CN114369605B - 植物抗病基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，本发明公开了一种植物抗病基因及其应用。其中，本发明提供了一种植物抗病基因New1，植物抗病基因New1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，植物抗病基因New1来自苔藓植物。本发明还提供了一种表达植物抗病基因New1的重组表达载体。本发明还提供了一种表达植物抗病基因New1的工程菌种。本发明提供的植物抗病基因New1、重组表达载体或工程菌种通过激发外类群植物产生植物过敏反应，使外类群植物获得抗病性。本发明为设计诱导植物产生抗病性的植物抗病基因工程提供了新的目的基因资源，以降低研发植物抗病性生物材料的成本，具有重要的实践应用价值。

Description

植物抗病基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种植物抗病基因及其应用。

背景技术

植物对病原物侵染的抗性表现在寄主和非寄主抗性两个方面。寄主抗性的抗病基因R(resistance gene)是指寄主体内能特异性识别病原并激发抗病反应的基因，它与病原物的无毒基因Avr (avirulence gene)互补，具有专门性和针对性。非寄主抗性的抗病基因具有广谱、抗性强烈和持久的特点，使植物免受大多数病原菌的危害。非寄主抗性使植物对大多数病原物产生抗性，并不是由植物单个专化性抗病基因控制的，不易随着病原物的变异而丧失，具有稳定持久抗性的特点。

植物抗病过程常伴随植物过敏反应(Hypersensitive Response，HR)，植物在受到病原物入侵时在病原侵染点及其周围的细胞发生程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)，用于限制病原物的增殖与扩散。植物过敏反应是植物-病原物不亲和互作后发生的一种细胞快速坏死的典型抗病反应，是植物的一种抗病机制。

苔藓植物包括苔类（～7300种），藓类（～13000种），和角苔类（～250种）三大支。苔藓植物是大自然的先锋植物，具有极强的抗逆作用，具有抗旱抗寒耐热等重要农业经济性状，是大自然的基因宝库。然而目前的抗病基因的研究主要集中于维管植物，缺乏苔藓植物中抗病基因的研究。植物抗病基因工程所选的目的基因大多是来自植物自身的抗病基因，关于苔藓植物中的抗病基因的抗病性以及抗病基因克隆到外类群植物的抗病效果的研究还比较少见。因而，需要寻找一种对外类群植物具有抗病效果的基因，以降低研发植物抗病性生物材料的成本。

发明内容

本发明实施例提供一种植物抗病基因及其应用，以降低研发植物抗病性生物材料的成本。

第一方面，本发明提供一种植物抗病基因New1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供一种表达植物抗病基因New1的重组表达载体，通过连接重组基因片段New1-short和线性载体pCHF1获得所述重组表达载体。

第三方面，本发明提供一种表达植物抗病基因New1的工程菌种，利用表达植物抗病基因New1的重组表达载体转化大肠杆菌细胞获得质粒，利用所述质粒转化农杆菌细胞获得所述工程菌种。

第四方面，本发明提供的植物抗病基因New1、重组表达载体或工程菌种在提高外类群植物抗病性方面的应用。

本发明实施例提供的植物抗病基因New1选自苔藓植物，通过在前期工作中测序了大量的苔藓植物全基因组数据，发现苔藓植物含有众多新型的R抗病基因，针对其中一个主要的植物抗病基因New1作为植物抗病基因工程的目的基因。本发明实施例提供的植物抗病基因New1、重组表达载体或工程菌种通过激发外类群植物产生植物过敏反应，使外类群植物获得抗病性。本发明为设计诱导植物产生抗病性的植物抗病基因工程提供了新的目的基因资源，具有重要的实践应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例中表达植物抗病基因New1的未染色烟草叶片结果图；

图2是本发明一实施例中表达植物抗病基因New1的染色烟草叶片结果图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的细胞株、试剂及载体等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作为举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。

以下通过实施例对本发明进行进一步的说明。

一种植物抗病基因New1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

可理解地，在植物抗病基因中，NBS-LRR基因家族是最大的抗病基因家族。由于NBS（核苷酸结合位点）这一区域包含有某些保守程度较高的基因序列，所以在对植物抗病基因进行识别和分类方面具有重要的作用。NBS-LRR抗病基因的氨基酸链N端含有一个核苷酸结合富亮氨酸重复受体(NLR)结构，在本发明实施例中，植物抗病基因New1通过NLR结构提高植物的抗病性。NLR具有包括N端的信号结构域、NBD结构域和LRR结构域的三段式结构，三个结构域可以完美配合形成一个分子开关，在适当的时机启动植物的免疫系统，以抑制或减少病原侵染对植物的伤害。在和病原生物数百万年共同进化的过程中，NLR结构具有了足够的多样性，可以识别以及快速适应不断演化的各种病原生物，保证植物的正常生长。病原菌分泌的分子被称为效应子，NLR对效应子的识别导致了细胞的一些反应，包括活性氧的积累、MAP激酶级联的激活和防御基因的表达，NLR的激活最终导致植物局部细胞死亡，发生植物过敏反应。

可选的，所述植物抗病基因New1来自苔藓植物。

可理解地，苔藓植物包括苔类（～7300种），藓类（～13000种），和角苔类（～250种）。苔藓是陆地的拓荒者，是重要的抗逆基因宝库。本发明实施例在前期工作中利用组学数据在苔藓植物的基因组中发现了众多新型R抗病基因，植物抗病基因New1来源于芽孢角苔（Anthoceros angustus）的基因组，属于尚未报道的苔藓植物特有的抗病基因的新类别。

一种表达植物抗病基因New1的重组表达载体，通过连接重组基因片段New1-short和线性载体pCHF1获得所述重组表达载体。

可理解地，构建重组基因表达载体是目的基因与运载体结合的过程，也是基因工程的核心。构建重组表达载体使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。目的基因与运载体结合的过程实际上是不同来源的DNA重新组合的过程，如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组表达载体。本发明实施例通过连接重组基因片段New1-short和线性载体pCHF1获得表达植物抗病基因New1的重组表达载体。

可选的，所述重组表达载体通过酶切位点KpnI和BamHI连接所述重组基因片段New1-short和所述线性载体pCHF1。

可理解地，酶切位点（Restriction Enzyme cutting site）是DNA上一段碱基的特定序列，限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将DNA序列切成两段。限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列，有些酶的切割位点在回文的一侧（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ类酶如AluI、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端。本发明实施例选择酶切位点KpnI和BamHI连接重组基因片段New1-short和线性载体pCHF1。

可选的，所述重组基因片段New1-short的重组引物包括：

上游引物New1-short-F(pCHF1-CZ)：GGGGACGAGCTCGGTACCATGGAACAACTGTGGTGT；和，

下游引物New1-short-R(pCHF1-CZ)：AGGTCGACTCTAGAGGATCCATGCGTCATCACCCCGGT。

可理解地，重组引物包括上游引物（Forwardprimer，F）和下游引物（Reverseprimer，R）。聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。将两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。其基本原理是将突变碱基、插入或缺失片段、或一种物质的几个基因片段设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。重叠延伸拼接PCR通过重叠延伸引物（上游引物片段的 3′端碱基序列和下游引物片段 5′端碱基序列的共线化形式），在不同的靶基因片段上引入重叠互补区，引导这些片段顺序连接。

一种表达植物抗病基因New1的工程菌种，利用表达植物抗病基因New1的重组表达载体转化大肠杆菌细胞获得质粒，利用所述质粒转化农杆菌细胞获得所述工程菌种。

可理解地，农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞采用最多的方法。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumour inducing)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。农杆菌转化法的原理是构建双元表达载体系统，由两种质粒组成，一种是位于大肠杆菌中的穿梭质粒，另一种是位于农杆菌中的辅助性质粒。将重组质粒电转化到农杆菌感受态细胞中后，用含有重组质粒的农杆菌去侵染植物根部切口，通过辅助性质粒的Vir区表达蛋白与重组质粒T-DNA区（目的片段）的反式作用激活T-DNA的转移，从而将目的片段整合到植物细胞基因组中。随着愈伤组织的形成，使得新生细胞均含有该目的片段的基因。

可选的，所述工程菌种具有大观霉素和利福平抗性的阳性。

可理解地，培养基中加入大观霉素spec和利福平rif的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌，具有大观霉素和利福平抗性的阳性的农杆菌的质粒转化率高。质粒中含有大观霉素抗性基因和利福平抗性基因作为筛选标签，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本发明一实施例中采用农杆菌感受态细胞GV3101菌株，GV3101菌株的核基因中含有筛选标签利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，还含有辅助性Ti质粒，Ti质粒含有vir基因。Ti质粒含有筛选标签spec，赋予GV3101菌株大观霉素抗性，适用于作物植物的转基因操作。感受态细胞是指经过处理（一般用CaCl₂溶液处理即可)后处于能够吸收外源DNA的状态的细胞。

植物抗病基因New1、重组表达载体或工程菌种在提高外类群植物抗病性方面的应用。

可选的，所述外类群植物是作物植物。

可理解地，植物抗病基因New1选自苔藓植物的芽胞角苔，除了在芽胞角苔自身表现出抗病性，更重要的是在苔藓植物类群之外的外类群植物中同样表现出抗病性。作物植物指农业上栽培的各种植物，包括粮食作物、经济作物等能大批长成或大面积收获，供盈利或食用的植物，如水稻、玉米、豆类、薯类、青稞、蚕豆、小麦、花生、向日葵、黄瓜、西红柿和烟草等。随着植物基因工程的发展，通过将人工分离和修饰过的外源基因导入到需要改良的作物植物的基因组中，使之产生新的性状，如抗虫、抗病、抗旱、抗寒、高产、优质等，从而达到改造作物植物的目的。

可选的，所述植物抗病基因、所述重组表达载体或所述工程菌种通过激发所述外类群植物产生植物过敏反应，使所述外类群植物获得抗病性。

实施例1、构建表达植物抗病基因New1的重组表达载体

通过PCR扩增出截短的植物抗病基因New1片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；聚丙烯凝胶电泳后胶回收PCR产物，采用Pfam数据库鉴定出基因的NBS的位置；由于LRR结构域会阻碍NLR基因的表达，通过PCR扩出氨基端结构域+NBS结构域基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

设计重组引物，进行重组PCR扩增重组基因片段New1-short，聚丙烯凝胶电泳后胶回收PCR产物；

其中，重组引物包括：

上游引物New1-short-F(pCHF1-CZ)：GGGGACGAGCTCGGTACCATGGAACAACTGTGGTGT；和，

下游引物New1-short-R(pCHF1-CZ)：AGGTCGACTCTAGAGGATCCATGCGTCATCACCCCGGT。

PCR体系的成分和含量如表1。

表1 PCR体系的成分和含量

退火温度为58℃，延伸时间为1分钟（根据Taq酶的扩增效率来设置，一般1kb/min），重复两次；

采用同源重组的方法连接重组基因片段New1-short和线性载体pCHF1（酶切位点KpnI和BamHI），连接条件：准备So so mix 5 μl，线性载体 2 μl和目的片段 3 μ1组成l0μl体系；50℃条件下PCR扩增15分钟。

实施例2、构建表达植物抗病基因New1的工程菌种

转化大肠杆菌

常规转化（冰30分钟-热45秒-冰2分钟-复苏1小时）：100μl的感受态细胞加入连接产物，轻轻混匀，冰上静置30分钟；42℃水浴热激45秒后迅速转置冰浴，静置2分钟；向离心管中加入700μl无抗性LB培养基（普通培养基），37℃/200rpm条件下复苏1小时；复苏结束后5500rpm离心5分钟，在超净工作台中吸掉上清650μl培养基，剩余50ul进行重悬沉淀；重悬沉淀后吸取转移至spec抗性的LB培养基上，涂板至看不见水渍为止；倒置培养基在37℃条件下过夜培养。

菌液PCR鉴定

挑菌：在超净工作台上吸取spec抗性的LB培养液300μl，挑选饱满的8个菌落，打掉枪头至2ml移液管；37℃，200rpm条件下摇菌至少3小时；采用上下游引物（各1μl）：pCHF1-F/R、Green mix（12.5μl）、模板（1μl），菌液、ddH₂O（10μl）组成25μlPCR体系菌液；跑胶条件：120v，30分钟（若序列较长，则40分钟）；200μl送测2管，剩下100μl用于保存菌液；若测序结果与基因片段一致，且有酶切位点，则确定已连接上，完成提质粒。

转化农杆菌

在50μl农杆菌感受态细胞(GV3101)中加入2μl质粒，然后用枪头搅拌；冰上放置5分钟，再迅速放入液氮中5分钟，最后37℃条件水浴5分钟；水浴后迅速放在冰上5分钟；加入700μl无抗培养基液(LB液体培养基)后上下摇匀；200rpm条件复苏3-4小时；在超净工作台中，吸掉650μl上清培养基，剩余的50ul重悬沉淀；重悬沉淀后吸取转移置spec + rif抗性的LB培养基上，涂板至看不见水渍为止；28℃条件下倒置涂布板培养48小时。

农杆菌菌液PCR

挑菌（挑选6个转化率高的抗性为阳性菌落，加700μl的spec+rif抗性LB培养基）、摇菌、过夜培养、菌液PCR、跑胶。

实施例3、表达植物抗病基因New1的工程菌种侵染烟草

摇菌：15ml移液管中加入5ml LB+70μl菌液，8ml LB+140μl菌液样品，样品、阳性、阴性各两管、空白对照一管；摇床中过夜使菌液达到一定浓度；用分光光度仪量OD值，OD值要达到0.8；按照机器上的说明预热20分钟，调波长λ=600nm，将盛spec+rif溶液的比色皿放入比色皿座架中的第一格内并调零；一半溶液加入比色皿内测量，测量完成后记录OD值，回收溶液（同一个样品可以用同一个比色皿，手接触有磨砂的一面，不要接触光滑的一面，否则会影响OD值）；阳性（2管）、阴性（2管）：各自调至体积相等；2管相同样品中，选择其中OD值更接近0.8的一管保留5ml；移液管在5500rpm条件离心5分钟(防止质粒从细胞内被甩出)，倒掉上清液；用缓冲液3ml洗涤，把沉淀吹吸混匀；100ml蒸馏水，MES 1ml，MgCl 21ml和AS200μl配制缓冲液；100rpm，28℃条件下摇床2.5-3小时；注射之前给烟草浇水，利于注射叶片；注射器注射时叶尖朝着操作者，翻上叶片。

观察侵染叶片

DAB染色：20mg DAB粉末（-20℃保存）+38ml蒸馏水配成终浓度为0.5mg/ml的DAB染液；将离体的烟草叶片浸入DAB染液；抽真空30min使得叶片完全浸入DAB染液中；室温孵育过夜后在95%乙醇中80℃水浴脱色并拍照。至少侵染3次后观察有无表型，结果如表2：

表2 表达植物抗病基因New1的工程菌种侵染烟草结果

本实施例通过表达植物抗病基因New1的农杆菌侵染烟草，观察烟草叶片的植物过敏反应结果。从表2的结果说明，在接种表达植物抗病基因New1的农杆菌侵染后，第1天（1dpi）的烟草叶片均未出现表型，随着时间的增加，第3天和第5天（3dpi和5dpi）均出现表型，由于表达植物抗病基因New1是瞬时表达实验，所以7天（7dpi）后不再表达，表型消失。如图1中表达植物抗病基因New1的未染色烟草叶片结果图和图2中表达植物抗病基因New1的染色烟草叶片结果图，可以观察到烟草叶片部位由于植物过敏反应而出现的抗病斑，未进行染色前观察不明显，染色后可以明显观察到，相比于表达植物抗病基因New1呈阴性的烟草叶片部位，表达植物抗病基因New1呈阳性的烟草叶片部位出现大片的抗病斑，这是因为植物抗病基因New1在阳性农杆菌中的转化率高于阴性农杆菌。本实施说明植物抗病基因New1能够在烟草中表达，激发烟草叶片产生植物过敏反应，使烟草获得抗病性。选自苔藓植物的抗病基因New1是有抗病功能的，并且可以被用来转入到外类群植物中，激发外类群植物产生植物过敏反应，使外类群植物获得抗病性。

以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳市仙湖植物园（深圳市园林研究中心）

<120> 植物抗病基因及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> Anthoceros angustus

<400> 1

atggaacaac tgtggtgtgg cagggcttgt gcttgcctgc tcatcaagtt atgcagctgc 60

ctgtctgcac ctgcgaatca agcggcgttg gtgacatgcg aagagaagct caggagcttt 120

cgggagagaa tgtctcttgc cctacagact cgccgtcccg tttgcgatct gccggatctg 180

cagtggcccc cggcggtcgg gatcgatgac cagattgata aggtgctcga gtttctgggg 240

cagactaact ctgaccaggg cgtgtcgtgc gtggtctgct tccacggggt gaacggtgtg 300

ggtaagagcc ggctcatgtt cgaggtgcag aacaggttcc cagcccagtc ccactttgac 360

aacttctaca ccatggactt cgcttcggca tccgatctcc aaagcctcct gtacttgcaa 420

caggggctcg tggagcatat cctgggcaca ggcacggcca ctgcactgag aagtacggat 480

tcgggcagga cgactatcag gaggtgcctg gctttccaga aggcgaggga gcagcgggtg 540

ctgtttgcct tcgacaacgt tgggaaggcg gaacacttga cttccatctt gccactgaac 600

ctggctgagg agctgcccgc tgggagctgc attctggtgt cactggccca caacgatcag 660

attctgagag ccatcgaaca ggtgtttcca cgcagcagga catgccagca caaaacacac 720

tcggtgactc gtctgaaaga agaggatgcc aagaagctcc tcagcctgca cgcagttaac 780

ctgccgaagg acgagtcggt ggtggaaaaa ctcgttgccc gctgtgacgg gctccctttc 840

ctgctcaagg ccgtgggtca acggcttgcg cagtgcgcag actggcaagc tgtgctggac 900

gggctgagaa aagctgaaga cggtgctctg gtgactgatg agcttaccgg ggtgatgacg 960

catcccaacg ccgtgccagc agaaaaacct tcacccgctg gcaggttacc atccatacca 1020

tccgtgaagc ctgcggtgcc agcacgcaaa ccttcaaacg cttgcaggtt aacatccata 1080

ccatccggga agcctgcgcc acttggccgt cgtgtgctag tcctgcgtgt ggaaccgagt 1140

tacagaaaat tggacaacgc ggccctgaac aagcgcctgg acagcaagtt gaaggttgtg 1200

ttcggagccc tggatgaaga gctgcagaat gcgctgaatg acatccgaag cttgctcgct 1260

ggttgggact ggaagacagt ggaggccatc cttgggacag atcttgatca tgggaaggac 1320

ttgatgaaga agctggctga tcggtctctc atatccccca aggtgagcaa gggggcgcgc 1380

ttggctccgg tagccaacct taccaggtac tcggggcctg gtccttggaa gaccaatgtg 1440

gtggctgtgg atgagcgcgt cctgcagccg tccaataccg tggccagtct ggtggagctg 1500

gatcatcctg aggctgtcac gcttgacaga atccagggcg tgaaatatct ggtggtgcac 1560

aacagttcac tggacgcgac atggtcccgt caccttgctg atttgaagtt cttgtacgtg 1620

gtgcaacaca agagctaccg gaggccatgt tcgtctcaag gaagctggaa gagctccgcc 1680

tga 1683

<210> 2

<211> 963

<212> DNA

<213> Anthoceros angustus

<400> 2

atggaacaac tgtggtgtgg cagggcttgt gcttgcctgc tcatcaagtt atgcagctgc 60

ctgtctgcac ctgcgaatca agcggcgttg gtgacatgcg aagagaagct caggagcttt 120

cgggagagaa tgtctcttgc cctacagact cgccgtcccg tttgcgatct gccggatctg 180

cagtggcccc cggcggtcgg gatcgatgac cagattgata aggtgctcga gtttctgggg 240

cagactaact ctgaccaggg cgtgtcgtgc gtggtctgct tccacggggt gaacggtgtg 300

ggtaagagcc ggctcatgtt cgaggtgcag aacaggttcc cagcccagtc ccactttgac 360

aacttctaca ccatggactt cgcttcggca tccgatctcc aaagcctcct gtacttgcaa 420

caggggctcg tggagcatat cctgggcaca ggcacggcca ctgcactgag aagtacggat 480

tcgggcagga cgactatcag gaggtgcctg gctttccaga aggcgaggga gcagcgggtg 540

ctgtttgcct tcgacaacgt tgggaaggcg gaacacttga cttccatctt gccactgaac 600

ctggctgagg agctgcccgc tgggagctgc attctggtgt cactggccca caacgatcag 660

attctgagag ccatcgaaca ggtgtttcca cgcagcagga catgccagca caaaacacac 720

tcggtgactc gtctgaaaga agaggatgcc aagaagctcc tcagcctgca cgcagttaac 780

ctgccgaagg acgagtcggt ggtggaaaaa ctcgttgccc gctgtgacgg gctccctttc 840

ctgctcaagg ccgtgggtca acggcttgcg cagtgcgcag actggcaagc tgtgctggac 900

gggctgagaa aagctgaaga cggtgctctg gtgactgatg agcttaccgg ggtgatgacg 960

cat 963

Claims (9)

1.一种植物抗病基因New1-short，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的植物抗病基因New1-short，其特征在于，所述植物抗病基因New1-short来自苔藓植物。

3.一种表达如权利要求1所述的植物抗病基因New1-short的重组表达载体，其特征在于，通过连接所述基因New1-short和线性载体pCHF1获得所述重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体通过限制性内切酶KpnI和BamHI连接所述基因New1-short和所述线性载体pCHF1。

5.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述基因New1-short的重组引物包括：

上游引物New1-short-F：

GGGGACGAGCTCGGTACCATGGAACAACTGTGGTGT；和，

下游引物New1-short-R：

AGGTCGACTCTAGAGGATCCATGCGTCATCACCCCGGT。

6.一种工程菌，其特征在于，利用如权利要求3所述的重组表达载体转化大肠杆菌细胞获得质粒，利用所述质粒转化农杆菌细胞获得所述工程菌。

7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌具有大观霉素和利福平的抗性。

8.根据权利要求1所述的植物抗病基因New1-short、权利要求3所述的重组表达载体或权利要求6所述的工程菌在提高外类群植物针对病原物侵染性疾病的抗病性方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述外类群植物是作物植物。

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