CN114377014A - DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂与Akt抑制剂联合用于制备抗结直肠癌药物的用途 - Google Patents

DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂与Akt抑制剂联合用于制备抗结直肠癌药物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂与Akt抑制剂联合用于制备抗结直肠癌药物的用途。本发明发现，DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂伊立替康和Akt抑制剂MK‑2206具有协同抑制结直肠癌细胞增殖的活性，这两种抑制剂的组合物具有开发成治疗结直肠癌的药物的前景。

Description

DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂与Akt抑制剂联合用于制备抗结直肠 癌药物的用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂与Akt抑制剂联合用于制备抗结直肠癌药物的用途。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是世界大多数地区最常见的恶性肿瘤之一，全球每年有60万人死于此病，已成为世界上第三大恶性肿瘤，也是癌症致死的第四大原因。
Akt又名蛋白激酶B(proteinkinase B，PKB)，是PI3K-Akt-mTOR信号通路的核心蛋白，该通路在调控肿瘤细胞凋亡、增殖和侵袭等方面发挥重要功能，是治疗癌症的重要靶点之一。MK-2206是一种强效Akt变构抑制剂，可抑制肿瘤细胞增殖，其主要作用是抑制Akt磷酸化，其阻断效果优于传统的竞争性抑制剂，具有更高的特异性、相对较小的副作用和毒性。
伊立替康(Irinotecan，CPT-11)是一种半合成水溶性喜树碱类衍生物，CPT-11及其代谢产物SN38为DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，其与拓扑异构酶Ⅰ及DNA形成的复合物能引起DNA单链断裂，阻止DNA复制及抑制RNA合成，为晚期结肠癌的一线用药。
目前没有伊立替康与MK-2206联合用于制备抗结直肠癌药物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂与Akt抑制剂联合用于制备抗结直肠癌药物的用途。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂和Akt抑制剂联合用于制备抗结直肠癌药物的用途。
优选地，所述DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂为伊立替康。
优选地，所述Akt抑制剂为MK-2206。
一种药物组合物，由DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂和Akt抑制剂组成。
优选地，所述DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂为伊立替康。
优选地，所述Akt抑制剂为MK-2206。
上述药物组合物在制备抗结直肠癌药物中的应用。
有益效果：
本发明发现，DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂伊立替康和Akt抑制剂MK-2206具有协同抑制结直肠癌细胞增殖的活性，这两种抑制剂的组合物具有开发成治疗结直肠癌的药物的前景。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料
试剂：DMSO(Sigma-Aldrich，美国)；青霉素-链霉素(Hyclone，美国)；0.5％胰酶-EDTA溶液(博士德，武汉博士德生物工程有限公司)；PBS溶液(Hyclone，美国)；FBS(Gibco,美国)；DMEM培养基(GIBCO，美国)，MTT(上海碧云天生物技术有限公司)
药物：MK-2206di-hydrochloride(CAS 1032350-13-2)购买于GLPBIO中国；伊立替康购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
细胞：人结肠癌细胞HCT116(购买于南京科佰生物科技有限公司)，人结肠癌细胞SW620(购买于南京宏新生物科技有限公司)。
二、实验方法
1、HCT116细胞培养
细胞培养：培养液由：89％DMED培养基+10％FBS+1％青霉素-链霉素(双抗)组成；培养箱条件为5％CO2，37℃；每日更换新鲜培养液。
细胞传代：显微镜下观察细胞长满培养皿底部(周期为2天)(1)培养液、胰酶、PBS置于37℃水浴锅中预热20分钟；(2)从培养箱中取出细胞培养皿，弃去旧培养液，用2mL的PBS轻柔缓慢润洗细胞两遍以去除残留的培养基，加入1mL胰酶，在室温条件下充分消化2.5min，至细胞呈沙粒状从培养皿底部脱落；(3)直接加入2mL新鲜培养液终止消化，轻柔吹打，将培养液转移到15mL离心管，于室温下1000rpm离心5min；(4)弃去培养液，加6mL新鲜培养液重悬，之后吸取1mL细胞重悬液(1:6传代)加入新培养皿，加入9mL新鲜培养液，通过“8字法”使细胞分散后放入培养箱培养。
细胞冻存：(1)将培养液、胰酶、PBS置于37℃水浴锅中预热20分钟；(2)从培养箱中取出细胞培养皿，弃去旧培养液，用2mLPBS轻柔润洗细胞两遍，加入1mL胰酶，在室温条件下充分消化2.5min，至细胞呈沙粒状从培养皿底部脱落；(3)直接加入2mL新鲜培养液终止消化，轻柔吹打，将培养液转移到15mL离心管，于室温下1000rpm离心5min；(4)弃去上层培养液，加1mL冻存液(DMEM培养基：FBS：DMSO＝7:2:1)重悬细胞后转移入冻存管，将冻存管放入程序降温盒后置于-80℃冰箱过夜，后转移入液氮中保存。
2、SW620细胞培养
细胞培养：条件同HCT116。
细胞传代：显微镜下观察细胞长满培养皿底部(周期为3天)(1)培养液、胰酶、PBS置于37℃水浴锅中预热20分钟；(2)从培养箱中取出细胞培养皿，弃去旧培养液，用2mL的PBS轻柔缓慢润洗细胞两遍以去除残留的培养基，加入1mL胰酶，放入培养箱在37℃条件下充分消化3min，至细胞呈沙粒状从培养皿底部脱落；(3)直接加入2mL新鲜培养液终止消化，轻柔吹打，将培养液转移到15mL离心管，于室温下1000rpm离心5min；(4)弃去上层培养液，加4mL新鲜培养液重悬，之后吸取1mL细胞重悬液(1:4传代)加入新培养皿，加入9mL新鲜培养液，通过“8字法”使细胞分散后放入培养箱培养。
细胞冻存：(1)培养液、胰酶、PBS置于37℃水浴锅中预热20分钟；(2)从培养箱中取出细胞培养皿，弃去旧培养液，用2mL的PBS轻柔缓慢润洗细胞两遍以去除残留的培养基，加入1mL胰酶，放入培养箱在37℃条件下充分消化3min，至细胞呈沙粒状从培养皿底部脱落；(3)直接加入2mL新鲜培养液终止消化，轻柔吹打，将培养液转移到15mL离心管，于室温下1000rpm离心5min；(4)弃去上层培养液，加1mL冻存液(DMEM培养基：FBS：DMSO＝7:2:1)重悬细胞后转移入冻存管，将冻存管放入程序降温盒后置于-80℃冰箱过夜，后转移入液氮中保存。
3、细胞增殖试验
取对数生长期的HCT-116细胞，用胰酶消化后收集细胞，按4.5×103cells/well的密度接种于96孔板中，单用MK-2206组给予不同浓度MK-2206，单用CPT-11组给予不同浓度的CPT-11，联用组药物浓度设置为上述浓度的两两交叉；溶媒为全培养基。细胞接种于96孔板之后5％CO2，37℃培养过夜，之后用不同浓度含药培养基替换孔内培养基，继续置于5％CO2条件下的培养箱孵育48小时。之后每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，继续置于5％CO2条件下的培养箱作用4小时，之后吸取孔内溶液，用150mLDMSO复溶，于置于微孔板振荡器上以200频率振荡10min。于570nm波长下测定各孔的吸光度值。
SW620细胞接种密度为6.5×103cells/well，给药浓度不同，其余与HCT-116细胞一致。
4、药物协同作用评价指标
细胞模型上药物协同作用评价指标采用金正均Q值法(金正均.合并用药中的相加[J].中国药理学报,1980)。药效独立模型的基本假设为：
MAB＝MA+MB-MAMB
其中MA、MB与MAB分别表示药物A的抑制率，药物B的效应值以及当前剂量下两药联用的抑制率。当两药物不存在协同作用时，MA+MB＝MAMB，即协同作用MAB为0。在金正均Q值法中，定义药物协同作用指标Q如下：
Figure BDA0003521540450000031
当Q值小于0.85时，认为两种药物存在拮抗效应；当Q值介于0.85到1.15之间时，认为两种药物之间相互独立，为相加效应；当Q值大于1.15时，认为两种药物存在协同作用。
三、实验结果
各组HCT-116细胞生存率以及伊立替康与MK-2206联合给药的金正均Q值计算结果如表1所示。该结果表明，伊立替康与MK-2206具有协同抑制HCT-116细胞增殖的作用。
表1各组HCT-116细胞生存率以及伊立替康与MK-2206联合给药的金正均Q值
Figure BDA0003521540450000041
各组SW-620细胞生存率以及伊立替康与MK-2206联合给药的金正均Q值计算结果如表2所示。该结果表明，伊立替康与MK-2206具有协同抑制SW-620细胞增殖的作用。
表2各组SW-620细胞生存率以及伊立替康与MK-2206联合给药的金正均Q值
Figure BDA0003521540450000042
Figure BDA0003521540450000051
综上可见，DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂伊立替康和Akt抑制剂MK-2206具有协同抑制结直肠癌细胞增殖的活性，这两种抑制剂的组合物具有开发成治疗结直肠癌的药物的前景。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (7)

1.DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂和Akt抑制剂联合用于制备抗结直肠癌药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，所述DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂为伊立替康。
3.根据权利要求1所述的用途，所述Akt抑制剂为MK-2206。
4.一种药物组合物，其特征在于：由DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂和Akt抑制剂组成。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，所述DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂为伊立替康。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，所述Akt抑制剂为MK-2206。
7.权利要求4～6所述的药物组合物在制备抗结直肠癌药物中的应用。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20110319354A1 (en) * 2009-03-06 2011-12-29 Layton Mark E Combination Cancer Therapy with an AKT Inhibitor and Other Anticancer Agents

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