CN114350657A - 一种促进环状rna生成的反向互补短侧翼序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进环状RNA生成的反向互补短侧翼序列及其应用。本发明发现circEXOC6B外显子的两侧近端的一对短的互补序列可以有效促进circEXOC6B成环，且对于circEXOC6B环化是必要的，而且将该序列连接到其他外显子两侧，仍然可以促进该外显子的环化，提示该对短序列对促进线性结构的外显子环化具有普适性。本发明证明了短反向互补序列同样能够高效的促进环状RNA的环化，揭示了环状RNA成环的新机制，并有望降低人工合成环状RNA的成本。

Description

一种促进环状RNA生成的反向互补短侧翼序列及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种促进环状RNA生成的反向互补短侧翼序列及其应用。

背景技术

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一种单链共价闭合的RNA分子，由前体mRNA(pre-mRNA)反向剪切而成。1979年，人类首次发现环状RNA的存在，但起初其被认为是基因剪切的副产物未给予足够重视。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，目前在多种细胞和物种中鉴定出了数以万计的环状RNA。与线性RNA相比，circRNA具有较高的稳定性，可以从血液甚至尿液等其他体液中检出，具有作为疾病发生、发展的生物标志物的潜力。尽管目前研究普遍认为circRNA由对应的未成熟的pre-mRNA反向剪切而来，至少通过RNA结合蛋白或者环状RNA两侧内含子中长反向互补序列，二者中的一种促进成环，但是目前针对这两种以及其他成环机制的研究仍不够完善，需要进一步探索和说明。

专利文献CN109943586A公开了一种植物circRNA过表达载体，所述过表达载体包括载体骨架，目的circRNA基因及辅助成环序列，所述辅助成环序列包括上游环化序列和下游环化序列，所述上游环化驱动序列和所述下游环化驱动序列为一对内含子反向互补序列；所述辅助成环序列与目的circRNA基因形成以下结构：上游环化驱动序列-目的circRNA基因-下游环化驱动序列。但根据公开的序列可见该专利文献中反向互补的上游环化序列和下游环化序列为416bp，即通过长反向互补序列促进pre-mRNA成环。这与现阶段普遍认同的circRNA的生成机制一致，即认为更多的互补序列更容易配对形成环状结构。

总的来说，现有技术并未公开短反向互补序列能够高效促进环状RNA环化的机制，更未见有关本申请的促进环状RNA生成的反向互补短侧翼序列的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种促进环状RNA生成的反向互补短侧翼序列及其应用。

第一方面，本发明提供了一种促进环状RNA成环的序列组合，所述促进环状RNA成环的序列组合由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核苷酸序列组成。

第二方面，本发明提供了一种用于促进环状RNA成环的DNA框架，所述用于促进环状RNA成环的DNA框架其结构为上游环化驱动序列-目的circRNA基因序列-下游环化驱动序列，所述上游环化驱动序列如SEQ ID NO:11所示，所述下游环化驱动序列如SEQ ID NO:12所示。

第三方面，本发明提供了一种基因表达盒，所述基因表达盒含有如上所述的用于促进环状RNA成环的DNA框架或其互补序列。

第四方面，本发明提供了一种促进环状RNA成环的载体，所述促进环状RNA成环的载体含有如上所述的用于促进环状RNA成环的DNA框架或其互补序列。

作为其中一种实施方式，所述促进环状RNA成环的载体其骨架载体为真核表达载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。所述骨架载体可根据实际情况在常规载体中进行选择，此处不做限定。

第五方面，本发明提供了一种转基因细胞系，所述转基因细胞系通过转染如上所述的促进环状RNA成环的载体制备得到。

第六方面，本发明提供了如上所述的促进环状RNA成环的载体的构建方法，所述构建方法包括将如上所述的促进环状RNA成环的序列组合连入骨架载体的多克隆位点中的步骤。

第七方面，本发明提供了一种促进环状RNA成环并过表达的方法，所述促进环状RNA成环并过表达的方法包括将如上所述的用于促进环状RNA成环的DNA框架连入骨架载体的多克隆位点中的步骤。

第八方面，本发明提供了如上所述的促进环状RNA成环的序列组合、如上所述的用于促进环状RNA成环的DNA框架、如上所述的基因表达盒、如上所述的促进环状RNA成环的载体或如上所述的转基因细胞系在制备环状RNA过表达产品中的应用。

本发明优点在于：

1、本发明发现circEXOC6B(has_circ_0009043)外显子的两侧近端的一对短的互补序列可以有效促进circEXOC6B成环，且对于circEXOC6B环化是必要的，而且将该序列连接到其他外显子两侧，仍然可以促进该外显子的环化，提示该对短序列对促进线性结构的外显子环化具有普适性。因此本发明证明了短反向互补序列同样能够高效的促进环状RNA的环化，揭示了环状RNA成环的新机制。

2、circRNA生物学功能和机制的研究，乃至circRNA药物的开发都依赖于circRNA的过表达，现有技术中的circRNA过表达载体的构建通常都在载体中插入长的反向互补序列以实现circRNA的环化，而本发明有望降低人工合成环状RNA的成本。

附图说明

图1.环状RNA circEXOC6B模式图。环状RNA circEXOC6B是由基因EXOC6B的3、4、5、6外显子形成的环状结构的RNA分子。

图2.CircRNA生成流程图(以circEXOC6B为例)。CircRNA母基因首先转录出未成熟的前体mRNA(pre-mRNA)。Pre-mRNA进一步剪切加工生成circRNA。

图3.侧翼序列对环状RNA成环的促进作用。通过构建不同的质粒，表明具有长内含子侧翼序列的外显子可以有效成环，当外显子任一侧或者两侧的侧翼内含子序列删除后，外显子无法再有效成环。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图4.通过对circRNA两侧的内含子序列进行比对，发现在其附近存在一对长11bp的短互补序列，无长互补序列的存在。

图5.短互补序列有效促进成环。通过构建过表达质粒，qPCR结果表明短互补序列可以有效促进外显子成环，对短互补序列突变后，其促成环作用消失。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图6.短互补序列促成环的作用具有普遍性。通过随机选择外显子并连接短互补序列构建质粒，仍能有效促进外显子环化。表明该短互补序列促进外显子环化具有普遍性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1方法

1)过表达质粒构建

过表达质粒载体由本课题组设计，由Novopro公司通过基因合成方法构建。骨架质粒均为pLVX-copGFP-T2A-Puro(序列如SEQ ID NO:13所示，Cat#.G0186754-1，NovoProBioscience Inc.，Shanghai)，插入的序列分别为：

质粒#1：上游侧翼内含子2000bp+circEXOC6B外显子+下游侧翼内含子2000bp(SEQID NO:4)；

质粒#2：上游侧翼内含子2000bp+circEXOC6B外显子(SEQ ID NO:5)；

质粒#3：circEXOC6B外显子+下游侧翼内含子2000bp(SEQ ID NO:6)；

质粒#4：circEXOC6B外显子(SEQ ID NO:7)；

质粒#5：野生型上游侧翼内含子短互补序列+circEXOC6B外显子+野生型下游侧翼内含子短互补序列(SEQ ID NO:8)；

质粒#6：突变型上游侧翼内含子短互补序列+circEXOC6B外显子+突变型下游侧翼内含子短互补序列(SEQ ID NO:9)；

质粒#7：野生型上游侧翼内含子短互补序列+circSOBP外显子+野生型下游侧翼内含子短互补序列(SEQ ID NO:10)。

插入位点为5’EcoRI，3’BamHI。

2)设计circEXOC6B引物并验证其特异性

首先提取收集细胞的总RNA，然后逆转录成cDNA。设计cirEXOC6B的特异性引物。序列如下：Forward:CCTCAAGTAAGCCACTATCG(SEQ ID NO:1)；Reverse:AGTATCCGTCACTTGATTTTGC(SEQ ID NO:2)。将PCR产物进行琼脂糖核酸电泳，验证其条带单一性，并送Sanger测序，验证扩增产物中的环化位点序列。CircEXOC6B的环化位点序列如下：GAGACTGCCATGAAGCAAAATCAAGTGACGGATACT(SEQ ID NO:3)。

3)细胞瞬转

细胞转染共分为8组，分别是空载质粒(Vector)、质粒#1、质粒#2、质粒#3、质粒#4、质粒#5、质粒#6、质粒#7。

传代：将293T细胞以合适的浓度种植在六孔板中，放在CO₂培养箱中培养。在第2天，如果细胞融合度长到了40％至50％，则可准备进行质粒的瞬转。

换液：瞬转前2h给293T细胞换液，丢弃旧培养基，加入1mL新鲜培养基。

配制转染体系：准备无菌的1.5mL EP管，按下表分别配制各质粒的转染体系，B液加入A液并轻轻混匀，室温静置20min，然后用移液器均匀加到六孔板中，继续放在培养箱中培养。

表1转染体系

RNA收集，RT-qPCR验证环状RNA的表达水平：转染48h后，收集六孔板中的各组细胞，提取RNA后逆转录，并进行qPCR验证环状RNA circEXOC6B的表达量。

2结果与分析

1)环状RNA(CircRNA)为环状结构的RNA分子

CircRNA是一种环状结构的RNA分子，首尾相接，不具备5’帽结构和3’poly A尾(图1)。

2)CircRNA生成过程

CircRNA对应的母基因首先转录出未成熟的前体mRNA(pre-mRNA)，pre-mRNA经过剪切修饰后生成环状RNA(图2)。

3)circEXOC6B的生成依赖于前后侧翼内含子

为了研究circRNA侧翼内含子序列对circRNA成环作用的影响，我们构建并瞬转包含侧翼内含子序列的质粒#1；仅包含上游侧翼内含子序列的质粒#2；仅包含下游侧翼内含子序列的质粒#3；不包含侧翼序列的质粒#4。提取RNA，逆转录后qPCR结果表明，只有同时具备环状RNA两侧的侧翼内含子序列时，环状RNA的外显子才能够有效成环，表明侧翼内含子对circRNA的成环不可或缺(图3)。

4)circEX0C6B侧翼内含子中存在一对短互补序列

通过对circEXOC6B的侧翼内含子序列进行比对，未发现长互补序列的存在。但是在circEXOC6B的两侧近端发现一对短互补序列(图4)。

5)短互补序列有效促进circRNA的成环

通过将短互补序列与circEXOC6B的线性序列连接，构建质粒#5，发现短互补序列可以有效促进circEXOC6B的成环。将circEXC6B两侧的短互补序列突变，构建质粒#6。过表达质粒#6，不能再有效促进circEXOC6B的成环。如上实验表明该短互补序列在circEXOC6B的成环过程中发挥了关键作用(图5)。这对短互补序列为：上游序列5’taaacccaaga 3’(SEQNO:11)；下游序列5’tcttgggttta 3’(SEQ NO:12)。

6)短互补序列的成环作用具有普适性

通过将短互补序列与circSOBP的线性序列连接构建质粒#7，过表达质粒#7仍然能够有效促进circSOBP的成环(图6)，表明该短序列的成环作用具有普适性的特点。

三、讨论

环状RNA(circRNA)是一种不同于普通线性mRNA的首尾相接的环状RNA分子。CircRNA无5’帽结构和3’poly A尾，因此相较于mRNA其稳定性更高。CircRNA由对应的母基因转录的pre-mRNA进一步剪切修饰生成。但是，关于circRNA是如何由pre-mRNA剪切修饰成的具有机制研究还不是十分清楚。目前观点认为，circRNA由pre-mRNA剪切修饰至少通过以下方式的一种：1、通过侧翼内含子序列中的长反向互补序列进行匹配结合后，进一步反向剪切生成；2、借助RNA结合蛋白，同时结合两侧的侧翼内含子，将侧翼序列拉进后进行剪切成环。

我们的研究结果表明，circEXOC6B两侧的侧翼内含子能够有效促进circEXOC6B的外显子环化，并且是circEXOC6B成环不可或缺的因素。但是通过对circEXOC6B的侧翼内含子序列进行比对分析，并未发现长反向互补序列的存在，仅在circEXOC6B外显子的两侧近端发现一对短的互补序列。并且实验证明该短序列可以有效促进circEXOC6B成环，将该对短序列突变后，其成促环能力丧失，表明该短互补序列对circEXOC6B环化的重要作用。并且将该序列连接到其他外显子两侧，仍然可以促进该外显子的环化。提示该对短序列对促进线性结构的外显子环化具有普适性。

通过上述实验，我们证实，不同于以往结论，在环状RNA的侧翼序列中，不仅是长反向互补序列，短反向互补序列同样能够高效的促进环状RNA的环化。该研究成果揭示了环状RNA成环的新机制，并且有望降低人工合成环状RNA的成本。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属金山医院（上海市金山区核化伤害应急救治中心、上海市金山区眼病防治所）

<120> 一种促进环状RNA生成的反向互补短侧翼序列及其应用

<130> /

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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cctcaagtaa gccactatcg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tccaagtgaa tatttttccc ctttcttggc taaaaatggc ttcatctgtt tttcctgtgg 300

ttagctttga ctccctctgc aaatgtgttc acttctaacc atgcttcagc ttgtaaagcc 360

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cttttagaca atgcttccat taacattgtc ttagatgtgc attttggacg gctttatcac 720

tcttaatttg tattgagctc agtgcaataa aaccacaaag tgtttcacat gtggtgccat 780

taattaaata ataaagaggg aatttgctga tttcttgcct ccctttctgg tactttaaag 840

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tcttttaaaa aactagctcc ttgagaagat cttcagttaa agggtattac gttagataaa 1020

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tgatgaggaa attactatcc tatataatta attttttcca tcattgaaat gtcaagagtg 1380

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caacttttct aggaatacat tggtgaaatg aggaatatct gtataaaatt tgtactttct 1680

attttatttt tctctcccct ttttcctctt gtctccccaa agttaaagtg cgatctttag 1740

ttattatggt agcttagttt agaactgttc taaactcacc atatttgtta gcaaattttt 1800

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tttcatatta aatttagatc tttttcaact attgtctaaa tgtttgtttt ttatgagttt 1980

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gaaaggaact ggtaatagca atggaagagc tgaagcagtg tcgactacaa cagagaaata 2100

tttctgccac tgttgataaa ttaatgctgt gtcttccagt cctagagatg tacagcaaac 2160

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tccccaagct tcgagaagaa ataaaagatg tttctatgtc cgatctcaaa gactttctgg 2340

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aatcaagtga cggatactaa tagaaaacta caacatgagg gaaaggaact ggtaatagca 60

atggaagagc tgaagcagtg tcgactacaa cagagaaata tttctgccac tgttgataaa 120

ttaatgctgt gtcttccagt cctagagatg tacagcaaac tgagggacca gatgaaaact 180

aaaaggcatt atcctgcact gaaaactctg gaacatctag agcataccta cctgcctcaa 240

gtaagccact atcgattctg caaggtgatg gtggacaaca tccccaagct tcgagaagaa 300

ataaaagatg tttctatgtc cgatctcaaa gactttctgg agagcatccg caaacattca 360

gacaaaattg gagagactgc catgaagcaa gtaggtcttg ggtttatgat aggttggcca 420

gtggctttat cagtattgag ttaaacacag gtttctcttt gccaagtgtc tagtcattat 480

cttatccaag tttcttatca ttttagggaa gtccttcata tttatggaaa catatgatta 540

aaaatgtttt cattttttta acagagcaat ggacaatttg ctctgtagat gttcagtaaa 600

tattgatcag ttgtgatggt ttacattgag gttatgaaga aatttttcta ctgtttgtat 660

acttcccttg actttgcata taatttgtag cttaagatat tttaaagttc tccttctagt 720

taatgaccta aattgtactg catgtgtctt tggctgatta tttactacgt aagcaagata 780

gcatgttata tatgcatatt tctgatatta ataggtatca gtgaaaaaag gcctattagg 840

aaatgctttg aattatgatc aaagaaaagg atttattaac agcttatata ttaaaaaata 900

tgttagcagt atatacattt gttaaaaaaa tcttcattcc taagtcacca aagtcacaag 960

gaacatctaa atttcttttt ttaaattatg aatgaaaggt cagtaatgtt ttataatggc 1020

atttgctcac ttgaaatttg tcacattgat tttattaaaa atttttagta tacctgatga 1080

tgtagcctac agcaacaaat acaagagtca gttgtttatg gaaagtactt tttggttctg 1140

taaacaatag tgttcttgaa tagatcattt gtagttttta tcattctgtg aggaatgagg 1200

gaatagatta tatttcaaat catattttag gtctcgacta gccttgataa tctattcaga 1260

tgtctatttg atctataata tctatttgat cctccaaaag agattctcca gttacccttt 1320

cctcagggaa tgcagatatt tcccttttct tcctttaaat tttgtcagtg ttatacttca 1380

caaagtgcag agtttaaaac tagatgataa acctgataga aataattata tgatttcatt 1440

gcttatagtg atggagaaat aaaattaatc agtgacaata taccttagca ttgctgggta 1500

cgtattttga atacaggaat gaagctatct tctaagataa gtctttattg tgattggttc 1560

agtttttcct aagcttttaa aatataggag agtgtagtac aaagcctcta tggaagttgc 1620

ctttttaaaa attgcttttt ctaggcctct gcttgagaaa ttaatttact tcccttttga 1680

tgaaagaaag aggaagccat gaagaatatt actttattta acgtgaggcc agctggtctc 1740

attccttaat tatctgaaga aattaagacc cagaggaggg aagtaacttg cctcaagttc 1800

aaataccttg taaaggtcag atcctgcatt agaattcagg ttgggttgaa atgaatttgt 1860

ctactatggt actcaatctg tgtaaactat tagctgtttg ctatattttt gtcatataaa 1920

gaaatgatga agaaatcttt tgtgaatcca ggacttttaa ttaactgaga aatcttcatt 1980

tctcctataa aatatttcat ctcaggatcc ttgagtaaag atatgttatg ttaacacatt 2040

aaaaaatctt ttgtagtacc gagagtgtaa ggaagatagg agagagaaaa taccatgtac 2100

tttgtacgta gtaggtgttc aataaatgtt tgaattccca gataagaggg agaggaagtg 2160

gtttatttct cactgcctca agcccaaaat agtgtttctg gtttgtgatg gttttctttg 2220

caatggtgat ttaagtactt agaatccttc cattgtatgg ctcttccatc tttaagatgg 2280

ctttgaagat tgcttcagaa ggggaaagac caaagagtgt tgcatgtggg agggtcttta 2340

agggccaggc atggatgcca cacattactt ctacccatat tctgttggtc 2390

<210> 7

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aatcaagtga cggatactaa tagaaaacta caacatgagg gaaaggaact ggtaatagca 60

atggaagagc tgaagcagtg tcgactacaa cagagaaata tttctgccac tgttgataaa 120

ttaatgctgt gtcttccagt cctagagatg tacagcaaac tgagggacca gatgaaaact 180

aaaaggcatt atcctgcact gaaaactctg gaacatctag agcataccta cctgcctcaa 240

gtaagccact atcgattctg caaggtgatg gtggacaaca tccccaagct tcgagaagaa 300

ataaaagatg tttctatgtc cgatctcaaa gactttctgg agagcatccg caaacattca 360

gacaaaattg gagagactgc catgaagcaa 390

<210> 8

<211> 559

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

taaacccaag agaatgccac tggaccaata tgtagtggag tactgaaaat atttaactgc 60

ctattcctaa tcttttcata ttaaatttag atctttttca actattgtct aaatgtttgt 120

tttttatgag tttaaattgt cttctctcca cagaatcaag tgacggatac taatagaaaa 180

ctacaacatg agggaaagga actggtaata gcaatggaag agctgaagca gtgtcgacta 240

caacagagaa atatttctgc cactgttgat aaattaatgc tgtgtcttcc agtcctagag 300

atgtacagca aactgaggga ccagatgaaa actaaaaggc attatcctgc actgaaaact 360

ctggaacatc tagagcatac ctacctgcct caagtaagcc actatcgatt ctgcaaggtg 420

atggtggaca acatccccaa gcttcgagaa gaaataaaag atgtttctat gtccgatctc 480

aaagactttc tggagagcat ccgcaaacat tcagacaaaa ttggagagac tgccatgaag 540

caagtaggtc ttgggttta 559

<210> 9

<211> 559

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaaaaaaaaa agaatgccac tggaccaata tgtagtggag tactgaaaat atttaactgc 60

ctattcctaa tcttttcata ttaaatttag atctttttca actattgtct aaatgtttgt 120

tttttatgag tttaaattgt cttctctcca cagaatcaag tgacggatac taatagaaaa 180

ctacaacatg agggaaagga actggtaata gcaatggaag agctgaagca gtgtcgacta 240

caacagagaa atatttctgc cactgttgat aaattaatgc tgtgtcttcc agtcctagag 300

atgtacagca aactgaggga ccagatgaaa actaaaaggc attatcctgc actgaaaact 360

ctggaacatc tagagcatac ctacctgcct caagtaagcc actatcgatt ctgcaaggtg 420

atggtggaca acatccccaa gcttcgagaa gaaataaaag atgtttctat gtccgatctc 480

aaagactttc tggagagcat ccgcaaacat tcagacaaaa ttggagagac tgccatgaag 540

caagtaggaa aaaaaaaaa 559

<210> 10

<211> 494

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

taaacccaag agaatgccac tggaccaata tgtagtggag tactgaaaat atttaactgc 60

ctattcctaa tcttttcata ttaaatttag atctttttca actattgtct aaatgtttgt 120

tttttatgag tttaaattgt cttctctcca cagaactttg cagaaaacac catgaatgaa 180

ctccttggct ggtatggcta tgataaggtt gaattaaaag atggtgagga tattgaattc 240

aggagctacc ctacagatgg ggagagccgg cagcacattt ctgttctcaa agaaaattct 300

ttgccaaaac caaaattacc cgaggacagt gttatttcac catacaatat aagcacaggc 360

tattcagggc ttgccactgg aaatggactc agtgactcac ctgcagggtc aaaggatcat 420

ggcagtgtgc ccattattgt acctttaatt ccaccacctt tcataaagcc accagcaggt 480

aggtcttggg ttta 494

<210> 11

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

taaacccaag a 11

<210> 12

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcttgggttt a 11

<210> 13

<211> 8833

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180

ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240

agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300

agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360

ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420

cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480

gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540

tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600

agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660

cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720

caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780

aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840

aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900

caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960

gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020

cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080

ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140

aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200

tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260

aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320

gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380

cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440

gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500

ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560

actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620

gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680

aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740

ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800

tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860

actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920

cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980

cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040

gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100

aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160

acagcagaga tccagtttat cgataagctt gggagttccg cgttacataa cttacggtaa 2220

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 2280

ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 2340

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 2400

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 2460

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 2520

agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 2580

ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 2640

acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 2700

gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 2760

tccatagaag acaccgactc tactagagga tcgctagcgc taccggactc agatctcgag 2820

ctcaagcttc gaattctgca gtcgacggta ccgcgggccc gggatcccgc gactctagat 2880

aattctaccg gggttggggt tgcgcctttt ccaaggcagc cctgggtttg cgcagggacg 2940

cggctgctct gggcgtggtt ccgggaaacg cagcggcgcc gaccctgggt ctcgcacatt 3000

cttcacgtcc gttcgcagcg tcacccggat cttcgccgct acccttgtgg gccccccggc 3060

gacgcttcct gctccgcccc taagtcggga aggttccttg cggttcgcgg cgtgccggac 3120

gtgacaaacg gaagccgcac gtctcactag taccctcgca gacggacagc gccagggagc 3180

aatggcagcg cgccgaccgc gatgggctgt ggccaatagc ggctgctcag cagggcgcgc 3240

cgagagcagc ggccgggaag gggcggtgcg ggaggcgggg tgtggggcgg tagtgtgggc 3300

cctgttcctg cccgcgcggt gttccgcatt ctgcaagcct ccggagcgca cgtcggcagt 3360

cggctccctc gttgaccgaa tcaccgacct ctctccccag acctgcagcc caagcttacc 3420

atgcccgcca tggagatcga gtgccgcatc accggcaccc tgaacggcgt ggagttcgag 3480

ctggtgggcg gcggagaggg cacccccaag cagggccgca tgaccaacaa gatgaagagc 3540

accaaaggcg ccctgacctt cagcccctac ctgctgagcc acgtgatggg ctacggcttc 3600

taccacttcg gcacctaccc cagcggctac gagaacccct tcctgcacgc catcaacaac 3660

ggcggctaca ccaacacccg catcgagaag tacgaggacg gcggcgtgct gcacgtgagc 3720

ttcagctacc gctacgaggc cggccgcgtg atcggcgact tcaaggtggt gggcaccggc 3780

ttccccgagg acagcgtgat cttcaccgac aagatcatcc gcagcaacgc caccgtggag 3840

cacctgcacc ccatgggcga taacgtgctg gtgggcagct tcgcccgcac cttcagcctg 3900

cgcgacggcg gctactacag cttcgtggtg gacagccaca tgcacttcaa gagcgccatc 3960

caccccagca tcctgcagaa cgggggcccc atgttcgcct tccgccgcgt ggaggagctg 4020

cacagcaaca ccgagctggg catcgtggag taccagcacg ccttcaagac ccccatcgcc 4080

ttcgccgagg gcaggggaag tcttctaaca tgcggggacg tggaggaaaa tcccggcccc 4140

atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta 4200

cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac 4260

cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 4320

atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag 4380

agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 4440

tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 4500

cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 4560

agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 4620

gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 4680

gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga 4740

ccgcgtctgg aacaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct 4800

taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc 4860

tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct 4920

ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga 4980

cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc 5040

tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac 5100

aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaagc tgacgtcctt 5160

tccatggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt 5220

cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc 5280

tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc 5340

gcctggaatt aattctgcag tcgagaccta gaaaaacatg gagcaatcac aagtagcaat 5400

acagcagcta ccaatgctga ttgtgcctgg ctagaagcac aagaggagga ggaggtgggt 5460

tttccagtca cacctcaggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt 5520

agccactttt taaaagaaaa gaggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa 5580

gatatccttg atctgtggat ctaccacaca caaggctact tccctgatta gcagaactac 5640

acaccagggc caggggtcag atatccactg acctttggat ggtgctacaa gctagtacca 5700

gttgagccag ataaggtaga agaggccaat aaaggagaga acaccagctt gttacaccct 5760

gtgagcctgc atgggatgga tgacccggag agagaagtgt tagagtggag gtttgacagc 5820

cgcctagcat ttcatcacgt ggcccgagag ctgcatccgg agtacttcaa gaactgctga 5880

tatcgagctt gctacaaggg actttccgct ggggactttc cagggaggcg tggcctgggc 5940

gggactgggg agtggcgagc cctcagatcc tgcatataag cagctgcttt ttgcctgtac 6000

tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc 6060

actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt 6120

gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag 6180

cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc 6240

agagagtgag aggccttgac attgctagcg ttttaccgtc gacctctagc tagagcttgg 6300

cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 6360

acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 6420

cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 6480

attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 6540

cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 6600

caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 6660

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 6720

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 6780

cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 6840

ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 6900

tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 6960

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 7020

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 7080

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 7140

gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 7200

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 7260

tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 7320

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 7380

tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 7440

aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 7500

tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 7560

ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 7620

gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 7680

gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 7740

taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 7800

tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 7860

ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 7920

tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 7980

ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 8040

tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 8100

ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 8160

aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 8220

actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 8280

aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 8340

tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 8400

aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 8460

ctgacgtcga cggatcggga gatcaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa 8520

agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 8580

ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggatca actggataac tcaagctaac 8640

caaaatcatc ccaaacttcc caccccatac cctattacca ctgccaatta cctgtggttt 8700

catttactct aaacctgtga ttcctctgaa ttattttcat tttaaagaaa ttgtatttgt 8760

taaatatgta ctacaaactt agtagttttt aaagaaattg tatttgttaa atatgtacta 8820

caaacttagt agt 8833

Claims (9)

1.一种促进环状RNA成环的序列组合，其特征在于，所述促进环状RNA成环的序列组合由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核苷酸序列组成。

2.一种用于促进环状RNA成环的DNA框架，其特征在于，所述用于促进环状RNA成环的DNA框架其结构为上游环化驱动序列-目的circRNA基因序列-下游环化驱动序列，所述上游环化驱动序列如SEQ ID NO:11所示，所述下游环化驱动序列如SEQ ID NO:12所示。

3.一种基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒含有如权利要求2所述的用于促进环状RNA成环的DNA框架或其互补序列。

4.一种促进环状RNA成环的载体，其特征在于，所述促进环状RNA成环的载体含有如权利要求2所述的用于促进环状RNA成环的DNA框架或其互补序列。

5.根据权利要求4所述的促进环状RNA成环的载体，其特征在于，所述促进环状RNA成环的载体其骨架载体为真核表达载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

6.一种转基因细胞系，其特征在于，所述转基因细胞系通过转染权利要求4所述的促进环状RNA成环的载体制备得到。

7.权利要求4所述的促进环状RNA成环的载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括将权利要求1所述的促进环状RNA成环的序列组合连入骨架载体的多克隆位点中的步骤。

8.一种促进环状RNA成环并过表达的方法，其特征在于，所述促进环状RNA成环并过表达的方法包括将权利要求2所述的用于促进环状RNA成环的DNA框架连入骨架载体的多克隆位点中的步骤。

9.权利要求1所述的促进环状RNA成环的序列组合、权利要求2所述的用于促进环状RNA成环的DNA框架、权利要求3所述的基因表达盒、权利要求4所述的促进环状RNA成环的载体或权利要求6所述的转基因细胞系在制备环状RNA过表达产品中的应用。

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