JP2511445B2 - 豚のｙ―精子の検定方法 - Google Patents
豚のｙ―精子の検定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は豚の精液からＹ染色体を有する精子（以下Ｙ
−精子と呼ぶ）を選択的に染色してＹ−精子を検定する
方法、殊に精液からＹ−精子とＸ染色体を有する精子
（以下Ｘ−精子と呼ぶ）とを分離した場合、その分離程
度を検定する方法に関する。
−精子と呼ぶ）を選択的に染色してＹ−精子を検定する
方法、殊に精液からＹ−精子とＸ染色体を有する精子
（以下Ｘ−精子と呼ぶ）とを分離した場合、その分離程
度を検定する方法に関する。
更に具体的には、本発明は蛍光色素のキナクリンマス
タードを用いてＹ−精子を特異的に染色することにより
Ｘ−精子とＹ−精子とを区別し、両者の分離程度を検定
するための方法に関する。本発明による蛍光染色法によ
って識別したＸ−精子またはＹ−精子を人工授精や体外
授精などの繁殖手段に利用することにより所望の性の産
仔を得ることができる。
タードを用いてＹ−精子を特異的に染色することにより
Ｘ−精子とＹ−精子とを区別し、両者の分離程度を検定
するための方法に関する。本発明による蛍光染色法によ
って識別したＸ−精子またはＹ−精子を人工授精や体外
授精などの繁殖手段に利用することにより所望の性の産
仔を得ることができる。
家畜繁殖の分野で雌雄の生み分けが出来ればその効果
は極めて大であって、例えば酪農においては雄は不要で
あり、縦牝豚を取り扱う業者でも雄は必要がない。また
純粋な縦牡豚や優良種牡牛を取り扱う業者は雌を必要と
しない。しかしながら自然の状態の家畜の繁殖では雄と
雌の出産の確率はそれぞれ1/2で上記のような要求には
出産した個体数の半分しか合致しない。そこで人工的に
雌雄を生み分ける方法が求められるのである。
は極めて大であって、例えば酪農においては雄は不要で
あり、縦牝豚を取り扱う業者でも雄は必要がない。また
純粋な縦牡豚や優良種牡牛を取り扱う業者は雌を必要と
しない。しかしながら自然の状態の家畜の繁殖では雄と
雌の出産の確率はそれぞれ1/2で上記のような要求には
出産した個体数の半分しか合致しない。そこで人工的に
雌雄を生み分ける方法が求められるのである。
ところで性を決定する因子は性染色体であることが知
られている。Ｙ−精子とＸ染色体を有する卵子との結合
により性染色体がXYである子が、またＸ−精子とＸ染色
体を有する卵子との結合により性染色体がXXである子が
生まれる。このように雌雄の性決定は精子がＹ染色体を
有するか、Ｘ染色体を有するかにかかることになる。そ
こで精子中の性染色体がＹまたはＸのみのものを分別す
る手法によって雌雄を生み分けることが原理的には可能
である。
られている。Ｙ−精子とＸ染色体を有する卵子との結合
により性染色体がXYである子が、またＸ−精子とＸ染色
体を有する卵子との結合により性染色体がXXである子が
生まれる。このように雌雄の性決定は精子がＹ染色体を
有するか、Ｘ染色体を有するかにかかることになる。そ
こで精子中の性染色体がＹまたはＸのみのものを分別す
る手法によって雌雄を生み分けることが原理的には可能
である。
そしてこの精子中の性染色体がＹまたはＸのものを分
別するためにはＹまたはＸ染色体の質量差に基づく比重
の差による分別手段が提案されている。これまでに、ヒ
ト、牛では精液に生理食塩水を加え希釈、混和、遠心分
離を繰返して洗浄した精子にパーコール（Percoll）密
度勾配遠心法を適用してＸ−精子とＹ−精子との分離に
成功している。
別するためにはＹまたはＸ染色体の質量差に基づく比重
の差による分別手段が提案されている。これまでに、ヒ
ト、牛では精液に生理食塩水を加え希釈、混和、遠心分
離を繰返して洗浄した精子にパーコール（Percoll）密
度勾配遠心法を適用してＸ−精子とＹ−精子との分離に
成功している。
また豚については特開昭63−217270号公報記載の発明
のように、精液を予め特定の手段で洗浄し、これを上記
と同様にパーコール密度勾配遠心法により分別してＸ−
精子とＹ−精子とに分離することができる。
のように、精液を予め特定の手段で洗浄し、これを上記
と同様にパーコール密度勾配遠心法により分別してＸ−
精子とＹ−精子とに分離することができる。
しかしながら、これらのＸ−精子とＹ−精子との分離
方法において、その分離程度を確実にかつ簡単に検定す
る方法が必要となる。
方法において、その分離程度を確実にかつ簡単に検定す
る方法が必要となる。
このためにはＹ−精子のみを特異的に染色する染料の
使用が考慮される。
使用が考慮される。
ところでＹ染色体の長腕部の中心から離れた領域にお
いてキナクリン（キナクリン塩酸塩）で染まる部分すな
わちＦ−体（Ｆ−body）が存在しこれはヒトおよびゴリ
ラのリンパ球の染色体標本では知られている（Nature V
ol 231.,June 4,（1971）326〜329頁）。またヒト精子
ではキナクリンマスタードで染色されたものがＦ−体と
視認されており（Nature Vol 226.,June 6,（1970）961
〜962頁）。さらに牛の精子についてもキナクリンで蛍
光染色できることも知られている（特開昭60−114137
号）。
いてキナクリン（キナクリン塩酸塩）で染まる部分すな
わちＦ−体（Ｆ−body）が存在しこれはヒトおよびゴリ
ラのリンパ球の染色体標本では知られている（Nature V
ol 231.,June 4,（1971）326〜329頁）。またヒト精子
ではキナクリンマスタードで染色されたものがＦ−体と
視認されており（Nature Vol 226.,June 6,（1970）961
〜962頁）。さらに牛の精子についてもキナクリンで蛍
光染色できることも知られている（特開昭60−114137
号）。
そこで豚についても精子を分離してＸ−精子とＹ−精
子を得る場合、その分離の程度の検定のためにＹ−精子
の蛍光染料による染色を行うことが考慮されるが、豚の
精液中には大量の夾雑物が存在するためＹ−精子の蛍光
染色方法を適用することができなかった。
子を得る場合、その分離の程度の検定のためにＹ−精子
の蛍光染料による染色を行うことが考慮されるが、豚の
精液中には大量の夾雑物が存在するためＹ−精子の蛍光
染色方法を適用することができなかった。
ところが本発明者らは、豚の精子をそれとほぼ同じ浸
透圧を有し精子の細胞膜を通過することのない媒体と共
に遠心分離に付し、リン酸塩緩衝液で洗浄し、次いでプ
ロテアーゼで処理することによってＹ−精子をキナクリ
ンマスタードによって染色しうることを見出して本発明
を完成した。
透圧を有し精子の細胞膜を通過することのない媒体と共
に遠心分離に付し、リン酸塩緩衝液で洗浄し、次いでプ
ロテアーゼで処理することによってＹ−精子をキナクリ
ンマスタードによって染色しうることを見出して本発明
を完成した。
豚の精液中には夾雑物が大量に含まれているために最
初にそれを除去する必要がある。それには豚の精液とほ
ぼ同じ浸透圧を有し、精子の細胞膜を通過することのな
い媒体で処理する。そのような媒体としてはショ糖とエ
ピクロルヒドリンを共重合した水溶性の合成高分子、ま
たはポリビニルピロリドンの被膜を有するコロイド状シ
リカを含有する溶液がある。前者はファルマシア社から
商品名フィコールとして、後者は同じくファルマシア社
から商品名パーコールとして市販されている。また例え
ばフィコール400の商品名で知られたファルマシア社製
の製品であるショ糖とエピクロルヒドリンとの水溶性の
共重合物質とジアトリゾエートナトリウムとの混合物
（溶液100ml中にフィコール400を5.7gと、ジアトリゾエ
ートナトリウムを9g含有する）すなわちフィコールパッ
ク（Ficoll−Paque）も好ましい媒体である。このよう
な浸透圧が制御されていて精子の細胞膜を通過すること
のない媒体を用い豚の精液と共に遠心分離器中で遠心分
離操作処理に付し、精液中の夾雑物を取り除き、かくし
て得られた精子を含む上層部についてこれを上記のリン
酸塩緩衝液に加えて遠心処理に付し、上澄部を廃棄し、
そして必要に応じてこのリン酸塩緩衝液による処理を２
〜５回程度繰り返し、このようにして得られるリン酸塩
緩衝液で処理した精子についてプロテアーゼを含有する
溶液を加えて37℃程度の温度に10〜20分間保持した場合
については同様にこの精子は容易にキナクリンマスター
ドにより染色されうることを見出した。
初にそれを除去する必要がある。それには豚の精液とほ
ぼ同じ浸透圧を有し、精子の細胞膜を通過することのな
い媒体で処理する。そのような媒体としてはショ糖とエ
ピクロルヒドリンを共重合した水溶性の合成高分子、ま
たはポリビニルピロリドンの被膜を有するコロイド状シ
リカを含有する溶液がある。前者はファルマシア社から
商品名フィコールとして、後者は同じくファルマシア社
から商品名パーコールとして市販されている。また例え
ばフィコール400の商品名で知られたファルマシア社製
の製品であるショ糖とエピクロルヒドリンとの水溶性の
共重合物質とジアトリゾエートナトリウムとの混合物
（溶液100ml中にフィコール400を5.7gと、ジアトリゾエ
ートナトリウムを9g含有する）すなわちフィコールパッ
ク（Ficoll−Paque）も好ましい媒体である。このよう
な浸透圧が制御されていて精子の細胞膜を通過すること
のない媒体を用い豚の精液と共に遠心分離器中で遠心分
離操作処理に付し、精液中の夾雑物を取り除き、かくし
て得られた精子を含む上層部についてこれを上記のリン
酸塩緩衝液に加えて遠心処理に付し、上澄部を廃棄し、
そして必要に応じてこのリン酸塩緩衝液による処理を２
〜５回程度繰り返し、このようにして得られるリン酸塩
緩衝液で処理した精子についてプロテアーゼを含有する
溶液を加えて37℃程度の温度に10〜20分間保持した場合
については同様にこの精子は容易にキナクリンマスター
ドにより染色されうることを見出した。
このように染色された精子については、蛍光顕微鏡で
検鏡することにより染色されたＦ−体を観察することが
でき、そしてこの染色されたＦ−体の数をカウントする
ことによってＹ−精子の数を知ることができるのであ
る。
検鏡することにより染色されたＦ−体を観察することが
でき、そしてこの染色されたＦ−体の数をカウントする
ことによってＹ−精子の数を知ることができるのであ
る。
本発明の方法において精液の洗浄に用いられるリン酸
塩緩衝液としては、リンゲル液、ロック液、タイロード
液、ハンクス液、ダルベッコ液などの生理的リン酸塩類
溶液が挙げられる。これらのリン酸塩類溶液の使用量は
洗浄目的が達成される限りにおいていかなる量で用いて
もよいが、通常は１回の遠心分離処理当たり精子を含む
分画の１容量当たり１〜５倍容量、通常は２〜３倍容量
で用いられる。
塩緩衝液としては、リンゲル液、ロック液、タイロード
液、ハンクス液、ダルベッコ液などの生理的リン酸塩類
溶液が挙げられる。これらのリン酸塩類溶液の使用量は
洗浄目的が達成される限りにおいていかなる量で用いて
もよいが、通常は１回の遠心分離処理当たり精子を含む
分画の１容量当たり１〜５倍容量、通常は２〜３倍容量
で用いられる。
本発明の方法で使用されるプロテアーゼとしては、至
適pHが中性域にある動物由来、植物由来および微生物由
来のプロテアーゼのいずれもが用い得られ、そしてこれ
らプロテアーゼの具体例としてはディスパーゼ、パパイ
ン、トリプシン、キモトリプシン、アクチナーゼ、プロ
ネースなどが挙げられる。そしてこれらのプロテアーゼ
中でディスパーゼが殊に好ましく用いられる。
適pHが中性域にある動物由来、植物由来および微生物由
来のプロテアーゼのいずれもが用い得られ、そしてこれ
らプロテアーゼの具体例としてはディスパーゼ、パパイ
ン、トリプシン、キモトリプシン、アクチナーゼ、プロ
ネースなどが挙げられる。そしてこれらのプロテアーゼ
中でディスパーゼが殊に好ましく用いられる。
キナクリンマスタードによる染色はリン酸塩緩衝液中
に0.0025〜0.0050％程度の量で溶解させたキナクリンマ
スタード溶液を用いて行われる。この溶液の少量を染色
しようとする精子に加え、20〜35℃で100〜180分程度振
盪しながら保持することによって行われる。
に0.0025〜0.0050％程度の量で溶解させたキナクリンマ
スタード溶液を用いて行われる。この溶液の少量を染色
しようとする精子に加え、20〜35℃で100〜180分程度振
盪しながら保持することによって行われる。
このようにして本方法によってはＹ−精子とＸ−精子
を分離する前の精子混合物についてその中に存在するＹ
−精子を検定することができるのは勿論であるが、Ｙ−
精子とＸ−精子とを分離する技術における分離程度を検
定するための方法として本方法は殊に有用である。すな
わち、種々の分離手段によって分離したＹ−精子とＸ−
精子とについて、その分離程度の検定は人工授精や体外
授精による繁殖手段における産仔の好ましい性のコント
ロールのために必須であって、この方法はそのための有
用な手段を提供するものである。
を分離する前の精子混合物についてその中に存在するＹ
−精子を検定することができるのは勿論であるが、Ｙ−
精子とＸ−精子とを分離する技術における分離程度を検
定するための方法として本方法は殊に有用である。すな
わち、種々の分離手段によって分離したＹ−精子とＸ−
精子とについて、その分離程度の検定は人工授精や体外
授精による繁殖手段における産仔の好ましい性のコント
ロールのために必須であって、この方法はそのための有
用な手段を提供するものである。
以下に実施例によってこの発明を更に詳細に説明す
る。
る。
実施例 フィコールパック3mlを遠沈管に取り、その上に4mlの
豚の精液を重層した。200Gで５分間遠心分離後精子を含
む上層をパスツールピペットで採取し、これにダルベッ
コのリン酸塩緩衝液を２〜３倍量（容量）加え、混和後
80Gで10分間遠心分離し上清を除いた。
豚の精液を重層した。200Gで５分間遠心分離後精子を含
む上層をパスツールピペットで採取し、これにダルベッ
コのリン酸塩緩衝液を２〜３倍量（容量）加え、混和後
80Gで10分間遠心分離し上清を除いた。
残った精子塊に３〜4mlのダルベッコのリン酸塩緩衝
液を加え同様の遠心分離処理をさらに２回繰返した。
液を加え同様の遠心分離処理をさらに２回繰返した。
このように洗浄した精子塊についてパーコール（Perc
oll）密度勾配遠心法によりＸ−精子とＹ−精子の分離
を行いその分離程度を検定した。その手順は次の通りで
ある。
oll）密度勾配遠心法によりＸ−精子とＹ−精子の分離
を行いその分離程度を検定した。その手順は次の通りで
ある。
１）パーコール液の調製 Ham F12液に、パーコールを32、38、50、60、65、70
および75％の濃度になるように加えて溶液を作り、HEPE
S bufferでpH7.4に調整後、ミリポアフィルター（0.45
μｍ）で濾過滅菌した。
および75％の濃度になるように加えて溶液を作り、HEPE
S bufferでpH7.4に調整後、ミリポアフィルター（0.45
μｍ）で濾過滅菌した。
２）パーコール液、精液の重層 プラスチック製試験管に熱した注射針（18G）を用い
て各パーコール層の界面の位置に穴をあけ、粘着テープ
で封じる。
て各パーコール層の界面の位置に穴をあけ、粘着テープ
で封じる。
この試験管にパーコール液を75、70、65、60、50、3
8、32％の順に0.7mlずつ積層した後、洗浄した精子懸濁
液1.4mlを重層した。
8、32％の順に0.7mlずつ積層した後、洗浄した精子懸濁
液1.4mlを重層した。
３）分画の採取 上記プラスチック製試験管を250Gで５〜20分間遠心分
離した後、各密度界面にあらかじめ設けた小孔から注射
針を挿入して各分画に存在する精子を採取した。
離した後、各密度界面にあらかじめ設けた小孔から注射
針を挿入して各分画に存在する精子を採取した。
４）精子の酵素処理 各々の分画に存在する精子の懸濁液（約５×107精子/
ml）0.1mlにプロテアーゼ液（Dispase三光純薬製、4000
P.u./ml）0.1mlを加え37℃で10分間保持した。
ml）0.1mlにプロテアーゼ液（Dispase三光純薬製、4000
P.u./ml）0.1mlを加え37℃で10分間保持した。
５）染 色 プロテアーゼ液で処理した夫々の分画の精子懸濁液に
ダルベッコのリン酸塩緩衝液中に0.0025％の濃度で溶解
したキナクリンマスタード溶液を0.2ml加え、20〜25℃
で100分間振盪しながら保持した。
ダルベッコのリン酸塩緩衝液中に0.0025％の濃度で溶解
したキナクリンマスタード溶液を0.2ml加え、20〜25℃
で100分間振盪しながら保持した。
６）Ｘ−精子、Ｙ−精子の分離の検定 上記のように各分画の精子をキナクリンマスタードで
染色したものについて、Ｘ−精子（Ｆ−body陰性）とＹ
−精子（Ｆ−body陽性）の割合を調べた。結果を次の表
で示す。
染色したものについて、Ｘ−精子（Ｆ−body陰性）とＹ
−精子（Ｆ−body陽性）の割合を調べた。結果を次の表
で示す。
次いで夫々の分画の精子を用いて人工授精を行った結
果、Ｆ−body72％のＹ精子分画を用いた群では雄21頭、
雌９頭の子豚が得られ、Ｆ−body7.9％のＸ−精子分画
を用いた群では雄３頭、雌20頭が得られた。
果、Ｆ−body72％のＹ精子分画を用いた群では雄21頭、
雌９頭の子豚が得られ、Ｆ−body7.9％のＸ−精子分画
を用いた群では雄３頭、雌20頭が得られた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭53−56381（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−114137（ＪＰ，Ａ) 丹羽太左衛門、「最新・家畜の人工受 精」、初版（昭和45年３月15日）、明文 書房，Ｐ．266−271 Ｎａｔｕｒｅ，226，（1970），Ｐ. 961−962
Claims (1)
- 【請求項１】豚の精液を、それとほぼ同じ浸透圧を有
し、精子の細胞膜を通過することのない媒体と共に遠心
分離に付し、リン酸塩緩衝液で洗浄し、次いでプロテア
ーゼで処理したものについて、キナクリンマスタードで
Ｙ−精子を染色し、Ｙ−精子のＦ−体を視認することを
特徴とするＹ−精子の検定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62050350A JP2511445B2 (ja) | 1987-03-06 | 1987-03-06 | 豚のｙ―精子の検定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62050350A JP2511445B2 (ja) | 1987-03-06 | 1987-03-06 | 豚のｙ―精子の検定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63217269A JPS63217269A (ja) | 1988-09-09 |
| JP2511445B2 true JP2511445B2 (ja) | 1996-06-26 |
Family
ID=12856462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62050350A Expired - Fee Related JP2511445B2 (ja) | 1987-03-06 | 1987-03-06 | 豚のｙ―精子の検定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2511445B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100949923B1 (ko) | 2008-04-21 | 2010-03-30 | 중앙대학교 산학협력단 | 번식능력이 불량한 수퇘지 선별법 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103822816B (zh) * | 2013-12-16 | 2015-12-30 | 内蒙古赛科星繁育生物技术（集团）股份有限公司 | 使用荧光染料fitc与mito鉴定混合精子的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1088025A (en) * | 1976-10-20 | 1980-10-21 | Bhairab C. Bhattacharya | Thermal convection counter streaming sedimentation and forced convection galvanization method and apparatus for controlling the sex of mammalian offspring |
-
1987
- 1987-03-06 JP JP62050350A patent/JP2511445B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｎａｔｕｒｅ，２２６，（１９７０），Ｐ．９６１−９６２ |
| 丹羽太左衛門、「最新・家畜の人工受精」、初版（昭和４５年３月１５日）、明文書房，Ｐ．２６６−２７１ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100949923B1 (ko) | 2008-04-21 | 2010-03-30 | 중앙대학교 산학협력단 | 번식능력이 불량한 수퇘지 선별법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63217269A (ja) | 1988-09-09 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |