CN114377117A

CN114377117A - 一种口服1型糖尿病疫苗及其制备方法

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Publication number: CN114377117A
Application number: CN202111513522.8A
Authority: CN
Inventors: 孙静; 马春丽; 王欣怡; 赵修涛; 胡云章; 李建芳; 乌美妮; 施建东; 李彦涵
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2021-12-06
Filing date: 2021-12-06
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2041-12-06
Also published as: CN114377117B

Abstract

本发明涉及一种口服1型糖尿病疫苗及其制备方法，将人源性GAD65_1‑585氨基酸序列通过乳酸菌密码子偏爱优化后5^’端引入NcoI的酶切位点，3’端引入XbaI的酶切位点，合成插入pNZ8148载体，构建重组质粒GAD65_1‑585‑pNZ8148；将阳性质粒电转化进入NZ9000乳酸菌菌株构建成GAD65乳酸菌疫苗菌株，用50ng/mL的Nisin进行诱导GAD65菌株表达融合蛋白。本发明将重组乳酸菌疫苗口服免疫非肥胖糖尿病小鼠，刺激产生针对GAD65的特异性抗体，并可激活体内调节性T细胞增殖从而诱导免疫耐受，并降低血糖水平，从而达到预防和治疗1型糖尿病的目的，改变传统药物治疗存在的诸多不足。

Description

一种口服1型糖尿病疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种口服1型糖尿病疫苗及其制备方法。

背景技术

1型糖尿病(type 1diabetes mellitus，T1 DM)又称为自身免疫性糖尿病，是由包括病毒感染、药物接触、遗传因素及自身免疫在内的各种原因引起的由激活的T淋巴细胞介导的一系列自身免疫反应所引起的选择性胰岛β细胞破坏甚至功能衰竭，导致体内胰岛素缺乏进行性加重以及慢性高血糖，依赖终身注射胰岛素控制血糖。自1921年Best和Banting发现胰岛素以来，皮下注射胰岛素一直是治疗T1 DM的最主要手段。近年来随着胰岛素缓释泵技术及基因工程改造的长效胰岛素的广泛应用，T1 DM患者的血糖较以往得到了更有效的控制。但由于通过此类方法产生的胰岛素释放不受血糖调控，或者血糖释放不符合生理节律等，患者的血糖往往波动较大，且容易引起低血糖晕厥，并且外源性胰岛素的注射容易引起心脑血管等部位的并发症。而且经济成本高、具有潜在的副作用，给患者带来了巨大的负担。治疗1型糖尿病的终极目标是抑制自身免疫性攻击并避免全身性副作用，同时促进胰岛再生和修复。但现有治疗方法，无论胰岛移植还是胰岛素，都无法实现这一目的。因此使用免疫手段调控自身免疫系统引发免疫耐受可成为预防并治疗1型糖尿病的创新手段。

GAD是谷氨酸代谢中γ-氨基丁酸的限速酶。谷氨酸脱羧酶(GAD65)是谷氨酸脱羧酶的异构体(65kD)，由585个氨基酸残基组成，是T1 DM中一个重要的自身抗原，超过65％的T1 DM患者在确诊时体内有GAD65自身抗体。人体内出现GAD65抗体后有相当大一部分人最终会发展成T1 DM。GAD65包含了许多不同的抗原表位，GAD_206-220、GAD_286-300、GAD_290-309、GAD_509-528、GAD_524-543、GAD_546-554抗原表位肽段或其特异性T细胞克隆能减轻自身免疫性胰岛炎，降低发病率，是预防1型糖尿病的保护性表位。近年来，无论是在动物模型还是人类的研究中，应用GAD65肽、GAD65蛋白对T1 DM进行预防和治疗，均显示GAD65可以成功地诱导机体的免疫耐受，降低T1 DM的发病率。重塑机体免疫系统对自身抗原的特异性免疫耐受是治疗1型糖尿病的最为理想的治疗策略，而诱导抗原特异性Tregs是T1 DM疫苗研究成功的关键。

然而目前处于临床研究的T1 DM疫苗多为单抗原疫苗，而T1 DM的自身抗体的表达水平不会一成不变，会受它们识别的抗原表位、自身抗原的水平、抗体表达的调控基因等多个因素的变化影响。50％～70％的T1 DM在初诊时可存在自身抗体阳性，随着病程进展，阳性率会逐渐降低。因此，携带多个目标抗原或者是辅助抗原，拓宽疫苗的保护谱，是糖尿病疫苗优化设计的一种策略。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种口服1型糖尿病疫苗及其制备方法，使疫苗免疫机体后，诱导机体产生针对GAD65的特异性抗体，同时诱导机体产生免疫耐受，诱导产生Treg细胞，降低血糖，从而达到预防和治疗1型糖尿病的目的。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种口服1型糖尿病疫苗的制备方法，包括如下步骤：

将表达人源性GAD65全长氨基酸的基因通过乳酸菌密码子偏爱优化后的GAD65_1-585氨基酸序列插入pNZ8148载体构成GAD65_1-585-pNZ8148重组质粒，然后转化至MC1061感受态细胞中进行扩增后提取质粒，筛选阳性质粒转入NZ9000乳酸菌菌株构建成GAD65乳酸菌疫苗菌株，对得到的GAD65乳酸菌疫苗菌株扩增后，用Nisin进行诱导乳酸菌表达蛋白。

进一步，优选的是，表达人源性GAD65全长氨基酸的基因通过乳酸菌密码子偏爱优化后的GAD65_1-585序列末尾加上6HIS标签，形成的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中，优化后的GAD65_1-585核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述的6HIS标签的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

进一步，优选的是，将通优化后的GAD65_1-585氨基酸序列插入pNZ8148载体构成重组GAD65_1-585-pNZ8148重组质粒的具体方法为：

将GAD65_1-585序列5’端引入NcoI的酶切位点、3’端引入XbaI的酶切位点，之后将引入NcoI的酶切位点、XbaI酶切位点的GAD65_1-585序列与pNZ8148载体采用NcoI酶、XbaI酶进行双酶切，之后T4酶连接过夜，构建重组质粒GAD65_1-585-pNZ8148。

酶切体系：2μL pNZ8148质粒、1μL NcoI酶、1μL XbaI酶、2μL BSA、2μL 10XBuffer、12μL水，共20μL，37℃酶切两小时，按DNA片段纯化的操作用小量胶回收试剂盒回收酶切产物；

GAD65_1-585片段与pNZ8148载体的连接，GAD65_1-585片段与EcoRI和XhoI双酶切电泳后的胶回收所得的PNZ8148载体片段进行连接，其连接反应体系为：3μL GAD65_1-585片段、1μLPNZ8148载体片段、2μL 10X Buffer、1μL T4 DNA连接酶、13μL水，共20μL，4℃连接12小时。

进一步，优选的是，将GAD65_1-585-pNZ8148重组质粒转化至MC1061感受态细胞中进行扩增后提取质粒，其具体方法为：

将GAD65_1-585-pNZ8148重组质粒转化MC1061感受态细胞，涂布在含氯霉素的LB固体培养基平板，37℃倒置培养过夜，挑取LB固体培养基平板中的单菌落至装有5ml含氯霉素的LB液体培养基的试管中，于恒温摇床过夜培养，次日将该5mL菌液接种400mL含氯霉素的LB液体培养基，于恒温摇床过夜培养，次日收获菌液，用质粒大量抽提试剂盒(promega)从克隆扩增收获的菌液中提取GAD65_1-585-pNZ8148重组质粒。

进一步，优选的是，恒温摇床的温度为37℃，转速为150rpm/min。

进一步，优选的是，筛选阳性质粒转入NZ9000乳酸菌菌株的具体方法为：

A、将1μL质粒与40μL感受态细胞NZ9000均匀混合，转入冰浴的0.2cm电转化杯中；

B、设置电击参数2000V、25μF、200Ω，然后将转化杯置于电击槽中电击；

C、电击后立即加入1mL GMMC恢复培养基，冰浴5min后转入1.5mL Enpendof管中，置于30℃恢复培养2h；

D、取恢复菌液铺于含氯霉素的GM培养平板上，涂100μL于平板上，待菌液吸收完全后，于30℃下静止培养36h待转化子出现；

E、挑取阳性克隆接种于5mL M17+0.5g/100mL glucose+10μg/mLchloramphenicol培养液的试管中扩增，用250μL甘油+750μL菌液制成甘油菌，冻存于-20℃保存待用。

进一步，优选的是，用Nisin进行诱导表达融合蛋白的具体方法为：

(1)挑取阳性克隆接种于5mL M17+0.5g/100mLglucose+10μg/mLchloramphenicol培养液的试管中，30℃过夜培养；

(2)次日按菌液：M17+0.5％glucose+10μg/mL chloramphenicol培养液为1:25比例接种于200mL M17+0.5％glucose+10μg/mL chloramphenicol培养液中，30℃培养至菌体OD600为0.4；

(3)向培养物中加入Nisin至终浓度为50ng/mL，30℃培养4h，诱导融合蛋白表达；

(4)将诱导表达成功的GAD65乳酸菌疫苗菌液4℃、8000rpm离心30min，收集沉淀稀释到1×10¹⁰pfu/mL，置于-20℃储存待用。

本发明同时提供上述口服1型糖尿病疫苗的制备方法制得的口服1型糖尿病疫苗。

本发明还提供上述口服1型糖尿病疫苗的制备方法制得的GAD65重组乳酸菌疫苗。

本发明另外提供上述GAD65重组乳酸菌疫苗在制备1型糖尿病疫苗中的应用。

本发明利用乳酸菌作为疫苗载体构建GAD65全表位疫苗有多种优势：(1)培养容易，操作方法(如电穿孔法转基因)简便，技术成熟，副作用少，成本低；(2)乳酸菌作为益生菌，可直接口服，比一些减毒的载体更具有安全性，同时免去了目的蛋白的体外提纯等后续加工处理工序。乳酸菌在发挥自身益生菌功能的同时，增强免疫效果，一举多得；(3)可在细胞内表达也可在细胞表面表达和分泌到胞外；(4)乳酸菌对机体黏膜有极强的粘附作用，因此进入消化道、呼吸道、泌尿系统等在黏膜处不断繁殖，持续向机体释放特异性的目的抗原蛋白；(5)具有免疫佐剂作用、固有免疫原性及对胆汁酸的抵抗力，不需要额外地提供外源性抗原刺激动物机体就能发生黏膜免疫和系统免疫。(6)乳酸菌作为益生菌，有利于肠道菌群多样性稳定，近年来发现1型糖尿病的发生发展与肠道菌群的紊乱有着密切的关系，乳酸菌本身的肠道菌群调节就有利于抵抗1型糖尿病的发生发展。由于乳酸菌以上的优点，选择弥补了传统抗原和其它基因工程抗原产量不高、纯化复杂等缺陷，对新型疫苗的开发具有重要意义。

本发明提出：将人源性GAD65_1-585氨基酸序列通过乳酸菌密码子偏爱优化后5’端引入NcoI的酶切位点CCATGG，3’端引入XbaI酶切位点TCTAGA，插入pNZ8148载体，构建重组质粒GAD65_1-585-pNZ8148；将阳性质粒电转化进入NZ9000乳酸菌菌株，用50ng/mL的Nisin进行诱导表达融合蛋白。这种构建方法的优势在于：(1)与短肽GAD65单价疫苗相比，全长的GAD65肽含所有抗原表位拓宽了疫苗的保护谱；(2)抗原肽会被机体中的酶降解无法发挥诱导免疫耐受的作用，而通过乳酸菌直接将抗原肽表达在肠道黏膜，能够直接被黏膜免疫系统中的抗原提呈细胞提取，一定程度上避免了抗原肽的降解；(3)乳酸菌表达系统有简单、无创、基因修饰接受性强、价格低和安全性高的优点，是一个相对安全的疫苗载体。将重组乳酸菌疫苗以口服方式免疫非肥胖糖尿病小鼠(NOD)，刺激产生针对GAD65的特异性抗体，同时可激活体内调节性T细胞增殖从而诱导免疫耐受，并降低血糖水平，从而达到预防和治疗1型糖尿病的目的，改变传统药物治疗存在的诸多不足或问题。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

将本发明提供的疫苗灌胃免疫治疗自发性1型糖尿病模型NOD(nonobesediabetic)小鼠(6-8周龄)。通过检测小鼠血糖发现，32周后经灌胃免疫组的小鼠83％血糖仍保持正常水平；而未治疗组小鼠50％血糖升高，糖尿病病发；并且疫苗组能显著地诱导Treg细胞，提高糖耐量，可缓解1型糖尿病；本发明提供的口服1型糖尿病疫苗的制备方法简单，无创治疗，能克服现有疫苗免疫谱单一、治疗成本过高和不能很好的诱导Treg细胞的缺点，具有很广的应用前景。

附图说明

图1为GAD65_1-585-pNZ8148重组质粒构建示意图；

图2为免疫完成两周后Balb/c小鼠特异性抗GAD65 IgA抗体水平结果图；

图3为32周NOD小鼠发病率结果图；

图4为各组中调节性T细胞(Treg)比例，其中，a-c分别为Contro组l、NZ9000组、GAD65组肠道固有层淋巴细胞中Treg细胞的占比，d为肠道固有层淋巴细胞中Treg细胞的占比统计；e-g分别为Contro组l、NZ9000组、GAD65组脾脏淋巴细胞中Treg细胞的占比；h为脾脏淋巴细胞中Treg细胞的占比统计。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明中所用培养基配方如下

GM液体培养基：M17broth+0.5g/100mL glucose；

GM培养平板：M17琼脂粉+0.5g/100mL glucose；

含氯霉素的GM培养平板：M17琼脂粉+0.5g/100mL glucose+10μg/mL氯霉素；

GSGM：0.5M蔗糖+25g/L甘氨酸+M17培养基+5g/L葡萄糖；

溶液I 0.5moL/L蔗糖+100mL/L甘油；

溶液Ⅱ0.5moL/L蔗糖+100mL/L甘油+0.05moL/L EDTA；

GMMC恢复培养基：M17培养基+0.5g/100mL葡萄糖+20mM MgC1₂+2mM CaC1₂；

LB固体培养基：4g胰蛋白胨+2g酵母粉+4g NaCl+8g琼脂粉溶于400mL超纯水中高温灭菌加入10μg/mL氯霉素；

LB液体培养基：4g胰蛋白胨+2g酵母粉+4g NaCl溶于400mL超纯水中高温灭菌加入10μg/mL氯霉素；

注：本发明中所有使用到氯霉素的培养基氯霉素的浓度均为10μg/mL。

一种GAD65重组乳酸菌载体口服疫苗构建方法，包括如下步骤：

(1)将表达GAD65全长氨基酸序列的人源性的基因通过乳酸菌密码子偏爱优化后，人源性GAD65_1-585全长氨基酸被表达，构建成了包含GAD65_206-220(Thr Tyr Glu Ile Ala ProVal Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr)、GAD65_217-236(Glu Tyr Val Thr Leu Lys LysMet Arg Glu Ile Ile Gly Trp Pro Gly Gly Ser Gly Asp)、GAD65_286-300(Lys Lys GlyAla Ala Ala Leu Gly IleGly Thr Asp Ser Val Ile)、GAD65_290-309(Ala Leu Gly IleGly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys Asp Glu Arg Gly Lys)、GAD65_515-528(ThrLeuGlu Asp Asn Glu Glu Arg Met Ser Arg Leu Ser Lys)等有效表位的GAD65全表位序列，并在末尾加上6HIS标签。(如图1所示)

原始GAD65基因序列如SEQ ID NO.3所示。

根据乳酸菌偏爱密码子基因优化后的GAD65基因序列如SEQ ID NO.2所示。

6HIS基因序列如SEQ ID NO.4所示。

密码子优化后氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白大小理论分子量为：65.411kd

(2)将GAD65_1-585序列5’端引入NcoI的酶切位点CCATGG，3’端引入XbaI的酶切位点TCTAGA，合成插入pNZ8148载体，构建重组质粒GAD65_1-585-pNZ8148；

(3)将构建得到的重组质粒GAD65_1-585-pNZ8148转化MC1061感受态细胞克隆扩增，大量提取质粒GAD65_1-585-pNZ8148，重组质粒测序验证无误后，进行扩大培养；

(4)抽提重组质粒10μg，运用电转化方法将质粒转化进NZ9000，筛选出阳性克隆，即为GAD65_1-585重组乳酸菌疫苗，用于后面的表达；

(5)GAD65_1-585重组NZ9000乳酸菌菌株用Nisin进行诱导表达。

将构建得到的重组质粒GAD65_1-585-pNZ8148转化MC1061感受态细胞克隆扩增的具体方法为：

将GAD65_1-585-pNZ8148重组质粒转化MC1061感受态细胞，涂布在含氯霉素的LB固体培养基平板，37℃倒置培养过夜，挑取含氯霉素的LB固体培养基平板中的单菌落至装有5mL含氯霉素的LB液体培养基的试管中，于恒温摇床(37℃，150rpm/min)过夜培养，次日将该5mL菌液接种400mL含氯霉素的LB液体培养基，于恒温摇床(37℃，150rpm/min)过夜培养，次日收获菌液，用质粒大量抽提试剂盒(promega)从克隆扩增收获的菌液中提取GAD65_1-585-pNZ8148重组质粒。

重组质粒GAD65_1-585-pNZ8148转入NZ9000乳酸菌及鉴定的方法是：

D、取恢复菌液铺于含氯霉素的GM培养平板上，取100μL涂布于平板上，待菌液吸收完全后，于30℃下静止培养36h，待转化子出现；

E、阳性鉴定：

a挑取转化子于5mL GM培养液中，30℃培养过。

b抽提质粒，设计引物

p8148-F:5'-acgcgagcataataaacgg-3'；(SEQ ID NO.5)

p8148-R:5'-cgaaagcgaaatcaaacga-3'；(SEQ ID NO.6)

进行PCR验证

PCR反应体系如表1。

表1

PCR反应程序如表2。

表2

挑取阳性克隆接种于5mL M17+0.5g/100mL glucose+10μg/mL chloramphenicol培养液的试管中扩增，用250μL甘油+750μL菌液制成甘油菌，冻存于-20℃保存待用。

GAD65_1-585重组NZ9000乳酸菌诱导表达的方法是：

(1)挑取阳性克隆接种于5mL M17+0.5g/100mL glucose+10μg/mLchloramphenicol培养液的试管中，30℃过夜培养；

(2)次日按菌液：M17+0.5％glucose+10μg/mL chloramphenicol培养液为1:25比例(体积比)分别接种于相同的3瓶200mL M17+0.5％glucose+10μg/mL chloramphenicol培养液中，30℃培养至菌体OD600为0.4；

(3)向培养物中加入Nisin至终浓度为50ng/mL，30℃培养4h，诱导融合蛋白表达。

(4)取出1mL诱导表达培养物，10000r/mim室温离心2min，取上清至新的离心管中。

(7)沉淀用200μL PBS重悬，重悬液进行超声波破碎后，10000r/mim室温离心2min取上清液。

(8)用获得的上清液进行Western blot实验，验证表达成功结果发现用50ng/mL浓度的Nisin诱导4小时表达效果比较合适。

(9)将诱导表达成功的GAD65乳酸菌疫苗菌液4℃、8000rpm离心30min，收集沉淀稀释到1×10¹⁰pfu/mL，置于-20℃储存待用。

本发明1型糖尿病疫苗的具体制备方法，其特征在于所述1型糖尿病疫苗的具体制备方法是：将表达人源性GAD65全长氨基酸的基因通过乳酸菌密码子偏爱优化后的GAD65_1-585氨基酸序列插入pNZ8148载体构成GAD65_1-585-pNZ8148重组质粒，然后转化至MC1061感受态细胞中进行扩增后提取质粒，筛选阳性质粒转入NZ9000乳酸菌菌株构建成GAD65乳酸菌疫苗菌株，对得到的GAD65乳酸菌疫苗菌株扩增后，用Nisin进行诱导乳酸菌表达蛋白。用Westernblot检测GAD65蛋白诱导表达成功后将菌液4℃、8000rpm离心30min，收集沉淀稀释到1×10¹⁰pfu/mL，置于-20℃储存待用。

GAD65_1-585重组NZ9000乳酸菌滴度测定：

取100μL待测GAD65重组乳酸菌菌液，用900μL PBS按10n倍比稀释；取100μL稀释液涂布在含chloramphenicol GM固体培养基平板，无氧，30℃过夜培养长出菌落，计数。滴度按pfu/mL记数，数值等于“菌落数×稀释倍数”。例如：如果稀释倍数为10⁶的平板上有50个菌落，滴度为50×10⁶＝5×10⁷pfu/mL。

所得1型糖尿病噬菌体疫苗的免疫试验和效果如下：

A、免疫方案

用GAD65乳酸菌疫苗(GAD65组)，含pNZ8148空载体的NZ9000乳酸菌对照组(NZ9000组)以及空白对照组(control组)，分别用100μL 1×10¹⁰pfu/mL/只GAD65疫苗、100μL1×10¹⁰pfu/mL/只NZ9000空载体菌和100μL/只PBS灌胃免疫，在免疫前8小时进行断食处理，用0.786mmol/mL/只NaHCO₃灌胃处理15min中和胃酸后，再用GAD65乳酸菌疫苗、NZ9000空载体及PBS免疫6-8周龄、16-20g的清洁级Balb/c小鼠(每组8只)和NOD小鼠(每组11只)，分别于第2周开始连续免疫5天，间隔14天后再进行第二次免疫，连续免疫10天。

B、检测方法

1、第二次免疫后第二周采集眼球取血4只小鼠，分离血清，分别用GAD65作为抗原包被板子，用间接ELISA法检测抗人GAD65抗体，取血后处死小鼠，取小鼠脾脏，研磨分离出脾脏细胞，使用抗小鼠CD4-FITC(RM4-5)，抗小鼠CD25-APC(PC61.5)，抗小鼠Foxp3-PE(FJK-16s)标记脾脏细胞，随后用流式细胞计数仪检测Treg细胞

2、免疫后观察小鼠至32周龄，每周自鼠尾静脉测量小鼠血糖；同时称量小鼠体重。

3、在NOD鼠23周龄时，将小鼠禁食8h后，尾静脉采血测定血清葡萄糖含量，作为基础对照(0min)，然后各组动物葡萄糖2g/kg灌胃，在此后的30、60、90和120min采血测定血清葡萄糖含量。

4、第32周时，处死小鼠，取小鼠脾脏，研磨分离出脾脏细胞，使用抗小鼠CD4-FITC(RM4-5)，抗小鼠CD25-APC(PC61.5)，抗小鼠Foxp3-PE(FJK-16s)标记脾脏细胞，随后用流式细胞计数仪检测Treg细胞。

C、实验结果

对所获得的实验数据以Graphpad prism8统计软件进行t检验，以P<0.05为差异的统计学意义。

(1)实验过程中各组小鼠均无死亡发生，活动正常，无腹泻，大便呈颗粒状、无稀便。第32周的时候，GAD65疫苗组、空载体组及空白对照组剩余存活小鼠因血糖还在正常范围内故而体重明无差别，结果如表4所示。

(2)Balb/c小鼠在免疫完成两周后呢采取血清检测抗体发现，GAD65疫苗组的抗GAD65的特异性IgA型的抗体在1：10的稀释水平上有明显的升高，证明口服免疫GAD65能够引起一个温和的免疫反应应答，结果如图2所示。

(3)各组疫苗经过口服免疫治疗NOD小鼠，并对其进行血糖监控发现，GAD65疫苗组治疗小鼠糖尿病防治比例达83％，NZ9000组有33％的小鼠发病，空白对照组有50％的小鼠发病。同时我们从发病时间也能看出，GAD65疫苗组的小鼠在第21周开始发病，而其他组小鼠均在14周或19周就开始发病，说明该1型糖尿病疫苗能延缓或阻止1型糖尿病的发病。结果如图3所示。

(4)疫苗组小鼠经治疗后，从表4中可以看出，GAD65疫苗组对葡萄糖灌胃具有较好的耐受性，与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。

(5)小鼠经免疫两周后，GAD65疫苗组小鼠脾脏和肠道CD4⁺CD25⁺Fxop3⁺Treg(调节性T细胞)细胞与其他组相比均发生增殖(P<0.05)。结果说明本发明疫苗能够显著地诱导NOD小鼠产生免疫耐受，有效地生成Treg细胞，而诱导出Treg细胞是利用自身抗原诱导机体重建对其的免疫耐受的关键因素之一。结果如图4所示。

表3 32周龄NOD小鼠体重

表4NOD鼠葡萄糖耐量

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 一种口服1型糖尿病疫苗及其制备方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 585

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Ala Ser Pro Gly Ser Gly Phe Trp Ser Phe Gly Ser Glu Asp Gly

1 5 10 15

Ser Gly Asp Ser Glu Asn Pro Gly Thr Ala Arg Ala Trp Cys Gln Val

20 25 30

Ala Gln Lys Phe Thr Gly Gly Ile Gly Asn Lys Leu Cys Ala Leu Leu

35 40 45

Tyr Gly Asp Ala Glu Lys Pro Ala Glu Ser Gly Gly Ser Gln Pro Pro

50 55 60

Arg Ala Ala Ala Arg Lys Ala Ala Cys Ala Cys Asp Gln Lys Pro Cys

65 70 75 80

Ser Cys Ser Lys Val Asp Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp

85 90 95

Leu Leu Pro Ala Cys Asp Gly Glu Arg Pro Thr Leu Ala Phe Leu Gln

100 105 110

Asp Val Met Asn Ile Leu Leu Gln Tyr Val Val Lys Ser Phe Asp Arg

115 120 125

Ser Thr Lys Val Ile Asp Phe His Tyr Pro Asn Glu Leu Leu Gln Glu

130 135 140

Tyr Asn Trp Glu Leu Ala Asp Gln Pro Gln Asn Leu Glu Glu Ile Leu

145 150 155 160

Met His Cys Gln Thr Thr Leu Lys Tyr Ala Ile Lys Thr Gly His Pro

165 170 175

Arg Tyr Phe Asn Gln Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu

195 200 205

Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys Lys Met

210 215 220

Arg Glu Ile Ile Gly Trp Pro Gly Gly Ser Gly Asp Gly Ile Phe Ser

225 230 235 240

Pro Gly Gly Ala Ile Ser Asn Met Tyr Ala Met Met Ile Ala Arg Phe

245 250 255

Lys Met Phe Pro Glu Val Lys Glu Lys Gly Met Ala Ala Leu Pro Arg

260 265 270

Leu Ile Ala Phe Thr Ser Glu His Ser His Phe Ser Leu Lys Lys Gly

275 280 285

Ala Ala Ala Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys

290 295 300

Asp Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser Asp Leu Glu Arg Arg Ile Leu

305 310 315 320

Glu Ala Lys Gln Lys Gly Phe Val Pro Phe Leu Val Ser Ala Thr Ala

325 330 335

Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala Phe Asp Pro Leu Leu Ala Val Ala Asp

340 345 350

Ile Cys Lys Lys Tyr Lys Ile Trp Met His Val Asp Ala Ala Trp Gly

355 360 365

Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg Lys His Lys Trp Lys Leu Ser Gly Val

370 375 380

Glu Arg Ala Asn Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys Met Met Gly Val

385 390 395 400

Pro Leu Gln Cys Ser Ala Leu Leu Val Arg Glu Glu Gly Leu Met Gln

405 410 415

Asn Cys Asn Gln Met His Ala Ser Tyr Leu Phe Gln Gln Asp Lys His

420 425 430

Tyr Asp Leu Ser Tyr Asp Thr Gly Asp Lys Ala Leu Gln Cys Gly Arg

435 440 445

His Val Asp Val Phe Lys Leu Trp Leu Met Trp Arg Ala Lys Gly Thr

450 455 460

Thr Gly Phe Glu Ala His Val Asp Lys Cys Leu Glu Leu Ala Glu Tyr

465 470 475 480

Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Asn Arg Glu Gly Tyr Glu Met Val Phe Asp

485 490 495

Gly Lys Pro Gln His Thr Asn Val Cys Phe Trp Tyr Ile Pro Pro Ser

500 505 510

Leu Arg Thr Leu Glu Asp Asn Glu Glu Arg Met Ser Arg Leu Ser Lys

515 520 525

Val Ala Pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met

530 535 540

Val Ser Tyr Gln Pro Leu Gly Asp Lys Val Asn Phe Phe Arg Met Val

545 550 555 560

Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gln Asp Ile Asp Phe Leu Ile Glu

565 570 575

Glu Ile Glu Arg Leu Gly Gln Asp Leu

580 585

<210> 2

<211> 1835

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gcaaaaaaaa gattatctca gctattttaa tgtctacagt gatactttct gctgcagccc 60

cgttgtcagg tgtttacgct atggcatcac caggttcagg tttttggtca tttggttcag 120

aagatggttc aggtgattca gaaaatccag gtactgctag agcttggtgt caagttgctc 180

aaaaatttac tggtggtatt ggtaataagt tatgtgcttt attatacggt gatgctgaaa 240

aaccagctga aagtggtggt tcacaaccac cacgtgcagc tgctcgtaaa gctgcttgtg 300

cttgtgatca aaaaccatgt tcatgttcaa aggttgatgt taattacgct tttttacacg 360

ctactgattt attaccagct tgtgatggtg aacgtccaac tttagcattt ttacaagatg 420

ttatgaacat tttattacaa tacgttgtta agtcatttga tcgttcaact aaagttattg 480

attttcacta cccaaacgaa ttattacaag aatataactg ggaattagct gatcaaccac 540

aaaacttaga agaaatttta atgcactgtc aaactacttt aaagtacgct attaagactg 600

gtcacccaag atactttaat caattatcaa ctggtttaga tatggttggt ttagctgctg 660

attggttaac ttctactgct aatactaata tgtttactta cgaaattgct ccagtttttg 720

ttttattaga atacgttact ttaaagaaga tgcgtgaaat tattggttgg ccaggtggta 780

gtggtgatgg tatttttagt cctggtggtg ctatttcaaa tatgtatgct atgatgattg 840

ctcgttttaa gatgtttcct gaagtaaagg aaaagggtat ggctgcttta cctcgtttaa 900

ttgcttttac tagtgaacat agtcactttt cattaaagaa gggtgctgct gctttaggta 960

ttggtactga ttcagttatt ttaattaagt gtgatgaacg tggtaagatg attccatcag 1020

atttagaacg tagaatttta gaagctaagc aaaaaggttt tgttccattt ttagtttcag 1080

ctactgctgg tactactgtt tatggtgctt ttgatccttt attagctgtt gctgatattt 1140

gtaaaaagta caagatttgg atgcacgttg atgctgcttg gggtggtggt ttattaatgt 1200

cacgtaaaca taaatggaag ttatcaggtg ttgaacgtgc taatagtgtt acttggaatc 1260

cacataaaat gatgggtgtt ccattacaat gttcagcttt attagttcgt gaagaaggtt 1320

taatgcaaaa ttgtaatcaa atgcacgcta gttatttatt tcaacaagat aagcactacg 1380

atttaagtta tgatactggt gataaggctt tacaatgtgg tcgtcatgtt gatgttttta 1440

aattatggtt aatgtggcgt gctaaaggta ctactggttt tgaagctcat gttgataaat 1500

gtttagaatt agctgaatac ttatacaaca ttattaagaa ccgtgaaggt tatgaaatgg 1560

tttttgatgg taagccacaa catactaatg tttgtttttg gtatattcca ccatcattac 1620

gtactttaga agataatgaa gaacgtatgt caagattatc aaaggttgct ccagttatta 1680

aggctcgtat gatggaatat ggtactacta tggtttctta tcaaccatta ggtgataaag 1740

ttaacttttt tcgtatggta atttcaaacc cagctgctac tcatcaagat attgattttt 1800

taattgaaga aattgaacgt ttaggtcaag attta 1835

<210> 3

<211> 2400

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

agctcgcccg cagctcgcac tcgcaggcga cctgctccag tctccaaagc cgatggcatc 60

tccgggctct ggcttttggt ctttcgggtc ggaagatggc tctggggatt ccgagaatcc 120

cggcacagcg cgagcctggt gccaagtggc tcagaagttc acgggcggca tcggaaacaa 180

actgtgcgcc ctgctctacg gagacgccga gaagccggcg gagagcggcg ggagccaacc 240

cccgcgggcc gccgcccgga aggccgcctg cgcctgcgac cagaagccct gcagctgctc 300

caaagtggat gtcaactacg cgtttctcca tgcaacagac ctgctgccgg cgtgtgatgg 360

agaaaggccc actttggcgt ttctgcaaga tgttatgaac attttacttc agtatgtggt 420

gaaaagtttc gatagatcaa ccaaagtgat tgatttccat tatcctaatg agcttctcca 480

agaatataat tgggaattgg cagaccaacc acaaaatttg gaggaaattt tgatgcattg 540

ccaaacaact ctaaaatatg caattaaaac agggcatcct agatacttca atcaactttc 600

tactggtttg gatatggttg gattagcagc agactggctg acatcaacag caaatactaa 660

catgttcacc tatgaaattg ctccagtatt tgtgcttttg gaatatgtca cactaaagaa 720

aatgagagaa atcattggct ggccaggggg ctctggcgat gggatatttt ctcccggtgg 780

cgccatatct aacatgtatg ccatgatgat cgcacgcttt aagatgttcc cagaagtcaa 840

ggagaaagga atggctgctc ttcccaggct cattgccttc acgtctgaac atagtcattt 900

ttctctcaag aagggagctg cagccttagg gattggaaca gacagcgtga ttctgattaa 960

atgtgatgag agagggaaaa tgattccatc tgatcttgaa agaaggattc ttgaagccaa 1020

acagaaaggg tttgttcctt tcctcgtgag tgccacagct ggaaccaccg tgtacggagc 1080

atttgacccc ctcttagctg tcgctgacat ttgcaaaaag tataagatct ggatgcatgt 1140

ggatgcagct tggggtgggg gattactgat gtcccgaaaa cacaagtgga aactgagtgg 1200

cgtggagagg gccaactctg tgacgtggaa tccacacaag atgatgggag tccctttgca 1260

gtgctctgct ctcctggtta gagaagaggg attgatgcag aattgcaacc aaatgcatgc 1320

ctcctacctc tttcagcaag ataaacatta tgacctgtcc tatgacactg gagacaaggc 1380

cttacagtgc ggacgccacg ttgatgtttt taaactatgg ctgatgtgga gggcaaaggg 1440

gactaccggg tttgaagcgc atgttgataa atgtttggag ttggcagagt atttatacaa 1500

catcataaaa aaccgagaag gatatgagat ggtgtttgat gggaagcctc agcacacaaa 1560

tgtctgcttc tggtacattc ctccaagctt gcgtactctg gaagacaatg aagagagaat 1620

gagtcgcctc tcgaaggtgg ctccagtgat taaagccaga atgatggagt atggaaccac 1680

aatggtcagc taccaaccct tgggagacaa ggtcaatttc ttccgcatgg tcatctcaaa 1740

cccagcggca actcaccaag acattgactt cctgattgaa gaaatagaac gccttggaca 1800

agatttataa taaccttgct caccaagctg ttccacttct ctaggtagac aattaagttg 1860

tcacaaactg tgtgaatgta tttgtagttt gttccaaagt aaatctattt ctatattgtg 1920

gtgtcaaagt agagtttaaa aattaaacaa aaaagacatt gctcctttta aaagtccttt 1980

cttaagttta gaatacctct ctaagaattc gtgacaaaag gctatgttct aatcaataag 2040

gaaaagctta aaattgttat aaatacttcc cttactttta atatagtgtg caaagcaaac 2100

tttattttca cttcagacta gtaggactga atagtgccaa attgcccctg aatcataaaa 2160

ggttctttgg ggtgcagtaa aaaggacaaa gtaaatataa aatatatgtt gacaataaaa 2220

actcttgcct ttttcatagt attagaaaaa aatttctaat ttacctatag caacatttca 2280

aatgtattta aatacatata attttacaaa aggaaaatat atatattaaa aaagatatcc 2340

tattttgtaa catatagatt tttattttat ataggttata caaactgcgg gggcggaatt 2400

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

catcaccatc atcatcat 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

acgcgagcat aataaacgg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

cgaaagcgaa atcaaacga 19

Claims

1.一种口服1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的口服1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，表达人源性GAD65全长氨基酸的基因通过乳酸菌密码子偏爱优化后的GAD65_1-585序列末尾加上6HIS标签，形成的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中，优化后的GAD65_1-585核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示；所述的6HIS标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的口服1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，将通优化后的GAD65_1-585氨基酸序列插入pNZ8148载体构成重组GAD65_1-585-pNZ8148重组质粒的具体方法为：

4.根据权利要求1所述的口服1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，将GAD65_1-585-pNZ8148重组质粒转化至MC1061感受态细胞中进行扩增后提取质粒，其具体方法为：

5.根据权利要求4所述的口服1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，恒温摇床的温度为37℃，转速为150rpm/min。

6.根据权利要求1所述的口服1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，筛选阳性质粒转入NZ9000乳酸菌菌株的具体方法为：

E、挑取阳性克隆接种于5mL M17+0.5g/100mL glucose+10μg/mL chlor amphenicol培养液的试管中扩增，用250μL甘油+750μL菌液制成甘油菌，冻存于-20℃保存待用。

7.根据权利要求1所述的口服1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，用Nisin进行诱导表达融合蛋白的具体方法为：

(1)挑取阳性克隆接种于5mL M17+0.5g/100mLglucose+10μg/mL chlor amphenicol培养液的试管中，30℃过夜培养；

8.权利要求1～7任意一项所述的口服1型糖尿病疫苗的制备方法制得的口服1型糖尿病疫苗。

9.权利要求1～7任意一项所述的口服1型糖尿病疫苗的制备方法制得的GAD65重组乳酸菌疫苗。

10.权利要求9所述的GAD65重组乳酸菌疫苗在制备1型糖尿病疫苗中的应用。