CN116103331A - SlGATA22基因在提高番茄植株抗寒和抗病性中的应用 - Google Patents

SlGATA22基因在提高番茄植株抗寒和抗病性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了SlGATA22基因在提高番茄植株抗寒和抗病性中的应用，涉及生物技术和作物遗传育种领域。本发明研究发现，采用基因编辑技术在番茄植株中敲除SlGATA22基因，获得的番茄植株具有更强的细菌性斑疹病抗性，同时抗寒性更高，因此可以通过基因编辑，敲除SlGATA22基因来进行番茄种质资源定向改良。本发明还提供了提高番茄植株抗寒性和对细菌性斑疹病的抗病性的方法，通过一步简单操作即实现对于番茄抗寒性和细菌性斑疹病抗病性的同步改良，精准高效，极大提升育种速度；利用该方法提高番茄品种的抗寒性和抗病性对环境无污染，病害防治效果好。

Description

SlGATA22基因在提高番茄植株抗寒和抗病性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术和作物遗传育种领域，特别是涉及SlGATA22基因在提高番茄植株抗寒和抗病性中的应用。
背景技术
番茄栽培过程中面临着一系列的生物和非生物胁迫。病原体可以严重影响植物的生长发育，最终通过多个生物过程降低其产量，如增加细胞死亡和改变植物形态等。植物病原体对全球粮食安全构成严重威胁，产量损失可达16％。番茄细菌性斑疹病是由丁香假单孢菌番茄叶斑病致病型引起的，主要危害叶、茎、花、叶柄和果实，尤以叶缘及未成熟果实最明显。番茄细菌性斑疹病病原菌可在番茄植株、种子、病残体、土壤和杂草上越冬，在干燥的种子上可存活20年，可随种子远距离传播。由于该病是一个重要的种传病害，因此往往需要加强检疫，防止带菌种子传入非疫区。目前对于该病的防治通常选用耐病抗病品种，实行轮作减少田间病菌来源，以及加强栽培管理和化学防治等措施，其中效果最好又不污染环境的方法是选用耐病抗病品种，但目前市场上可供选择的抗病品种以及育种过程中可利用的抗性资源有限，因此通过生物技术途径获得抗性资源具有重要意义。
寒冷对植物有诸多不利影响，包括抑制种子萌发，影响植物生长、繁殖，降低作物产量和品质。冷胁迫对细胞的生理和代谢平衡有破坏作用，可能会影响膜定位蛋白的功能，并触发下游反应，对植物有致命危害。低温可以引起番茄植株细胞死亡、生长发育迟缓以及果实畸形等，严重制约番茄生产。
低温高湿的环境也是引起包括番茄细菌性斑疹病在内的多种病害的重要因素，早春季节以及南方冬季的番茄生产常面临低温冷害和细菌性斑疹病等病害的多重威胁。因此提高番茄植株抗寒性和细菌性斑疹病抗病性对于番茄生产意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供SlGATA22基因在提高番茄植株抗寒和抗病性中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现，采用基因编辑技术在番茄植株中敲除SlGATA22基因，获得的番茄植株具有更强的细菌性斑疹病抗性，同时抗寒性更高，因此可以通过基因编辑进行番茄种质资源定向改良。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种提高番茄植株抗寒和/或抗病性的基因，所述基因为SlGATA22基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供一种敲除SlGATA22基因的CRISPR/Cas9质粒，包括sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒；
所述sgRNA1表达盒靶向SlGATA22基因中第159-179位核苷酸，所述sgRNA2表达盒靶向所述SlGATA22基因中第291-311位核苷酸；
所述SlGATA22基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种敲除SlGATA22基因的重组微生物菌株，包括上述的CRISPR/Cas9质粒。
本发明还提供上述的基因、CRISPR/Cas9质粒或重组微生物菌株在以下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)构建SlGATA22蛋白功能丧失的转基因番茄植株，所述SlGATA22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)提高番茄植株抗寒性；
(3)提高番茄植株对细菌性斑疹病的抗病性；
(4)同时提高番茄植株抗寒性和对细菌性斑疹病的抗病性。
本发明还提供一种提高番茄植株抗寒性的方法，包括构建SlGATA22蛋白功能丧失的转基因番茄植株的步骤，所述SlGATA22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述转基因番茄植株通过CRISPR/Cas9基因编辑方法构建。
进一步地，所述CRISPR/Cas9基因编辑方法采用的质粒为上述的CRISPR/Cas9质粒
进一步地，所述CRISPR/Cas9基因编辑方法采用的CRISPR/Cas9质粒包括sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒；
所述sgRNA1表达盒靶向SlGATA22基因中第159-179位核苷酸，所述sgRNA2表达盒靶向所述SlGATA22基因中第291-311位核苷酸；
所述SlGATA22基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种提高番茄植株对细菌性斑疹病的抗病性的方法，包括构建SlGATA22蛋白功能丧失的转基因番茄植株的步骤，所述SlGATA22蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
进一步地，所述转基因番茄植株通过CRISPR/Cas9基因编辑方法构建；
所述CRISPR/Cas9基因编辑方法采用的CRISPR/Cas9质粒包括sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒；
所述sgRNA1表达盒靶向SlGATA22基因中第159-179位核苷酸，所述sgRNA2表达盒靶向所述SlGATA22基因中第291-311位核苷酸；
所述SlGATA22基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述细菌性斑疹病的致病菌为丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)pv.tomato DC3000。
本发明还提供一种同时提高番茄植株抗寒性和对细菌性斑疹病的抗病性的方法，包括构建SlGATA22蛋白功能丧失的转基因番茄植株的步骤，所述SlGATA22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明公开了以下技术效果：
本发明研究发现，采用基因编辑技术在番茄植株中敲除SlGATA22基因，获得的番茄植株具有更强的细菌性斑疹病抗性，同时抗寒性更高，因此可以通过基因编辑进行番茄种质资源定向改良。
采用基因编辑技术进行基因敲除，后代可以获得无任何外源基因，同时实现目标基因功能缺失的番茄材料。本发明通过一步简单操作即实现对于番茄抗寒性和细菌性斑疹病抗性的同步改良，精准高效，极大提升育种速度；利用该方法提高番茄品种的抗寒性和抗病性对环境无污染，病害防治效果好。
由于本发明中SlGATA22基因是不同番茄品种和资源中普遍存在的基因，因此本领域技术人员可以对任何选中的番茄材料进行基因编辑敲除，实现定向改良，普适性强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为SlGATA22基因结构及编辑位置示意图；
图2为氨基酸序列对比示意图；
图3为野生型植株和基因编辑植株在低温胁迫和病原菌接种后的表型观察结果，其中(a)为冷胁迫处理10天后的植株；(b)为病原菌接种后7天的叶片对比；(c)为病原菌接种后台盼蓝染色叶片显微观察对比坏死细胞的数量。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所指的SlGATA22基因的DNA序列(SEQ ID NO.1)：
TCACACCAAAAACACACACTCGTTTCACACATTCCTCTTTTAGCTGAAATAATTTCTAATGGAAACACCTGATTTCTTTCAAACAGGTTACTATAACTCTTCCGAAAAACAGCTCATTTCTGATGTCAAAAATGGTGAACATTTCGTTGTTGACGACCTTTTGGACTTGCCTAACGATGAAGGAATGGCCACTGATGACACGTTGGACCTTACCGTCATTGGAAACTCCACGGATTGCTCCGTAGTACATAATTCATGTAACTCCTCATTGTCTGGAAGCAATCACCACCCACAAT CACTCGGCTACCGGGATTTCCCCCAAGGACACTTGTCCACTGAATTCGCTCTTCCAGTAAGCACAATTTTCATGTAATTTCGTAACGTGGTTTAATTTGTTGTTTTGTATATAAAAGAAGTGAGAAAAAGTAGTCACTACACAAGTAACTTTAATGCTTTTGTGACGAGTTTTGTTTAATAACCTTTTTTTTTCTTCTAGAAAAGAAAAGAAATATTTACTTTTCTTGTTTGGTTGCTGAATACAAAGATGAAAATTCATGAATTTTTTTTGTTTTTTTTCTTCTAAAATGAATTTAACGAAAAAATAGTTATTGTATTTGCCATTCGAATTGGTGCCTATTGTCCCCAAATTATGAGACCACTAGTTTGAAGAGACCAAAATTCAAATCATCAAGACAATAAGTGAATAACAGTGTAATTTCATAAGTATGATTTGAATATGTAAATCTTATTCTTGAGATAGAGAGATTAAATTATTATTATTTTTTAAAATATTTGTTACTAACAAATTGTTGTTTTTTAAATAAAAATACAGTATGAAGATATGGCTGAGCTAGAATGGCTGTCGAATTTTGTGGAAGAATCATTTTCTAGTAACGAGATGCATAAAATGCAGATGGTGCAAGCAATGAGGAATCGAACTGATTCTGAGATTCACCAATTCATTCCTGACCCGAACCGAGCATCCGCAACGTCTAACACAATCTTCAAGCCGGAAATGCCTGTCCCAGCCAAGGCACGTAGCAAACGATCACGAATGGCTCCAGGAAACTGGGCCTCTCGATTGCTAGTCGTGTCTCCGAACACTACAAACCCGGATTCCTCGATGGACACGATATCAGTGCAAGACATGTCATCGTCATCAGAGTCCGGGATGATAATCCCGAGCTCTGGGAAGAAGACAGTGAAGTGTTCCTCTGCTCCGAAAAAGAAAGAGAATAATATCCATCATGTTCCGAGTAACAATACGGGTAGCAATAGTGAAGGAAGGAAGTGTCTTCATTGTGCTACGGATAAGACACCACAATGGAGGACAGGACCATTGGGTCCGAAAACACTTTGCAATGCTTGTGGTGTAAGGTACAAGTCTGGACGTCTCGTTCCTGAATATCGACCTGCTGCTAGCCCAACTTTTATGCTCACTAAACACTCCAATTCTCACCGCAAAGTGCTTGAGATTCGGAGGCAAAAGGAAGTTACTCAAGTCGAACACCAACACCAACATCAATTCCTTCCTCATAACATGATGTTCGATGTATCCAATGCCGATGATTATTTGATTCATCAACATATGGGGCCAGATTTTCGACAGTTAATCTAG。
SlGATA22蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：
METPDFFQTGYYNSSEKQLISDVKNGEHFVVDDLLDLPNDEGMATDDTLDLTVIGNSTDCSVVHNSCNSSLSGSNHHPQSLGYRDFPQGHLSTEFALPYEDMAELEWLSNFVEESFSSNEMHKMQMVQAMRNRTDSEIHQFIPDPNRASATSNTIFKPEMPVPAKARSKRSRMAPGNWASRLLVVSPNTTNPDSSMDTISVQDMSSSSESGMIIPSSGKKTVKCSSAPKKKENNIHHVPSNNTGSNSEGRKCLHCATDKTPQWRTGPLGPKTLCNACGVRYKSGRLVPEYRPAASPTFMLTKHSNSHRKVLEIRRQKEVTQVEHQHQHQFLPHNMMFDVSNADDYLIHQHMGPDFRQLI。
以下实施例中使用的pYLCRISPR/Cas9和YLgRNA-u3b/d质粒购自Addgene(https://www.addgene.org/)，E.coli DH10B感受态细胞购自上海昂羽公司，农杆菌GV3101购自上海昂羽公司，丁香假单胞菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)pv.tomato DC3000(PstDC3000)购自ATCC:The Global Bioresource Center(https://www.atcc.org/)。
实施例1
1.CRISPER-Cas9重组质粒的构建
(1)sgRNA靶点设计及表达盒的构建
以茄科数据库SGN网站(http://solgenomics.net/)公布的序列号为Solyc08g066510的基因序列(即SEQ ID NO.1)设计两个sgRNA的靶点序列分别命名为sgRNA1和sgRNA2，将设计好的gRNA靶点序列与番茄基因组序列进行比对，从而排除非特异性靶点。sgRNA1靶点(靶点一)的核苷酸序列为5’-CATCGTTAGGCAAGTCCAAA-3’(SEQ IDNO.3)，对应SEQ ID NO.1中第160-179位核苷酸；sgRNA2靶点(靶点二)的核苷酸序列为5’-CCCGGTAGCCGAGTGATTGT-3’(SEQ ID NO.4)，对应SEQ ID NO.1中第292-311位核苷酸。
sgRNA表达盒构建反应体系如下：
第一轮PCR(50μL体系)：
KOD OneTM PCR Master Mix 25μL、H2O 18μL、YLgRNA-u3b/d 4μL(模板)、10μmol/LU-F和AtU3bT1/AtU3dT2各1.5μL(反应一)；
KOD OneTM PCR Master Mix 25μL、H2O 18μL、YLgRNA-u3b/d 4μL(模板)、10μmol/LgRNA-R和gRT1/gRT2各1.5μL(反应二)。
第一轮反应程序为：98℃10s；58℃5s，68℃1s，35个循环；4℃保存。
第二轮PCR：分别取两个靶基因的第一轮PCR中的反应一和反应二的产物各1μL加入到8μL的ddH2O中混合稀释10倍，各取1μL作为第二轮PCR的模板。
第二轮反应体系：KOD OneTM PCR Master Mix 25μL、H2O 21μL、10μmol/L通用混合引物3μL(靶位点一：B1’+B2；靶位点二：B2’+BL)、反应一+反应二稀释液1μL。
第二轮反应程序为：98℃10s；58℃5s，68℃1s，35个循环；4℃保存。
sgRNA表达盒构建引物表见表1：
表1 sgRNA表达盒构建引物表
Figure BDA0004118996870000061
(2)PCR产物回收
使用胶回收试剂盒将两个靶位点进行胶回收。胶回收片段为620bp(靶点一)和230bp(靶点二)。
(3)将sgRNA1与sgRNA2表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9质粒
反应总体系为15μL，反应体系如表2所示：
表2
Figure BDA0004118996870000071
PCR反应程序：37℃5min，10℃5min，20℃5min，10个循环；37℃5min。
2.连接产物的转化
将连接产物采用热激发将10μL的连接产物转入E.coli DH10B感受态细胞中，具体方法如下：取一支总体积含量100μL的E.coli DH10B感受态细胞于冰上至融化；将10μL的连接产物加入其中，轻轻吹打混匀，冰上静止20min；之后在42℃热激45s，然后立即冰上静置2min，随后加入600μL LB液体培养基，在200r/min、37℃，1h；活化结束后，5000r/min离心4分钟，弃去500μL上清液并重悬菌液，吸取菌液50μL涂板到含卡那霉素(50mg/mL)的固体LB培养基上，直至单克隆菌落1mm；挑取单菌落于含卡那霉素(50mg/mL)液体LB培养基扩繁培养，从而测序鉴定。
3.转基因番茄的获取及阳性植株鉴定
选取阳性克隆菌液提取质粒后转入农杆菌GV3101中，运用叶盘法侵染Micro-Tom番茄子叶。将外植体接种到含50mg/mL卡那霉素的MS筛选培养基(AS 100mM，IAA0.5mg/L+ZT1.5mg/L，其中AS即乙酰丁香酮，IAA即吲哚乙酸，ZT即玉米素)，直至长出生长状态良好的愈伤组织。将愈伤组织放置于分化培养基(IAA 0.5mg/L+ZT 1.5mg/L)进行培养，促进愈伤组织分化形成幼芽。待幼芽长到2cm高时将幼芽从基部剪下，放入生根培养基(IAA 1mg/L)诱导生根。在生根培养基上诱导生出强壮根后，将其转入MS液体培养基中，待适应环境后，将其转入土壤中生长，盖上一层薄膜放在光照下，使其适应强光，3天后去膜，最终获得T0代转基因番茄植株。
待番茄植株长至七叶一心后，分别提取T0代转基因番茄植株上叶片的基因组DNA，利用引物5’-CAGGTTACTATAACTCTTCCG-3’(SEQ ID NO.15)和5’-GTTACTTGTGTAGTGACTAC-3’(SEQ ID NO.16)并对其进行PCR扩增，得到相应PCR扩增产物片段长度362bp。分别将PCR扩增产物进行Sanger测序。测序结果分别与SlGATA22基因目标序列进行比对，统计突变类型。
经检测，T0代转基因番茄植株12株中，有2株为1bp缺失和1bp插入纯合突变体植株。将T0代纯合突变植株自交3代，从而得到T3代基因编辑植株，之后按照上述测序方法对T3代植株进行检测最终确定植株的突变体类型。将2个纯合突变体命名为CR-23(1bp缺失)和CR-37(1bp插入)。具体检测结果见图1。结果发现，CR-23和CR-37突变基因的核苷酸序列与SlGATA22相比，导致蛋白质编码提前终止，该突变造成SlGATA22蛋白功能缺失(图2)。
4.SlGATA22基因敲除植株抗寒性能
将T3代基因编辑植株CR-23和CR-37与野生型植株(WT)的种子进行播种，四个星期后，分别选取20株植株进行4℃冷胁迫处理，低温处理10天后记录各组植株的萎蔫情况，并统计萎蔫植株比例，结果见图3中(a)和表3。
萎蔫植株比例(％)＝萎蔫叶片超过50％的植株数量/总植株数量×100％。
结果发现低温处理10天后野生型植株相比于基因编辑植株叶片更加萎蔫，由此可见，SlGATA22蛋白的功能丧失会导致番茄植株抗寒性增加。
表3
实验组 萎蔫植株比例(％)
WT 70％
CR23 0
CR37 0
5.SlGATA22基因敲除植株抗病性能
将T3代基因编辑植株CR-23和CR-37与野生型植株(WT)的种子进行播种，四个星期后，分别选取20株植株，4℃冷胁迫处理，同时接种丁香假单胞菌Pst DC3000，接菌7天后，记录各实验组的叶片情况，记录结果见图3中(b)和(c)；统计染病植株比例，结果见表4。
表4
实验组 染病植株比例(％)
WT 50％
CR23 10％
CR37 10％
结果发现，野生型植株相比于基因编辑植株，叶片病斑多，基因编辑植株叶片基本没有染病现象，由此可见，SlGATA22蛋白的功能丧失会导致番茄植株抗病性增加。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种提高番茄植株抗寒和/或抗病性的基因，其特征在于，所述基因为SlGATA22基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种敲除SlGATA22基因的CRISPR/Cas9质粒，其特征在于，包括sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒；
所述sgRNA1表达盒靶向所述SlGATA22基因中第159-179位核苷酸，所述sgRNA2表达盒靶向所述SlGATA22基因中第291-311位核苷酸；
所述SlGATA22基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种敲除SlGATA22基因的重组微生物菌株，其特征在于，包括权利要求2所述的CRISPR/Cas9质粒。
4.一种如权利要求1所述的基因、权利要求2所述的CRISPR/Cas9质粒或权利要求3所述的重组微生物菌株在以下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)构建SlGATA22蛋白功能丧失的转基因番茄植株，所述SlGATA22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)提高番茄植株抗寒性；
(3)提高番茄植株对细菌性斑疹病的抗病性；
(4)同时提高番茄植株抗寒性和对细菌性斑疹病的抗病性。
5.一种提高番茄植株抗寒性的方法，其特征在于，包括构建SlGATA22蛋白功能丧失的转基因番茄植株的步骤，所述SlGATA22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转基因番茄植株通过CRISPR/Cas9基因编辑方法构建。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑方法采用的质粒为权利要求1所述的CRISPR/Cas9质粒。
8.一种提高番茄植株对细菌性斑疹病的抗病性的方法，其特征在于，包括构建SlGATA22蛋白功能丧失的转基因番茄植株的步骤，所述SlGATA22蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细菌性斑疹病的致病菌为丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)pv.tomatoDC3000。
10.一种同时提高番茄植株抗寒性和对细菌性斑疹病的抗病性的方法，其特征在于，包括构建SlGATA22蛋白功能丧失的转基因番茄植株的步骤，所述SlGATA22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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