CN114344304A - 川芎嗪硝酮化合物在制备预防和/或治疗肾性贫血药物中的应用 - Google Patents

川芎嗪硝酮化合物在制备预防和/或治疗肾性贫血药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种川芎嗪硝酮化合物在制备预防和/或治疗肾性贫血药物中的应用，其中川芎嗪硝酮化合物为具有通式(I)所示结构的化合物或其在药学上可以接受的盐。实验结果显示，本发明川芎嗪硝酮化合物能显著增加STZ诱导的SD大鼠和自发性高血压大鼠血清铁离子和促红细胞生成素含量，可用于预防和/或治疗肾脏EPO生成减少或/和伴发铁缺乏而导致的肾性贫血。因此所述川芎嗪硝酮化合物可与药物载体制成各种剂型。

Description

川芎嗪硝酮化合物在制备预防和/或治疗肾性贫血药物中的 应用
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及一种川芎嗪硝酮化合物在制备预防和/或治疗肾性贫血药物中的应用。
背景技术
肾性贫血是指由各类肾脏疾病造成促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)的相对不足或者绝对不足导致的贫血，以及尿毒症患者血浆中的一些毒性物质通过干扰红细胞的生成和代谢而导致的贫血。
EPO合成的减少及其导致的造血干细胞合成障碍是肾性贫血的主要原因。EPO是一种主要由肾皮质生成的造血细胞因子，次要来源是肝脏，合成后被直接分泌到血液中，在其生产的细胞内没有储存，在循环中分布体积接近血浆体积。当肾皮质受损时，EPO生成减少，阻断了祖细胞向红细胞和网织红细胞成熟分化，以及未成熟红细胞存活率降低，进而导致贫血。在正常生理状态下，约90％的EPO由肾脏产生；在机体组织缺氧时，血中促红细胞生成素水平升高，从而刺激骨髓红细胞生成增多，促红细胞生成素分泌也受红细胞数量降低的负反馈调节。在糖尿病肾病病理状态下，高糖诱导肾小管间质损伤，EPO合成不足，进而导致贫血的发生。此外，EPO合成减少甚至早于肾小球滤过率(eGFR)降低和蛋白尿的出现。
肾性贫血另一发病因素为缺铁。缺铁在慢性肾病患者中很常见，非透析慢性肾病患者缺铁发生率高于50％，接受透析的患者比例更高。慢性肾病患者红细胞生成中铁的缺乏常常伴随着肠道铁吸收相对阻滞以及巨噬细胞和肝中储存铁释放减少。这种铁阻滞现象主要由肝产生的铁调素介导，铁调素浓度升高导致铁转运蛋白内化到细胞中，其结果是铁不会通过肠细胞或储存组织进入循环。铁调素浓度与机体铁储存、炎症、贫血和EPO水平等因素相关，在慢性肾病病理状态下，炎症刺激铁调素保持高水平，阻断生成红细胞所需要的铁。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种川芎嗪硝酮化合物在预防和/或治疗肾性贫血中的应用。或者，本发明提供一种川芎嗪硝酮化合物在制备用于预防和/或治疗肾性贫血药物中的应用。
本发明所述的川芎嗪硝酮化合物在制备用于预防和/或治疗肾性贫血药物中的应用，其中川芎嗪硝酮化合物为具有如下通式(I)所示结构的化合物或其在药学上可以接受的盐：
Figure BDA0003300796010000021
其中：
R2，R3相同或不同，各自独立选自氢或C1-C6烷基；
R1为氢、甲基或
Figure BDA0003300796010000022
R4为仲丁基、异丁基、环戊基或环己基，R5为仲丁基、异丁基、叔丁基或环己基。
在一种实施方式中，R2，R3相同或不同，各自独立选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基或正戊基。
在一种具体的实施方式中，本发明所述的川芎嗪硝酮化合物选自如下结构式：
Figure BDA0003300796010000023
在本申请的一些实施方案中，本发明“药学可接受的盐”可以是式I化合物与无机酸形成的盐，例如与以下无机酸形成的盐：盐酸(HCl)、氢溴酸(HBr)、氢碘酸、硫酸、焦硫酸、磷酸或硝酸；或者式I化合物与有机酸形成的盐，例如与以下有机酸形成的盐：甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、扑酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、肥酸、藻酸、马来酸、富马酸、D-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或硫氰酸。
在本申请的一些实施方案中，所述的肾性贫血是指各种肾脏病致肾功能下降时，肾脏EPO生成减少或/和伴发铁缺乏而导致的贫血。
在本申请的一些实施方案中，所述的肾性贫血包括但不限于糖尿病肾病肾性贫血、慢性肾脏病(CKD)并发肾性贫血、癌症并发肾性贫血等。本发明所述癌症并发肾性贫血为癌症放疗或化疗所致肾性贫血。
在本申请的一些实施方案中，所述的糖尿病肾病肾性贫血，包括1型糖尿病或2型糖尿病引起的肾病肾性贫血。
本发明目的之二在于提供一种药用组合物，其包括有效剂量的本发明所述的川芎嗪硝酮化合物，以及药学上可接受的载体。
在本申请的一些实施方案中，所述的药物组合物可以以本发明所述的川芎嗪硝酮化合物作为唯一的药用活性成分，也可以与其他活性药物联合使用。
本发明所述的药用组合物，可通过多种途径给药，该途径包括但不限于选自以下的途径：口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、透皮、舌下、肌内、直肠、透颊、鼻内、吸入、阴道、眼内、局部、皮下、脂肪内、关节内、腹膜内和鞘内。在一个特定的实施方案中，通过口服给药。
本发明所述的药用组合物，可以为药学上可接受的各种剂型，所述剂型包括但不限于片剂、颗粒剂、针剂、粉剂、胶囊剂或悬浮剂。
本发明所述的药用组合物中所述的药学上可接受的载体包括但不限于药物赋形剂，添加剂，无毒的可相容的填料，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，抗氧化剂，润滑剂，矫味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂等。
给予本发明所述的川芎嗪硝酮化合物的量可根据疾病的严重程度、疾病的响应、任何治疗相关的毒性、受试者的年龄和健康状态来确定。在一个实施方案中，有效剂量为0.001～2g/kg。
在本申请的一些实施方案中，所述的其他活性药物可以为其他用于预防治疗糖尿病肾病、慢性肾脏病或癌症等的药物。
在一种实施例中，优选为用于预防和/或治疗糖尿病肾病的活性药物。其他活性药物包括但不限于降低血压类药物例如血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin-ConvertingEnzyme Inhibitors,ACEI)、血管紧张素II受体拮抗剂(Angiotensin II receptorantagonist,ARB)、钙通道阻滞剂、β受体阻滞剂以及利尿剂等；调控血糖药物例如双胍类、磺脲类、格列奈类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、二肽基肽酶(DPP-4)抑制剂、胰岛素等；低氧诱导因子脯氨酸羟化酶(HIF-PH)抑制剂等。
在一些具体的实施方案中，优选为血管紧张素II受体阻断剂氯沙坦、二甲双胍、HIF-PH抑制剂roxadustat等。
本文所用“联用”或“联合使用”意指两种或更多种活性物质可以在混合物中一起、作为单一制剂同时地或作为单一制剂以任何顺序依次地施用于受试者。例如，本发明川芎嗪硝酮化合物与其他用于预防治疗糖尿病肾病、慢性肾脏病或癌症等的药物联合使用在用于预防或治疗糖尿病肾病并发肾性贫血、慢性肾脏病并发肾性贫血或癌症并发肾性贫血药物中的应用。
本发明川芎嗪硝酮化合物与降低血压药物(例如血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors,ACEI)、血管紧张素II受体拮抗剂(Angiotensin II receptor antagonist,ARB)、钙通道阻滞剂、β受体阻滞剂、利尿剂)联合使用在用于预防或治疗高血压合并肾性贫血药物中的应用。本发明川芎嗪硝酮化合物与调控血糖药物(例如双胍类、磺脲类、格列奈类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、二肽基肽酶(DPP-4)抑制剂、胰岛素)联合使用在用于预防或治疗糖尿病合并肾性贫血药物中的应用。本发明川芎嗪硝酮化合物与低氧诱导因子脯氨酸羟化酶(HIF-PH)抑制剂联合使用在用于预防或治疗肾性贫血药物中的应用。
本发明川芎嗪硝酮化合物与氯沙坦联合使用在用于预防或治疗高血压合并肾性贫血药物中的应用；本发明川芎嗪硝酮化合物与二甲双胍联合使用在用于预防或治疗糖尿病合并肾性贫血药物中的应用；本发明川芎嗪硝酮化合物与roxadustat联合使用在用于预防或治疗肾性贫血药物中的应用。
治疗肾性贫血的方法，其包括向患者给药本发明川芎嗪硝酮化合物(药用组合物)。治疗肾性贫血的方法，其包括向患者给药本发明川芎嗪硝酮化合物和其他活性物质。
本发明的技术优势：
1.本发明提供了川芎嗪硝酮化合物的新用途，即在制备预防和/或治疗肾性贫血药物中的应用，可有效提高肾脏EPO生成和铁离子含量，可用于预防和/或治疗肾脏EPO生成减少或/和伴发铁缺乏而导致的肾性贫血。
2.本发明所述的川芎嗪硝酮化合物在STZ诱导SD大鼠的DKD模型、STZ诱导SHR大鼠肾病合并高血压模型、顺铂诱导的小鼠肾性贫血模型中，TBN能够增加血清EPO和铁离子含量，EPO和铁离子减少为肾性贫血的诱发因素，即TBN能够减少肾性贫血的发生率，为患者带来更高的获益比。
3.本发明提供的川芎嗪硝酮化合物还可与临床上现有的肾性贫血和肾性贫血并发症治疗药物联合使用，通过协同作用提高疗效，降低现有临床药物的副作用，提高临床用药收益/风险比。
附图说明
图1为细胞缺氧模型中细胞内EPO mRNA水平的表达结果。
图2为TBN对STZ诱导DKD大鼠肾脏形态的影响。**P<0.01与对照组比较；#P<0.05，##P<0.01与模型组比较。其中，对照组：n＝16只；模型组：n＝13只；TBN 10mg/kg组：n＝16只；TBN 30mg/kg组：n＝16只；TBN 60mg/kg组：n＝16只；Losartan10mg/kg组：n＝16只。
图3为TBN降低DKD大鼠肾小球硬化指数。***P<0.001与对照组比较；###P<0.001与模型组比较。其中，对照组：n＝7只；模型组：n＝5只；TBN 10mg/kg组：n＝6只；TBN 30mg/kg组：n＝6只；TBN 60mg/kg组：n＝7只；Losartan 10mg/kg组：n＝6只。
图4为TBN显著降低DKD大鼠间质纤维化指数。**P<0.01与对照组比较；#P<0.05，##P<0.01与模型组比较。其中，对照组：n＝6只；模型组：n＝6只；TBN 10mg/kg组：n＝6只；TBN30mg/kg组：n＝6只；TBN 60mg/kg组：n＝6只；Losartan 10mg/kg组：n＝6只。
图5为TBN增加STZ诱导DKD大鼠血清中铁离子的含量。**P<0.01与对照组比较；#P<0.05与模型组比较。其中，对照组：n＝15只；模型组：n＝13只；TBN 10mg/kg组：n＝16只；TBN30mg/kg组：n＝16只；TBN 60mg/kg组：n＝16只；Losartan 10mg/kg组：n＝16只。
图6为TBN增加STZ诱导DKD大鼠血清中EPO的含量。***P<0.001与对照组比较；#P<0.05与模型组比较。其中，对照组：n＝15只；模型组：n＝13只；TBN 10mg/kg组：n＝16只；TBN30mg/kg组：n＝16只；TBN 60mg/kg组：n＝16只；Losartan 10mg/kg组：n＝16只。
图7为TBN对db/db小鼠24h尿微量白蛋白的影响。***P<0.001与野生组(wt/wt)比较，##P<0.01，###P<0.001与模型组(db/db)比较。其中，野生组：n＝10只；模型组：n＝10只；TBN 10mg/kg组：n＝10只；TBN 30mg/kg组：n＝10只；TBN 60mg/kg组：n＝10只；Losartan10mg/kg组：n＝10只。
图8为TBN对db/db小鼠肾组织病理组织学的影响。***P<0.001与野生组(wt/wt)比较，##P<0.001，###P<0.001与模型组(db/db)比较。其中，野生组：n＝10只；模型组：n＝10只；TBN 10mg/kg组：n＝10只；TBN 30mg/kg组：n＝10只；TBN 60mg/kg组：n＝10只；Losartan10mg/kg组：n＝10只。
图9为TBN对db/db小鼠肾组织亚显微形态的影响。**P<0.01与野生组(wt/wt)比较，#P<0.01，##P<0.01与模型组(db/db)比较。其中，野生组：n＝8只；模型组：n＝8只；TBN10mg/kg组：n＝8只；TBN 30mg/kg组：n＝8只；TBN 60mg/kg组：n＝8只；Losartan 10mg/kg组：n＝8只。
图10为TBN对db/db小鼠尿中尿白蛋白/肌酐的影响。其中，野生组：n＝8只；模型组：n＝8只；TBN 30mg/kg组：n＝8只；Losartan 10mg/kg组：n＝8只；TBN+Losartan组：n＝8只。
图11为TBN对STZ诱导SHR大鼠体重、饮水量和饮食量的影响。其中，WKY组：n＝16只；SHR组：n＝16只；SHR-STZ组：n＝16只；SHR-STZ+TBN组：n＝16只；SHR-STZ+Losartan组：n＝16只。
图12为TBN对STZ诱导SHR大鼠肾脏形态的影响。其中，WKY组：n＝16只；SHR组：n＝16只；SHR-STZ组：n＝16只；SHR-STZ+TBN组：n＝16只；SHR-STZ+Losartan组：n＝16只。
图13为TBN对STZ诱导SHR大鼠肾小球指数的影响。其中，WKY组：n＝16只；SHR组：n＝16只；SHR-STZ组：n＝16只；SHR-STZ+TBN组：n＝16只；SHR-STZ+Losartan组：n＝16只。
图14为TBN对STZ诱导SHR大鼠血清中铁离子和EPO的影响。其中，WKY组：n＝16只；SHR组：n＝16只；SHR-STZ组：n＝16只；SHR-STZ+TBN组：n＝16只；SHR-STZ+Losartan组：n＝16只。
图15为TBN对小鼠铁调素水平的影响；其中*P<0.05vs.Model mice；#P<0.05vs.Control mice.其中control组：n＝8只；model组：n＝7只；TBN 30mg/kg组：n＝8只；TBN 60mg/kg组：n＝7只；Roxadustat 10mg/kg组：n＝8只。
图16TBN对小鼠促红细胞生成素含量的影响；其中control组：n＝5只；model组：n＝5只；TBN 30mg/kg组：n＝5只；TBN 60mg/kg组：n＝5只；Roxadustat 10mg/kg组：n＝5只。
具体实施方式
下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。
实施例1 细胞缺氧模型实验
细胞缺氧模型的建立
将HepG2细胞冻存管在37℃水浴锅中融化，加入3-4倍细胞混悬液体积的完全培养基混匀后1000r/min离心5min后弃去上清液并转移至培养瓶中，往培养瓶中补足5ml完全培养基(10％FBS+90％DMEM)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。待培养瓶中HepG2细胞密度达到80％，弃去培养基。用2-3mL HBSS缓冲液洗涤两次，完全去除含血清的培养基。往培养瓶中加入1mL 0.25％胰酶-0.02％EDTA，放置于37℃的培养箱消化2min左右。取出培养瓶，在显微镜底下观察细胞形态，得到小而圆细胞。弃去0.25％胰酶-0.02％EDTA，加3mL完全培养基洗涤，吹打培养瓶壁上的细胞，将吹打下来的细胞悬液转移到新的培养瓶中进行培养，每次传代的比例为一传三。待细胞经过2-3次传代操作后，用浓度为50μM的缺氧造模剂氯化钴(CoCl2)进行造模。以80000个/毫升的密度接种于六孔板内，每孔接种1.5mL，设置三个组(control，CoCl2，TBN30)，培养24h待细胞贴壁。细胞贴壁后将CoCl2，TBN 30μM组培养基换成50μM CoCl2-纯培养基，control组换成纯培养基，培养24h构建细胞缺氧模型。孵育24h后弃掉原培养基，control组加入不含药物的纯培养基(DMEM)，model组加入50μMCoCl2-纯培养基，给药组加入含药30μM TBN的50μM CoCl2-纯培养基继续培养24h。
通过RT-PCR检测细胞EPO水平
在培养板中加入(buffer RZ)裂解液裂解细胞，每10cm2面积加1mL RZ，用取样器抽打若干次至溶液透明。将匀浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec(秒)，室温放置3min。在4℃12,000rpm的离心条件下离心10min，样品会分成黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50％，把水相转移到新管中，缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀，将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，在4℃12,000rpm的离心条件下离心30sec，向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RD在4℃12,000rpm的条件下离心30sec，弃废液，将CR3放入收集管中。向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，在上述条件下离心30sec，弃废液。将吸附柱放入2ml收集管中，在上述条件下离心2min，去除残余液体。最后将吸附柱CR3转入一个新的1.5ml离心管中，加30-100μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，在上述条件下离心2min。
逆转录为cDNA
使用FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂合成第一链cDNA，50ng-2μg的总RNA可建立20μL反应体系。
1.将模板RNA在冰上解冻；5×FastKing-RT SuperMix和RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
以下操作步骤在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行反应体系配制时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
总RNA反应体系的建立
按照下表1所示配制反转录反应体系。
表1 反转录反应体系
组成成分 使用量
5×FastKing-RT SuperMix 4μL
Total RNA 50ng-2μg
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O 补足到20μL
按照下表2所示进行反转录反应。
表2 反转录反应参数
反应温度 反应时间 说明
42℃ 15min 去除基因组及反转录反应
95℃ 3min 酶灭活过程
cDNA扩增定量
1.取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
Figure BDA0003300796010000081
Figure BDA0003300796010000091
引物参见(Jussi-Pekka Tolonen.et,Along hypoxia-inducible factor3isoform 2 is a transcription activator that regulates erythropoietin,Cellular and Molecular Life Sciences(2020)77:3627–3642)。
2.PCR扩增
预变性 95℃，10min
循环(40次) 95℃，15s→60℃，60s
熔解曲线 60℃→95℃，每15s升温0.3℃。
HepG2细胞缺氧模型中细胞内EPO mRNA水平的表达结果如图1所示。TBN 30μM能够显著提高二氯化钴诱导的HepG2细胞缺氧模型中细胞内EPO mRNA水平的表达。实验发现，TN-2也能提高二氯化钴所导致的缺氧模型中细胞内EPO mRNA水平的表达。
实施例2.STZ诱导糖尿病肾病大鼠模型的制作及分组
(1)STZ诱导的SD大鼠DKD模型的建立
注射前大鼠禁食不禁水12h，称重后腹腔注射55mg/kg STZ(STZ需快速注射，10min内完成注射)，然后放回笼内确保大鼠24h充足饮水，正常对照组大鼠注射等体积的柠檬酸缓冲液(pH 4.5)。STZ注射3w(周)后尾静脉采血，将血糖≥16.7mmol/L作为DKD大鼠入组的标准。
(2)动物分组及给药
按照随机数字表进行分组后，每组大鼠具体情况如下表3所示：
表3 STZ诱导糖尿病肾病大鼠给药具体情况
Figure BDA0003300796010000092
Figure BDA0003300796010000101
给药途径为灌胃给药，TBN每天给药两次(固定在每天早上9:00-10:00和下午3:00-4:00)，Losartan每天给药一次(固定在每天早上9:00-10:00)，连续给药6w。
TBN对STZ诱导的DKD大鼠肾组织形态学影响
实验终点，迅速分离肾组织经4％多聚甲醛固定和石蜡包埋，连续组织切片，每片5μm，37℃烘干1h，然后进行苏木精-伊红(HE)染色，简要步骤如下：石蜡切片从65℃烘箱中取出后立即放入二甲苯中脱蜡和梯度酒精复水后，用苏木精染液染色10min，镜检控制1％盐酸酒精分化，直至细胞核及核内染色质清晰为止；1％氨水-乙醇溶液蓝化；0.5％曙红Y-乙醇溶液染色3min，最后常规脱水，封片，光镜下观察组织形态改变。染色结果显示Ctrl组大鼠肾小球和肾小管结构清晰规则，肾小管上皮细胞排列整齐未见异常，未见毛细血管基底膜增厚、系膜细胞及细胞外基质增生，系膜区未见明显的炎性细胞浸润，肾小球无渗出及粘连。Vehicle组的DKD组大鼠肾小球体积增大，系膜区弥漫性增宽，系膜细胞增生，毛细血管袢扩张，系膜基质增多，肾小球毛细血管基底膜不规则增厚，近端肾小管上皮细胞空泡变形、脱落及大量炎症细胞浸润等的肾脏病理改变(图2A)。肾小球面积统计结果显示，Vehicle组的DKD组大鼠肾小球面积相对Ctrl组明显增大(P<0.01)。TBN各给药剂量组对上述病理性改变均有所改善，其中60mg/kg TBN改善最明显。阳性对照药Losartan对肾组织损伤也有改善，但未明显降低肾小球面积(图2B)。
TBN明显改善STZ诱导的DKD大鼠肾小球硬化程度
实验终点，迅速分离肾组织经4％多聚甲醛固定和石蜡包埋，连续组织切片，每片5μm，37℃烘干1h，然后进行PAS染色。简要步骤如下：石蜡切片从65℃烘箱中取出后立即放入二甲苯中脱蜡和梯度酒精复水后，先后利用高碘酸处理5min和Schiff处理10min，然后利用分化液分化10s，流水冲洗后返蓝，最后常规脱水，封片。PAS染色结果显示Ctrl组大鼠肾小球基底膜面积未见明显改变，Vehicle组大鼠肾小球基底膜面积明显大于Ctrl组(图3A)。Vehicle组大鼠肾小球硬化指数明显增加，相对Ctrl组具有显著统计学差异(P<0.001，图3B)。TBN各剂量和阳性对照药Losartan治疗组均能显著降低DKD大鼠肾小球硬化指数(P<0.001，图3B)。
TBN对各组大鼠间质纤维化程度的影响
实验终点，迅速分离肾组织经4％多聚甲醛固定和石蜡包埋，连续组织切片，每片5μm，37℃烘干1h，然后进行Masson染色。简要步骤如下：石蜡切片从65℃烘箱中取出后立即放入二甲苯中脱蜡和梯度酒精复水后，按照试剂盒说明书加入试剂A(A1和A2等量混合液)染色8min；接着利用试剂B分化和试剂C返蓝；试剂D染色7min；试剂E洗1min；试剂F洗1min；试剂G染色1min；95％乙醇和无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。染色结果显示，与Ctrl组大鼠相比，Vehicle组大鼠肾小球和肾小管间质纤维化面积明显大于Ctrl组(图4A)。Vehicle组大鼠间质纤维化指数明显增加，相对Ctrl组具有显著统计学差异(P<0.01，图4B)。TBN各治疗组剂量依赖性的降低间质纤维化指数，其中60mg/kg TBN改善最为显著(P<0.01)。阳性对照药Losartan组相对Vehicle组大鼠同样显著降低间质纤维化指数(P<0.05，图4B)。
TBN对STZ诱导DKD大鼠血清铁离子的含量
实验终点，大鼠麻醉后腹主动脉取血，静置1h后，3000rmp离心10min，-80℃分装保存。使用全自动生化分析仪检测血清中铁离子的含量。实验结果如图5所示，Vehicle组大鼠血清中铁离子含量与Ctrl组相比显著降低(P<0.01)；TBN各给药组剂量依赖性的增加了血清铁离子的含量，尤其是TBN高剂量组增加最为显著，血清铁离子含量的增加相对于Vehicle组具有统计学差异(P<0.05)。
TBN对STZ诱导DKD大鼠血清促红细胞生成素的影响
实验终点，麻醉大鼠后腹主动脉取血，静置1h后，3000rmp离心10min收集上清，按照试剂盒操作说明检测血清中促红细胞生成素水平。步骤简述如下：取酶标板平衡至室温，按照等比稀释法配制标准品，设置空白孔，标准品孔及待测样品孔，空白对照孔不加样品，只加显色剂A、B和终止液用于调零；标准品孔：加入稀释好的标准品50μL，0ng/L组加入标准品/样品稀释液50μL；待测样品孔加入样本50μL；所有组别加入生物抗原工作液50μL，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃培养箱中孵育60min，小心揭掉封板膜后弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，吸尽孔内残余液体后，每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min，每孔加终止液50μL，终止反应。测定时以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。根据浓度和OD值算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应样品浓度。实验结果如图6所示，Vehicle组大鼠血清EPO含量相较于Ctrl组显著减少(P<0.001)；相对于Vehicle组大鼠，TBN各给药剂量组不同程度的增加了血清中EPO的含量，其中30mg/kg和60mg/kg TBN增加EPO含量具有显著的统计学差异(P<0.05)。阳性对照药Losartan并没有增加DKD大鼠血清中EPO水平，反而EPO的水平略有降低。
实施例3.2型自发性糖尿病肾病小鼠模型的建立及分组
(1)2型自发性糖尿病肾病小鼠模型的建立
db/db小鼠是由于位于4号染色体上的瘦素受体基因G-T发生点突变导致瘦素受体(Leptin receptor,Lepr)自发性突变的先天肥胖性2型DKD小鼠，其多饮、多食、多尿、糖尿病和高尿糖的病程与人类较为相似，是目前最广泛应用的2型DKD自发性动物模型。db/db小鼠随着糖尿病的加重产生一系列并发症，肾组织主要病理学改变为肾小球系膜间质扩张，肾小球基底膜增厚，细胞外基质过量积聚等。但db/db小鼠肾小球系膜改变相对缓慢，并且肾小球系膜不会发生溶解或结节性肾小球硬化，也没有渐进性肾功能不全。
(2)动物分组及给药如下表4所示
表4 2型自发性糖尿病肾病小鼠给药具体情况
分组 剂量 给药方式 给药频率
wt/wt / i.g. twice/day
db/db / i.g. twice/day
db/db+TBN 10mg/kg i.g. twice/day
db/db+TBN 30mg/kg i.g. twice/day
db/db+TBN 60mg/kg i.g. twice/day
db/db+Losartan 10mg/kg i.g. once/day
购买回6周龄的db/db小鼠，适应性喂养1w后(即7周龄)开始给药，TBN每天给药两次(固定在每天早上9:00-10:00和下午3:00-4:00开始，间隔6h)，阳性对照药Losartan每天给药一次(固定在每天早上9:00-10:00给药)，连续给药6w。
TBN对db/db小鼠24h尿微量白蛋白的影响
db/db小鼠在药物治疗后第4w和第6w各检测一次24h尿液测尿微量白蛋白。各组db/db小鼠放置于代谢笼中，自由饮水，收集24h尿液标本，所有尿液标本采用甲苯防腐，24h尿液离心去沉淀置于1.5mLEP管内，置于-20℃冰箱中备用，ELISA试剂盒检测microalbuminuria含量，简要步骤如下：实验设置空白孔、标准品孔和待测样品孔。空白对照孔只加入显色剂A&B和终止液，其他试剂均不加；标准品孔每孔分别加入50μL不同浓度的标准品和链霉素-辣根过氧化物酶50μL；待测样品孔每孔分别加入40μL样本，然后加入10μLmicroalbuminuria抗体和50μL链酶亲和素-辣根过氧化物酶，轻轻振荡混匀后置于37℃培养箱孵育60min；然后每孔加入至少350μL洗涤液，浸泡30s后弃去，重复5次，末次洗板后，将孔内残余洗涤液吸干；每孔分别加入50μL显色剂A和50μL显色剂B，轻轻震荡混匀后，37℃培养箱避光反应10min；最后每孔分别加入50μL终止液，此时反应液由蓝色立转黄色，反应终止，反应完成后应立即使用多功能酶标仪在450nm波长处测定吸光度值(OD值)；以空白对照孔调零，microalbuminuria标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，计算标准曲线回归方程，根据此回归方程和样品的OD值计算出样品的浓度。实验结果显示db/db小鼠尿微量白蛋白水平相对wt/wt组显著增加(图7)，并具有显著统计学差异(P<0.001)。TBN给药6w结束时，TBN各给药组剂量依赖性的降低db/db小鼠24h尿微量白蛋白的产生，尤以30和60mg/kg TBN给药组更为明显(P<0.001)；阳性对照药Losartan也显著降低24h尿微量白蛋白的产生(P<0.001)。
TBN对db/db小鼠肾组织病理组织学的影响
HE染色步骤详见实施例2所示。H&E染色结果显示wt/wt组小鼠肾脏结构清晰，毛细血管分布均匀，肾小管上皮细胞排列完整，间质未见炎症细胞浸润，肾小球体积正常；相反db/db组小鼠肾脏结构紊乱，毛细血管分布不均，肾小管上皮细胞空泡变性，肾小管间质细胞增多伴有炎性细胞浸润。TBN各给药剂量组不同程度改善db/db小鼠损伤的肾组织病理结构，其中30mg/kg和60mg/kg剂量组改善小鼠肾小球结构紊乱程度，肾间质炎症细胞浸润程度均明显好于db/db组(图8A)。肾小球面积相对于wt/wt组小鼠显著增大(P<0.001)。TBN治疗组随剂量依赖性的降低肾小球的面积，尤以TBN 30mg/kg和60mg/kg降低更为显著(图8B)。
TBN对db/db小鼠肾组织亚显微形态的影响
小鼠处死后，迅速用锋利的刀片取1mm3左右的肾皮质(冰上操作)；用2.5％的戊二醛(pH 7.4)4℃固定6h；然后置于0.2mmol/L PBS与2％锇酸按1:1比例配置的固定液中固定2h；4℃条件下梯度丙酮脱水，50％，70％，90％丙酮中各脱水10min，然后室温下100％丙酮脱水2次，每次15min；在1:1的丙酮与Epon812环氧树脂包埋刻混合液中，室温浸透30min；再以纯包埋剂浸透过夜，使包埋剂逐步浸入组织块中完全取代脱水剂；样品包埋于包埋剂中，便于超薄切片，35℃放12h；45℃放12h；60℃放置48h；置于37℃烤箱中12h，60℃烤箱中放置36h；超薄切片机上制备约厚1.5μm的半薄切片；光学显微镜下定位，修成顶端面积为1mm2左右的梯形，制备60-70nm厚的超薄切片；醋酸双氧铀染液避光染色10min，柠檬酸铅染色10min。电镜结果显示wt/wt组肾小球基底膜均匀规则，足突无融合，肾小球系膜(GBM，glomerular basement membrane)未见增生，肾小球基底膜也没有出现增厚，肾小管上皮细胞排列清晰；相反，db/db组肾小球基底膜明显增厚，足突呈节段性融合，肾小球系膜增宽，系膜细胞增多(图9A)。TBN(10mg/kg)组足突略融合，肾小球系膜无明显增生，肾小球基底膜增厚相对vehicle组有所降低(P<0.05)；TBN(30mg/kg)组足突少区域融合，肾小球系膜无明显增生，相对db/db组，肾小球基底膜显著降低(P<0.01)；TBN(60mg/kg)组足突无明显节段性融合，肾小球系膜无明显增生，相对db/db组，肾小球基底膜显著降低(P<0.01)。阳性对照药Losartan组血管扩张好，足突节段性融合，肾小球系膜基质，基底膜无明显增加，相对db/db组，肾小球基底膜厚度显著降低(P<0.01)。
TBN对db/db小鼠血清铁离子含量的影响
实验结束时，使用全自动生化分析仪检测血清中铁离子含量。结果表明，wt/wt组小鼠血清中铁离子含量为40.26±7.96mmol/L，db/db模型组小鼠血清中铁离子含量为28.13±4.46mmol/L，相对于wt/wt组，db/db小鼠铁离子含量的降低具有统计学差异。TBN治疗后，相对于db/db模型组，TBN 10mg/kg组小鼠铁离子含量为30.84±5.92mmol/L，TBN30mg/kg组小鼠铁离子含量为36.20±11.89mmol/L。而阳性对照药Losartan组小鼠铁离子含量为30.62±6.73mmol/L，各给药剂量组均增加了血清铁离子的含量且增加铁离子效果均比阳性对照药组强。
TBN对db/db小鼠血清EPO含量的影响
实验终点，麻醉小鼠后腹主动脉取血，静置1h后，3000rmp离心10min收集上清，按照试剂盒操作说明检测血清中促红细胞生成素水平。步骤如实施例2所示，研究结果表明相对于db/db组小鼠血清EPO水平略有降低，含量为257.19±67.80ng/L，wt/wt组，含量为277.24ng/L。TBN给药后，TBN 10mg/kg组的EPO含量为265.04±79.32ng/kg，TBN 30mg/kg组的EPO含量为288.80±36.78ng/kg，阳性对照药组的EPO含量为240.70±35.68ng/kg，在此情况下，TBN对自发db/db小鼠血清EPO水平具有增加的趋势，且通过上述数据可知TBN各给药剂量组对于血清EPO的含量增加均强于阳性对照药。
实施例4.TBN与其他活性物质联合使用的考察
分组和给药方式同实施例2。在实验终点，收集24h尿液标本，所有尿液标本采用甲苯防腐，24h尿液离心去沉淀置于1.5mL EP管内，置于-20℃冰箱中备用，ELISA试剂盒检测尿中白蛋白含量，使用全自动生化分析仪检测尿液中肌酐含量，计算两者比值。结果如图12所示，db/db组小鼠尿微量白蛋白与肌酐比值较wt/wt组增加，TBN、氯沙坦组以及TBN和氯沙坦联用组(TBN 60mg/kg+Losartan 10mg/kg)均降低db/db小鼠24h尿微量白蛋白肌酐比。参照该方法，二甲双胍(150mg/kg,q.d.)和HIF-PH抑制剂roxadustat(10mg/kg,once every2days)灌胃给药，TBN分别与二甲双胍和roxadustat联合用药组同样会降低24h尿微量白蛋白肌酐比。
实施例5.STZ诱导自发性高血压大鼠糖尿病模型的建立
(1)STZ诱导SHR大鼠糖尿病模型的建立
6w龄SHR大鼠在注射前禁食不禁水12h，称重后腹腔注射55mg/kg STZ(STZ需快速注射，10min内完成注射)，然后放回笼内确保大鼠24h充足饮水，正常对照组大鼠注射等体积的柠檬酸缓冲液(pH 4.5)。STZ注射3w后尾静脉采血，将血糖≥16.7mmol/L作为成模标准，满足以上条件的SHR大鼠视为造模成功。
(2)动物分组及给药
按照随机数字表进行分组，每组大鼠具体情况如下表5所示：
表5 STZ诱导自发性高血压大鼠具体给药情况
分组 剂量 给药方式 给药频率
WKY组 / i.g. twice/day
SHR组 / i.g. twice/day
SHR-STZ组 / i.g. twice/day
SHR-STZ+TBN组 60mg/kg i.g. twice/day
SHR-STZ+Losartan组 10mg/kg i.g. once/day
给药途径为灌胃给药，TBN每天给药两次(固定在每天早上9:00-10:00和下午3:00-4:00)，Losartan每天给药一次(固定在每天早上9:00-10:00)，连续给药6w。
川芎嗪衍生物TBN对STZ诱导SHR大鼠体重、摄食量和饮水量的影响
每周观察大鼠造模后的一般情况和体重变化，一般情况包括大鼠的活动情况、精神状态、毛色、饮食、饮水量及尿量等，每周记录饮水量和饲料量。STZ诱导的SHR大鼠体重下降，连续给药6周后，TBN组大鼠(SHR-STZ-T60组)相对SHR-STZ组大鼠体重明显增加(图11)。给药6w后，SHR-STZ组大鼠总饮水量和摄食量相对SHR组(SHR-Ctrl组)显著增加(图11)。
TBN对STZ诱导SHR大鼠肾组织形态学影响
具体步骤如实施例2。染色结果显示WKY组大鼠肾小球和肾小管结构清晰规则，肾小管上皮细胞排列整齐未见异常，未见毛细血管基底膜增厚、系膜细胞及细胞外基质增生，系膜区未见明显的炎性细胞浸润，肾小球无渗出及粘连。SHR-STZ组大鼠组织切片H&E中可见肾小球体积增大，系膜区弥漫性增宽，系膜细胞增生，毛细血管袢扩张，系膜基质增多，肾小球毛细血管基底膜不规则增厚，近端肾小管上皮细胞空泡变形、脱落及大量炎症细胞浸润等的肾脏病理改变。60mg/kg TBN对上述病理性改变均有所改善(图12)。
TBN对STZ诱导SHR大鼠肾小球硬化程度
具体步骤如实施例2。PAS染色结果显示，与SHR-STZ组大鼠相比，TBN 60mg/kg组大鼠明显降低肾小球基底膜面积和肾小球硬化指数(图13)。
TBN对STZ诱导SHR大鼠血清EPO含量的影响
实验终点，麻醉大鼠后腹主动脉取血，静置1h后，3000rmp离心10min收集上清，分别利用自动生化仪检测血清中铁离子含量和试剂盒检测血清中促红细胞生成素水平。步骤如实施例2所示，研究结果表明SHR-STZ组(model组)大鼠血清中铁离子含量和EPO含量低于SHR组(control)，并具有显著统计学意义(P<0.01)。相对于模型组，TBN组(T60)显著增加血清中铁离子和EPO的含量(P<0.05，图14)。
实施例6.顺铂诱导的C57BL/6J小鼠肾性贫血模型
造模方法：将动物随机分成5组，分别为正常对照组、模型组、3个治疗组，其中正常对照组注射等容积的生理盐水，模型组及3个治疗组每周一次腹腔注射顺铂(CDDP)5mg/kg，共注射4周。
动物的分组及给药见下表6。
表6 顺铂诱导的C57BL/6J小鼠具体给药情况
Figure BDA0003300796010000161
Figure BDA0003300796010000171
给药途径为灌胃给药，TBN每天给药两次(固定在每天早上9:00-10:00和下午3:00-4:00)，Roxadustat两天给药一次(固定在每天早上9:00-10:00)，连续给药4w。
小鼠铁调素水平的影响
铁调素是由肝脏合成并分泌的富含半胱氨酸的抗菌多肽，在机体内铁平衡的调节中起到负性调节的作用，可用于间接评价小鼠的贫血症状。如图15所示，给药结束时，模型组铁调素水平相对于空白对照组显著增加(P<0.05)；与模型组相比，TBN 60mg/kg给药组显著降低肾性贫血小鼠铁调素水平(P<0.05)。阳性对照组Roxadustat虽然也可以降低肾性贫血小鼠铁调素水平，但无显著性统计学差异。顺铂等化疗药物会导致小鼠体内铁调素失衡，TBN给药后可以降低机体内铁调素的表达水平，因而可以用于治疗癌症并发肾性贫血。
小鼠促红细胞生成素的变化
实验终点，麻醉大鼠后腹主动脉取血，静置1h后，3000rmp离心10min，-80℃分装保存。使用全自动生化分析仪检测血清中促红细胞生成素的含量。实验结果如图16所示，给药结束后，与模型组相比，TBN各剂量治疗组均能不同程度增加促红细胞生成素的表达。由图16可以看出不同剂量的TBN给药组均可以增加小鼠体内的EPO的含量，存在剂量依赖性，且高剂量组的药效强于阳性对照药，说明本发明所述的化合物可以用于治疗癌症并发肾性贫血。

Claims (14)

1.一种川芎嗪硝酮化合物在制备用于预防和/或治疗肾性贫血药物中的应用，其特征在于，川芎嗪硝酮化合物为具有如下通式(I)所示结构的化合物或其在药学上可以接受的盐：
Figure FDA0003300795000000011
其中：
R2，R3相同或不同，各自独立选自氢或C1-C6烷基；
R1为氢、甲基或
Figure FDA0003300795000000012
R4为仲丁基、异丁基、环戊基或环己基，R5为仲丁基、异丁基、叔丁基或环己基。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，R2，R3相同或不同，各自独立选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基；R1为氢、甲基、
Figure FDA0003300795000000013
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的川芎嗪硝酮化合物选自如下结构式：
Figure FDA0003300795000000014
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肾性贫血是指各种肾脏病致肾功能下降时，肾脏红细胞生成素生成减少或/和伴发铁缺乏而导致的贫血。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肾性贫血为糖尿病肾病肾性贫血、慢性肾脏病并发肾性贫血或癌症并发肾性贫血。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病肾病肾性贫血，包括1型糖尿病或2型糖尿病引起的肾病肾性贫血。
7.一种药用组合物，其包括有效剂量的权利要求1所述的川芎嗪硝酮化合物，以及药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的药物组合物以权利要求1所述的川芎嗪硝酮化合物作为唯一的药用活性成分，或者权利要求1所述的川芎嗪硝酮化合物与其他活性药物联合使用。
9.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，为药学上可接受的各种剂型，优选为片剂、颗粒剂、针剂、粉剂、胶囊剂或悬浮剂。
10.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，其他活性药物为其他用于预防治疗糖尿病、慢性肾脏病或癌症引起肾病的药物；优选为血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、β受体阻滞剂、利尿剂、双胍类、磺脲类、格列奈类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、二肽基肽酶抑制剂、胰岛素、低氧诱导因子脯氨酸羟化酶抑制剂；进一步优选的为，氯沙坦、二甲双胍、roxadustat。
11.权利要求1-3任一项所述川芎嗪硝酮化合物与其他用于预防治疗糖尿病肾病的药物联合使用在用于预防或治疗糖尿病肾病并发肾性贫血药物中的应用；或者权利要求1-3任一项所述川芎嗪硝酮化合物与其他用于预防治疗慢性肾脏病并发肾性贫血的药物联合使用在用于预防或治疗慢性肾脏病并发肾性贫血中的应用；或者权利要求1-3任一项所述川芎嗪硝酮化合物与其他用于预防治疗癌症的药物联合使用在用于预防或治疗癌症并发肾性贫血药物中的应用。
12.权利要求1-3任一项所述川芎嗪硝酮化合物与降低血压药物联合使用在用于预防或治疗高血压合并肾性贫血药物中的应用，优选的，所述降低血压药物选自血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、β受体阻滞剂或利尿剂；或者权利要求1-3任一项所述川芎嗪硝酮化合物与调控血糖药物联合使用在用于预防或治疗糖尿病合并肾性贫血药物中的应用，优选的，所述的调控血糖药物选自双胍类、磺脲类、格列奈类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、二肽基肽酶(DPP-4)抑制剂、胰岛素；或者权利要求1-3任一项所述川芎嗪硝酮化合物与低氧诱导因子脯氨酸羟化酶(HIF-PH)抑制剂联合使用在用于预防或治疗肾性贫血药物中的应用。
13.权利要求1-3任一项所述川芎嗪硝酮化合物与氯沙坦联合使用在用于预防或治疗高血压合并肾性贫血药物中的应用；或者权利要求1-3任一项所述川芎嗪硝酮化合物与二甲双胍联合使用在用于预防或治疗糖尿病合并肾性贫血药物中的应用；或者权利要求1-3任一项所述川芎嗪硝酮化合物与roxadustat联合使用在用于预防或治疗肾性贫血药物中的应用。
14.治疗肾性贫血的方法，所述方法包括给患者施用权利要求7-10任一项所述药用组合物。
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