CN114371236A - 一种美沙拉秦灌肠液中苯胺的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种美沙拉秦灌肠液中苯胺的测定方法，它包括如下步骤：制样、检测等前处理步骤，其HPLC检测条件为：以磷酸盐缓冲液(用稀氢氧化钠溶液调节pH至8.0)‑乙腈(90:10)为流动相，检测波长为235nm，流速每分钟1.0ml，柱温30℃。精密量取供试品溶液及对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算含量。本发明提供的美沙拉秦灌肠液中苯胺的测定方法，能够实现对美沙拉秦灌肠液中苯胺的快速、准确、高重现性、高回收率的测定，比BP标准中苯胺的测定方法灵敏度高、精密度、准确度及稳定性好。苯胺测定方法的准确性、重复性、线性关系、稳定性等能达到科研和生产的要求，适用于推广应用，对控制美沙拉秦灌肠液的质量具有重要的意义。

Description

一种美沙拉秦灌肠液中苯胺的测定方法
技术领域
本发明涉及到一种美沙拉秦灌肠液中苯胺的测定方法，该方法采用高效液相色谱法测定美沙拉秦灌肠液中苯胺的含量。
背景技术
溃疡性结肠炎是一个全世界都有的疾病，近年来，溃疡性结肠炎的发病率在我国有增高趋势，临床上多采用柳氮磺胺吡啶(SASP)治疗，虽然有一定疗效，但其副作用发生率较高，且对磺胺过敏者不能应用。美沙拉秦最早由德国霍克大药厂研制成功并投放市场，与SASP相比，其主要化学结构在于保留了5-氨基水杨酸有效成份，去除了磺胺吡啶基团，因此克服了SASP的缺点，是治疗溃疡性结肠炎的一种新药，已在西方国家广泛应用。目前由于人们生活环境恶化和生活习惯等诸多因素影响，溃疡性结肠炎发病率在逐年增加，在美沙拉秦问世前，没有更好的药物用于治疗溃疡性结肠炎，美沙拉秦问世后，以其良好的疗效和不良反应少等优势，在临床上不断推广。
美沙拉秦的主要药理作用在于直接抑制结肠过氧化物酶，抑制炎症介质，包括前列腺素、白三烯等的合成和释放；抑制血小板活化因子的活性；清除自由基，降低肠道黏膜的损伤及刺激，且避免了SASP的副作用，适用于SASP、糖皮质激素无效或不耐受的患者。从缓解症状、结肠镜下改变，其有效率明显高于SASP。另外，还可明显降低患者血清中TNF-а和IL-8水平，这可能是其治疗溃疡性结肠炎的作用机制之一。
美沙拉秦的抗炎作用机制尚不完全清楚。体外研究显示美沙拉秦对肠黏膜前列腺素的含量有一定影响，具有清除活性氧自由基的功能，对脂氧合酶可能起到一定的抑制作用。
美沙拉秦灌肠液采用直肠给药的方式，提高用药的顺应性；直肠给予美沙拉秦灌肠液后，美沙拉秦主要局部作用于肠黏膜和粘膜下层组织，对溃疡性结肠炎起到良好的治疗作用。
苯胺主要是美沙拉秦合成过程中带入未反应完全的起始原料。与药品质量和安全性密切相关，苯胺是一种胺类物质，主要引起高铁血红蛋白血症和肝、肾及皮肤损害，可能产生遗传毒性；因此，必须通过适当的检测分析方法控制药物中苯胺的含量，确保药品质量。
目前已有BP标准中苯胺测定方法为：精密称取本品适量(约相当于美沙拉秦50mg)，加流动相溶解并稀释制成每ml约含美沙拉秦2mg的溶液，作为供试品溶液。精密称取苯胺对照品适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.01μg的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，磷酸盐缓冲溶液(取磷酸二氢钾1.41g和磷酸氢二钠0.37g，加水溶解并稀释至1000ml，用1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.0)-甲醇(85:15)为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长205nm，柱温40℃，精密量取对照品溶液和供试品溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。测定美沙拉秦灌肠液中苯胺的波长是205nm，吸收主要在紫外末端，测定时可能受到干扰，无法准确测定苯胺含量；供试品的配制为直接取样品用流动相稀释配制，美沙拉秦灌肠液中含有多种辅料及美沙拉秦原料，同时苯胺的控制限度较低，测定时可能干扰苯胺的测定，影响苯胺含量的准确性。
发明内容
本发明的目的是提供了一种具有测定准确，重现性好，操作简单、分析速度快的新的测定美沙拉秦灌肠液中苯胺的测定方法。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：美沙拉秦灌肠液中苯胺的测定方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取本品15g，精密称定，置试管中，加入1mol/L氢氧化钠溶液10ml使溶解，精密加入二氯甲烷15ml，剧烈振摇1分钟，用可分离水相和有机相的滤纸滤过，精密量取有机相溶液5ml置另一试管中，精密加入0.01mol/L磷酸溶液5ml，剧烈振摇1分钟，用硅过滤器滤过，取水相溶液作为供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备：精密称取苯胺对照品适量，加二氯甲烷制成每1ml含2μg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取5ml置试管中，加入1mol/L氢氧化钠溶液10ml，精密加入二氯甲烷10ml，自“剧烈振摇1分钟”起同法操作，取水相溶液作为对照品溶液。
(3)测定方法：照高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠6.9g溶解至1000ml水中，用稀氢氧化钠溶液调节pH值至8.0)-乙腈(90:10)为流动相，检测波长为235nm，流速每分钟1.0ml，柱温30℃。精密量取供试品溶液及对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算含量。
本发明的有益技术效果是：能够实现对苯胺含量的快速、准确、高重现性、高回收率的测定，适于应用推广，对控制美沙拉秦灌肠液的质量控制具有重要意义。
附图说明
图1苯胺溶液线性关系图；
图2为采用本发明的美沙拉秦灌肠液中苯胺的分析方法中色谱图(本发明标准色谱图)；
图3为采用本发明的美沙拉秦灌肠液BP标准中苯胺分析方法中色谱图；
图4为采用本发明的美沙拉秦灌肠液中苯胺分析方法的系统适用性试验溶液的色谱图；
图5为采用本发明的美沙拉秦灌肠液中苯胺分析方法的专属性空白试验溶液的色谱图；
图6为采用本发明的美沙拉秦灌肠液中苯胺分析方法的专属性供试品溶液的色谱图；
具体实施方式
为了进一步验证本发明的技术方案，申请人进行了如下方案：
系统适用性试验
分别对照品溶液和加标供试品溶液，照苯胺测定方法，各连续进样6次，测定其峰面积，考察系统适用性。试验结果见下表：
表1系统适用性结果
测定次数 1 2 3 4 5 6 平均 RSD％
对照品峰面积 41.35 40.95 41.08 41.12 41.57 41.28 41.20 0.54
加标供试品峰面积 40.55 40.70 39.88 40.08 40.11 39.95 40.21 0.83
系统适用性试验测定对照品和加标供试品溶液峰面积的RSD％均小于2.0％，符合要求，试验结果表明该苯胺的测定方法系统适用性良好。
空白辅料干扰试验
分别空白辅料、混合杂质对照品(杂质K(苯胺)、杂质A、杂质C、杂质E、杂质G、杂质L、杂质M、杂质N、杂质R、杂质F、杂质J、杂质O、杂质H、对苯二酚、对苯醌、美沙拉秦)、对照品、原料、供试品、加标供试品，精密称定，分别照“供试品溶液的制备”和“对照品溶液的制备”制得各溶液，照苯胺测定方法进行测定，试验结果见下表：
表2专属性试验结果
Figure BDA0003455579470000031
试验结果表明空白辅料和其他杂质对苯胺含量测定无干扰，苯胺测定方法专属性较好。
线性范围
取苯胺对照品适量，精密称定，制备200μg/ml的储备液100ml，用二氯甲烷稀释制成浓度约为3μg/ml、2μg/ml、1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.3μg/ml、0.05μg/ml的溶液，作为线性测定的7份溶液，照苯胺测定方法，测定其峰面积，求峰面积对浓度线性方程及相关系数。考察结果见下表：
表3线性范围
Figure BDA0003455579470000041
线性方程：Y＝0.0162x-0.0097r＝0.9997
试验结果表明苯胺溶液在0.0253μg/ml～3.1634μg/ml浓度范围内呈良好线性。
定量限和检测限
取对照品溶液，加0.01mol/L磷酸溶液稀释制成0.024μg/ml、0.016μg/ml、0.008μg/ml的溶液进样以确定定量限和检测限，信噪比10:1的浓度为定量限，定量限浓度确认为0.024μg/ml，信噪比3:1的浓度为检测限，检测限浓度确认为0.016μg/ml，然后配制6份定量限浓度的溶液，照苯胺测定方法，测定6份溶液的峰面积，以检测定量限精密度。
表4定量限与检测限
稀释过程 浓度 信噪比
0.6ml对照品→50ml 0.0253μg/ml 51
0.4ml对照品→50ml 0.0169μg/ml 20
0.2ml对照品→50ml 0.0084μg/ml 9
表5定量限精密度
名称 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD
峰面积 1.81 1.81 1.88 1.86 1.74 1.82 2.67 峰面积
名称 1 2 3 4 5 6 最小值 名称
信噪比 47 56 41 41 49 46 41 信噪比
测定结果定量限为0.0253μg/ml，检测限为0.016μg/ml；平行配制6份定量限浓度的溶液测定其吸收度RSD小于5.0％，符合要求，试验结果表明定量限精密度良好。
重复性
取苯胺对照品约20mg，精密称定，照“对照品溶液的制备”制备对照品溶液，平行制备2份；另取样品适量，精密称定，加入对照品贮备液5ml，照“供试品溶液的制备”制备供试品溶液，平行制备6份，照苯胺测定方法，计算6份溶液的含量，并计算RSD(n＝6)。
表6重复性
测定次数 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD
苯胺含量(％) 0.00102 0.00104 0.00104 0.001 0.00104 0.00101 0.00103 1.72
平行测定6份样品，其苯胺测定结果RSD小于10.0％，试验结果表明该方法测定美沙拉秦灌肠液中苯胺的重复性良好。
中间精密度
不同时间由不同的操作人员(乙)取苯胺对照品约20mg，精密称定，照“对照品溶液的制备”制备对照品溶液，平行制备2份，另取样品适量，精密称定，加入对照品贮备液5ml，照“供试品溶液的制备”制备供试品溶液，平行制备6份，照苯胺测定方法，计算6份溶液的含量，计算RSD，最后结合重复性的6个含量数据(操作人员甲测定)，计算12个含量数据的RSD。
表7中间精密度
Figure BDA0003455579470000051
由不同的操作人员不同时间平行测定6份样品，其苯胺含量测定结果RSD为1.05％，苯胺含量重复性与中间精密度12个数据RSD为2.42％，均小于10.0％，符合要求，试验结果表明该方法测定美沙拉秦灌肠液中苯胺的中间精密度良好。
准确度(回收率)
对照品约20mg，精密称定，加二氯甲烷配制成浓度分别为0.2mg/ml和0.002mg/ml的贮备液，精密量取浓度为0.002mg/ml的贮备液，照“对照品溶液的制备”制备对照品溶液，平行制备2份；精密量取0.2mg/ml的贮备液0.5ml、1.5ml，分别置100ml量瓶中，加二氯甲烷稀释并定容至刻度，作为50％对照品溶液和150％对照品溶液，取供试品溶液适量(约相当于美沙拉秦1.0g)，分别加入50％对照品贮备液5ml、对照品贮备液5ml、150％对照品贮备液5ml，照“供试品溶液的配制”制备加标供试品溶液，各平行制备3份；取供试品溶液适量(，照“供试品溶液的配制”制备供试品溶液照苯胺测定方法，计算样品回收率。
表8准确度结果
Figure BDA0003455579470000061
该方法测定其高、中、低浓度含量回收率均在90％～108％之间，平均回收率为97.18％，RSD小于10.0％；均符合要求，试验结果表明该方法用于测定美沙拉秦灌肠液中苯胺含量，准确度高、回收率好。

Claims (2)

1.一种美沙拉秦灌肠液中的苯胺测定方法，其特征在于：该方法采用高效液相色谱法进行测定，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：取本品适量15g，精密称定，置试管中，加入1mol/L氢氧化钠溶液10ml使溶解，精密加入二氯甲烷15ml，剧烈振摇1分钟，用可分离水相和有机相的滤纸滤过，精密量取有机相溶液5ml置另一试管中，精密加入0.01mol/L磷酸溶液5ml，剧烈振摇1分钟，用硅过滤器滤过，取水相溶液作为供试品溶液。
2)对照品溶液的制备：精密称取苯胺对照品适量，加二氯甲烷制成每1ml含2μg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取5ml置试管中，加入1mol/L氢氧化钠溶液10ml，精密加入二氯甲烷10ml，自“剧烈振摇1分钟”起同法操作，取水相溶液作为对照品溶液。
3)测定方法：照高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液-乙腈(90:10)为流动相，检测波长为235nm，流速每分钟1.0ml，柱温30℃。精密量取供试品溶液及对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算含量。
2.根据权利要求1美沙拉秦灌肠液中的苯胺测定方法，其特征在于：步骤3)所述的磷酸盐缓冲液为取磷酸二氢钠6.9g溶解至1000ml水中，用稀氢氧化钠溶液调节pH值至8.0。
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