KR20180030358A

KR20180030358A - 재조합 간암세포주를 이용하여 다양한 레벨의 miR-122 발현을 조절하는 방법

Info

Publication number: KR20180030358A
Application number: KR1020160118264A
Authority: KR
Inventors: 이성욱; 김지현; 이창호
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2016-09-13
Filing date: 2016-09-13
Publication date: 2018-03-22

Abstract

본 발명은 miR-122의 발현 조절 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (a) 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 구축하는 단계; 및, (b) 상기 간암세포주에 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 처리하여 miR-122를 조절하는 단계;를 포함하는 miR-122의 발현 조절 방법, 상기 재조합 간암세포주, 상기 간암세포주를 이용하여 간암치료제 후보물질의 항암제로서의 유효성 평가방법, 및 상기 간암세포주를 포함하는 유효성 평가용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 간암세포주를 이용한 miR-122의 발현을 조절하는 방법을 통해, miR-122 수치에 의해 영향받는 간암에 대한 항암제나 유전자 치료제의 효율성을 유용하게 검증할 수 있다.

Description

재조합 간암세포주를 이용하여 다양한 레벨의 miR-122 발현을 조절하는 방법 {Method for regulating different miR-122 expression levels by recombinant hepatocellular carcinoma cell line}

본 발명은 miR-122의 발현 조절 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (a) 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 구축하는 단계; 및, (b) 상기 간암세포주에 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 처리하여 miR-122를 조절하는 단계;를 포함하는, miR-122의 발현 조절 방법, 상기의 재조합 간암세포주, 상기 재조합 간암 세포주를 이용하여 간암치료제 후보물질의 항암제로서의 유효성을 평가하는 방법 및 상기 재조합 간암 세포주를 포함하는 유효성 평가용 키트에 관한 것이다.

간암(hepatocellular carcinoma)은 한국의 경우 남자에서는 3번째로, 여자에서는 7번째로 호발하며, 조기에 발견할 경우 수술로 제거할 수 있다. 하지만, 진행된 간암에서는 수술, 동맥색전술, 에탄올 주입법, 고주파치료, 경피적 동위원소 주입법 등을 사용할 수 있으나 완치가 어렵다. 간암에서도 다른 불량한 예후를 가지는 악성 종양에서와 유사하게 면역요법, 유전자 치료법 등이 시도되고 있다.

MicroRNA (miRNA)는 ~22nt의 작은 비암호화된 RNA(small non coding RNA)로, 전사 후 레벨(post transcription level)에서 특정 mRNA의 3' UTR에 결합하여 유전자 발현을 조절한다. 그 중에서도 miR-122는 간 특이적으로 발현되는 miRNA인데, 간세포에서 발현하는 전체 miRNA 집단의 약 70%를 차지하고 있고, 콜레스테롤 합성과정과 지질대사를 조절할 뿐만 아니라 HCV의 감염에 있어서도 중요한 인자이다. 또한, miR-122는 간암(human hepatocellular carcinoma, HCC)와 밀접한 연관이 있는데, 이전 연구에 따르면 miR-122는 원발성 종양(primary tumor)에서 상당히 감소되어 있어, 이와 같은 miR-122의 수치는 암 치료 이후의 예후와도 연관이 있다고 보고되고 있다.

이에 따라, 최근 miR-122의 발현 수치를 정확하게 확인할 수 있는 세포주에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 지금까지 알려진 세포주, 예를 들어, Huh-7 또는 Huh-7.5와 같은 세포주에서는 miR-122의 발현이 매우 높은 수치를 보이는 반면, Hep3B 또는 SNU 398와 같은 세포주에서는 miR-122 발현이 거의 되지 않는 등(Oncogene. 2009 Oct 8;28(40):3526-36. Loss of miR-122 expression in liver cancer correlates with suppression of the hepatic phenotype and gain of metastatic properties), 세포주마다 miR-122의 발현 수치가 매우 헤테로지니어스(heterogeneous)하다는 문제점이 존재하고 있다.

또한, 실제 간암 환자 샘플도 수집하여 확인해 본 결과, 암의 간 조직에서의 miR-122 발현 수치는 대부분 감소되어 있었으나, 오히려 그 반대로 증가되어 있거나 변화가 미미한 경우도 존재하고 있음을 확인할 수 있었으며, 간 조직이 일반 조직인지 암의 조직인지에 따라, 또는 개개인에 따라 miR-122 발현 수치가 매우 헤테로지니어스(heterogeneous)하여, 기존의 세포주로는 이러한 환경을 반영하지 못하다는 문제점이 존재하고 있었다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 테트라사이클린 유도 시스템을 이용하여 전이유전자(transgene)의 발현을 조절하는 연구가 계속 진행되어 오고 있으나, 상기 기존의 세포주의 경우는 2ug/ml의 농도로만 사용해도 특정 동물 세포주에서는 세포독성이 증가하여 세포사멸을 일으키는 문제점을 가지고 있고(Cancer Res; 75(21) November 1, 2015, PLOS ONE May 2013, Volume 8, Issue 5, Cell Rep. Author manuscript; available in PMC 2016 September 10, 및 Analytical Biochemistry 318 (2003) 152-154 등), 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 높은 농도로 처리할 경우는 세포독성이 증가하여 헤테로지니어스한 발현에 따른 항암제 또는 유전자 치료제의 효능을 평가하기 어렵다는 문제점도 있으며, 특히, 기존에 존재하는 세포주의 경우 낮은 농도에서는 도입된 유전자가 발현되지 않아 고농도로만 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 처리해야 하는 문제점(Heinz et al. BMC Biotechnology 2013, 13:5, Tet-On^® Advanced Inducible Gene Expression Systems User Manual 등)은 여전히 존재하고 있다. 이에, 실제 임상에서 헤테로지니어스한 miR-122의 수치를 확인할 수 있는 새로운 간암세포주를 이용하여 다양한 수치의 miR-122의 발현을 확인할 수 있으면서 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 세포 독성을 줄이기 위한 새로운 재조합 세포주에 대한 요구는 계속 존재하여 왔다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 구축하고, 상기 재조합세포주에 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 처리하면 다양한 수치의 miR-122의 발현을 조절할 수 있어 실제 헤테로지니어스한 임상에서도 적용 가능하고, 특히 매우 극소량의 테트라사이클린 또는 독시사이클린 농도 하에서도 miR-122의 발현을 조절할 수 있어 테트라사이클린 또는 독시사이클린에 의한 세포독성을 회피할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 (a) 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 구축하는 단계; 및, (b) 상기 간암세포주에 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 처리하여 miR-122를 조절하는 단계;를 포함하는, miR-122의 발현 조절 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 간암세포주를 이용하여 간암치료제 후보물질의 항암제로서의 유효성 평가방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 간암세포주를 포함하는 간암치료제 유효성 평가용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트 및 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 구축하는 단계; 및, (b) 상기 간암세포주에 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 처리하여 miR-122의 발현을 조절하는 단계;를 포함하는, miR-122의 발현 조절 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은 (a) 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 구축하는 단계; 및 (b) 상기 간암세포주에 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 처리하여 miR-122의 발현을 조절하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 용어, "테트라사이클린(tetracycline)"은 개선된 약물을 생산하기 위해 자연 발생 물질을 변형한 최초의 물질로, 약전명으로 염산테트라사이클린으로, 상품명으로는 아크로마이신이라 불리는 화학물질을 의미한다. 1952년에 오레오마이신(클로로테트라시클린)과 테라마이신(옥시테트라사이클린)의 화학구조가 밝혀졌을 때, 이론상 이 두 가지의 기본체라고 할 수 있는 테트라사이클린이 예상되어 4고리 모양체라는 의미를 가진 테트라사이클린이라고 명명되어 다음 해부터 제조되었으며, 염산염으로 물에 녹는다. 테트라사이클린의 파생물질인 독시사이클린(doxycline), 미노사이클린(minocycline) 또한, 현재 다양한 질병을 치료하기 위해 사용되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어, "오퍼레이터(operator)"는 작동유전자라고 불리는 것으로서, 세균의 유전자 조절 시 특정 유전자의 발현을 조절하는 역할을 하는 유전자를 의미한다. 주로 구조 유전자의 옆에 위치하고 있으며 특정한 상황에서 필요한 유전자가 발현되거나 발현되지 않도록 조절하는 역할을　한다. 구체적으로, 본 발명에서는 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO)를 포함하고 있으며, 상기 테트라사이클린 오퍼레이터는 테트라사이클린 또은 독시사?延Ц걋? 없을 때에는 테트라사이클린 오퍼레이터에 테트라사이클린 리프레서(TetR) 단백질이 상기 오퍼레이터(TetO)에 결합하여 전사가 일어나지 않게 되고, 반대로 테트라사이클린 또는 독시사?延Ц걋? 있을 때에는 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 테트라사이클린 리프레서에 결합하여 리프레서가 오퍼레이터에 결합하지 못하게 함으로써, 전사가 일어날 수 있게 된다.

본 발명에서 용어, "리프레서(repressor)"는 조절유전자의 산물로, 어느　오페론의 조절자부분과 특이적으로 결합하며, 그 오페론에 속하고 있는　유전자의 발현을　억제하는　단백질을 말한다. 활성형 리프레서는 조절자와 결합할 수 있지만 불활성형은 결합할 수 없다. 어느 효소의　생산이　기질에 의해서　유도되거나 일련의 합성계의 최종산물에 의해서 억제되거나 하는 현상은 리프레서의 존재로 설명된다.　전자의 경우에 조절유전자는 활성형의 리프레서를 생산하고, 합성계의 최종산물에 의해서 활성형이 된다. 구체적으로, 본 발명에서는 테트라사이클린 리프레서(TetR)을 포함하고 있으며, 상기 테트라사이클린 리프레서는 테트라사이클린 또은 독시사?延Ц걋? 없을 때에는 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하여 전사가 일어나지 않도록 하고, 반대로 테트라사이클린 또는 독시사?延Ц걋? 있을 때에는 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 테트라사이클린 리프레서에 결합하여 오퍼레이터에 결합하지 못하도록 함으로써, 원하는 유전자의 발현이 일어나도록 유도한다. 보다 구체적으로, 본 발명에서는 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 있을 때 상기 물질이 테트라사이클린 리프레서(TetR)에 결합하여 리프레서가 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO)에 결합하지 못하게 함으로써, 목적하는 유전자인 miR-122의 발현을 유도할 수 있다.

본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어, miR-122 전구체를 암호화하는 서열을 오퍼레이터에 작동 가능하게 연결시킴으로써, miR-122의 발현은 이 오퍼레이터의 영향 또는 조절 하에 있게 된다. 즉, 오퍼레이터 작용이 유도됨으로써 miR-122 전구체 서열이 전사되는 경우 작동 가능하게 연결된 것이며, 상기 두 서열 사이의 연결 특성이 프레임 변경 돌연변이(frame-shift mutation)를 유도하지 않고, 발현 조절서열이 miR-122의 발현을 지배하는 능력을 저해하지 않는 경우 작동 가능하게 연결되었다고 한다. 상기 작동 가능한 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 이용할 수 있다. 본 발명은 구체적으로, 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO) 서열에 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 연결되어 있는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열에 miR-122 전구체 서열이 연결되어 있다. 상기 서열의 기능적인 연결에 따라, 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 첨가 하에 테트라사이클린 오퍼레이터에 테트라사이클린 리프레서가 결합하지 못하게 되면, 전사가 일어나 목적하는 유전자, 구체적으로는, miR-122의 발현을 유도한다.

본 발명에서 용어, "miR-122"는 정상 세포에서는 정상적으로 발현되나, 간암 세포에서는 발현량이 감소하는 특징을 나타낸다. 이를 이용하여 간암 세포에 대한 민감도 및 특이도를 증가 시킨 치료제를 개발할 수 있으며, 이에 대한 구체적인 예시로는, 항암유전자가 연결된 라이보자임에 마이크로 RNA-122a(microRNA-122a, miR-122a)를 인식하는 핵산서열을 연결함으로써, 간암 세포 특이적인 라이보자임 발현을 통해 간암 세포 특이적인 세포사멸이 일어나게 할 수 있다.

본 발명에서 용어, "전구체"는 어떤　물질대사나 화학반응 등에서 최종적으로 얻을 수 있는 특정 물질이 되기 전 단계의 물질을 의미하는 것으로, 예를 들어, 특정 물질로는 금속, 이온, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지방 등의 모든 물질을 포함할 수 있으며, 꼭 어떤 반응의 마지막 물질일 필요는 없고, 임의로 정한 어느 단계에서 얻을 수 있는 물질일 수 있다. 전구체는　pH, 온도, 효소의 존재 등 특별한 환경하에서 그 다음 단계의 물질로 화학적 변화를 일으킬 수 있으며, 전구체가 그 다음 물질로 되는 방법은 수 없이 다양하고, 또한 수 없이 많은 전구체가 존재할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 재조합세포주는 miR-122의 발현을 유도하기 위하여 miR-122 전구체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "발현 카세트"는 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO)와 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체가 연결된 구조를 의미하고, 여기에 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 첨가되면 전사가 일어나 목적하는 유전자인 miR-122를 발현시킬 수 있는 카세트를 의미한다. 본 발명에서 발현 카세트는 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO) 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체가 연결된 서열에 전사체의 수준을 조절하는 서열, 즉 조절 유도체를 추가로 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "간암세포주"는 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO) 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 세포주를 의미한다.

본 발명에서 용어, "헤테로지니어스(heterogeneous)"는 사전적으로는 구성요소들이 서로 비슷하지 않은 것을 의미하나, 본 발명에서는 miR-122의 발현 정도가 비균질적으로 존재하거나 진행하는 것을 의미하며, 구체적으로는, 실제 간암 환자의 간조직에서 miR-122의 발현이 다양한 수치로 존재하고 있는 것을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는 Hep3B 세포를 배양하여 TetR 발현벡터(expression vector) 및 Opti-MEM를 넣고, 리포좀 형태로 복합체를 이루도록 혼합시킨 후 각각의 세포 위에 뿌려 형질감염하여 TetR 발현 세포주(TetR expression stable cell)인 Hep3B-TetR 세포주를 제조하여, RT-PCR을 통해 TetR의 발현을 확인하였으며, 특히, 개별 세포주 #7과 풀(pool) #1에서 TetR의 발현이 가장 높게 나타남을 확인하였다(도 4).

또한, 상기의 Hep3B-TetR 세포주 pool #1과 개별 세포주 #7 두 개의 세포주를 이용하여, 상기 세포주에 pri-miR-122 발현벡터를 각각 형질감염하여 Hep3B miR-122 세포주를 제작하여, 상기 세포주에서 qRT-PCR로 독시사이클린을 처리하지 않았을 때의 miR-122 발현을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 Hep3B miR-122 세포주가 기존의 Huh-7 세포주 및 HepG2 세포주보다 miR-122 발현이 다양한 수치로 발현됨을 확인할 수 있었으며, 상대적으로 miR-122 발현이 가장 적은 #1-7, #1-15, #7-2, #7-4, #7-14, #7-15, #7-18, 및 #7-20 세포주를 잠재적으로 독시사이클린에 의해 조절될 수 있는 세포주로 선택하였다(도 5).

그런 다음, 상기의 세포주인 #7-2, #7-4, #7-14, #7-15 세포주에 다양한 범위의 농도의 독시사이클린 또는 테트라사이클린을 처리한 후 miR-122 발현 수치를 확인해 본 결과, 독시사이클린을 100ng/ml 이하의 농도 범위로 처리한 경우까지 miR-122가 다양한 수치로 발현되는 것을 확인하였으며, 특히, 100ng/ml 미만의 농도, 예를 들어, 1ng/ml 또는 10 pg/ml, 보다 구체적으로는 1pg/ml의 매우 적은 농도에서도 miR-122가 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 6 내지 9 및 표 1). 또한, 테트라사이클린의 경우에도, 1ug/ml 이하의 농도 범위로 처리한 경우까지 miR-122가 다양한 수치로 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 그보다 더 적은 농도, 예를 들어, 10ng/ml 미만 또는 100pg/ml의 농도에서도 miR-122가 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 보다 구체적으로는 10pg/ml의 매우 적은 농도에서도 확인할 수 있었다(도 6 내지 9 및 표 1).

따라서, 본 발명의 신규 재조합 간암세포주는 매우 적은 농도의 테트라사이클린 또는 독시사이클린에 의해서도 miR-122가 on/off 되어 miR-122의 세포당 카피수를 조절함으로써, 생체 외(in vitro) 뿐 아니라 헤테로지니어스한 실제 생체 내(in vivo) 또는 임상에서도 항암제나 유전자치료제의 효능을 평가하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 miR-122의 발현 조절 방법은 상기의 (a) 단계에서 구축된 재조합 간암세포주에 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 처리하여 miR-122를 조절하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 용어, "분리"는 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 테트라사이클린 리프레서에 결합하여 상기 리프레서가 테트라사이클린 오퍼레이터와 결합되지 않도록 하는 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 첨가된 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 테트라사이클린 리프레서와 오퍼레이터가 결합할 수 있는 부위에 결합함으로써, 테트라사이클린 리프레서가 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하지 못하게 저해하는 것이며, 이에 따라 전사가 일어나게 된다.

본 발명에서 용어, "독시사이클린"은 테트라사이클린 계열의 항생제로, 그람 양성 및 음성균과 리켓치아에 항균력을 가지고 있어 탄저, 브루셀라, 페스트, Q열, 야토, 전염성 발진티푸스, 털진드기병 등의 치료에 쓰일 수 있는 화학물질을 의미한다. 또한, 말라리아에 대해서도 어느 정도의 효과가 있어서 예방 목적 또는 항말라리아제와 병용 투여할 수 있다고 알려져 있다. 본 발명에서는 테트라사이클린과 유사하게, 본 발명의 재조합 간암세포주에 첨가시 테트라사이클린 리프레서에 결합하여 전사가 일어날 수 있도록 한다.

본 발명은 상기 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 처리하여 테트라사이클린 오퍼레이터와 테트라사이클린 리프레서가 분리되는 것에 의해 miR-122를 상향조절하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "상향조절"은 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 처리 농도에 따라 miR-122가 다양한 수치로 발현되는 것을 의미하며, 상기 처리 농도는 특별히 한정되지는 않았으나, 매우 적은 농도라 할지라도 miR-122가 발현될 수 있는 농도를 의미한다.

본 발명은 상기 테트라사이클린을 10pg/ml 내지 100ng/ml 범위의 농도, 구체적으로, 100pg/ml 내지 100ng/ml 범위의 농도, 보다 구체적으로는 10ng/ml 내지 100ng/ml의 농도에서 처리할 수 있다.

본 발명은 상기 독시사이클린을 1pg/ml 내지 10ng/ml 범위의 농도 구체적으로, 10pg/ml 내지 10 ng/ml 범위의 농도, 보다 구체적으로는 100 pg/ml 내지 10ng/ml의 농도에서 처리할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 테트라사이클린을 10pg/ml 내지 1ug/ml의 농도 범위에서 처리하였는데, 상기 범위에서 다양한 miR-122의 발현량을 측정할 수 있었으며, 특히, 1ng/ml 내지 100ng/ml의 범위에서는 보다 효과적으로 miR-122의 발현량을 확인할 수 있었다. 또한, 독시사이클린의 경우에는, 1pg/ml 내지 100ng/ml의 농도 범위에서 처리하였는데, 테트라사이클린과 마찬가지로 상기 범위에서 다양한 miR-122의 발현량을 확인 가능하였으며, 특히, 100pg/ml 내지 10ng/ml의 범위에서 보다 효과적으로 miR-122의 발현량을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과를 통해, 본 발명의 재조합 간암세포주를 이용하여 다양한miR-수치의 miR-122의 발현을 조절함으로써, miR-122 수치에 의해 영향받는 간암에 대한 항암제나 유전자 치료제의 효율성을 검증하는데 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 제공한다.

본 발명에서 용어, "테트라사이클린", "오퍼레이터", "작동가능하게 연결된", "miR-122", "전구체", "발현 카세트", "테트라사이클린 리프레서", "간암세포주", 및 "독시사이클린"은 상기에서 설명한 바와 같다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 세포주에 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 다양한 농도로 처리하는 단계; (c) 상기 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 처리된 간암세포주의 miR-122의 발현양을 측정하는 단계; (d) 상기 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 처리된 간암세포주에 간암치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및 (e) 상기 후보물질 처리 후의 간암세포주에서 상기 후보물질에 의한 세포사멸을 측정하는 단계;를 포함하는, 간암치료제 후보물질의 항암제로서의 유효성 평가방법을 제공한다.

상기 방법에서, (a) 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 배양하는 단계는 테트라사이클린 오퍼레이터; 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서를 포함하는 간암세포주를 생물체(주로 미생물 및 발생중인 동식물의 배)나 생물체의 일부(기관 ·조직 ·세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 말한다. 배양조건은 특별히 제한되지 않으며, 통상의 기술자가 공지된 기술을 가지고 배양할 수 있다.

상기 방법은 상기 (a) 단계에서 배양된 세포주에 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 다양한 농도로 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로 다양한 농도는 특별히 제한된 것은 없으나, 통상의 기술자가 행할 수 있는 범위로 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 투여하는 것을 의미하며, 보다 구체적으로는 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 처리된 농도에 따라 miR-122가 발현되는 양이 조절되는 것을 의미한다.

상기 방법은 상기 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 처리된 간암세포주의 miR-122의 발현양을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 다양한 농도로 처리됨에 따라 miR-122 또한 다양한 범위로 발현될 것이므로, 발현되는 miR-122의 양을 측정하는 것을 의미하며, 특별히 제한되지는 않으나, 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 발현량을 측정할 수 있다.

상기 방법은 상기 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 처리된 간암세포주에 간암치료제의 후보물질을 처리하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "간암치료제"는 간암이 발병한 환자의 증상을 개선, 경감 또는 치료하는 효과를 나타내는 물질을 의미하는데, 간암세포의 형태학적, 생리학적 또는 유전학적 변화를 유의하게 나타내는 한, 이들의 물리적 성상, 화학적 성상, 생물학적 기원 등은 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로는 원발성 간암에서 외에도 전이성 간암 등 간에서 성장하는 모든 원발암과 전이암의 치료에 선택되는 암치료제일 수 있고, 보다 구체적으로는 간암 치료에 사용되는 물질일 수 있다. 상기 형태학적 변화는 특별히 이에 제한되지 않으나, 간암세포가 사멸하거나 또는 간암세포의 형태가 정상적인 간조직 세포의 형태로 바뀌는 것을 의미하고, 상기 생리학적 변화는 특별히 이에 제한되지 않으나, 간암세포의 증식특성, 전이특성, 발현단백질의 종류 등이 소멸하거나 또는 정상적인 간조직 세포의 특성으로 바뀌는 것을 의미하며, 유전학적 변화는 특별히 이에 제한되지 않으나, 간암세포에서 발현되는 간암특이적인 유전자의 발현이 억제되거나 또는 유전자의 발현양상이 정상적인 간조직 세포의 것으로 바뀌는 것을 의미한다. 구체적으로는, 간암치료제 후보물질이 처리된 후의 miR-122의 발현양을 측정하는 것을 의미한다.

발명의 용어 "암치료 후보물질"이란 암환자에 적용하여 암에 의한 환자의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 항암제, 항종양 항생제 등 상기 특성을 나타내는 물질은 제한없이 포함될 수 있다.

상기 간암세포주에 테트라사이클린 또는 독시사이클린은 다양한 농도로 처리될 수 있다. 보다 구체적으로, 간암세포주에 저농도에서 고농도의 다양한 범위의 농도로 독시사이클린 또는 테트라사이클린 농도를 처리 후 miR-122의 발현량을 측정하여 헤테로지니어스하게 miR-122를 발현하는 간암세포주를 확인 후 각각의 다른 수치로 miR-122를 발현하는 세포에 간암치료제 후보물질을 처리하는 것을 의미하며, 이에 따라, 실제 간암 환자와 유사한 헤테로지니어스하게 miR-122를 발현할 수 있는 재조합 간암세포주를 이용하여 간암치료제 후보물질의 miR-122 발현 정도에 따른 항암 치료제로서의 유효성을 평가할 수 있다. 또한, 실제 임상 환자와 유사한 환경을 제공함으로써, 보다 효과적으로 간암치료제 후보물질의 항암 치료제로서의 유효성을 평가할 수 있다.

본 발명에서 용어, "유효성"은 상기 간암치료제 후보물질이 항암 치료제로서의 역할을 할 수 있는지에 대해 평가하는 것을 의미하는 것으로, 보다 구체적으로, 스크리닝 또는 테스트에 사용되는 경우를 말한다. 즉, 스크리닝 검사로 얻어진　진단이 참 진단과 어느 정도 일치하는가를 의미한다.

상기 방법은 상기 후보물질 처리 후의 간암세포주에서 상기 후보물질에 의한 세포사멸을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "세포사멸"은 아포토시스(Apoptosis)라 불리기도 하며, 세포가 기능적인 역할은 유지하면서 유전적 성질에 의해 죽음으로 이르는 단계를 말한다. 상기 세포사멸은 세포 전체가 위축되면서 새로운 단백질이 합성되고 세포의 자살 유전자에 의해 죽음으로 유도된다.

상기 간암치료제 후보물질을 처리한 후의 간암세포주에서 상기 후보물질에 의한 세포사멸을 측정하는 방법은, 이에 제한된 것은 아니나, 구체적으로는, 세포독성 분석법(cytotoxicity assay)을 통해 측정할 수 있으며, 보다 구체적으로는, WST-1 Cell Proliferation Assay System으로 측정할 수 있다. 상기 WST는 물에 작 녹는 고감도 수용성 Tetrazolium salt로 살아있는 세포의 디하이드로게네이즈(dehydrogenase)와 반응하여 오랜지 색의 수용성 formazam을 생성하는데, 구체적으로, 상기 WST와 반응하는 디하이드로게네이즈는 대사적으로 왕성한 활동을 하는 세포의 미토콘드리아 전자전달계에 존재하는 효소로 살아있는 세포에만 유효하여, formazam의 생성은 살아있는 세포수와 상관관계를 가지며, WST가 살아있는 세포의 디하이드로게네이즈와 반응하여 오랜지 색으로 변하기 때문에 흡광도 450nm로 측정하여 확인할 수 있게 된다. 따라서, 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 처리한 세포주와 처리하지 않은 세포주에 후보물질을 처리한 후 WST-1 assay를 수행함으로써 miR-122 발현 정도에 따른 항암 치료제로서의 유효성을 평가할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 포함하는 간암치료제 유효성 평가용 키트를 제공한다.

본 발명에서 용어, "테트라사이클린", "오퍼레이터", "작동가능하게 연결된", "miR-122", "전구체", "발현 카세트", "테트라사이클린 리프레서", "간암세포주", "독시사이클린" 및 "유효성"은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어 "유효성 평가용 키트"란 간암치료제 후보물질이 항암 치료제로서의 역할을 할 수 있는지에 대해 평가할 수 있는 키트를 의미하며, 구체적으로는 스크리닝 또는 테스트에 사용될 수 있고, 스크리닝 검사로 얻어진　진단이 참 진단과 어느 정도 일치하는가를 확인하는 키트를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 유효성 평가용 키트는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로는 본 발명의 간암세포주를 이용하여 간암을 개선, 경감 또는 치료할 수 있는 효과를 나타내는 물질을 선발하는데 사용되는 키트가 될 수 있다. 보다 구체적으로는 기판에 상기 간암세포주가 위치하여 세포 배양을 용이하게 수행하고, 간암세포주의 변화를 용이하게 검출할 수 있는 세포주칩을 포함하는 키트가 될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 재조합 간암세포주를 이용한 miR-122의 발현을 조절하는 방법을 통해, miR-122 수치에 의해 영향받는 간암에 대한 항암제나 유전자 치료제의 효율성을 유용하게 검증할 수 있다.

도 1은 제조된 pri-miR-122 발현벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 실제 간암 환자의 간조직에서 miR-122 발현을 확인한 그래프이다.
도 3은 테트라사이클린-유도 시스템의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 테트라사이클린 리프레서(TetR) stable cell을 제작한 후, 개별 세포 클론과 풀(pool)에서 TetR RNA 발현을 확인한 것이다.
도 5는 Tet-on miR-122 stable cell을 제작하여 독시사이클린을 처리하지 않았을 때의 miR-122 발현을 확인한 것이다.
도 6은 #7-2, #7-4 stable cell에서 독시사이클린 및 테트라사이클린 에 의해 miR-122 레벨이 변화하는 것을 확인한 것이다.
도 7은 #7-14 stable cell에서 독시사이클린 및 테트라사이클린 에 의해 miR-122 레벨이 변화하는 것을 확인한 것이다.
도 8은 #7-15 stable cell에서 독시사이클린 및 테트라사이클린 에 의해 miR-122 레벨이 변화하는 것을 확인한 것이다.
도 9는 #1-7 stable cell에서 독시사이클린 및 테트라사이클린 에 의해 miR-122 레벨이 변화하는 것을 확인한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포배양

한국세포주 은행에서 구입한 KCLB NO. 88064인 Hep3B (hepatocellular carcinoma) 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 스트렙토마이신/페니실린이 첨가된 배지 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)으로 37℃, 5% CO₂ 배양기(incubator)에서 배양하고, 2-3일마다 계대배양(sub-culture)하였다. 계대배양시 배지를 버리고 1XPBS(8g NaCl, 0.2g KH₂PO₄, 1.14g Na₂HPO₄, 0.2g KH₄PO₄/L) 5ml로 세포를 씻어준 후, 1x 트립신 1ml을 처리하여 CO₂ 배양기에 1분간 두었다. 배지 9ml로 트립신을 불활성화시키고 1,500rpm으로 2분 30초간 원심 분리하여 세포를 풀어준 후, 상층액을 제거하고 배지 10ml로 재부유(resuspension)하였다. 계대배양 때마다 새로운 100mm 배양접시에 1/3을 접종(seeding)하여 배양하였다.

실시예 2: TetR 세포주( TerR stable cell )의 제조

먼저, 하기와 같은 과정으로 TetR 발현 세포주를 제조하였다. 구체적으로, Hep3B 세포를 35mm 배양접시에 2X10⁵ 접종한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. TetR 발현벡터 1ug(In vitrogen에서 구입, pcDNA6/TR cat no. V1025-20)과 Opti-MEM 100ul를 1.5ml의 튜브에 넣어 섞고, Lipofectamin2000 5ul와 SFM 100ul를 새로운 1.5ml 튜브에 넣고 섞은 후 5분 동안 상온에서 보관하였다. 리포좀(liposome) 형태로 복합체를 이룰 수 있도록 두 개의 튜브 혼합물을 혼합시킨 후 20분 동안 상온에서 보관하였다. 10초간 원심 분리한 후 각각의 세포 위에 뿌려 형질감염(transfection)시키고, 4시간 후 새로운 배지로 갈아주었다. 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 1XPBS로 세포를 수세하였다. 이 후, 트립신을 처리하여 세포를 떼어내고, 100mm 배양접시에 접종하였다. 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 2~3일에 한 번씩 새로운 배지에 블라스티사이딘(blasticidin) 5ug/ml을 추가하여 갈아주었다. 개별 클론(clone) 각각과 풀(pool)을 키운 후, RT-PCR을 이용하여 TetR의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 개별 세포주와 풀(pool)에서 TetR RNA 발현을 확인할 수 있었으며, 특히, 개별 세포주(cell clone) #7과 풀(pool) #1에서 TetR의 발현이 가장 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

실시예 3: pri - miR -122 세포주( pri - miR -122 stable cell )의 제조

3-1: pri - miR -122 발현벡터의 제조

Pri-miR-122 발현벡터의 제조를 위해 골격벡터(Backbone vector, 서열번호 1)인 pcDNA4.0/Myc HisA 벡터를 in vitrogen에서 구입하여 하기와 같은 방법으로 클로닝을 진행하였다.

Pri-miR-122를 클로닝하기 위해 프라이머 5'- GGAGTGTGACAATGGTGTTTGTGTCTAAACTATCAAACGCCATTATCACACTAAA-3'(서열번호 2)을 주형으로 하여, 하기의 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 98℃ 에서 30초, 58℃ 에서 30초, 72℃에서 30초의 PCR 조건으로 35 사이클을 반복한 후, 최종적으로 72℃에서 7분간 증폭하여 하기와 같은 pre-miR-122(서열번호 5)를 얻었다. 하기 서열번호 3 및 4의 프라이머에서 밑줄 친 부위는 각각 SalI enzyme site 및 XbaI enzyme site이다.

Pre-miR-122 F primer: 5'-acgcgtcgacCCTTAGCAGAGCTGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3' (서열번호 3)

Pre-miR-122 R primer 5'-gctctagaGCCTAGCAGTAGCTATTTAGTGTGATAATGGCGTTTG-3' (서열번호 4)

그런 다음, 상기 pre-miR-122 PCR 생성물과 U6+1 벡터를 SalI(Roche) 및 XbaI(Roche)을 이용하여 37℃에서 16시간 동안 자른 후, 페놀 추출(phenol extraction) 및 에탄올 침지를 수행하여 U6+1 벡터와 pre-miR-122를 정량하였다. U6+1 벡터 : 삽입체(insert)의 비율을 1:10으로 혼합하고, T4 DNA 라이게이즈(roche)를 이용하여 라이게이션시킨 후 형질전환(transformation)하여 클론을 획득하였다. 돌연변이 없이 정확하게 pre-miR-122가 들어갔는지를 확인하기 위하여, 상기 획득한 클론을 미니-프렙(mini-prep)하고 SalI과 XbaI으로 처리하여 pre-miR-122 단편의 사이즈를 확인 및 시퀀싱한 후, 이를 U6+1 pre-miR-122라 명명하였다.

상기의 방법으로 제작된 pre-miR-122 발현 벡터를 주형으로 하여 하기의 서열번호 7 및 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

Pri-miR-122 5' nest: 5'-CACCTTCGTGGCTACAGAGTTTCCTTAGCAGAGCTG-3'(서열번호 7)

Pri-miR-122 3' nest: 5'-GACATTTATCGAGGGAAGGATTGCCTAGCAGTAGCT-3'(서열번호 8)

이렇게 얻어진 PCR 생성물로 하기 서열번호 9 및 10의 프라이머를 이용하여 프리-히팅(pre-heating) 95℃에서 5분 후, 95℃에서 30초 동안 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초동안 신장하는 조건으로 30회 PCR을 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 10분 동안 배양하여 불활성화시키고, EcoRI과 XbaI enzyme site가 포함된 전체 pri-miR-122(서열번호 11) 프래그먼트를 얻었다. 하기 서열번호 9 및 10의 프라이머에서 밑줄 친 부위는 각각 EcoRI enzyme site 및 XbaI enzyme site이다.

Pri-miR-122 5' primer 5'-ggaattcTGGAGGTGAAGTTAACACCTTCG TGGCTAC-3'(서열번호 9)

Pri-miR-122 3' primer 5'-gctctagaAAGCAAACGATGCCAAGACATTTATCGAGGG-3'(서열번호 10)

상기 Pri-miR-122 PCR 프래그먼트(fragment)와 Tet operator(TetO)가 포함된 pcDNA4.0 Myc/HisA 벡터를 EcoRI(Roche)과 XbaI(Roche)으로 37℃에서 16시간 동안 배양하여 리니얼라이제이션(linearization)하였다. 효소로 자른 후 페놀 추출 및 에탄올 침지를 수행하고 정량하였다. 이 후, pcDNA4.0 Myc/HisA 벡터 : pri-miR-122를 1:10의 비율로 넣고 T4 DNA 라이게이즈(roche)를 이용하여 라이게이션하였다. 라이게이션 프로덕트(ligation product)를 DH5ａ E. coli 균주에 넣고 아이스(ice)에서 30분간 놓아둔 후 42℃에서 1분 30초간 열 충격(heat shock)을 주어 형질전환을 시켰다. 이 후 앰피실린 아가 플랫(ampicillin agar plat)에 플레이팅(plating) 한 후 37℃의 배양기에서 16시간 배양시킨 후 각각의 콜로니를 성장시켜 미니-프렙(mini-preparation)하여 DNA를 얻었다. 이 후 EcoRI/XbaI으로 효소반응을 시켜 삽입체의 크기를 확인한 후 시퀀싱하였다.

3-2: pri - miR -122 세포주( pri - miR -122 stable cell )의 제조

실시예 2에서 제조된 Hep3B-TetR 세포주 pool #1과 개별 세포주 #7의 두 개의 세포를 이용하여 pri-miR-122 세포주를 제조하였다. 구체적으로, 35mm 배양접시에 2X10⁵으로 접종하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후, pri-miR-122 발현벡터 1ug을 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 각각 형질감염시키고, 100mm 배양접시에 접종한 세포를 2~3일에 한 번씩 새로운 배지에 블라스티사이딘 5ug/ml와 제오신(zeocin) 200ug/ml을 추가하여 갈아주었다. 상기 배지에서 키운 세포주에 대하여 miR-122 발현을 확인하기 위해 qRT-PCR을 이용하여 독시사이클린을 처리하지 않았을 때의 miR-122 발현을 확인하였다. 구체적으로 qRT-PCR의 방법은 하기와 같다.

3-3: miR -122 발현을 확인하기 위한 qRT - PCR 방법

독시사이클린을 처리하지 않은 세포주와 처리한 세포주를 나누어 각 세포주에서 각각 트리졸을 이용하여 각각 RNA를 분리하였고, 역전사효소를 이용하여 역전사하여 cDNA를 합성하였다. 이 때, quantitative real-time PCR을 수행하기 위해 합성된 miR-122 RNA를 표준(standard)으로 하여 정량별로 각각 역전사하였으며, 역전사로 얻어진 cDNA를 real-time PCR 하였다. mature miR-122 프로브(ABI)를 이용하여 합성한 cDNA 2㎕, 20x Taqman small RNA assay 3.5㎕, 2x Taqman Universal PCR Master Mix II(ABI) 35㎕를 넣고 dH₂O로 총 70㎕를 만들어 섞고 20㎕씩 분주하여 Real time PCR로, 효소활성은 95℃에서 10분동안, 변성은 95℃에서 15초동안, 어닐링 및 신장은 60℃에서 60초간의 조건으로 수행하였으며, 총 40 사이클 반복 수행하였다.

그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 Hep3B miR-122 세포주와 Huh-7 세포주 및 HepG2를 비교해 본 결과, 본 발명의 세포주에서의 miR-122 발현이 상기 세포주보다 다양한 수치로 발현됨을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 상대적으로 miR-122 발현이 가장 적은 #1-7, #1-15, #7-2, #7-4, #7-14, #7-15, #7-18, 및 #7-20 세포주를 잠재적으로 독시사이클론에 의해 조절될 수 있는 세포주로 선택하였다. 참고로, 독시사이클린(Dox)이 처리되지 않았을 때 발현되는 miR-122는 Dox에 의해 조절되는 것이 아니라 leaky하게 발현되는 경우를 의미한다.

실시예 4: Real - time PCR 수행

하기의 방법에 따라 상기 실시예 3에서 구축된 세포주인 #7-2, #7-4, #7-14, #7-15 세포주에 다양한 범위의 농도의 독시사이클린 또는 테트라사이클린을 처리한 후, miR-122 발현 수치를 확인해 보았다.

4-1: 전체 RNA 의 분리

각 세포를 1X PBS 1ml로 2번 씻어낸 후 트리졸(trizol)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 구체적으로, 트리졸 500ul을 처리한 후 5분간 상온에서 둔 후 1.5ml의 튜브에 옮겼다. 그런 다음, 클로로포름(chloroform) 100ul~200ul를 첨가한 후 섞어 4℃, 13,000rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상층액을 새로운 1.5ml의 튜브에 옮긴 후, 에탄올 침지(precipitation)하여 DEPC(Diethylpyrocarbonate) dH₂O에 녹였다. 그 후 DNaseI를 처리하여 남아 있는 genomic DNA를 제거하고 역전사하였다.

4-2: Reverse transcription

DNaseI를 처리한 total RNA 100ng을 internal control인 18s를 확인하기 위해 랜덤 프라이머(Random primer)를 사용하였고, 또한 miR-122를 확인하기 위해 전체 RNA 100ng을 miR-122 특이적인 RT 프라이머 (ABI)를 사용하여 역전사하였다. 역전사 반응은 ABI PCR 기계를 이용하여 16℃에서 30분 / 42℃에서 30분 / 85℃에서 5분으로 한 후 4℃에서 보관하였다.

4-3: Real - time PCR

상기 4-2에서 역전사에 의해 합성된 cDNA를 이용하여 real time PCR을 진행하였다. 구체적으로, cDNA 2㎕, 10x PCR 버퍼, dNTP 10mM, 각각의 프라이머 10pmole, taq polymerase 2.5unite 및 10X cybergreen 1㎕씩 넣고, dH₂O로 70㎕를 만들어 20㎕씩 분주하여 Real time PCR을 수행하였다. real time PCR의 수행 조건은 효소활성(enzyme activation)은 95℃에서 10분, 변성은 95℃에서 30초간, 어닐링(anneal)은 58℃에서 30초간, 신장(extensino)은 72℃에서 30초간 하였고, 총 40 사이클 반복하였다. 유전자에 대한 대조군으로는(internal control) 18s 유전자를 이용하였다. 또한, miR-122는 mature miR-122 프로브(ABI)를 이용하여 합성한 cDNA 2㎕, 20x Taqman small RNA assay 3.5㎕, 2x Taqman Universal PCR Master Mix II(ABI) 35㎕를 넣고 dH₂O로 총 70㎕를 만들어 섞고 20㎕씩 분주하여 Real time PCR로, 효소활성은 95℃에서 10분동안, 변성은 95℃에서 15초동안, 어닐링 및 신장은 60℃에서 60초간의 조건으로 수행하였으며, 총 40 사이클 반복 수행하였다.

아울러, 상기의 실험을 진행 후, 그에 대한 결과를 도 6 내지 8에 그래프로 표시하였으며(도 6 내지 8), 이들 각각 세포에서 독시사이클린과 테트라사이클린 농도에 의한 세포당 카피수를 하기 표 1에 나타내었다. 비교예인 #1-7 세포주의 경우는 독시사이클린과 테트라사이클린의 어느 농도에서도 miR-122의 발현이 증가하지 않았다(도 9).

도 6 내지 8 및 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 독시사이클린을 100ng/ml 이하의 농도 범위로 처리한 경우까지 miR-122가 다양한 수치로 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 100ng/ml 미만의 농도, 예를 들어, 1ng/ml 또는 10 pg/ml에서도 miR-122의 발현을 확인할 수 있었으며, 1pg/ml의 매우 적은 농도에서도 발현함을 확인할 수 있었다. 테트라사이클린의 경우에도, 1ug/ml 이하의 농도 범위로 처리한 경우까지 miR-122가 다양한 수치로 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 그보다 더 적은 농도인, 예를 들어, 10ng/ml 미만 또는 100pg/ml의 농도에서도 miR-122가 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 10pg/ml의 매우 적은 농도에서도 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 miR-122의 발현이 세포주마다 차이는 있지만, 대조군인 mock과 비교했을 때 약 10~20배 정도로 현저히 증가하는 것이다.

이와 같은 결과를 통해, 본 발명에서 구축된 재조합 간암 세포주를 이용하면 세포 독성을 유발하지 않는 극소량 농도의 독시사이클린 또는 테트라사이클린에 의해서도 miR-122의 발현이 조절되어 기존의 세포주가 낮은 농도에서는 도입된 유전자가 발현되지 않아 고농도로만 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 처리해야 하는 문제, 그와 같은 높은 농도로 인한 세포독성의 문제를 회피할 수 있을 뿐 아니라, 그와 동시에 miR-122의 발현을 효과적으로 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Method for regulating different miR-122 expression levels by recombinant hepatocellular carcinoma cell line <130> KPA161210KR <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA4.0 myc/hisA backbone vector <400> 1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggaacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ccctatcagt gatagagatc 840 tccctatcag tgatagagat cgtcgacgag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga 900 gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgga 960 ctctagcgtt taaacttaag cttggtaccg agctcggatc cactagtcca gtgtggtgga 1020 attctctaga gggcccttcg aacaaaaact catctcagaa gaggatctga atatgcatac 1080 cggtcatcat caccatcacc attgagttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc 1140 tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 1200 cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 1260 tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 1320 tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg 1380 gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg tagcggcgca 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tcatcattgg aaaacgttct 4800 tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 4860 cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 4920 acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 4980 atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 5040 tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 5100 aaagtgccac ctgacgtc 5118 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Pri-miR-122 cloning <400> 2 ggagtgtgac aatggtgttt gtgtctaaac tatcaaacgc cattatcaca ctaaa 55 <210> 3 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pre-miR-122 F primer <400> 3 acgcgtcgac ccttagcaga gctgtggagt gtgacaatgg tgtttg 46 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pre-miR-122 R primer <400> 4 gctctagagc ctagcagtag ctatttagtg tgataatggc gtttg 45 <210> 5 <211> 85 <212> DNA <213> pre-miR-122 sequence <400> 5 ccttagcaga gctgtggagt gtgacaatgg tgtttgtgtc taaactatca aacgccatta 60 tcacactaaa tagctactgc taggc 85 <210> 6 <211> 85 <212> RNA <213> Pre-miR-122 RNA sequence <400> 6 ccuuagcaga gcuguggagu gugacaaugg uguuuguguc uaaacuauca aacgccauua 60 ucacacuaaa uagcuacugc uaggc 85 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pri-miR-122 5' nest_primer <400> 7 caccttcgtg gctacagagt ttccttagca gagctg 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pri-miR-122 3' nest_primer <400> 8 gacatttatc gagggaagga ttgcctagca gtagct 36 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pri-miR-122 5'primer <400> 9 ggaattctgg aggtgaagtt aacaccttcg tggctac 37 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pri-miR-122 3'primer <400> 10 gctctagaaa gcaaacgatg ccaagacatt tatcgaggg 39 <210> 11 <211> 159 <212> DNA <213> pri-miR-122 sequence <400> 11 ggaggtgaag ttaacacctt cgtggctaca gagtttcctt agcagagctg tggagtgtga 60 caatggtgtt tgtgtctaaa ctatcaaacg ccattatcac actaaatagc tactgctagg 120 caatccttcc ctcgataaat gtcttggcat cgtttgctt 159 <210> 12 <211> 160 <212> RNA <213> Pri-miR-122 RNA sequence <400> 12 aagcaaacga ugccaagaca uuuaucgagg gaaggauugc cuagcaguag cuauuuagug 60 ugauaauggc guuugauagu uuagacacaa acaccauugu cacacuccac agcucugcua 120 aggaaacucu guagccacga agguguuaac uucaccucca 160

Claims

(a) 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 구축하는 단계; 및
(b) 상기 간암세포주에 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 처리하여 miR-122의 발현을 조절하는 단계;를 포함하는, miR-122의 발현 조절 방법.
제1항에 있어서, 상기 조절은 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 처리하여 테트라사이클린 오퍼레이터와 테트라사이클린 리프레서가 분리되는 것에 의해 miR-122를 상향조절하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 테트라사이클린은 10pg/ml 내지 100ng/ml 범위의 농도에서 처리하는 것인, 방법.
제3항에 있어서, 상기 테트라사이클린은 10ng/ml 내지 100ng/ml 범위의 농도에서 처리하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 독시사이클린은 1pg/ml 내지 10ng/ml 범위의 농도에서 처리하는 것인, 방법.
제5항에 있어서, 상기 독시사이클린은 100pg/ml 내지 10ng/ml 범위의 농도에서 처리하는 것인, 방법.
테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주.
(a) 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 세포주에 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 다양한 농도로 처리하는 단계;
(c) 상기 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 처리된 간암세포주의 miR-122의 발현양을 측정하는 단계;
(d) 상기 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 처리된 간암세포주에 간암치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및
(e) 상기 후보물질 처리 후의 간암세포주에서 상기 후보물질에 의한 세포사멸을 측정하는 단계;를 포함하는, 간암치료제 후보물질의 항암제로서의 유효성 평가방법.
테트라사이클린 오퍼레이터(TetO); 및 이에 작동가능하게 연결된 miR-122 전구체를 포함하는 발현 카세트와 상기 테트라사이클린 오퍼레이터에 결합하는 테트라사이클린 리프레서(TetR)를 포함하는 재조합 간암세포주를 포함하는 간암치료제 유효성 평가용 키트.