CN114341643A

CN114341643A - 用于测量血浆样品中功能性c1-酯酶抑制剂(c1-inh)的侧向流免疫测定

Info

Publication number: CN114341643A
Application number: CN202080042522.1A
Authority: CN
Inventors: P·S·乔卡林加姆; 周志卫
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2020-04-09
Publication date: 2022-04-12
Also published as: CA3136694A1; AU2020271846A1; CO2021014018A2; JP2022526186A; KR20210151180A; EP3953711A1; MX2021012444A; IL287208A; WO2020210446A1; BR112021020410A2; TW202104898A; JP2024087052A; JP7481361B2

Abstract

一种用于检测和/或量化功能性C1‑酯酶抑制剂(fC1‑INH)的装置，装置包括：(i)结合垫，其包括第一区和第二区，在其上分别固定第一试剂和第二试剂；和(ii)膜，其与结合垫相通，其中膜包括第三区，在其上固定第三试剂。结合垫可进一步包括用于放置生物样品的第四区，生物样品以第一区、第二区和第三区的顺序流过装置。

Description

用于测量血浆样品中功能性C1-酯酶抑制剂(C1-INH)的侧向流免疫测定

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2019年4月12日提交的美国临时申请号62/833,235和于2019年11月5日提交的美国临时申请号62/930,615的权益，其每一篇的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

C1-酯酶抑制剂(又称C1-抑制剂或C1-INH)是属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的蛋白酶抑制剂。其主要功能是抑制补体系统以防止自发激活。C1-INH也是血浆激肽释放酶(pKal)的内源抑制剂。C1-INH的常染色体显性突变导致遗传性血管性水肿(HAE)，包括I型和II型HAE。

目前用于评估C1-INH功能性水平的可获得的测定利用发色测定或复合ELISA方法来测量C1-INH对补体级联的C1的抑制。通常认为发色测定是优选的，但两种方法都具有局限性。发色测定更有可能具有偶尔的假阳性，而复合ELISA具有仅62％的阴性预测值。

对开发更新的测定和/或平台来测量参与HAE疾病病理的功能性C1-INH是感兴趣的。

发明内容

本文提供的是以快速和成本有效的定性和/或定量方式检测功能性C1-INH(fC1-INH)的装置和方法。在一些实施方式中，检测fc1-INH是经侧向流免疫测定(LFA)使用配置用于检测和/或量化fC1-INH的装置实现的。

相应地，本公开的一个方面提供了用于检测和/或量化功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)的装置，装置包括(i)结合垫(conjugate pad)，其包括第一区和第二区，在其上分别固定第一试剂和第二试剂；和(ii)膜，其与结合垫相通，其中膜包括第三区，在其上固定第三试剂。第一试剂可以是功能性C1抑制剂(fC1-INH)结合剂或C1抑制剂(C1-INH)结合剂。第二试剂和第三试剂是功能性C1抑制剂(fC1-INH)结合剂、C1抑制剂(C1-INH)结合剂和捕获剂之一。第一试剂、第二试剂和第三试剂彼此是不同的。FC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂之一缀合至可检测标签，和fC1-INH结合剂和C1-INH结合剂之一缀合至对接剂(docking agent)。可检测标签和对接剂缀合至不同试剂。结合垫进一步包括用于放置生物样品的第四区，生物样品以第一区、第二区和第三区的顺序流过装置。在一些情况下，用于放置生物样品的第四区可与第二区重叠，fC1-INH结合剂可位于第二区上。

在一些实施方式中，第一试剂、第二试剂和第三试剂分别是C1-INH结合剂、fC1-INH结合剂和捕获剂。在其他实施方式中，第一试剂、第二试剂和第三试剂分别是fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂。

在一些示例中，第一试剂缀合至可检测标签，第二试剂缀合至对接剂。在其他示例中，第一试剂缀合至对接剂，第二试剂缀合至可检测标签。

在一些实施方式中，fC1-INH结合剂可以是因子XII的活性形式(FXIIa)。可替选地或另外地，C1-INH结合剂可以是结合C1-INH的抗体。进一步，对接剂和捕获剂可以是受体-配体对的成员。例如，受体-配体对可以包括生物素和抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白或聚链霉抗生物素蛋白)。

在一些实施方式中，可检测标签可以是铕、胶体金、藻红蛋白、荧光素、若丹明、绿色荧光蛋白、量子点和生色团。在一些实施方式中，可检测标签是铕。在一些情况下，可检测标签可附着至乳胶颗粒。

在一个示例中，第一试剂是位于第一区处的C1-INH结合剂，第二试剂是位于第二区处的fC1-INH结合剂，和第三试剂是位于第三区处的捕获剂。C1-INH结合剂可以是结合至C1-INH的抗体，其可缀合至如本文公开的可检测标签。可替选地或另外地，fC1-INH结合剂可以是FXIIa，其可缀合至对接剂(例如，生物素)。进一步，捕获剂可以是抗生物素蛋白，比如链霉抗生物素蛋白或聚链霉抗生物素蛋白。

在一些实施方式中，装置进一步包括与膜相通的吸收垫。吸收垫和结合垫可通过膜分开。可替选地或另外地，装置可进一步包括支撑构件，在其上安装结合垫、膜和/或吸收垫。

进一步，装置也可包括外壳。在一些实施方式中，外壳可包括形成缓冲口的第一开口、形成样品口的第二开口和形成测试窗口的第三开口。样品口可位于缓冲口和测试窗口之间。在一些示例中，缓冲口可与第一区对齐，C1-INH结合剂位于第一区上。在一些示例中，样品口可与第二区对齐，fC1-INH结合剂位于第二区上。在一些示例中，测试窗口与第三区对齐，捕获剂位于第三区上。

在另一方面中，本公开提供了使用本文公开的任何LFA装置检测和/或量化样品中的功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)的方法。这种方法可包括：(i)将样品放置在本文所述的装置的样品口中，(ii)将缓冲液放置在装置的缓冲口中，其中缓冲液以第一区至第三区的方向流动；(iii)检查装置中的测试窗口处的信号，和(iv)基于测试窗口处信号的存在或强度确定样品中fC1-INH的存在或测量样品中fC1-INH的水平。在一些实施方式中，步骤(ii)在步骤(i)后至少5分钟进行。fC1-INH结合剂可以固定在第二区处，第二区可与样品口对齐。

本文还提供了检测和/或量化样品中功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)的方法，方法包括(i)将样品与fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂接触以形成复合物，其中fC1-INH结合剂和C1-INH试剂之一缀合至对接剂，其结合捕获剂，和其中fC1-INH结合剂、C1-INH试剂和捕获剂之一缀合至可检测标签，可检测标签和对接剂被缀合至不同试剂；和(ii)检测从复合物中可检测标签释放的信号；其中从复合物中可检测标签释放的信号的存在指示样品中fC1-INH的存在。如本文公开的任何fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂、对接剂、可检测标签和捕获剂可用于本文公开的方法。

在一些实施方式中，步骤(i)可通过如下进行：(a)将样品与fC1-INH结合剂孵育至少5分钟，和(b)将样品与C1-INH结合剂和捕获剂接触。在其他实施方式中，步骤(i)通过如下进行：(a)将样品与fC1-INH结合剂孵育至少5分钟以形成第一复合物，(b)将第一复合物与C1-INH结合剂接触以形成第二复合物，和(c)将第二复合物与捕获剂接触以形成复合物，和其中捕获剂被固定在支撑构件上。

在本文公开的任何测定方法中，待分析的样品可以是获得自受试者的生物样品，例如，血清样品、血浆样品或血液样品(例如，全血)。在一些实施方式中，受试者可以是怀疑患有fC1-INH缺陷-介导的紊乱或处于fC1-INH缺陷-介导的紊乱风险的人患者，fC1-INH缺陷-介导的紊乱包括但不限于遗传性血管性水肿(HAE)、获得性血管性水肿(AAE)和C1-INH相关的免疫疾病。在一些实施方式中，受试者具有HAE的症状。在一些实施方式中，HAE是I型HAE或II型HAE。在其他实施方式中，受试者不具有HAE的症状、不具有HAE的症状的病史或没有HAE的病史。在一些实施方式中，受试者对抗组胺疗法、皮质激素疗法或两者均有抵抗力。

本文所述的装置和方法的几个实施方式的细节在附图和详细描述中陈述。本文所述的装置和方法的其他特征、目的和优点将从描述和权利要求中显而易见。

附图说明

各种方面和实施方式将参照以下图进行描述。图不一定按比例绘制。

图1是用于检测和/或量化功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)的示例性侧向流测定(LFA)装置100的示意性描述。按照本文所述的技术的一些实施方式，LFA装置100包括结合垫200、膜300，和任选地吸收垫400和支撑构件500。

图2是示例性LFA装置100的示意性描述，按照本文所述的技术的一些实施方式，显示了每个部件的示例性尺寸和两个相邻部件之间重叠的示例性尺寸。

图3A是用于检测和/或量化fC1-INH的示例性LFA装置100的俯视图的示意性描述。按照本文所述的技术的一些实施方式，LFA装置100包括结合垫200，其包括第一区210和第二区220；和膜300，其包括第三区230。

图3B是用于检测和/或量化fC1-INH的示例性LFA装置100的俯视图的示意性描述。按照本文所述的技术的一些实施方式，LFA装置100包括结合垫200，其包括与用于放置样品的第五区250重叠的第一区210，和与用于放置缓冲液的第四区240重叠的第二区220；和膜300，其包括第三区230。

图4是用于检测和/或量化fC1-INH的示例性LFA装置100的俯视图的示意性描述。按照本文所述的技术的一些实施方式，LFA装置100进一步包括外壳600，形成缓冲口610、样品口620和测试窗口630。还指示了第一区210、第二区220、第三区230、结合垫200、膜300和吸收垫400。

图5是按照本文所述的技术的一些实施方式的示例性LFA装置的图像。

图6是显示使用本文公开的LFA装置从稀释到C1-INH耗尽的血浆中的功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)产生的校准曲线的图。

图7是基于来自对照受试者和患有遗传性血管性水肿(HAE)的受试者的样品，使用本文公开的LFA装置对于诊断性能的接收者操作特征曲线(ROC)的图。

图8是显示使用本文所述的发色测定(Chrom)或LFA装置(LFA)正常受试者(正常)和患有遗传性血管性水肿的受试者(HAE)中的功能性C1-INH的水平的图。

图9是显示与本文所述的LFA装置相比，通过发色测定确定的患有遗传性血管性水肿(HAE)的受试者中功能性C1-INH的水平之间的相关性的图。

图10A是显示了使用样品环(sample loop)和手指针刺(fingerstick)收集血液样品的示意图。

图10B是显示了充满图10A的血液的样品环添加至

瓶子的示意图。

图11A是显示在指定条件下使用缀合至铕纳米颗粒的抗C1-INH Fab的图。

图11B是显示在指定条件下使用缀合至红金纳米颗粒的抗C1-INH Fab的图。

图12是显示在测试线中作为捕获剂的聚链霉抗生物素蛋白R与链霉抗生物素蛋白比较的结果的图。R²值指示与模型线(虚线)的拟合。

图13是显示来自在测试线中使用指定试剂作为捕获剂的结果的图。

图14是显示来自作为检测剂的指定抗C1-INH Fab或抗体克隆的结果的图。对于每个抗体，列指的是检测剂的浓度，从左到右，1200mU/mL、600mU/mL、100mU/mL、0mU/mL。

图15是显示在不同pH值下使用含有无机阻断剂(IBA)或有机阻断剂(OBA)的缓冲液的结果的图。

图16是显示来自使用链霉抗生物素蛋白测试线(0.75mg/mL链霉抗生物素蛋白)和指定浓度的

的结果的图。

图17是本文所述的示例性方法的示意图。捕获蛋白质，比如链霉抗生物素蛋白，与缀合至捕获剂(例如，生物素化的FXIIa)的其配对(例如，生物素)相互作用，其中捕获剂结合至功能性C1-INH(fC1-INH，

)。使用检测剂，比如缀合至金颗粒的抗C1-INH抗体(抗C1-INH Au缀合物)检测结合的FC1-INH。

详细描述

本公开至少部分基于用于测量功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)的侧向流测定(LFA)方法和装置的开发。LFA方法和装置被设计用于在例如生物样品中特定检测fC1-INH的存在和/或测量fC1-INH的水平。fC1-INH的存在和/或水平通常表明与C1-INH起作用的生物途径相关的疾病状况。同样地，LFA方法和装置将特别地用于由C1-INH缺陷介导的疾病，例如，由血浆激肽释放酶途径介导的疾病(例如，疾病比如遗传性血管性水肿)的诊断和预后，因为FC1-INH是pKal途径的抑制剂。

如本文使用的，“功能性C1-INH”或“fC1-INH”指以能够结合至蛋白质因子的形式的C1-INH蛋白质，C1-INH实质上与蛋白质因子结合并且发挥其生物活性。这种蛋白质因子包括但不限于C1s、因子XIIa(FXIIa)和血浆激肽释放酶(pKal)。检测fC1-INH的该亚群特别地有助于评估疾病比如HAE中C1-INH的功能性水平。

HAE是非常罕见的并且潜在地威胁生命的遗传性病症，其在约10,000分之一至50,000分之一人中发生。症状包括身体各部位的水肿(肿胀)，包括手、脚、脸和气道(喉咙)。患者通常遭受由肠壁肿胀引起的使人极痛苦的腹痛、恶心和呕吐。气道或喉咙的肿胀是特别地危险的；其可导致窒息死亡。确认HAE I&II型所需的三种特定血液测试是C1INH抗原、fC1INH和C4。许多诊断测定使用过时的技术，并且不是快速或标准化的或全世界可获得的。

本文公开的快速和灵敏的LFA方法和装置可以在医生的办公室实验室进行，用于基于fC1INH水平快速诊断HAE(例如，I&II型)。这种方法和装置将导致医疗保险报销的低成本耗材、定量结果的高度置信水平、医生轻松进行数据解释和/或对确认性分析的低水平需求。医生的办公室中诊断I型或II型HAE的这种快速分析可以扩大HAE的筛选，并且更快地鉴别新的HAE患者。目前，HAE的全球诊断率仅是40％；因此，未被诊断的患者有很高的未满足需求。普通装置平台上快速测试可用性可以扩展HAE的识别。进一步，本文公开的fC1INH的快速测试可以帮助在临床背景中以及时的方式监测HAE疾病进展或对疗法的应答。

本文公开的LFA方法和装置涉及对fC1-INH特异性的第一结合剂(fC1-INH结合剂)、对C1-INH特异性(对功能性C1-INH、非功能性C1-INH或两者特异性)的第二结合剂和捕获剂。fC1-INH结合剂或C1-INH结合剂都可与能够结合至捕获剂的对接剂缀合。FC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂之一可与可检测标签缀合。相应地，样品(例如，生物样品)中的fC1-INH可以与fC1-INH结合剂和C1-INH结合剂形成复合物。这种复合物可经捕获剂和缀合至C1-INH结合剂和fC1-INH结合剂之一的对接剂之间的相互作用结合至捕获剂。在检测到从可检测标签释放的信号(例如，存在或强度)后，可基于与之一起测试的标准物来确定和/或量化样品中fC1-INH的存在或水平。例如，不同水平的

纯化的人血浆衍生的C1INH可用作标准物，以生成标准曲线，来推断和确定如通过本文公开的任何方法测量的样品中fC1INH的水平。基于标准物，从可检测标签释放的信号强度可以量化为样品中fC1INH的U/ml，并且表明样品中fC1-INH的水平。

I.用于侧向流测定(LFA)的组分

本文公开的LFA方法和装置涉及(i)fC1-INH结合剂，(ii)C1-INH结合剂，其中之一缀合至对接剂，和(iii)捕获剂，其结合对接剂。(i)-(iii)之一缀合至可检测标签。

(a)fC1-INH结合剂

fC1-INH结合剂是特异性结合功能性C1-INH的分子(例如，结合fC1-INH的蛋白质或其片段)。如果分子与特定靶标(例如，本文公开的那些)的反应比其与可替选的靶标(其可以是特定靶标的改变形式)的反应更频繁、更快速、具有更长持续时间和/或具有更大亲和力，则该分子被认为展示出“特异性结合”。例如，特异性结合fC1-INH的分子与可替选的靶标，比如非功能性C1-INH相比，与fC1-INH的反应更频繁、更快速、具有更长持续时间和/或具有更大亲和力。“特异性结合”或“优先结合”不一定要求(尽管其可包括)排他性结合。

在一些情况下，本质上能够结合至fC1-INH的蛋白质或多肽或其结合片段可用作fC1-INH结合剂。在一些示例中，fC1-INH结合剂是FXII，例如，FXII的活性形式(FXIIa)。因子XII是参与血液凝固、纤维蛋白溶解的启动以及缓激肽和血管紧张肽的生成的血清糖蛋白。前激肽释放酶被因子XII裂解以形成激肽释放酶，其然后激活因子XII，导致因子XIIa和因子XII片段(因子XIIf)形成(“Histidine-rich glycoprotein binds factor XIIa withhigh affinity and inhibits contact-initiated coagulation”Macquarrie等，Blood117:4134-4141 2011)。C1抑制剂(C1-INH)已经显示是因子XIIa和因子XIIf二者的重要血浆抑制剂(“Effect of negatively charged activating compounds on inactivationof factor XIIa by C1 inhibitor”Pixley等，Arch Biochem Biophys 256(2):490-81987)。

FXII蛋白质，包括其前体形式、成熟形式和活性形式，在本领域是众所周知的。例如，人因子XII和其活性形式的前体蛋白质序列在GenBank登录号：NP_000496.2下提供。其他物种，例如，非人哺乳动物的FXII蛋白质也是本领域已知的。它们的结构信息可以在本领域中找到，例如，从公开地可获得的基因数据库鉴定的，使用人FXII序列作为查询。

“活性”或“功能性”因子XII指保留类似于，但可不一定等同于天然存在的因子XII对应物，包括成熟形式的生物活性的因子XII多肽或因子XII多肽片段。在一些实施方式中，活性或功能性因子XII是结合至fC1-INH的因子XII多肽或因子XII多肽片段。在一些实施方式中，活性或功能性因子XII是结合至fC1-INH的因子XIIa多肽或因子XIIa多肽片段。在一些实施方式中，活性或功能性因子XII是结合至fC1-INH的因子XIIf多肽或因子XIIf多肽片段。

在其他示例中，fC1-INH结合剂是血浆激肽释放酶(pKal)，例如，天然存在的pKal蛋白质的催化片段。血浆激肽释放酶是接触系统的丝氨酸蛋白酶组分(Sainz I.M.等，Thromb Haemost 98，77-83，2007)。接触系统在暴露于外来的或带负电的表面时由因子XIIa或在内皮细胞表面上由脯氨酸羧肽酶激活(Sainz I.M.等，Thromb Haemost 98，77-83，2007)。激活血浆激肽释放酶经其反馈激活因子XII加强了内在凝固并且经产生促炎性九肽缓激肽增强了炎症。作为循环中主要的激肽原酶，血浆激肽释放酶在很大程度上对血管中缓激肽的生产负责。

pKal蛋白质是本领域熟知的。示例性血浆激肽释放酶序列可包括人(登录号：NP_000883.2)、小鼠(登录号：NP_032481.1)或大鼠(登录号：NP_036857.2)血浆激肽释放酶氨基酸序列。

“活性”或“功能性”血浆激肽释放酶指保留类似于，但可不一定等同于于天然存在的血浆激肽释放酶对应物，包括成熟形式的生物活性(例如，蛋白酶活性)的血浆激肽释放酶多肽或血浆激肽释放酶多肽片段。在一些实施方式中，活性或功能性血浆激肽释放酶是结合至fC1-INH的血浆激肽释放酶多肽或血浆激肽释放酶多肽片段。

在仍其他示例中，本文公开的fC1-INH结合剂可以是C1s和C1r，或其活性/功能性片段。C1s和C1r是补体(C1)的第一组分的激活的同源的丝氨酸蛋白酶。C1s和C1r二者可与C1-INH形成复合物。Arlaud等，(1993)Methods Enzymol.223,61–82。C1s是模块化丝氨酸蛋白酶，其执行C1复合物的催化功能。C1r是通过蛋白水解裂解将C1s激活为其活性形式的酶。

C1s和C1r蛋白质也在本领域中是众所周知的。例如，人C1s的前体蛋白质序列是在GenBank登录号：NP_001725.1提供的和人C1r是在GenBank登录号：NP_001724.4提供的。

“活性”或“功能性”C1s和C1r指保留分别类似于，但可不一定等同于天然存在的C1s和C1r对应物，包括成熟形式的生物活性的C1s和C1r多肽片段。在一些实施方式中，活性或功能性C1s或C1r片段是结合至fC1-INH的C1s多肽或C1s多肽的部分。

任何fC1-INH结合剂可经重组体技术产生，或从合适的自然来源分离。

(b)C1-INH结合剂

用于本文公开的LFA方法和装置的C1-INH结合剂可以任何能够结合至C1-INH的分子(例如，蛋白质或多肽)。在一些情况下，C1-INH结合剂对fC1-INH是特异性的。在其他情况下，C1-INH结合剂与功能性和非功能性C1-INH二者都交叉反应。

C1-INH结合剂可以是结合C1-INH的抗体。如本文使用的，术语“抗体”指包括至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质。例如，抗体可包括重(H)链可变区(本文缩写为VH)，和轻(L)链可变区(本文缩写为VL)。在另一示例中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体”涵盖抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab和sFab片段、F(ab')₂、Fd片段、Fv片段、scFv和结构域抗体(dAb)片段(de Wildt等，Eur J Immunol.1996；26(3):629-39))以及完整的抗体。抗体可具有IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(以及其亚型)的结构特征。

VH和VL区域可进一步细分为超可变性的区域，称为"互补决定区"("CDR")，与称为"框架区域"("FR")的更保守的区域相间。框架区和CDR的范围已被精确定义(参见，Kabat，E.A.等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公布号91-3242和Chothia,C.等，(1987)J.Mol.Biol.196:901-917，还参见www.hgmp.mrc.ac.uk)。本文使用了Kabat定义。每个VH和VL通常包括三个CDR和四个FR，以以下顺序从氨基-末端至羧基-末端布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

抗体的VH或VL链可以进一步包括全部或部分重或轻链恒定区，从而分别形成重或轻免疫球蛋白链。在一个实施方式中，抗体是两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的四聚体，其中重和轻免疫球蛋白链通过，例如，二硫键相互连接。在IgG中，重链恒定区包括三个免疫球蛋白结构域，CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包括CL结构域。重和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。免疫球蛋白的轻链可以具有κ或λ链。在一个实施方式中，抗体是糖基化的。抗体可以对于抗体依赖性细胞毒性和/或补体介导的细胞毒性是功能性的。

在一些实施方式中，结合C1-INH的抗体可特异性结合至Cl-INH，例如，fC1-INH的表位或fC1-INH和非功能性C1-INH共享的表位。“特异性结合”至抗原或表位的抗体是本领域中众所周知的术语，而确定这种特异性结合的方法也是本领域内众所周知的。如果抗体与特定的靶标抗原的反应或缔合比与可替选的靶标的反应或缔合更频繁、更快速、具有更长的持续时间和/或具有更大的亲和力，则该抗体被认为展示出“特异性结合”。如果抗体结合至靶标抗原或表位与其结合至他物质比具有更大的亲和力、亲合力(avidity)、更容易和/或具有更长的持续时间，则抗体“特异性结合”至靶标抗原或表位。例如，特异性(或优先)结合至抗原(例如，C1-INH)或其中的抗原表位的抗体是与该靶标抗原的结合比与其他抗原或同一抗原中的其他表位的结合具有更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更持久的抗体。通过阅读该定义还可以理解，例如，特异性结合至第一靶标抗原的抗体可以或可以不特异性或优先结合至第二靶标抗原。正因如此，“特异性结合”或“优先结合”不一定要求(尽管其可包括)排他性结合。通常而言，但不一定，提及结合指优先结合。在一些示例中，“特异性结合”至靶标抗原或其表位的抗体可以不结合至相同抗原中的其他抗原或其他表位。

用于本文公开的LFA方法和装置的结合至C1-INH的抗体可以对C1-INH或其合适的表位具有合适的结合亲和力。如本文使用的，"结合亲和力"指表观缔合常数或KA。KA是解离常数(KD)的倒数。本文所述的抗体可具有至少10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10M或更低的结合亲和力(KD)。结合亲和力的增加对应于KD的降低。相对于第二抗原，抗体对第一抗原的更高的亲和力结合，可以通过比结合第二抗原的KA(或数值KD)更高的结合第一抗原的KA(或更小的数值KD)来指示。在这种情况下，相对于第二抗原，抗体对第一抗原具有特异性。结合亲和力(例如，特异性或其他比较)的差异可以是至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、10000或10⁵倍。结合亲和力(或结合特异性)可以通过常规方法确定。

结合至C1-INH的抗体可以是全长抗体。可替选地，抗体是全长抗体的抗原-结合片段。全长抗体的术语“抗原-结合片段”指保留特异性结合至感兴趣的靶标的能力的全长抗体的一个或多个片段。全长抗体的术语"抗原-结合片段"内涵盖的结合片段的示例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，包括由铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域的组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)保留功能性的分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH，是由不同的基因编码的，但它们可以使用重组方法，通过合成连接体连接起来，所述合成连接体使它们能够制备单一蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子，称为单链Fv(scFv)。参见，例如，US专利5,260,203、4,946,778和4,881,175；Bird等，(1988)Science 242:423-426和Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883。抗体片段可以使用包括本领域技术人员已知的常规技术的任何适当的技术获得。

本文所述的任何结合至C1-INH的抗体可以是单克隆的或多克隆的。“单克隆抗体”指同源的抗体群和“多克隆抗体”指异源的抗体群。这两个术语不限制抗体的来源或其制备方式。

结合至C1-INH的抗体可通本领域已知的任何方法制备。参见，例如，Harlow和Lane，(1998)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork。在一些实施方式中，对C1-INH(例如，人C1-INH)特异性的抗体可通过常规的杂交瘤技术制备。在其他实施方式中，对C1-INH特异性的抗体可以依照常规的抗体文库筛选技术从抗体文库分离。

在一些实施方式中，抗体是特异性结合至人C1-INH的抗体。在一些实施方式中，抗体是特异性结合至人C1-INH的单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是特异性结合至人C1-INH的小鼠单克隆抗体，比如抗体克隆MM06或MM03(也分别称为10995-MM06和10995-MM03，来自Sino Biological Inc.)。在一些实施方式中，抗体是特异性结合至人C1-INH的多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是特异性结合至人C1-INH的兔子多克隆抗体，比如抗体克隆RP01或RP02(也分别称为10995-RP01和10995-RP02，来自Sino Biological Inc.)。在一些实施方式中，抗体是RP02。

(c)对接-捕获剂

fC1-INH结合剂和C1-INH结合剂之一与对接剂缀合，对接剂能够结合至也用于本文公开的LFA方法和装置的捕获剂。在一个实施方式中，对接剂缀合至fC1-INH结合剂(例如，FXIIa)。在其他实施方式中，对接剂可缀合至C1-INH(例如，结合至C1-INH的抗体)。

对接剂和捕获剂是受体-配体对的成员，其指能够彼此结合以形成复合物的任何分子对。在一个示例中，对接剂和捕获剂分别是生物素和抗生物素蛋白，或反之亦然。例如，对接剂可以是生物素，并且捕获剂可以是链霉抗生物素蛋白或聚链霉抗生物素蛋白。

(d)可检测标签

用于本文公开的LFA方法和装置的fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂之一可缀合至可检测标签。在一些实施方式中，fC1-INH结合剂缀合至可检测标签。在其他实施方式中，C1-INH结合剂缀合至可检测标签。可替选地，捕获剂缀合至可检测标签。

如本文使用的，“可检测标签”指能够直接地或间接地释放可检测信号的任何分子。在一些实施方式中，可检测标签可以是荧光团(例如，荧光素)。如本文使用的，术语“荧光团”(也称为“荧光标签”或“荧光染料”)指在限定的激发波处吸收光能和在不同波长发射光能的部分。

荧光团的示例包括但不限于氧杂蒽衍生物(例如，荧光素、若丹明、俄勒冈绿(Oregon green)、曙红和德克萨斯红)、花青衍生物(例如，花青、吲哚碳菁、氧杂羰花青、硫碳菁和份菁)、萘衍生物(例如，丹酰和普罗丹衍生物)、香豆素衍生物、噁二唑衍生物(例如，吡啶噁唑、硝基苯噁二唑和苯并噁二唑)、芘衍生物(例如，级联蓝(cascade blue))、噁嗪衍生物(例如，尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫和噁嗪170)、吖啶衍生物(例如，原黄素、吖啶橙和吖啶黄)、芳基次甲基(arylmethine)衍生物(例如，金胺、结晶紫和孔雀绿)、四吡咯衍生物(例如，卟啉、酞菁和胆红素)、或荧光蛋白质(例如，绿色荧光蛋白)。

在一些实施方式中，可检测标签是藻红蛋白。

在一些实施方式中，可检测标签是生色团(例如，蒽)。在一些实施方式中，可检测标签是半导体颗粒(例如，量子点)。在一些实施方式中，可检测标签附着至半导体颗粒(例如，量子点)。在一些实施方式中，可检测标签是铕。在一些实施方式中，可检测标签是胶体金。在一些实施方式中，可检测标签附着至金颗粒。在一些实施方式中，可检测标签附着至红金颗粒。在一些实施方式中，可检测标签附着至乳胶颗粒。在一些实施方式中，C1-INH结合剂是缀合至铕的抗体RP02。在一些实施方式中，C1-INH结合剂是缀合至金颗粒的抗体RP02。在一些实施方式中，C1-INH结合剂是缀合红金颗粒的抗体RP02。在一些实施方式中，C1-INH结合剂是缀合至乳胶颗粒的抗体RP02。

II.LFA装置

在一些方面中，本公开提供了用于测量含有这种fC1-INH的样品中的fC1-INH的侧向流测定(LFA)装置。现参考图1-4，其描绘地阐释了本文所述的示例性LFA装置的各种实施方式。

如图1中显示的，装置100，在一些实施方式中，包括结合垫200、膜300以及任选地吸收垫400和支撑构件500，结合垫200、膜300以及任选地吸收垫400安装在支撑构件500上。

结合垫200直接地或经连接体与膜300相通。当装置含有吸收垫400时，结合垫200和吸收垫400通过膜300分开，膜300直接地或间接地与吸收垫400是相通。在一些实施方式中，结合垫200与膜300重叠，例如，2-6mm，比如3mm，如图2中显示的。可替选地或另外地，膜300与吸收垫400重叠，例如，2-6mm，比如3mm，如图2中显示的。

结合垫200、膜300、吸收垫400和支撑构件500的具体特点和尺寸可根据需要改进以实现期望的结果。如图2中显示的，在一些实施方式中，支撑膜具有80mm的长度，其是结合垫(42mm)、膜(25mm)和吸收垫(19mm)的组合长度减去样品垫和吸收垫在膜上的重叠(3mm，3mm)。

如图3A中显示的，装置100的俯视图，装置可包括用于，在一些实施方式中，固定如本文所述的那些fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂的各种区(210、220、230)。在一些实施方式中，装置100包括第一区210和第二区220，其可在结合垫200上；和第三区230，其可在膜300上。

fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂各自可被固定在区210、220和230(其可以以任何顺序)之一上。任何这些试剂可使用本领域已知的任何方式固定。试剂可直接地或间接地固定，或结合至，结合垫200和/或膜300的表面。在一些实施方式中，结合剂经共价键固定至表面。在一些实施方式中，结合剂经非共价键固定至表面。在一些实施方式中，结合剂经连接体固定至表面。连接体的示例，包括但不限于含有碳的链、聚乙二醇(PEG)、核酸、单糖单元、生物素、抗生物素蛋白和肽。

在一些实施方式中，fC1-INH结合剂比如FXIIa固定在第一区210上。fC1-INH结合剂可缀合至对接剂比如生物素。C1-INH结合剂比如结合至C1-INH的抗体可固定在第二区220上。C1-INH结合剂可缀合至可检测标签比如本文公开的那些。捕获剂比如抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)可固定在第三区230上。

在一些实施方式中，fC1-INH结合剂比如FXIIa固定在第一区210上。fC1-INH结合剂可缀合至本文所述的那些可检测标签。C1-INH结合剂比如结合C1-INH的抗体可固定在第二区220上。C1-INH结合剂可缀合至对接剂比如生物素。捕获剂比如抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)可固定在第三区230上。

在一些实施方式中，C1-INH结合剂比如结合至C1-INH的抗体可固定在第一区210上。C1-INH结合剂可缀合至对接剂比如生物素。fC1-INH结合剂比如FXIIa可固定在第二区220上。fC1-INH结合剂可缀合至可检测标签比如本文所述的那些。捕获剂比如抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)可固定在第三区230上。

在一些实施方式中，C1-INH结合剂比如结合至C1-INH的抗体可固定在第一区210上。C1-INH结合剂可缀合至可检测标签比如本文所述的那些。fC1-INH结合剂比如FXIIa可固定在第二区220上。fC1-INH结合剂可缀合至对接剂比如生物素。捕获剂比如抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)可固定在第三区230上。

在一些实施方式中，fC1-INH结合剂比如FXIIa固定在第一区210上。fC1-INH结合剂可缀合至对接剂比如生物素。捕获剂比如抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)可固定在第二区220上。捕获剂可缀合至可检测标签比如本文公开的那些。C1-INH结合剂比如结合C1-INH的抗体可固定在第三区230上。

在一些实施方式中，fC1-INH结合剂比如FXIIa固定在第一区210上。fC1-INH结合剂可缀合至可检测标签比如本文所述的那些。捕获剂比如抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)可固定在第二区220上。C1-INH结合剂比如结合至C1-INH的抗体可固定在第三区230上。C1-INH结合剂可缀合至对接剂比如生物素。

在一些实施方式中，C1-INH结合剂比如结合至C1-INH的抗体可固定在第一区210上。C1-INH结合剂可缀合至对接剂比如生物素。捕获剂比如抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)可固定在第二区220上。捕获剂可缀合至可检测标签比如本文公开的那些。fC1-INH结合剂比如FXIIa可固定在第三区230上。

在一些实施方式中，C1-INH结合剂比如结合至1-INH的抗体固定在第一区210上。C1-INH结合剂可缀合至可检测标签比如本文所述的那些。捕获剂比如抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)可固定在第二区220上。fC1-INH结合剂比如FXIIa可固定在第三区230上。fC1-INH结合剂可缀合至对接剂比如生物素。

本文公开的任何LFA装置可进一步包括第四区240，其可用于放置样品比如本文所述的那些，和任选地第五区250，其可用于放置缓冲溶液。

第五区250可位于装置的一个末端处，使得当缓冲溶液放置在第五区250上时，缓冲溶液可从第一区210向第三区230流过装置。在一些示例中，第五区250可与第一区210重叠。参见图3B。在该情况下，C1-INH结合剂比如结合至C1-INH的抗体可固定在第一区210上，第一区210与第五区250重叠。C1-INH结合剂可缀合至可检测标签。

可替选地或另外地，第四区240可位于第五区250和第二区220之间。在一些情况下，第四区240和第二区220可重叠。参见图3B。fC1-INH结合剂比如FXIIa，其可缀合至对接剂比如生物素，可固定在第二区220上。

如图4中显示的，装置100，在一些实施方式中，可进一步包括外壳600，其可以是可拆卸的。在图5中显示了外壳中如本文所述的装置的图像。外壳600可以配置为暴露装置100的至少一部分结合垫200和膜300。在一些实施方式中，外壳600包括形成缓冲口610的第一开口，其可与第一区210对齐。外壳600可进一步包括形成样品口的第二开口620，其可与第二区220对齐。进一步，外壳600可包括形成测试窗口的第三开口630，其可与第三区230对齐。

在一些实施方式中，C1-INH结合剂比如结合至C1-INH的抗体固定在第一区210上，其与缓冲口610对齐。图4。C1-INH结合剂可缀合至可检测标签比如本文所述的那些。fC1-INH结合剂比如FXIIa可固定在第二区220上，第二区220可与样品口620对齐。fC1-INH结合剂可缀合至对接剂比如生物素。捕获剂比如抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)可固定在第三区230上，第三区230可与测试窗口630对齐。

在一些示例中，样品可放置在样品口620中，允许其中的fC1-INH与FXIIa-生物素共轭物结合。缓冲溶液可放置在缓冲口610中，允许第一区210上的C1-INH结合剂连同缓冲溶液一起向第二区220迁移。当C1-INH结合剂与第二区220处的fC1-INH-FXIIa复合物接触时，形成了C1-INH结合剂/fC1-INH/FXIIa-生物素的复合物。该复合物将与缓冲溶液一起向第三区230迁移并且经第三区230处生物素和链霉抗生物素蛋白之间的相互作用在第三区230处被捕获。可测量在第三区230(其与测试窗口630对齐)处缀合至C1-INH结合剂的可检测标签释放的信号，其指示样品中fC1-INH的存在或水平。

可替选地或另外地，外壳600可以是透明(clear)的，以促进样品口610和/或缓冲口620和/或测试窗口630的可视化。在一些实施方式中，一部分外壳是透明的。在一些实施方式中，全部外壳600是透明的。

外壳600，在一些实施方式中，包括标签以促进样品或结果的鉴定。在一些实施方式中，外壳600包括一个或多个标签以促进测试窗口630中结果的鉴定。在一些实施方式中，一个或多个标签鉴定样品结果。

应当理解装置的各种实施方式，包括如本文所述的装置中的多种组件(例如，结合垫、膜、吸收垫和支撑构件)可以用合适的材料，例如，用任何合适的结合垫、用任何合适的膜、用任何合适的吸收垫、用任何合适的支撑构件、用任何合适的结合剂和用其任何合适的组合形成。

例如，如本文公开的LFA装置中的膜300可以是任何合适的膜，其包括但不限于硝化纤维素膜、尼龙膜、纤维素膜、聚乙烯氟化物膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚乙烯膜、聚四氟乙烯膜和聚对苯二甲酰对苯二胺(poly-paraphenylene terephthalamide)膜。在一些实施方式中，膜是硝化纤维素膜。

任何合适的支撑构件可用于本文所述的装置中。在一些实施方式中，支撑构件包括金属。在一些实施方式中，支撑构件包括塑料。在一些实施方式中，支撑构件包括塑料，其选自由以下组成的组中：苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和聚氯乙烯。

任何合适的垫可用作本文所述的装置中的结合垫。在一些实施方式中，结合垫包括纤维素或玻璃纤维。在一些实施方式中，吸收垫包括纤维素或玻璃纤维。

本文提供的装置可进一步包括样品垫。在一些实施方式中，样品垫包括纤维素或玻璃纤维。

应当认识到，本发明的各种实施方式可以与一个或多个以上特征一起形成。本发明的以上方面和特征可以在任何合适的组合中采用，因为本发明在这方面不受限制。还应当认识到，附图阐释了可被并入本发明的各种实施方式的各种部件和特征。为了简化，一些附图可阐释了一个以上的任选的特征或部件。然而，本发明不限于附图中公开的具体实施方式。应该认识到，本发明涵盖的实施方案可仅包括任何一个附图中阐释的部分部件，和/或本发明涵盖的的实施方式也可涵盖结合不同附图中阐释的部件。

III.功能性C1-INH的测量

本文还提供了用于检测和/或量化样品中功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)的方法。本文公开的测定方法涉及使用fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂，其都在本文中公开。FC1-INH结合剂和C1-INH试剂之一缀合至对接剂，其结合捕获剂。FC1-INH结合剂、C1-INH试剂和捕获剂之一缀合至可检测标签。可检测标签和对接剂缀合至不同试剂。

为了执行本文公开的测定方法，在允许形成包括fC1-INH、fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂的复合物(通过与缀合至fC1-INH结合剂或C1-INH结合剂的对接剂相互作用)的条件下，可以将怀疑含有fC1-INH的样品与fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂接触。样品中fC1-INH的存在或水平可通过测量从可检测标签释放的信号检测和/或量化，可检测标签可接合于fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂任意一种。

在一些示例中，样品和fC1-INH结合剂(例如，FXIIa)可首先孵育适当时期(例如，至少5分钟，比如5-10分钟)以允许形成fC1-INH/FXIIa复合物。然后，复合物可与C1-INH结合剂比如结合至C1-INH的抗体一起孵育以形成三组分复合物，然后其可与捕获剂接触，所述捕获剂结合缀合至fC1-INH结合剂或C1-INH结合剂的对接剂。可测量从缀合至最终复合物中一种组分的可检测标签释放的信号，用于确定样品中fC1-INH的存在/不存在和/或水平。

本文提供的用于检测和/或量化fC1-INH的方法，在一些实施方式中，包括(i)将样品与fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂接触以形成复合物，其中fC1-INH结合剂和C1-INH试剂之一缀合至对接剂，其结合捕获剂，和其中fC1-INH结合剂、C1-INH试剂和捕获剂之一缀合至可检测标签，可检测标签和对接剂被缀合至不同试剂；和(ii)检测从复合物中可检测标签释放的信号；其中复合物中从可检测标签释放的信号的存在指示样品中fC1-INH的存在。

本文所述的方法涵盖以任何合适的方式在任何合适的衬底上固定的捕获剂。衬底的示例包括但不限于珠子、颗粒、载片和多孔板。在一些实施方式中，捕获剂共价结合至衬底。在一些实施方式中，捕获剂非共价结合至衬底。在一些实施方式中，捕获剂间接地结合至衬底，例如，通过连接体。

在一些实施方式中，本文公开的的测定方法可使用任何本文公开的LFA装置进行。例如，样品可放置在样品口620中(图4)和缓冲溶液可放置在缓冲口610中。样品口620可与第二区220对齐。缓冲口610可与第一区210对齐。缓冲溶液将与固定在第一区210和第二区220上的样品和fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和/或捕获剂一起从，例如，第一区210向第二区220和第三区230流动。当缓冲溶液穿过第一区210、第二区220和第三区230时，这允许样品与fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂接触，使得可以形成包括样品中的fC1-INH、fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂的复合物。样品中fC1-INH的存在或水平可通过测量从缀合至复合物中一种组分的可检测标签释放的信号确定。

在一个示例中，用包括FXIIa-生物素和缀合至铕颗粒的抗C1-INH抗体的LFA装置，例如，如图4中显示的配置的装置检测和/或量化fC1-INH方法，被描述仅用于阐释目的。在该示例中，缀合至铕颗粒的抗C1-INH抗体用作缀合至检测标签的C1-INH结合剂，并且抗C1-INH抗体共轭物固定在第一区210中。缀合至生物素的FXIIa用作缀合至对接剂的fC1-INH结合剂，并且FXIIa-生物素固定在第二区220中。为了检测样品中fC1-INH的存在，将样品经样品口620放置在结合垫200上的第二区220处。当样品接触第二区220中的FXIIa-生物素时，样品中的fC1-INH结合至FXIIa，从而形成FXIIa-生物素：fC1-INH复合物。

如本文使用的，术语“接触”指样品与一种或多种结合剂暴露足以与样品中的fC1-INH和/或C1-INH(如果有的话)形成复合物的合适的一段时期。在一些实施方式中，样品和/或缓冲液经毛细管作用接触一种或多种结合剂，其中样品和/或缓冲液移动穿过结合垫或膜。

缓冲液可经缓冲口610放置在结合垫200上的第一区210处。在样品放置在第二区220处后，缓冲液可放置在第一区210处任何时间长度，例如，在样品放置在装置中后，缓冲液可放置至少5分钟。缓冲液溶解抗C1-INH抗体共轭物，并且经毛细管作用将其沿着结合垫200从第一区210向膜300移动。当缓冲液达到第二区220时，其接触FXIIa-生物素：fC1-INH复合物，并且缓冲液中的抗C1-INH抗体共轭物结合至具有FXIIa-生物素的复合物中的fC1-INH，从而形成“夹心”。在该示例中，fC1-INH夹心因此包括与结合至fC1-INH的生物素缀合的FXIIa，fC1-INH通过缀合至铕颗粒的抗C1-INH抗体结合。

包括fC1-INH夹心的缓冲液继续在结合垫200向前移动至膜300，在膜300上链霉抗生物素蛋白固定在第三区230(例如，测试线)处。在该示例中，链霉抗生物素蛋白用作结合至对接剂，特别地生物素的捕获剂。当缓冲液在第三区230处与链霉抗生物素蛋白接触时，fC1-INH夹心中的生物素结合至第三区230处的链霉抗生物素蛋白，从而捕获fC1-INH夹心。然后基于来自第三区230处的铕颗粒的信号的存在经测试窗口630检测样品中fC1-INH的存在。fC1-INH夹心的检测不限于经铕颗粒的检测。例如，fC1-INH的存在可经颜色或pH的可检测改变来检测。如果fC1-INH不存在于样品中，则不形成fC1-INH夹心，并且在第三区230处没有检测到信号。

在移动至第三区230后，样品继续从膜300向前移动至吸收垫400，其充当芯(wick)以将样品向上拉，从而去除来自第三区230的任何背景材料。

本文提供的方法涵盖检测和/或量化各种样品中的fC1-INH，或其缺乏。在一些实施方式中，样品是从受试者获得的生物样品。在一些实施方式中，生物样品是血清样品、血浆样品或血液样品。在一些实施方式中，样品是从怀疑患有fC1-INH缺陷-介导的紊乱(例如，HAE)或处于fC1-INH缺陷-介导的紊乱(例如，HAE)的风险的受试者中获得的。

在一些实施方式中，生物样品是血液样品，例如，从受试者获得的全血。全血包括红细胞、白细胞、血小板和血液血浆。在一些实施方式中，血液样品可以从血管(例如，毛细血管、静脉和动脉)收集。在一些实施方式中，血液样品可通过手指针刺产生几滴血液获得。在一些实施方式中，获得血液样品之后，将血液样品在2-8℃处理。对于血浆或血清制备，血浆或血清可在通过离心收集血液后制备。血浆和血清样品可以在分析之前存储在-80℃。

在一些实施方式中，本文所述的方法和/或装置可进一步包括控制线。如本领域普通技术人员将理解的，可使用控制线以确保方法和/或装置如预期运行，例如，检测fC1-INH。

IV.LFA方法和装置的应用

本文所述的方法和装置可用于疾病的评估，例如，疾病的诊断或预后。评估可包括鉴定受试者处于本文所述的疾病的风险或患有本文所述的疾病，例如，fC1-INH缺陷-介导的紊乱。评估还可包括监测疾病的治疗，比如评估fC1-INH缺陷-介导的紊乱的治疗效果。fC1-INH缺陷-介导的紊乱的示例包括但不限于遗传性血管性水肿(例如，I型和/或II型HAE)、获得性血管性水肿(例如，I型和/或II型AAE)、C1-INH缺陷有关的免疫疾病(例如，系统性红斑狼疮(SLE)和C1-INH缺陷有关的癌症(例如，淋巴瘤)。

在一些实施方式中，本文使用的方法和装置用于评估受试者是否患有遗传性血管性水肿或处于遗传性血管性水肿的风险。一般来说，有不同类型的遗传性血管性水肿，其展示类似的炎症性应答，但在病因上有所不同。例如，I型HAE与功能性但低水平的C1-INH有关，而II型HAE则与在正常浓度存在的非功能性的C1-INH有关。

A.诊断

在一些实施方式中，本文所述的方法和装置用于确定从受试者(例如，怀疑患有fC1-INH缺陷-介导的紊乱比如HAE的人患者)收集的生物样品(例如，血清样品或血浆样品或血液样品)中fC1-INH水平。然后，将fC1-INH水平与参考值比较以确定受试者是否患有fC1-INH缺陷-介导的紊乱或处于fC1-INH缺陷-介导的紊乱的风险中。参考值可以是能够结合至如本文所述的fC1-INH结合剂(例如，FXIIa)的fC1-INH的对照水平。在一些实施方式中，对照水平是能够结合至fC1-INH结合剂的对照样品中fC1-INH的水平。在一些实施方式中，对照样品从健康受试者或健康受试者的群体获得。如本文使用的，健康受试者是在测量fC1-INH水平的时候明显没有fC1-INH缺陷-介导的紊乱或不具有该疾病的病史的受试者。

对照水平也可以是预定的水平。这种预定的水平可表示不患有fC1-INH缺陷-介导的紊乱或不处于fC1-INH缺陷-介导的紊乱的风险的受试者群体中的fC1-INH水平。预定的水平可采用各种形式。例如，其可以是单个截断值，比如中值或平均值。在一些实施方式中，这种预定的水平可以基于比较组建立，比如其中一个定义组已知患有靶疾病并且另一定义组已知不患有靶疾病。可替选地，预定的水平可以是范围，例如，表示预定的百分位数内对照群体的fC1-INH水平的范围。

如本文所述的对照水平可通过各种方法确定。在一些实施方式中，对照水平可通过执行已知的方法获得。在一些实施方式中，对照水平可通过执行用于确定来自受试者的样品中fC1-INH水平的相同测定获得。在一些实施方式中，对照水平可通过执行本文所述的方法获得。在一些实施方式中，对照水平可用本文所述的装置获得。在一些实施方式中，对照水平可从对照群体的成员获得并且结果可通过，例如，计算程序分析，以获得表示对照群体中fC1-INH水平的对照水平(预定的水平)。

通过比较从受试者获得的样品中能够结合至fC1-INH结合剂的fC1-INH水平与如本文所述的参考值，可确定受试者是否患有fC1-INH缺陷-介导的疾病(例如，HAE)或处于fC1-INH缺陷-介导的疾病(例如，HAE)的风险。例如，如果受试者的结合至fC1-INH结合剂的fC1-INH水平偏离参考值(例如，与参考值相比减少)，则候选受试者可被鉴定为患有fC1-INH缺陷-介导的疾病例如HAE或处于fC1-INH缺陷-介导的疾病例如HAE的风险。本文公开的测定可用于预先确定表示正常受试者的fC1-INH的截断值。这种截断值可用于确定受试者是否患有fC1-INH缺陷-介导的疾病(例如，HAE)或处于fC1-INH缺陷-介导的疾病(例如，HAE)的风险。在一些情况下，受试者的fC1-INH水平小于截断值可指示疾病风险或发生。

如本文使用的，“降低水平或参考值以下的水平”意思是结合至fC1-INH结合剂的fC1-INH水平小于参考值，比如对照样品中结合至fC1-INH结合剂的预定的fC1-INH的阈值或水平。

结合至fC1-INH结合剂的fC1-INH的降低水平包括fC1-INH水平例如，比参考值低50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更高。结合至fC1-INH结合剂的fC1-INH的降低水平还包括减少从非零状态(例如，样品中一些或可检测的结合至fC1-INH结合剂的fC1-INH)至零状态(例如，样品中没有或检测不到的结合至fC1-INH结合剂的fC1-INH)的现象。

在一些实施方式中，受试者是具有fC1-INH缺陷-介导的疾病，例如，本文公开的那些比如HAE的症状的人患者。例如，受试者具有水肿、肿胀，其中所述肿胀完全或主要是外周的；荨麻疹；没有感染迹象的发红、疼痛和肿胀；非组胺-介导的水肿、肿胀的反复发作或其组合。在一些实施方式中，受试者在收集样品时不具有fC1-INH缺陷-介导的疾病的症状、不具有fC1-INH缺陷-介导的疾病的症状的病史、或没有fC1-INH缺陷-介导的疾病比如HAE的病史。在一些实施方式中，受试者对抗组胺疗法、皮质激素疗法或二者有抗性。

fC1-INH缺陷-介导的疾病的示例包括但不限于非组胺依赖性特发性血管性水肿、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、狼疮、阿尔茨海默氏疾病、脓毒性休克、烧伤、脑缺血/再灌注损伤、脑水肿、糖尿病视网膜病、糖尿病型肾病、黄斑性水肿、血管炎、动脉或静脉血栓形成、与心室辅助装置或支架相关的血栓形成、具有血栓形成的肝素-诱导的血小板减少症、血栓栓塞病和具有不稳定心绞痛的冠心病、水肿、眼病、痛风、肠道疾病、口腔黏膜炎、神经性疼痛、炎症性疼痛、椎管狭窄-退行性脊椎病、术后肠梗阻、主动脉动脉瘤、骨关节炎、遗传性血管性水肿、肺栓塞、中风、头部创伤或瘤周脑水肿、脓毒、急性中脑动脉(MCA)缺血性事件(中风)、再狭窄(例如，在血管成形术后)、系统性红斑狼疮肾炎、自身免疫性疾病、炎症性疾病、心血管疾病、神经疾病、与蛋白质错折叠相关的疾病、与血管生成相关的疾病、高血压肾病和糖尿病型肾病、过敏和呼吸疾病(例如，过敏、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、急性呼吸窘迫综合症、囊性纤维化、持续性鼻炎)和组织损伤(例如，灼伤或化学损伤)。

B.评估治疗效果

本文所述的方法和装置也可应用于评估fC1-INH缺陷-介导的疾病(例如，HAE)的治疗效果。例如，在治疗前和治疗后或治疗过程期间，可以从进行治疗的受试者收集多种生物样品(例如，血清、血浆或血液样品)。fC1-INH的水平可通过本文所述的任何方法来测量。如果治疗后或治疗过程中fC1-INH水平增加(后来收集的样品中的fC1-INH水平与先前收集的样品中的fC1-INH水平相比)，保持相同或升高，其指示治疗是有效的。

如果受试者被鉴定为对治疗没有反应，则对鉴定的受试者施用更高剂量和/或给药频率的治疗剂。在一些实施方式中，对鉴定为对治疗有反应或不需要进一步治疗的受试者，保持、降低或停止治疗剂的剂量或给药频率。可替选地，可以对发现对第一种治疗没有反应的受试者应用不同的治疗。

治疗剂包括但不限于激肽释放酶结合剂、缓激肽B2受体拮抗物、C1-INH取代剂、DX-2930和DX88(参见，例如，PCT公开号WO 2014/113701，其通过引用以其整体并入本文)。

实施例

为了本文所述的装置和方法更充分地被理解，阐释了以下实施例。本申请中描述的实施例是为了阐释本文提供的方法和组合物，而不能以任何方式解释为限制它们的范围。

实施例1：用于检测和/或量化功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)的侧向流测定(LFA)装置的制备

膜的加条纹

FRONTLINE HR^TM(BioDot)被用于将膜加条纹(stripe)。用10个循环的洗涤缓冲液(diH₂O中的0.05％

(Stepan Company))洗涤Front lines，并且对齐，以便使测试线(test line)距离膜底部11mm。将Front lines清空(emptied)并且用10mM磷酸盐，pH 7.3，0.5％蔗糖中的0.5mg/mL聚链霉抗生物素蛋白灌注(primed)。将聚链霉抗生物素蛋白的测试线加条纹到膜上(参见，例如，图3A中膜300上的第三区230)。然后，膜被标记并且在40℃干燥30分钟。加条纹后用10个循环的洗涤缓冲液洗涤Front lines。在表1中显示用于使膜加条纹的组分。

表1.用于使膜加条纹的组分。

结合垫的加条纹

FRONTLINE HR^TM(BioDot)被用于将抗C1-INH Eu颗粒共轭物和FXIIa-生物素加条纹到结合垫(Ahlstrom)上。在使结合垫加条纹之前，在Eu乳胶稀释剂中将抗C1-INH Eu颗粒共轭物稀释至0.04％w/v，并且在FXIIa-生物素稀释剂中将FXIIa-生物素稀释至2.4μM。然后，用10个循环的洗涤缓冲液(diH₂O中0.05％

(Stepan Company))洗涤Front lines。将Front lines对齐，以便分别以10和2.5μL/cm的速率使抗C1-INH Eu颗粒共轭物从结合垫底部15mm加条纹并且使FXIIa-生物素共轭物从结合垫顶部8mm加条纹。抗C1-INH Eu颗粒共轭物和FXIIa-生物素共轭物的位置分别与定制SLA外壳盒中的缓冲口和样品口对齐。

清空Front lines并且用任一共轭物灌注。将共轭物加条纹到结合垫，其然后被贴上标签，并在40℃干燥30分钟。结合垫被密封和干燥。加条纹后用10个循环的洗涤缓冲液洗涤Front lines。表2中显示了用于使结合垫加条纹的组分。表3和表4中分别显示了Eu乳胶稀释剂和FXIIa-生物素稀释剂的组分。

表2.用于使结合垫加条纹的组分

表3.Eu乳胶稀释剂的组分

表4.FXIIa-生物素稀释剂的组分

抗C1-INH Eu颗粒共轭物的制备

为了制备抗C1-INH Eu颗粒共轭物，使用制造商的方案，经ZEBA^TM旋转柱(ThermoFisher)将0.1mg的抗C1-INH抗体交换到50mM硼酸盐，pH8中。通过吸光度(A₂₈₀，1mm，1OD＝1.4mg/mL)确定抗体的浓度。使储存的乳胶旋转10分钟，并且然后使用微尖声纳器(设置25)超声处理10-15秒。在0.1M MES，pH 6.5中将储存的乳胶溶液(10％)稀释至1％，并且以17,000g下微量离心10分钟。除去上清液，并且将沉淀物(pellet)再悬浮于在其中缓冲液的体积等于乳胶的起始体积的0.1M MES，pH 6.5中。将所得溶液溶液如先前描述的超声处理、微量离心并且再悬浮。

为了在0.1M MES缓冲液中制备15mg/mL的EDC，允许EDC平衡到室温，并且称重。EDC溶液在用于制备抗C1-INH Eu颗粒共轭物的10分钟内制备。EDC储备粉被干燥并且在-20℃冷冻以长期存储。

为了在0.1M MES缓冲液中制备50mg/mL的硫代-NHS，允许硫代-NHS平衡到室温，并且称重。在用于制备抗C1-INH Eu颗粒共轭物的10分钟内制备硫代-NHS溶液。通过在1000rpm的振动器上孵育30分钟活化硫代-NHS溶液。将溶液以17,000g微量离心8分钟。将沉淀物再悬浮于在50mM硼酸盐缓冲液中，涡旋并且超声处理。缓冲液的体积等于乳胶溶液的起始体积(600μL)。然后将溶液如先前描述微量离心，再悬浮于硼酸盐缓冲液(300μL)中，涡旋并且超声处理。将活化的颗粒等分入50μL/管中，并且添加适量的缓冲液和蛋白质(例如，20μg蛋白质(即，抗体))，以获得20:1质量与质量比的颗粒与蛋白质。在添加缓冲液和蛋白质后，立即涡旋试管。

将试管在室温在1,000rpm的振动器上孵育2小时。孵育后，以10μL/mL添加1M乙醇胺，并且将试管在室温在1,000rpm的振动器上孵育30分钟。试管以17,000g微量离心10分钟，并且将沉淀物再悬浮于7-天陈化的1％的酪蛋白中，并且摇动孵育过夜。孵育过夜后，微量离心试管，并且将沉淀物再悬浮于7-天陈化的1％的酪蛋白中，涡旋并超声处理。然后将颗粒共轭物加条纹到如本文所述的结合垫上。表5中显示了用于抗C1-INH Eu颗粒共轭物的组分。

表5.抗C1-INH Eu颗粒共轭物

层压组分到背衬卡(backing card)上

为了将组分层压到80mm长的背衬卡(DCN)上，使用直尺剃刀在离卡底部39mm处切下背衬贴(backing sticker)。从卡顶部上39mm位置去除背衬贴。从卡的底部39mm处将膜附着至卡上。将吸收垫(Ahlstrom)附着至卡的顶部，以便使垫与膜的顶部重叠3mm。去除剩余的背衬贴，并且将结合垫附着至卡的底部，以便使垫与膜的底部重叠3mm。表6和表7分别显示了组分和组分顺序。

表6.卡组分

表7.层压组分顺序、方向和位置

制备测试条

将卡放入Kinematic切割器(Kinematic)，并且将卡切割成5.0mm宽的条。短于5.0mm的条或在切条期间用笔做过标记的条被丢弃。切下的条被放置入具有干燥剂的箔袋中。箔袋被密封并且储存在干燥箱中直到使用。

实施例2：使用LFA装置检测来自患者血浆样品中的功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)。

为了执行确定fC1-INH浓度的侧向流测定(LFA)，将如以上实施例1所述制备的测试条放入定制的立体光刻(SLA)盒中(参见，例如，图4)。通过将C1-INH参考标准物(批号#TCP103，Shire，Takeda Company)掺入(spiking)到C1-INH耗尽的人K3-EDTA血浆(由Shire，Takeda Company制备)中来制备标准物和质量对照。含有0mU/mL至800mU/mL纯化的C1-INH的对照样品用于生成校准曲线。在C1-INH耗尽的培养基中将对照样品1:20稀释。将样品添加至样品口，并且孵育5分钟。将运行缓冲液(30μL)添加至样品口，允许样品运行到膜上并且上至测试窗口。然后将运行缓冲液(150μL)添加至缓冲口，并且将盒孵育另外20分钟。将测试条从盒中取出，并且使用Axxin AX-2X荧光阅读机(Axxin)测量测试线区域的强度。图5中显示了盒中测试条的图像。将测量的测试线区域的强度针对C1-INH浓度作图，以生成图6中显示的校准曲线，并且得出0.97的R²。

50个正常K3-EDTA血浆样品通过商业上获得，并且50个HAE血浆样品是从SAHARA患者同意使用的，SAHARA是III期、随机、双盲、安慰剂对照、两周期、三序列、部分交叉的研究，其评估了皮下施用2000IU的C1酯酶抑制剂[人]注射液体对预防患有HAE的青少年和成人的血管性水肿发作的有效性和安全性。

然后来自图6的校准曲线用于确定对照受试者和患有遗传性血管性水肿(HAE)的受试者的血浆样品中的FC1-INH浓度。简言之，在C1-INH耗尽的血浆中将来自受试者的血浆样品1:20稀释。将稀释的血浆样品(20μL)添加至样品口，并且孵育5分钟。使用测试条确定的fC1-INH浓度在ELISA确定的浓度值的20％内。

如图8中显示的，两种方法中，与健康的对照相比，HAE受试者的C1-INH水平都较低。在发色和LFA方法中，健康对照测量的平均C1-INH浓度分别是1345和1089mU/mL，并且HAE受试者测量的平均C1-INH浓度分别是275和163mU/mL(表8)。表8中提供了测量的SEM和95％的置信区间。从两种方法获得的所有HAE受试者的C1-INH数据彼此关联，其中R²是0.86，包括两名HAE受试者的C1-INH浓度在健康对照范围中(图9)。发色和LFA方法中正常对照和HAE受试者测得的的fC1INH之间平均比值分别是4.9和6.7。

基于来自对照受试者和患有HAE的受试者的样品的诊断性能的接收者操作特征曲线(ROC)是0.98，指示由LFA确定的C1-IHN浓度精确地在对照和HAE受试者之间区分(图7)。ROC曲线指示，496mU/mL的C1-INH切点产生94％的灵敏性(真阳性率)和96％的特异性(假阳性率)(图7)；假阴性和假阳性在表9中列出。

如表8和图8-9中显示的，使用LFA获得的结果与使用ELISA的发色测定分析进行了比较。简言之，发色方法直接测量fC1-INH水平，涉及裂解合成底物的C1s以形成有色化合物，其中颜色强度降低表明C1s酶活性的抑制。发色测定的精确性、准确性、线性和定量的上限和下限都合格。C1-INH蛋白质(2000IU的C1酯酶抑制剂[人]注射液体，Shire，TakedaCompany)用于制备三个质量对照以及标准曲线，标准曲线有10个标准点，范围为1000-1.95mU/mL。标准曲线的最高点和最低点用作锚点。简言之，在室温(RT)将K3-EDTA血浆样品和参考蛋白质与重组人补体组分C1s蛋白质(R&D Systems)在聚丙烯板中预孵育30分钟。在测定缓冲液中将形成的C1-INH和C1s复合物1:5稀释，并且与底物溶液((具有硫代苄基酯基的合成底物，M-1300，Bachem)和5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)#D-8000，Biosynth)混合，允许反应在RT孵育40分钟。使用具有SoftMax Pro软件的SpectraMax M5板阅读器在405nm处记录吸光度。

表8.比较发色测定和LFA以确定fC1-INH浓度的结果

表9.显示对照和HAE样品的假阳性和阴性的结果。

总之，这些结果表明，通过LFA和ELISA(称为发色测定)在患者血浆样品中检测到相似的FC1-INH浓度。因此，本文所述的LFA和测试条可能是用于基于来自患者的血浆样品中的fC1-INH水平来鉴定患有HAE的患者的有效工具。使用本文所述的LFA获得的结果与来自评估FC1-INH的发色测定的结果关联。

本文公开的快速且灵敏的LFA方法和装置可以在医生办公实验室进行，用于基于fC1INH水平快速诊断HAE(例如I&II型)。这种方法和装置可导致医疗保险报销的低成本耗材，定量结果的高置信水平，医生容易解释数据，和/或对确认性分析的需求水平低。在医生办公室诊断I型或II型HAE的这种快速分析可扩大HAE的筛选，并且更快地鉴定新的HAE患者。目前，全球HAE的诊断率只有40％；因此，未被诊断的患者具有高的未满足需求。普通装置平台上的快速测试可得性可扩大对HAE的识别。此外，本文公开的fC1INH的快速测试可以帮助在临床上及时监测HAE疾病的进展或对疗法的应答。

参考文献

1.Maurer,M.等人，(2018)The international WAO/EAACI guideline for themanagement of hereditary angioedema-the 2017revision and update.World AllergyOrganization Journal

2.Aabom,A.等人，(2017)Complement factor C4 activation in patients withhereditary angioedema.Clinical Biochemistry 50(15),816-821.

3.Bork,K.和Davis-Lorton,M.(2013)Overview of hereditary angioedemacaused by C1-inhibitor deficiency:assessment and clinical management.Eur AnnAllergy Clin Immunol 45(1),7-16.

4.Csuka,D.等人，(2017)The role of the complement system in hereditaryangioedema.Mol Immunol 89,59-68.

5.Li,H.H.等人，(2015)Comparison of chromogenic and ELISA functional C1inhibitor tests in diagnosing hereditary angioedema.J Allergy Clin ImmunolPract 3(2),200-5.

6.Campbell,R.L.,Wagner,D.B.和O’Connel,J.P.(1987).Solid phase assaywith visual readout.U.S.Patent No.4,703,017.

7.Rosenstein,R.W.和Bloomster,T.G.(1989).Solid phase assay employingcapillary flow.U.S.Patent No.4,855,240.

8.May,K.,Prior,M.E.,和Richards,I.(1997).Capillary immunoassay anddevice therefore comprising mobilizable particulate labelledreagents.U.S.Patent No.5,622,871.

9.O’Farrell,B.(2009).Evolution in Lateral Flow-Based ImmunoassaySystems.In:Wong,R.C.and Tse,H.Y.(eds.).Lateral Flow Immunoassay.Humana PressNew York(NY).

10.Zahedi R,Aulak KS,Eldering E,Davis AE 3rd(1996).Characterizationof C1 inhibitor-Ta.A dysfunctional C1INH with deletion of lysine 251.J BiolChem.1996Sep 27；271(39):24307-12

实施例3：竞争性结合测定证明了侧向流测定(LFA)装置检测功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)的特异性。

通过在不同竞争性结合蛋白质存在的情况下进行测定，检验了如本文所述的侧向流测定(LFA)装置用于确定fC1-INH浓度的特异性。样品含有100mU/mL的纯化C1-INH。对照样品中没有添加竞争蛋白质。测量测试线区域的强度，并且对于每个样品计算来自对照反应的信号的百分比降低。对于具有竞争蛋白质的样品，与对照样品相比，测试线(TL)的强度降低了40％到60％之间(表10)。通过添加生物素标记的BSA，TL强度降低了55％，表明不相关的蛋白质在测定中没有被检测到(表10)。未标记的FXIIa和未标记的抗体的TL强度分别降低了61％和48％，表明了FXIIa和具有C1-INH的抗体对信号产生的特异性(表10)。

表10.特异性测试的结果

使用已经通过加热变性的C1-INH蛋白质进一步测试了检测的特异性。在40℃加热，TL强度没有降低，但在53℃加热，TL强度降低到背景信号的TL强度(表11)。

表11.以热处理的C1-INH的特异性测试的结果

总之，这些结果表明，本文所述的LFA和测试条对检测血浆样品中的FC1-INH是特异的。

实施例4：使用来自患者的血液样品来检测LFA装置中的功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)。

简言之，根据本领域普通技术人员显而易见的实验室惯例，通过进行手指针刺来收集全血样品。擦去第一血滴后，在手指上形成第二个血滴。使用样品环来接触第二血滴，使该环充满血液(图10A)。然后将环添加至容器，比如

瓶(图10B)。当环接触到瓶子的底部时，关上(snap)瓶子并扭转(twist)，使轴的底部进入瓶子。最后，更换瓶盖，并且摇动瓶子进行混合。全血样品可添加至任何装置用于分析。

实施例5：试剂的选择

试剂被选择用于本文所述的方法和/或装置。开发了两种初始检测剂：一种是采用缀合至抗fC1-INH Fab的铕纳米颗粒(图11A)，并且一种是采用缀合至抗fC1-INH Fab的红金纳米颗粒(图11B)。

观察到在动态范围的较低端信号的急剧下降，表明系统达到最大信号。为了降低这种关系的斜率，评估了不同量的不同试剂。两种试剂被评估为测试线：链霉抗生物素蛋白和聚合形式的链霉抗生物素蛋白(聚链霉抗生物素蛋白R)，其以0.5mg/mL的浓度印刷。发现链霉抗生物素蛋白与聚链霉抗生物素蛋白相比具有更高的信号，而发现聚链霉抗生物素蛋白则有更高的线性(图12)。将铕共轭物从0.1％调整到0.05％固体。与

一起在孵育步骤中使用的FXIIa浓度从1pmol/μL降低至0.5pmol/μL，以降低测定的动态范围。这获得信号在可检测的范围内的测定。

不同的试剂也被评估为测试线。简言之，产生了三种不同的测试线：人生物素化的FXIIa(B-HFXIIa)与链霉抗生物素蛋白混合，B-HFXIIa与聚链霉抗生物素蛋白混合，以及HFXIIa(非生物素化)单独。使用HFXIIa提供了阳性仍低的信号，而B-HFXIIa和链霉抗生物素蛋白以及B-HPFXIIa和链霉抗生物素蛋白则没有任何明显的阳性信号(图13)。

另外，还评估了抗C1-INH抗体用于本文所述方法。在四种浓度(1200mU/mL、600mU/mL、100mU/mL和9mU/mL)评估了四种铕共轭物(抗C1-INH Fab以及来自Sino BiologicalInc.的抗C1-INH抗体RP01、RP02、MM03和MM06抗体)(图14)。与Fab共轭物相比，使用抗体RP01、RP02、MM03和MM06每一种获得的信号都增强。选择多克隆抗体RP02用于进一步分析。

还评估了缓冲液条件。例如，在7.0-9.5的不同pH值下，分别制备了具有无机缓冲剂(IBA)的缓冲液或具有有机缓冲剂(OBA)的缓冲液。具有IBA的缓冲液在pH范围的更高端(pH9.5)表现更好(例如，更高的信号)，而具有OBA的缓冲液在生理pH范围(大约7-7.5)表现更好(例如，更高的信号)(图15)。

最后，还评估了与抗C1-INH结合剂共轭的可检测试剂。特别地，使用铕共轭物或红金共轭物评估了抗体RP02，并且与抗C1-INH Fab进行了比较。Fab共轭物没有导致阳性信号，而具有红色金共轭物的RP02抗体导致了阳性信号(图16)。

其他实施方式

本说明书中公开的所有特征可以以任何组合被组合。本说明书中公开的每一个特征都可以被服务于相同、等同或类似目的的可替选的特征所取代。因此，除非另有明确说明，公开的每个特征仅是通用系列的等同或类似特征的示例。从以上描述中，本领域技术人员可以很容易地确定本公开的基本特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以对本公开进行各种改变和修改，使其适应各种用途和条件。因此，其他实施方式也在权利要求内。

等同物和范围

本领域的技术人员将认识到，或能够明确仅仅使用常规实验，许多与本文所述的本公开的具体实施方式等价。本公开的范围不旨在限于上述描述，而是如所附的权利要求中陈述的。

在权利要求中，冠词比如“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”意味着指一个或多于一个，除非有相反的指示或从上下文中可以看出。如果一个、多于一个或所有的组成员存在于给定的产品或过程中、采用于给定的产品或过程中或以其他方式与给定的产品或过程相关，则组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述被认为是满足的，除非有相反的指示或从上下文中可以看出。本公开包括这样的实施方式，其中组的正好一个成员存在于给定的产品或过程中、采用于给定的产品或过程中或以其他方式与给定的产品或过程相关。本公开内容包括这样的实施方式，其中多于一个或所有的组成员存在于给定的产品或过程中、采用于给定的产品或过程中或以其他方式与给定的产品或过程相关。

此外，本公开还涵盖所有的变化、组合和排列，其中来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、元素、条款和描述性术语被引入另一个权利要求。例如，从属于于另一权利要求的任何权利要求可被修改为包括在从属于相同基本权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或多个限制。当元素以列表形式呈现时，例如以马库什基团的形式，元素的每个子基团也被公开，并且任何元素都可以从基团中去除。应该理解，一般来说，其中本公开或本公开的方面被称为包括特定元素和/或特征时，本公开或本公开的方面的某些实施方式由这种元素和/或特征组成或基本上由这种元素和/或特征组成。为了简化的目的，那些实施方式在本文没有具体地以这样的话陈述。还要提出，术语“包括”和“含有”旨在是开放的，并且允许包括另外元素或步骤。在给出范围的地方，包括了端点。此外，除非另外指出或从上下文和本领域普通技术人员的理解中可以看出，在本公开的不同实施方式中，表示为范围的数值可以承担所述范围内的任何具体数值或子范围，至范围下限的单位的十分之一，除非上下文有明确规定。

本申请提及各种已发布的专利、已公开的专利申请、期刊文章和其他出版物，所有这些都通过引用并入本文。如果任何并入的参考文献与本说明书之间有冲突，应以本说明书为准。另外，落入现有技术内的本公开的任何特定的实施方式都可以明确地排除在任何一个或多个权利要求之外。因为这种实施方式被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使本文没有明确陈述排除，它们可以被排除。本公开的任何特定实施方式可以基于任何原因被排除在任何权利要求之外，无论是否与现有技术的存在有关。

本领域技术人员将认识到或能够明确使用仅仅常规实验许多与本文所述的具体实施方案等同。本文所述的本实施方式的范围不旨在限于以上描述，而是所附的权利要求中陈述的。本领域技术人员会明白，在不背离如权利要求定义的本公开的精神或范围的情况下，可以对本描述进行各种改变和修改。

Claims

1.一种用于检测和/或量化功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)的装置，所述装置包括：

(i)结合垫，其包括第一区和第二区，在所述第一区和第二区上分别固定第一试剂和第二试剂，和

(ii)膜，其与结合垫相通，其中所述膜包括第三区，在所述第三区上固定第三试剂，

其中第一试剂为功能性C1抑制剂(fC1-INH)结合剂或C1抑制剂(C1-INH)结合剂；

其中第二试剂和第三试剂各自选自由以下组成的组中：功能性C1抑制剂(fC1-INH)结合剂、C1抑制剂(C1-INH)结合剂和捕获剂，第一试剂、第二试剂和第三试剂彼此不同；

其中fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂之一缀合至可检测标签，和fC1-INH结合剂和C1-INH结合剂之一缀合至对接剂，可检测标签和对接剂被缀合至不同试剂；和

其中结合垫进一步包括用于放置生物样品的第四区，所述生物样品以第一区、第二区和第三区的顺序流过装置。

2.根据权利要求1所述的装置，其中所述第一试剂、第二试剂和第三试剂分别是C1-INH结合剂、fC1-INH结合剂和捕获剂，或其中所述第一试剂、第二试剂和第三试剂分别是fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的装置，其中所述第一试剂缀合至可检测标签，所述第二试剂缀合至对接剂，或其中所述第一试剂缀合至对接剂，所述第二试剂缀合至可检测标签。

4.根据权利要求1-3的任一项所述的装置，其中fC1-INH结合剂是因子XII(FXIIa)的活性形式。

5.根据权利要求1-4的任一项所述的装置，其中C1-INH结合剂是结合C1-INH的抗体。

6.根据权利要求1-5的任一项所述的装置，其中对接剂和捕获剂是受体-配体对的成员。

7.根据权利要求6所述的装置，其中所述受体-配体对包括生物素和抗生物素蛋白。

8.根据权利要求7所述的装置，其中所述对接剂是生物素并且捕获剂是抗生物素蛋白。

9.根据权利要求8所述的装置，其中所述抗生物素蛋白是链霉抗生物素蛋白或聚链霉抗生物素蛋白。

10.根据权利要求1-9的任一项所述的装置，其中所述可检测标签选自由以下组成的组中：铕、胶体金、藻红蛋白、荧光素、若丹明、绿色荧光蛋白、量子点和生色团。

11.根据权利要求10所述的装置，其中所述可检测标签是铕。

12.根据权利要求10所述的装置，其中所述可检测标签是胶体金。

13.根据权利要求1-12的任一项所述的装置，其中所述可检测标签附着至乳胶颗粒。

14.根据权利要求1-13的任一项所述的装置，其中第四区与第二区重叠。

15.根据权利要求1-14的任一项所述的装置，其中第一试剂是位于第一区处的C1-INH结合剂，第二试剂是位于第二区处的fC1-INH结合剂，和第三试剂是位于第三区处的捕获剂。

16.根据权利要求15所述的装置，其中C1-INH结合剂是结合至C1-INH的抗体，其缀合至可检测标签，fC1-INH结合剂是缀合至对接剂的FXIIa，所述对接剂是生物素，并且捕获剂是抗生物素蛋白，所述抗生物素蛋白任选地是链霉抗生物素蛋白或聚链霉抗生物素蛋白。

17.根据权利要求15或权利要求16所述的装置，其中用于放置生物样品的第四区与第二区重叠，fC1-INH结合剂位于所述第二区上。

18.根据权利要求1-17的任一项所述的装置，进一步包括与膜相通的吸收垫，其中吸收垫和结合垫通过膜分开。

19.根据权利要求1-18的任一项所述的装置，进一步包括支撑构件，在所述支撑构件上安装结合垫、膜和/或吸收垫。

20.根据权利要求1-19的任一项所述的装置，进一步包括外壳。

21.根据权利要求20所述的装置，其中外壳包括形成缓冲口的第一开口，形成样品口的第二开口，和形成测试窗口的第三开口。

22.根据权利要求21所述的装置，其中样品口位于缓冲口和测试窗口之间。

23.根据权利要求21或权利要求22所述的装置，其中缓冲口与第一区对齐，C1-INH结合剂位于所述第一区上。

24.根据权利要求21-23的任一项所述的装置，其中样品口与第二区对齐，fC1-INH结合剂位于所述第二区上。

25.根据权利要求21-24的任一项所述的装置，其中测试窗口与第三区对齐，捕获剂位于所述第三区上。

26.一种用于检测和/或量化样品中功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)的方法，所述方法包括：

(i)将样品放置在根据权利要求21-25的任一项所述的装置的样品口中，

(ii)将缓冲液放置在装置的缓冲口中，其中缓冲液以第一区至第三区的方向流动；

(iii)检查装置的测试窗口处的信号，和

(iv)基于测试窗口处信号的存在或强度确定样品中fC1-INH的存在或测量样品中fC1-INH的水平。

27.根据权利要求26所述的方法，其中步骤(ii)在步骤(i)后至少5分钟进行，和其中fC1-INH结合剂固定在第二区处，所述第二区与样品口对齐。

28.根据权利要求26和权利要求27所述的方法，其中样品是从受试者获得的生物样品。

29.根据权利要求28所述的方法，其中生物样品是血清样品、血浆样品或血液样品。

30.根据权利要求26-29的任一项所述的方法，其中受试者是怀疑患有fC1-INH缺陷-介导的紊乱或处于fC1-INH缺陷-介导的紊乱的风险的人患者。

31.根据权利要求30所述的方法，其中fC1-INH缺陷-介导的紊乱选自由以下组成的组中：遗传性血管性水肿(HAE)、获得性血管性水肿(AAE)和C1-INH相关的免疫疾病。

32.根据权利要求31所述的方法，其中受试者具有HAE的症状。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其中HAE是I型HAE或II型HAE。

34.根据权利要求31所述的方法，其中受试者不具有HAE的症状、不具有HAE的症状的病史，或没有HAE的病史。

35.一种用于检测和/或量化样品中功能性C1-酯酶抑制剂(fC1-INH)的方法，所述方法包括：

(i)将样品与fC1-INH结合剂、C1-INH结合剂和捕获剂接触以形成复合物，其中fC1-INH结合剂和C1-INH试剂之一缀合至对接剂，所述对接剂结合捕获剂，和其中fC1-INH结合剂、C1-INH试剂和捕获剂之一缀合至可检测标签，可检测标签和对接剂被缀合至不同试剂；和

(ii)检测从复合物中可检测标签释放的信号；其中从复合物中可检测标签释放的信号的存在指示样品中fC1-INH的存在。

36.根据权利要求35所述的方法，其中步骤(i)通过以下进行：(a)将样品与fC1-INH结合剂孵育至少5分钟，和(b)将样品与C1-INH结合剂和捕获剂接触。

37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中fC1-INH结合剂是因子XII(FXIIa)的活性形式。

38.根据权利要求35-37的任一项所述的方法，其中对接剂和捕获剂是受体-配体对的成员。

39.根据权利要求38所述的方法，其中对接剂是生物素并且捕获剂是抗生物素蛋白；或对接剂是抗生物素蛋白并且捕获剂是生物素。

40.根据权利要求39所述的方法，其中抗生物素蛋白是链霉抗生物素蛋白或聚链霉抗生物素蛋白。

41.根据权利要求35-40的任一项所述的方法，其中C1-INH结合剂是结合C1-INH的抗体。

42.根据权利要求35-41的任一项所述的方法，其中可检测标签选自由以下组成的组中：铕、胶体金、藻红蛋白、荧光素、若丹明、绿色荧光蛋白、量子点和生色团。

43.根据权利要求42所述的方法，其中可检测标签是铕。

44.根据权利要求42所述的方法，其中可检测标签是胶体金。

45.根据权利要求35-44的任一项所述的方法，其中可检测标签附着至乳胶颗粒。

46.根据权利要求35-45的任一项所述的方法，其中fC1-INH结合剂是因子XII(FXIIa)的活性形式，其缀合至生物素，其中C1-INH结合剂是结合C1-INH的抗体，所述抗体缀合至可检测标签，和其中捕获剂是链霉抗生物素蛋白。

47.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(i)通过以下进行：(a)将样品与fC1-INH结合剂孵育至少5分钟以形成第一复合物，(b)将第一复合物与C1-INH结合剂接触以形成第二复合物，和(c)将第二复合物与捕获剂接触以形成复合物，和其中捕获剂固定在支撑构件上。

48.根据权利要求35-47的任一项所述的方法，其中样品是从受试者获得的生物样品。

49.根据权利要求48所述的方法，其中生物样品是血清样品、血浆样品或血液样品。

50.根据权利要求48或权利要求49所述的方法，其中受试者是怀疑患有fC1-INH缺陷-介导的紊乱或处于fC1-INH缺陷-介导的紊乱的风险的人患者。

51.根据权利要求50所述的方法，其中fC1-INH缺陷-介导的紊乱选自由以下组成的组中：遗传性血管性水肿(HAE)、获得性血管性水肿(AAE)和C1-INH相关的免疫疾病。

52.根据权利要求51所述的方法，其中受试者具有HAE的症状。

53.根据权利要求51或52所述的方法，其中HAE是I型HAE或II型HAE。

54.根据权利要求48-53的任一项所述的方法，其中受试者对抗组胺疗法、皮质激素疗法或二者是抗性的。

55.根据权利要求50所述的方法，其中受试者不具有HAE的症状、不具有HAE的症状的病史，或没有HAE的病史。