상기 표 2에서, Sensitivity는 10마리 미만의 산자수를 기록한 개체 중 93%가 B-패턴 35% 이하로 나타냈음을 뜻하며, specificity는 10마리 이상의 산자수를 기록한 개체 중 67%가 B-패턴 35% 이상으로 나타낸 것을 보여주고 있으며, 이 방법을 통하여 B-패턴 35% 이하일 때 10마리 미만의 산자 생산 능력을 가진 개체의 예측률은 86% 이며, B-패턴 35% 이상일 때 10마리 이상의 산자 생산능력을 가진 개체의 예측률은 82% 이다.
따라서 상기 표 3과 같이 10마리 미만의 산자 수를 가진 수컷들 중에서 93%가 B-패턴≤35%라는 사실이 중요한 바, 10마리 이상의 산자 수의 예측에 대한 전체적인 정확도는 83% 임을 확인할 수 있었다.
3. 또한 도 2를 참고하면, 도 2는 CTC 염색의 B-패턴 (Live-Capacitated spermatozoa)에 대한, 보통 산자 수의 하한(lower limit)의 결정을 나타낸 것이다. 보통 산자 수의 하한점은 B-패턴≤30%를 기준으로 8보다 크거나 같다(≥8)로 정의되었다.
또한 표 3은 B-패턴 (Live-Capacitated spermatozoa)과 보통 산자 수 사이의 상관관계를 나타낸다. B-패턴 (Live-Capacitated spermatozoa, LC)이 30% 이하일 때, 8마리 미만의 적은 산자 수의 산자 생산능력을 가질 확률이 높음을 예측할 수 있다.
| litter size < 8 | litter size ≥8 | |
| B pattern ≤30%(n=9) | 7 | 2 |
| B pattern ＞30%(n=15) | 0 | 15 |
| sensitivity | 100% | |
| specificity | 88% | |
| predictive positive value | 78% | |
| predictive negative value | 100% | |
| overall accuracy | 92% | |
CTC 염색에서 B-패턴의 정상 범위를 결정하기 위하여, 도 2로부터 B-패턴 30%가 하한으로 확립되었다.
상기 표 3은 CTC 염색에서 양성 숫자(score) (B-패턴≤30%)는 8마리 미만의 적은 산자 수에 대하여 높게 예측되는 것을 보여준다. B-패턴≤30%를 가진 수퇘지 중 100%가 8마리보다 적은 산자를 생산하였다. 반대로, B-패턴>30%를 가진 수퇘지 중, 88%가 8마리 또는 그 이상의 산자를 생산하였다. 따라서 8마리 미만의 산자 수의 예측에 대한 전체적인 정확도는 92%임을 확인할 수 있었다.
결론
상기한 바와 같이 본 연구에서 포함된 모든 변수 중에서, 산자 수는 유의적으로 B-패턴과 관련이 있음을 확인하였다 (표 1 참고).
본 연구에서 행해진 관찰결과에서 B-패턴을 보이는 (Live-Capacitated spermatozoa) 정자의 확률이 산자 수와 강한 상관관계가 있음을 추정할 수 있다. 특히 최적화된 CTC 염색에서 정상 산자 수의 범위를 결정하기 위하여, 8마리 미만 산자수에 대해서 B-패턴≤30%가, 10마리 이상 산자 수에 대해서는 B-패턴>30%가 기준으로 확정되었다. 전체적인 정확도는 각각 83%, 92% 이었다. 그러므로 본 방법을 이용하여 산자 수가 적은 수퇘지를 효과적으로 선별하므로 번식력 혹은 수태성이 불량한 수퇘지를 92%의 정확성을 가지고 선별할 수 있게 된다.
상술한 바와 같이 본 발명에 방법에 의하여 돼지 정자의 산자 생산능력을 체외에서 간편하고 경제적으로 정확하게 예측할 수 있어, 번식능력이 불량한 수퇘지를 구별할 수 있게 된다.
도 1은 정자의 두부를 CTC 염색하여 구분된 네 개의 패턴 중 B-패턴 (Live-Capacitated spermatozoa)에 대한, 많은 산자 수의 하한점의 결정을 나타낸 것이다.
도 2는 CTC 염색의 B-패턴 (Live-Capacitated spermatozoa)에 대한 정상 산자 수의 하한(lower limit)의 결정을 나타낸 것이다.
Claims (5)
- 수퇘지로부터 채취한 정액 시료로부터 얻은 정자세포를 H33258 용액에 첨가하여 배양하는 제1단계; 과잉 염색을 제거하는 제2단계; 상층액을 제거하고, 다시 현탁한 후 CTC (chlortetracycline) 용액을 첨가하여 염색하는 제3단계; 및 상기 염색된 정자의 생사여부 및 정자의 두부 막 변화상태를 관찰하여 돼지 정자의 산자수를 예측하는 제4단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 정자 또는 수퇘지의 번식능력을 예측하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1단계의 정자세포는 2x106cells/ml의 농도로 희석된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1단계는 39℃에서 10분 동안 빛을 차단한 수조 (light shield water bath)에서 배양됨을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제3단계는 CTC를 첨가한 뒤 20초후에, 글루탈알데히드 (glutaraldehyde)를 첨가하여 염색반응을 정지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제4단계는 관찰된 정자 중 수정능이 획득된 생존 정자 (Live/capacitated spermatozoa)가 35% 초과이면 10두 이상의 많은 산자 생산능력을 가지는 수퇘지 또는 정자인 것으로 예측하고, 관찰된 정자 중 수정능이 획득된 생존 정자가 30% 이하이면 8두 미만 적은 산자 생산능력을 가지는 수퇘지 또는 정자인 것으로 예측함을 특징으로 하는 방법.
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- 2008-04-21 KR KR1020080036830A patent/KR100949923B1/ko not_active IP Right Cessation
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