CN114350635B - 异戊烯基转移酶突变体及生产大麻萜酚的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种异戊烯基转移酶突变体及生产大麻萜酚的方法，通过将现有的异戊烯基转移酶进行定点突变，可帮助橄榄醇和焦磷酸香叶酯催化生成催化活性和纯度较高的大麻萜酚，具有较高的生产应用前景。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种异戊烯基转移酶突变体及生产大麻萜酚的方法。
背景技术
大麻素是指可以激活细胞中大麻素受体的一类化合物。目前已从大麻植物中分离出70多种大麻素，主要包括：四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol，THC)、大麻萜酚(Cannabigerol，CBG)、大麻萜酚酸(Cannabigerolic Acid，CBGA)、大麻二酚(Cannabidiol，CBD)、大麻酚(Cannabinol，CBN)、大麻环萜酚(Cannabichromene，CBC)、四氢次大麻酚(Tetrahydrocannabivarin，THCV)、次大麻萜酚(Cannabigerovarin，CBGV)和次大麻萜酚酸(Cannabigerovarinic Acid，CBGVA)等。
无致幻副作用的大麻萜酚(Cannabigerol，CBG)在医药、食品、保健和化妆品等领域有重要的应用价值。CBG与人体CB1和CB2受体结合后行使诸如抗肿瘤、抗炎症、抗氧化、保护神经、免疫调节及治疗癌症等功效。同时，CBG还对甲氧西林耐药性的金黄色葡萄菌有杀菌效果。
近年来，CBG的生物合成及生产备受关注，目前已有技术利用异戊烯基转移酶(NphB)催化，并通过橄榄醇(Olivetol)和焦磷酸香叶酯(geranyl pyrophosphate，GPP)来合成CBG，异戊烯基转移酶的作用是将异戊烯基转移到另一个基团，但是现有的异戊烯基转移酶存在催化活性以及纯度不高的问题。
发明内容
本申请提供一种异戊烯基转移酶突变体及生产大麻萜酚的方法，旨在利用该异戊烯基转移酶突变体生成催化活性以及纯度较高的大麻萜酚。
第一方面，本申请提供一种异戊烯基转移酶突变体，所述异戊烯基转移酶突变体的序列是对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的部分位点被取代，所述部分位点包括：A232、G286、Y288、Q161、S214、V49、S177、F107以及H290中的至少一种。
可选的，所述A232被取代为苏氨酸T。
可选的，所述G286被取代为苏氨酸T或丙氨酸A中的任一种。
可选的，所述部分位点包括：G286和Y288。
可选的，所述S177被取代为甘氨酸G。
可选的，所述V49被取代为半胱氨酸C或酪氨酸Y中的任一种。
可选的，所述F107被取代为天冬氨酸D。
可选的，所述H290被取代为天冬氨酸D或半胱氨酸C中的任一种。
可选的，对应于SEQ ID NO.1，所述部分位点包括：
G286和Y288；
Q161、S214、Y288和S177；
Q161、S214、Y288和F107；
Q161、S214、Y288、V49和H290；以及
Q161、S214、Y288和G286中的一组或多组的组合。
可选的，对应于SEQ ID NO.1，所述部分位点发生以下取代：
A232T；
G286T和Y288A；
G286T和Y288K；
Q161S、S214H和Y288A；
Q161R、S214H和Y288V；
Q161R、S214H和Y288H；
Q161R、S214H和Y288I；
Q161S、S214H和Y288T；
Q161N、S214H和Y288V；
Q161S、S214H和Y288A；
Q161N、S214H和Y288A；
Q161H、S214H和Y288I；
Q161R、S214H、Y288V和S177G；
Q161R、S214H、Y288V和F107D；
Y288V；
Q161R、S214H、Y288V、V49Y和H290C；
Q161R、S214H、Y288V、V49Y和H290D；
Q161R、S214H、Y288V、V49C和H290D；以及
Q161R、S214H、Y288L和G286A中的一组或多组的组合。
第二方面，本申请提供一种核酸分子，所述核酸分子为第一方面中的异戊烯基转移酶突变体的编码基因。
可选的，所述核酸分子的核酸序列为对应于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的发生以下取代：
A232T:GCC-ACT；
G286T:GGT-ACT、Y288A:TAT-GCT；
G286T:GGT-ACT、Y288K:TAT-AAG；
Q161S:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288A:TAT-GCT；
Q161R:CAG-CGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GTT；
Q161R:CAG-CGT、S214H:AGC-CAT、Y288H:TAT-GTT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288I:TAT-ACT；
Q161S:CAG-AAT、S214H:AGC-CAT、Y288T:TAT-GTT；
Q161N:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT；
Q161S:CAG-AAT、S214H:AGC-CAT、Y288A:TAT-GGT；
Q161N:CAG-CAT、S214H:AGC-CAT、Y288A:TAT-ATT；
Q161H:CAG-CGT、S214H:AGC-CAT、Y288I:TAT-GTT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT、S177G:AGC-GGT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT、F107D:TTT-GAT；
Y288V:TAT-GTT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT、V49Y:GTT-TAT、H290C:CAT-TGT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT、V49Y:GTT-TAT、H290D:CAT-GAT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT、V49C:GTT-TGT、H290D:CAT-GAT；以及
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、G286A:GGT-GCA、Y288L:TAT-CTA中的一组或多组的组合。
第三方面，本申请提供一种表达载体，所述表达载体包含第二方面中的核酸分子。
第四方面，本申请提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括第二方面中的核酸分子或第三方面中的表达载体。
第五方面，本申请还提供一种异戊烯基转移酶突变体的制备方法，通过培养第四方面所述的宿主细胞得到所述异戊烯基转移酶突变体。
第六方面，本申请提供一种生产大麻萜酚的方法，所述方法包括：将第一方面所述的异戊烯基转移酶突变体与底物接触，从而得到大麻萜酚。
可选的，所述底物为橄榄醇和焦磷酸香叶酯。
有益效果：
本申请提供一种能定向催化合成CBG的异戊烯基转移酶突变体，该异戊烯基转移酶突变体可帮助橄榄醇和焦磷酸香叶酯催化生成催化活性和纯度较高的大麻萜酚，具有较高的生产应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本申请实施例中构建的NphB基因质粒图谱；
图2是本申请实施例中提供的NphB蛋白纯化的SDS-PAGE胶图；
图3是本申请实施例中提供的以橄榄醇和GPP为底物，M13突变体催化生成CBG的液相色谱图；
图4为是本申请实施例中提供的以橄榄醇和GPP为底物，M13突变体催化生成CBG的质谱图；
图5为是本申请实施例中提供的CBG标准品的质谱图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请实施例提供一种异戊烯基转移酶突变体及生产大麻萜酚的方法。以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。
首先，本申请涉及一种异戊烯基转移酶(NphB)突变体，所述NphB突变体的序列是对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的部分位点被取代，所述部分位点包括：A232、G286、Y288、Q161、S214、V49、S177、F107以及H290中的至少一种。
需要说明的是，所述所述NphB突变体的氨基酸序列还可以是具有所述发生取代的氨基酸序列中的所述取代位点，且与所述发生取代的氨基酸序列至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％的相似性的具有NphB活性的功能性片段。
本申请中的“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经序列相似性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。在本申请中，关于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的部分位点被“取代”是指在特定位置处的氨基酸已被其他的氨基酸代替，取代可以是保守的或非保守的，取代可以为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列上的单个位点取代，也可以为多个位点取代。
本领域技术人员可以理解，在本申请中取代的部分位点中，单字母代码表示氨基酸，具有如下含义：A：Ala(丙氨酸)；R：Arg(精氨酸)；N：Asn(天冬酰胺)；D：Asp(天冬氨酸)；C：Cys(半胱氨酸)；Q：Gln(谷氨酰胺)；E：Glu(谷氨酸)；G：Gly(甘氨酸)；H：His(组氨酸)；I：Ile(异亮氨酸)；L：Leu(亮氨酸)；K：Lys(赖氨酸)；M：Met(甲硫氨酸)；F：Phe(苯丙氨酸)；P：Pro(脯氨酸)；S：Ser(丝氨酸)；T：Thr(苏氨酸)；W：Trp(色氨酸)；Y：Tyr(酪氨酸)；V：Val(缬氨酸)。例如：A232T是指对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第232位的丙氨酸被替代为苏氨酸。
作为示例性方案，所述A232被取代为苏氨酸T。
作为示例性方案，所述G286被取代为苏氨酸T或丙氨酸A中的任一种。
作为示例性方案，所述S177被取代为甘氨酸G。
作为示例性方案，所述V49被取代为半胱氨酸C或酪氨酸Y中的任一种。
作为示例性方案，所述H290被取代为天冬氨酸D或半胱氨酸C中的任一种。
作为示例性方案，所述F107被取代为天冬氨酸D。
作为示例性方案，所述H290被取代为天冬氨酸D或半胱氨酸C中的任一种。
作为示例性方案，对应于SEQ ID NO.1，所述部分位点包括：
G286和Y288；
Q161、S214、Y288和S177；
Q161、S214、Y288和F107；
Q161、S214、Y288、V49和H290；以及
Q161、S214、Y288和G286中的一组或多组的组合。
作为示例性方案，对应于SEQ ID NO.1，所述部分位点发生以下取代：
A232T；
G286T和Y288A；
G286T和Y288K；
Q161S、S214H和Y288A；
Q161R、S214H和Y288V；
Q161R、S214H和Y288H；
Q161R、S214H和Y288I；
Q161S、S214H和Y288T；
Q161N、S214H和Y288V；
Q161S、S214H和Y288A；
Q161N、S214H和Y288A；
Q161H、S214H和Y288I；
Q161R、S214H、Y288V和S177G；
Q161R、S214H、Y288V和F107D；
Y288V；
Q161R、S214H、Y288V、V49Y和H290C；
Q161R、S214H、Y288V、V49Y和H290D；
Q161R、S214H、Y288V、V49C和H290D；以及
Q161R、S214H、Y288L和G286A中的一组或多组的组合。
相应的，本申请还提供一种核酸分子，所述核酸分子为上述任一项实施例所述的NphB突变体的编码基因。在本申请一些实施例中，核酸分子可以是包括编码此突变体的多核苷酸。在本申请另一些实施例中，所述核酸分子还可以包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
作为示例性的方案，所述核酸分子的核酸序列为对应于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的发生以下取代：
A232T:GCC-ACT；
G286T:GGT-ACT、Y288A:TAT-GCT；
G286T:GGT-ACT、Y288K:TAT-AAG；
Q161S:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288A:TAT-GCT；
Q161R:CAG-CGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GTT；
Q161R:CAG-CGT、S214H:AGC-CAT、Y288H:TAT-GTT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288I:TAT-ACT；
Q161S:CAG-AAT、S214H:AGC-CAT、Y288T:TAT-GTT；
Q161N:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT；
Q161S:CAG-AAT、S214H:AGC-CAT、Y288A:TAT-GGT；
Q161N:CAG-CAT、S214H:AGC-CAT、Y288A:TAT-ATT；
Q161H:CAG-CGT、S214H:AGC-CAT、Y288I:TAT-GTT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT、S177G:AGC-GGT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT、F107D:TTT-GAT；
Y288V:TAT-GTT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT、V49Y:GTT-TAT、H290C:CAT-TGT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT、V49Y:GTT-TAT、H290D:CAT-GAT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT、V49C:GTT-TGT、H290D:CAT-GAT；以及
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、G286A:GGT-GCA、Y288L:TAT-CTA中的一组或多组的组合。
在本申请中核苷酸发生取代的部分位点中，氨基酸取代的位点后面代表的分别是取代前编码该氨基酸的核苷酸位点和取代后编码该氨基酸的核苷酸位点。例如：A232T:GCC-ACT是指对应于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的含氮碱基GCC被替代为ACT，该GCC原来是用于编码A232，经替代后可用来编码A232T。
为了更好的理解，如下表1所示，表1示出了氨基酸序列和对应的核苷酸序列发生取代的位点。可以理解的是，以下仅为示例，本申请提供的核酸分子的核苷酸序列不仅限于此，只要最后得到的核苷酸分子能够编码实施例中所列出的突变体即可，具体此处不作限定。
表1
“核酸分子”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，核酸分子可以是多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。在本申请的具体的实施方式中，所述核酸分子可以是与编码M1～M19突变体的氨基酸序列的DNA相似性至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％的DNA分子。本申请的核酸分子还包括经密码子优化的核酸分子，可以采用本领域已知的密码子优化方法，例如简并密码子的替换。
本领域普通技术人员公知的测定序列相似性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis ofSequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，vonHeinje，G.，学术出版社，1987；序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991；和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAMJ.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相似性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相似性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相似性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相似性。
相应的，本申请还提供一种表达载体，所述表达载体包含所述的核酸分子。
本申请中的“表达载体”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，表达载体可以是可方便地经由重组DNA程序并且引起多核苷酸表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线状或环状质粒。载体优选含有一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了抗生素抗性或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原养性等。
相应的，本申请还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括以上任一项实施例所述的核酸分子或以上任一项实施例所述的表达载体。
本申请中的“宿主细胞”是含有本申请所述核酸分子或表达载体的细胞。换言之，本申请可以利用任何宿主细胞，只要所述细胞中含有本申请所述的核酸分子或表达载体且能够生产氨基酸的细胞。例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、乳酸菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌、假单胞菌属、类芽孢杆菌属。
真核宿主细胞可为哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞，包括但不限于：丝状真菌(曲霉、毛霉、根霉、青霉等)、酵母(毕赤酵母、假丝酵母、汉逊酵母等)。
相应的，本申请还提供一种NphB突变体的制备方法，所述方法利用了以上实施例所述的宿主细胞得到所述NphB突变体。
相应的，本申请还提供一种生产大麻萜酚(Cannabigerol，CBG)的方法，所述方法包括：将以上任一项实施例所述的NphB突变体与底物接触，从而得到大麻萜酚。
作为示例性方案，所述接触可以发生在细胞反应体系中，也可以发生在无细胞反应体系中。
作为示例性方案，所述底物具体为橄榄醇(Olivetol)和焦磷酸香叶酯(geranylpyrophosphate，GPP)。
作为示例性方案，在将所述NphB突变体与底物接触过程中，温度为20℃～60℃，和/或，pH值为7.5～8.5。可以理解的是，所述温度可以为20℃～60℃范围内任意取值，例如24℃～60℃，再例如30℃～50℃。具体可以为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，或是20℃～60℃其他未列出的数值。所述pH值可以为7.5～8.5，具体可以为7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5，或者是7.5～8.5其他未列出的数值。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
实施例1：重组菌株的构建与突变体表达过程
(1)构建表达质粒
将源自链霉菌Streptomyces sp.物种的NphB编码序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏爱性做密码子优化，然后按照图1连接到pet-28a质粒(购自北京索莱宝生物科技有限公司)上，转化大肠杆菌感受态(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，培养8h-12h后，划线铺板，制备pET-28a-NphB的单克隆菌株。
(2)蛋白的表达纯化：
配制蛋白纯化缓冲液：50mM Tris，150mM NaCl，PH＝8
a.挑取pET-28a-NphB的单克隆菌株或其-80℃保存的菌株接种于含5mL LB液体培养基(Kan+，100μg/mL)的小试管中，37℃、220rpm过夜培养，作为种子液。
b.将种子液转入50mL LB液体培养基(Kan+，100μg/mL)中，37℃、220rpm，摇床培养再次活化。
c.将再次活化后的菌液按1％的接种量，转入800mL2YT液体培养基(Kan+，100μg/mL)中，37℃、220rpm，摇床培养至OD 600约为0.6-0.8。
d.降低摇床温度至16℃-18℃，待培养的菌液温度降低后，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)至终浓度0.5mM，诱导表达14-16h。
e.表达完成后，将上述培养菌液收集到瓶中，将离心机预冷到4℃，5500rpm，离心10min。
f.去除上清，加入30mL蛋白纯化缓冲液，用旋涡振荡器重悬菌体。
g.将重悬的菌体再次离心5500rpm，10min。倒掉上清，加入30mL蛋白纯化缓冲液，用旋涡振荡器将菌体重悬(不能有固体颗粒状)，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。
(3)蛋白纯化
a.破菌：将上述收集好的菌液采用高压低温破碎仪在压力800-1000bar，4℃条件下进行破菌3-5min，使细胞充分裂解，从而将表达的目的蛋白释放并溶于蛋白缓冲液中。
b.离心：将破碎好的菌液于预冷好4℃的离心机中8000rpm，离心60min，取离心后的沉淀、上清，制样，并收集上清液。
c.纯化：上清液进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：
柱平衡：先用dd H2O洗Ni亲和层析柱(购自GE Healthcare)2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积。
上样：将上清取50uL样品后缓慢经过Ni亲和层析柱，流穿(可重复一次)并取前几滴流穿样品。
洗脱目的蛋白：用30mL分别含有20mM、50mM、100mM、200mM、300mM咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合的杂蛋白，分别取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测，结果如图2所示(仅以SEQ ID NO：1为例)，图2显示SEQ ID NO:1的蛋白纯化的SDS-PAGE胶图(泳道1：菌液破碎的沉淀；泳道2：破碎后的上清；泳道3：蛋白marker；泳道4：10mM咪唑洗脱液；泳道5：20mM咪唑洗脱液；泳道6：50mM咪唑洗脱液；泳道7：100mM咪唑洗脱液；泳道8：200mM咪唑洗脱液；泳道9：300mM咪唑洗脱液)。
d.浓缩换液：将收集到含有目的蛋白的蛋白洗脱液用50mLAmicon超滤管(10kDa，Millipore公司)进行离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。再加10mL蛋白缓冲液，再浓缩至1mL，重复该过程1次，确保除去蛋白中的咪唑，得到纯化蛋白NphB。
(4)蛋白浓度测定
蛋白浓度测定采用Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo FisherScientific)。
首先利用蛋白在280nm有吸光值进行蛋白浓度的初步测定，然后根据初测的值将蛋白浓度稀释到0.5-1mg/mL。将BCAProtein Assay Kit中试剂A与试剂B按50:1的比例配置好做反应液。取200uL反应液放置在酶标板中，在反应液中加入25uL稀释后的蛋白，用枪吹吸混匀后放置在37℃下，反应30min。将酶标板放入酶标仪中测定562nm吸光值，并按照蛋白标准曲线进行数据处理，即可得到蛋白浓度。
蛋白质浓度测定方法的操作步骤具体可参见Valliere M A,Korman T P,WoodallN B,et al.A cell-free platform for the prenylation ofnatural products andapplication to cannabinoid production[J].Nature communications,2019,10(1):1-9。
本实施例以SEQ ID NO.1对应的NphB为例，制备得到纯化的野生型NphB，本申请实施例中经过突变的NphB，例如M1～M19突变体的制备和纯化均采用相同的操作步骤。
实施例2：在体外通过蛋白酶NphB催化橄榄醇和GPP生成CBG
本实施例旨在体外利用实施例1中生成的野生型和M1～M19突变体催化橄榄醇和GPP生成CBG。
其合成的方式图如下：
反应的缓冲液：50mM Tris-HCl，pH＝8.0。
MgCl2终浓度为5mM。
GPP终浓度为2.5mM。
Olivetol终浓度为：5mM。
NphB蛋白酶的量为50ng(即NphB蛋白酶的添加量为1ng/uL)。
反应温度为24℃。
反应时间：12h。
反应总体系为：50uL。
反应后通过乙酸乙酯萃取2次后，通过真空旋转蒸发仪蒸干溶液，最后用50uL的甲醇进行溶解得到含有CBG的产物。
实施例3：对反应生成的CBG进行液相及质谱的检测
本实施例的目的在于对实施例2中生成的产物进行鉴定。
实验仪器：超高效液相色谱-质谱联用仪(Shimadzu LC-30A，SCIEXTripleTOF6600)。
色谱条件：流速：0.4mL/min；柱温30℃；色谱柱：Agilent Eclipse plus C18(100mm×2.1mm,3.5μm)；流动相A：5mM碳酸氢铵水溶液；流动相B：0.005％甲酸乙腈溶液；梯度：0min～2min：1％B，2min～2.1min：1～10％B，2.1min～12min：10～80％B，12min～12.1min：80～100％B，12.1min～20min：100B％。
质谱条件：ESI离子源；负离子IDA检测模式；离子源参数：ion voltage 4500 V，declustering potential 80 V，source temperature 600℃，curtain gas 35 psi，nebulizer gas 55 psi，heater gas 55 psi；一级扫描范围m/z 200-600；二级扫描范围m/z 30-600。
数据分析软件：Peakview软件(SCIEX，美国)。
实验结果如表2和图3～图5所示。其中，表2为M1～M19突变体的催化相对活性，图3为M13对应的NphB催化生成的CBG对应的液相色谱对应的结果，从图3可以看出，野生型和M13突变体催化生成的产物的液相色谱的出峰时间与CBG标准品一致。图4为M13突变体催化生成的产物对应的质谱对应的结果，图5为CBG标准品的质谱图，从图4和图5可以看出，M13突变体催化生成的产物的分子量与CBG一致，可见M13突变体对应的NphB成功的催化橄榄醇和GPP生成CBG。
其他突变体对应的液相色谱的出峰时间和质谱检测的分子量结果与M13一致，符合预期。
表2
注：相对活性是指突变体相对于野生型的倍数，相对纯度是指产物CBG的峰面积与总的峰面积的占比。
从表2可以看出，本申请实施例提供的NphB突变体的催化活性均大于野生型的催化活性。此外，M13、M14、M16～M19的突变体催化活性显著提高，尤其是M16的催化活性为野生的42倍，催化效果显著。
本申请实施例提供的NphB突变体的催化生成的CBG纯度也均大于野生型的，尤其是M5、M13、M14、M16～M19，相对纯度均大于50％，相较于野生型的，产物的纯度有显著的提升，效果显著。
以上对本申请所提供的一种异戊烯基转移酶及生产大麻萜酚的方法，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。
序列表
<110> 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司
<120> 异戊烯基转移酶突变体及生产大麻萜酚的方法
<141> 2022-01-07
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 315
<212> PRT
<213> Streptomyces sp. CL190
<400> 1
Met Ser Glu Ala Ala Asp Val Glu Arg Val Tyr Ala Ala Met Glu Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Leu Leu Gly Val Ala Cys Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Pro
20 25 30
Leu Leu Ser Thr Phe Gln Asp Thr Leu Val Glu Gly Gly Ser Val Val
35 40 45
Val Phe Ser Met Ala Ser Gly Arg His Ser Thr Glu Leu Asp Phe Ser
50 55 60
Ile Ser Val Pro Thr Ser His Gly Asp Pro Tyr Ala Thr Val Val Glu
65 70 75 80
Lys Gly Leu Phe Pro Ala Thr Gly His Pro Val Asp Asp Leu Leu Ala
85 90 95
Asp Thr Gln Lys His Leu Pro Val Ser Met Phe Ala Ile Asp Gly Glu
100 105 110
Val Thr Gly Gly Phe Lys Lys Thr Tyr Ala Phe Phe Pro Thr Asp Asn
115 120 125
Met Pro Gly Val Ala Glu Leu Ser Ala Ile Pro Ser Met Pro Pro Ala
130 135 140
Val Ala Glu Asn Ala Glu Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Asp Lys Val
145 150 155 160
Gln Met Thr Ser Met Asp Tyr Lys Lys Arg Gln Val Asn Leu Tyr Phe
165 170 175
Ser Glu Leu Ser Ala Gln Thr Leu Glu Ala Glu Ser Val Leu Ala Leu
180 185 190
Val Arg Glu Leu Gly Leu His Val Pro Asn Glu Leu Gly Leu Lys Phe
195 200 205
Cys Lys Arg Ser Phe Ser Val Tyr Pro Thr Leu Asn Trp Glu Thr Gly
210 215 220
Lys Ile Asp Arg Leu Cys Phe Ala Val Ile Ser Asn Asp Pro Thr Leu
225 230 235 240
Val Pro Ser Ser Asp Glu Gly Asp Ile Glu Lys Phe His Asn Tyr Ala
245 250 255
Thr Lys Ala Pro Tyr Ala Tyr Val Gly Glu Lys Arg Thr Leu Val Tyr
260 265 270
Gly Leu Thr Leu Ser Pro Lys Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Tyr
275 280 285
Tyr His Ile Thr Asp Val Gln Arg Gly Leu Leu Lys Ala Phe Asp Ser
290 295 300
Leu Glu Asp Leu Glu His His His His His His
305 310 315
<210> 2
<211> 948
<212> DNA
<213> Streptomyces sp. CL190
<400> 2
atgagcgaag cagcagatgt tgaacgtgtt tatgcagcaa tggaagaagc agccggtctg 60
ctgggtgttg catgtgcacg tgataaaatc tatccgctgc tgagcacctt tcaggatacc 120
ctggttgaag gtggtagcgt tgttgttttt agcatggcaa gcggtcgtca tagcaccgaa 180
ctggatttta gcattagcgt tccgaccagc catggtgatc cgtatgcaac cgttgttgaa 240
aaaggtctgt ttccggcaac cggtcatccg gttgatgatc tgctggcaga tacccagaaa 300
catctgccgg ttagcatgtt tgcaattgat ggtgaagtta ccggtggctt caaaaaaacc 360
tatgcatttt ttccgaccga taatatgcct ggtgttgcag aactgagcgc aattccgagc 420
atgcctccgg cagttgcaga aaatgccgaa ctgtttgcac gttatggtct ggataaagtt 480
cagatgacca gcatggatta caaaaaacgt caggtgaacc tgtattttag cgaactgagt 540
gcacagaccc tggaagcaga aagcgttctg gcactggttc gtgaactggg tctgcatgtt 600
ccgaatgaac tgggcctgaa attttgtaaa cgtagcttta gcgtttatcc gacgctgaat 660
tgggaaaccg gtaaaattga tcgtctgtgc tttgccgtta ttagcaatga tccgacactg 720
gttccgagca gtgatgaagg tgatatcgaa aaatttcaca actacgcaac caaagcaccg 780
tatgcatatg ttggtgaaaa acgtaccctg gtgtatggtc tgaccctgag tccgaaagaa 840
gaatattaca aactgggtgc ctattaccat attaccgatg ttcagcgtgg tctgctgaaa 900
gcatttgata gcctggaaga tctggaacat catcatcacc atcactaa 948
Claims (8)
1.一种异戊烯基转移酶突变体，其特征在于，所述异戊烯基转移酶突变体的序列是对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的部分位点被取代而获得序列，所述取代的方式为以下任意一组：
Q161R、S214H和Y288V；
Q161R、S214H、Y288V和S177G；
Q161R、S214H、Y288V和F107D；
Q161R、S214H、Y288V、V49Y和H290C；
Q161R、S214H、Y288V、V49Y和H290D；
Q161R、S214H、Y288V、V49C和 H290D。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为权利要求1所述的异戊烯基转移酶突变体的编码基因。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核酸序列为对应于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的部分位点被取代而获得的序列，所述取代的方式为以下任意一组：
Q161R:CAG-CGT 、S214H:AGC-CAT 和Y288V:TAT-GTT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT和S177G:AGC-GGT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT和F107D:TTT-GAT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT、V49Y:GTT-TAT 和H290C:CAT-TGT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT、V49Y:GTT-TAT和H290D:CAT-GAT；
Q161R:CAG-AGT、S214H:AGC-CAT、Y288V:TAT-GCT、V49C:GTT-TGT和H290D:CAT-GAT。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2所述的核酸分子。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求2所述的核酸分子或权利要求4所述的表达载体。
6.一种异戊烯基转移酶突变体的制备方法，其特征在于，通过培养权利要求5所述的宿主细胞得到所述异戊烯基转移酶突变体。
7.一种生产大麻萜酚的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的异戊烯基转移酶突变体与底物接触，从而得到大麻萜酚。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述底物为橄榄醇和焦磷酸香叶酯。
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