CN114340737A - 激活性抗gal9结合分子 - Google Patents

Abstract

本发明公开抗GAL9抗体构建体、包含该构建体的药物组合物及其使用方法。

Description

激活性抗GAL9结合分子

1.相关申请的交叉引用

依据U.S.C.§119(e)，本申请要求2020年1月22日提交的在先共同待决的美国临时专利申请No.62/964,487，2019年9月13日提交的美国临时专利申请No.62/900,105和2019年5月31日提交的美国临时专利申请No.62/855,590的权益。

2.序列表

本申请含有通过EFS-Web提交的序列表，通过引用将其整体并入本文中。所述创建于2020年4月9日的ASCII拷贝命名为42700WO_CRF_sequencelisting.txt，大小为389,339字节。

3.背景技术

免疫疗法在治疗癌症方面具有巨大的潜力。然而，肿瘤可以变得对免疫疗法具有抗性，例如通过将免疫抑制细胞或信号传导分子募集到肿瘤微环境中或通过征用免疫检查点信号传导途径。

半乳糖凝集素-9(GAL9)是S-型凝集素β-半乳糖苷结合蛋白，其N-和C-末端碳水化合物结合结构域通过接头肽连接。GAL9参与调节细胞-细胞和细胞-基质相互作用。已经显示GAL9结合可溶性PD-L2，并且已经表明PD-L2的至少一些免疫作用是通过多聚PD-L2与GAL9的结合而不是通过PD-1介导的(WO 2016/008005，通过引用将其整体并入本文中)。然而，GAL9和PD-L2影响免疫效应子功能的机制尚未得到完全表征。

仍然需要可增强免疫效应子功能并减少免疫抑制性或T细胞耗竭途径的治疗剂。此类治疗剂可用于改善癌症免疫治疗。

4.发明概述

在第一个方面中，本公开提供了半乳糖凝集素-9(GAL9)抗原结合分子，其包含对第一GAL9抗原的第一表位具有特异性的第一抗原结合位点(ABS)，其中第一抗原结合位点包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一个ABS克隆的所有三个VH CDR。

在第二个方面中，本公开提供了半乳糖凝集素-9(GAL9)抗原结合分子，其包含对第一GAL9抗原的第一表位具有特异性的第一抗原结合位点，其中第一抗原结合位点包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一个ABS克隆的所有三个VL CDR。

在第三个方面中，本公开提供了半乳糖凝集素-9(GAL9)抗原结合分子，其包含对第一GAL9抗原的第一表位具有特异性的第一抗原结合位点，其中第一抗原结合位点包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一个ABS克隆的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在第四个方面中，本公开提供了一种半乳糖凝集素-9(GAL9)抗原结合分子，其包含对第一GAL9抗原的第一表位具有特异性的第一抗原结合位点，其包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一个ABS克隆的VL序列和VH序列。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子包含含有VH序列的完整免疫球蛋白重链“IgG1”序列和含有VL序列的完整免疫球蛋白轻链序列，其中VH序列和VL序列来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子包含含有VH序列的完整免疫球蛋白重链“IgG4”序列和含有VL序列的完整免疫球蛋白轻链序列，其中VH序列和VL序列来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子包含含有VH序列的完整免疫球蛋白重链“IgG3”序列和含有VL序列的完整免疫球蛋白轻链序列，其中VH序列和VL序列来自选自P9-02B，P9-04，P9-05，P9-08，P9-09，P9-10，P9-15，P9-16，P9-18，P9-19，P9-20，P9-21，P9-22，P9-27，P9-28，P9-31，P9-32，P9-36，P9-39，P9-49，P9-54和P9-58的任一ABS克隆。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子可包含是人GAL9抗原的GAL9抗原。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子可以进一步包含第二抗原结合位点。

在某些实施方案中，第二抗原结合位点对GAL9抗原具有特异性。在其他实施方案中，第二抗原结合位点与第一抗原结合位点相同。

在其它实施方案中，第二抗原结合位点对第一GAL9抗原的第二表位具有特异性。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的另一个ABS克隆的所有三个VH CDR、所有三个VL CDR或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点包含来自另一个ABS克隆的VL序列和VH序列。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点包含含有VH序列的完整免疫球蛋白重链序列和含有VL序列的完整免疫球蛋白轻链序列，所述VH序列和VL序列来自另一个ABS克隆。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点对第一GAL9抗原以外的抗原具有特异性。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS的所有三个VH CDR、所有三个VL CDR或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自选自P9-18、P9-15、P9-21和P9-28的任一ABS克隆的所有三个VH CDR、所有三个VL CDR或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-15的所有三个VHCDR、所有三个VL CDR或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-18的所有三个VHCDR、所有三个VL CDR或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-21的所有三个VHCDR、所有三个VL CDR或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-22的所有三个VHCDR、所有三个VL CDR或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-28的所有三个VHCDR、所有三个VL CDR或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子包含选自以下的抗体形式：全长抗体、Fab片段、F(ab)’2片段、Fv、scFv、tandcFv、Diabody、scDiabody、DART、单链VHH骆源抗体、tandAb、微型抗体和B-体(B-body)。B-体描述于美国授权前公开号US 2018/0118811中，将其通过引用整体并入本文中。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子增加由激活的免疫细胞分泌的TNF-α，其中相对于用对照剂处理的激活的免疫细胞，所述增加为大于20、30、40、50、60、70或80倍的增加。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子增加由激活的免疫细胞分泌的IFN-γ，其中相对于用对照剂处理的激活的免疫细胞，所述增加为大于1.2倍的增加。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子增加激活的CD8+T细胞的CD40L表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，所述增加为大于2倍的增加。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子增加激活的CD8+T细胞的OX40表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，所述增加为大于2倍的增加。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子增加激活的树突细胞(DC)的IL-12产生，其中相对于用对照剂处理的激活的DC，所述增加为大于20倍的增加。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子增加激活的树突细胞(DC)上的PD-L2表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的DC，所述增加为大于4倍的增加。

在一些实施方案中，对照剂是阴性对照剂或阳性对照剂。

在一些实施方案中，对照剂是对照抗体。

在一些实施方案中，对照抗体选自：ECA 42克隆抗GAL9抗体、RG9.1克隆抗GAL9抗体、RG9.35克隆抗GAL9抗体、抗PD1抗体和非GAL9结合性同种型对照抗体。

在一些实施方案中，激活的免疫细胞、激活的CD8+T细胞或激活的DC，是通过肽刺激(例如通过已知诱导免疫应答的一种肽或多种肽)而被激活的。

在第五个方面中，本公开提供，GAL9抗原结合分子增加激活的免疫细胞的TNF-α分泌，其中相对于用对照剂处理的激活的免疫细胞，所述增加为大于80倍的增加。

在第六个方面中，本公开提供，GAL9抗原结合分子增加激活的免疫细胞的IFN-γ分泌，其中相对于用对照剂处理的激活的免疫细胞，所述增加为大于1.2倍的增加。

在第七个方面中，本公开提供，GAL9抗原结合分子增加激活的CD8+T细胞的CD40L表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，所述增加为大于2倍的增加。

在第八个方面中，本公开提供，GAL9抗原结合分子增加激活的CD8+T细胞的OX40表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，所述增加为大于2倍的增加。

在第九个方面中，本公开提供，GAL9抗原结合分子增加激活的树突细胞(DC)的IL-12产生，其中相对于用对照剂处理的激活的DC，所述增加为大于20倍的增加。

在第十个方面中，本公开提供，GAL9抗原结合分子增加激活的树突细胞(DC)上的PD-L2表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的DC，所述增加为大于4倍的增加。

在第十一个方面中，本公开提供GAL9抗原结合分子展示一种或多种以下性质：A)增加激活的免疫细胞的TNF-α分泌，其中相对于用对照剂处理的激活的免疫细胞，所述增加为大于80倍的增加；B)增加激活的免疫细胞的IFN-γ分泌，其中相对于用对照剂处理的激活的免疫细胞，所述增加为大于1.2倍的增加；C)增加激活的CD8+T细胞的CD40L表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，所述增加为大于2倍的增加；D)增加激活的CD8+T细胞的OX40表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，所述增加为大于2倍的增加；E)增加激活的树突细胞(DCs)的IL-12产生，其中相对于用对照剂处理的激活的DCs，所述增加为大于20倍的增加；F)增加激活的树突细胞(DCs)上的PD-L2表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的DCs，所述增加为大于4倍的增加。

在一些实施方案中，对照剂是阴性对照剂或阳性对照剂。

在一些实施方案中，对照剂是对照抗体。

在一些实施方案中，对照抗体选自：ECA 42克隆抗GAL9抗体、RG9.1克隆抗GAL9抗体、RG9.35克隆抗GAL9抗体、抗PD1抗体和非GAL9结合性同种型对照抗体。

在一些实施方案中，激活的免疫细胞、激活的CD8+T细胞或激活的DC，是通过肽刺激(例如通过已知诱导免疫应答的一种肽或多种肽)而激活的。

在一些实施方案中，本文提供的第五至第十一方面的GAL9抗原结合分子，包含对第一GAL9抗原的第一表位具有特异性的第一抗原结合位点，其中第一抗原结合位点包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，VL序列和VH序列来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子包含含有VH序列的完整免疫球蛋白重链序列和含有VL序列的完整免疫球蛋白重链序列，其中所述VH序列和VL序列来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆。

在一些实施方案中，GAL9抗原是人GAL9抗原。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子进一步包含第二抗原结合位点。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点对GAL9抗原具有特异性。

权利要求48的GAL9抗原结合分子，其中第二抗原结合位点与第一抗原结合位点相同。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点对第一GAL9抗原的第二表位具有特异性。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的另一个ABS克隆的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点包含来自另一个ABS克隆的VL序列和VH序列。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点包含来自另一个ABS克隆的、含有VH序列的完整免疫球蛋白重链序列和含有VL序列的完整免疫球蛋白轻链序列。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点对第一GAL9抗原以外的抗原具有特异性。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自选自P9-10、P9-15、P9-18、P9-21、P9-22和P9-28的任一ABS克隆的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自选自P9-10、P9-15、P9-18、P9-21、P9-22和P9-28的任一ABS克隆的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-15的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-18的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-21的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-22的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-28的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子包含选自全长抗体、Fab片段、Fv、scFv、串联scFv、Diabody、scDiabody、DART、tandAb、微型抗体和B-体的抗体形式。

在第十二个方面中，本公开提供了一种GAL9抗原结合分子，其与之前任一项权利要求的GAL9抗原结合分子结合相同的表位。

在第十三个方面中，本公开提供了一种GAL9抗原结合分子，其与之前任一项权利要求的GAL9抗原结合分子竞争结合。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子是纯化的。

在第十四个方面中，本公开提供了一种药物组合物，其包含之前任一项权利要求的GAL9抗原结合分子和药学上可接受的稀释剂。

在第十五个方面中，本公开提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文提供的药物组合物施用于受试者。

在一些实施方案中，癌症选自：胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、黑素瘤、尤文肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、B-ALL、血液癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌和子宫癌。

在一些实施方案中，癌症选自：乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌、血液和淋巴系统的癌症(包括霍奇金病、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和瓦尔登斯特伦氏病)、皮肤癌(包括恶性黑素瘤)、消化道的癌症(包括头颈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、结肠和直肠癌、肛门癌)、生殖和泌尿系统的癌症(包括肾癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌)、女性癌症(包括乳腺癌、卵巢癌、妇科癌症和绒毛膜癌)以及脑、骨类癌、鼻咽、腹膜后、甲状腺和软组织肿瘤。

在一些实施方案中，癌症是由癌症病毒引起的病毒诱发的肿瘤。在一些实施方案中，癌症病毒是Epstein-Barr病毒(EBV)、乙肝病毒、丙肝病毒、人乳头瘤病毒、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KHSV)、Merkel细胞多瘤病毒或巨细胞病毒。

5.附图简述

图1显示了在结肠癌肿瘤模型中施用免疫激活性抗-GAL9(α-GAL9)抗体的结果。BALB/c小鼠皮下植入CT26肿瘤系细胞，并用对照大鼠IgG或抗-GAL9抗体P9-18或P9-21治疗。所有治疗是在第7、11、15和19天腹膜内(I.P.)给药200μg。n＝10只/组。通过测量肿瘤体积来评估肿瘤生长。与用对照IgG治疗相比，用P9-18和P9-21治疗的小鼠显示出植入的CT26肿瘤的生长减少。

图2显示了在黑素瘤肿瘤模型中施用免疫激活性抗-GAL9抗体的结果。C57BL/6小鼠皮下植入B16.F0肿瘤系细胞，并用对照IgG或α-GAL9抗体P9-18或P9-21治疗。所有治疗是在第7、11、15和19天腹膜内(I.P.)给药200μg。n＝10只/组。通过测量肿瘤体积来评估肿瘤生长。与用对照IgG处理相比，用P9-18和P9-21治疗的小鼠显示出植入的B16.F0肿瘤的生长减少。

图3A和3B显示，用各种GAL9抗体候选物、已知的比较工具抗体(Tool mAb)、抗-PD-1抗体、对照抗体(IgG Ctrl)和溶媒对照(PBS Ctrl)体外刺激的激活的PBMC的INF-γ(3A)和TNF-α(3B)分泌。黑色菱形形状显示由比较工具mAb和抗PD-1抗体(阳性对照)刺激的激活的PBMC的分泌。

图4显示，用各种GAL9抗体候选物或IgG对照抗体体外刺激的激活的CD8⁺T细胞，其表面上的免疫刺激标志物CD 27、CD40L、ICOS、4-1BB和OX40的水平。

图5显示，定量由对照IgG或α-GAL9候选物P9-18连同染色对照体外刺激的DC产生的IL-12的代表性流式细胞图。

图6A和6B显示，用对照抗体P9-55(克隆55)、抗-GAL9候选抗体P9-15(克隆15)或α-GAL9候选抗体P9-18(克隆18)以5μg(图6A)或20μg(图6B)的剂量刺激72小时后，CD56⁺NK细胞分泌TNF-α的代表性流式细胞图。

图7A-7E显示，通过应用于本文提供的P9-28抗-GAL9候选抗体上，举例说明Martin编号方案以及各种CDR定义——Chothia、AbM、Kabat、Contact、IMGT。图7A-7E按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:187和188。

图8A-8C显示了代表性的共聚焦显微图像，展示了用IgG对照(图8A)、P9-18(图8B)和P9-21(图8C)处理后，DC上GAL9和PD-L2的共定位和簇集。蓝色染色显示DNA(DAPI)，红色染色显示PD-L2，绿色染色显示CD11c，黄色染色显示GAL9。未标记的显微图像是明视场；在附图中以灰度呈现。

图9A和9B显示了代表性的共聚焦图像，展示了与IgG对照(图9A)相比，用抗-GAL9P9-18(图9B)处理后，CT26肿瘤细胞表面上PD-L2和PD-L1的保留。图像中的斑点突显出PD-L2和PD-L1配体的表达增加。蓝色染色显示DNA(DAPI)，红色染色显示PD-L2，绿色染色显示PD-L1；在附图中以灰度呈现。

图10A-E显示，来自用抗-GAL9 P9-15治疗的EBV感染的人源化小鼠模型的代表性数据。图10A显示了具有治疗时间线的方案示意图。图10B显示了来自用IgG对照和P9-15治疗的小鼠的脾脏的图像。箭头指向IgG对照小鼠中不受控制的肿瘤生长。图10C显示了脾脏重量的柱状图。图10D显示了每个脾脏的细胞数量的柱状图。图10E显示了脾脏病毒载量的柱状图。

图11显示，来自用抗-GAL9 P9-28处理的EBV感染的人源化小鼠模型的代表性数据。图10A显示了具有治疗时间线的方案示意图。图11显示了来自IgG对照和抗-GAL9 P9-28治疗的小鼠的脾脏的图像。箭头指向IgG对照治疗的小鼠中不受控制的肿瘤生长。

图12A显示，使用P9-18-IgG1(菱形-◇-)、sFc-P9-18-IgG2a(倒三角形-▽-)、P9-18 IgG2a(圆形-○-)和IgG(IgG2a)对照#1(黑色方块-■-)的CT26肿瘤模型中肿瘤生长的体内评估。

图12B显示，在使用sFc-P9-18 IgG2a(倒三角形-▽-)、P9-18 IgG2a(圆形-○-)和IgG(IgG2a)对照#2(黑色菱形-◆-)的之前治疗的CT 26肿瘤中免疫记忆的体内评估。

图13显示，用抗-GAL9 P9-18或对照治疗后，PD-L1⁺或PD-L2⁺肿瘤相关树突细胞(CD11c⁺)的平均百分比和肿瘤相关树突细胞(CD11c⁺)上PD-L1或PD-L2的平均细胞表面表达(GMI)的柱状图。

图14显示，用抗-GAL9 P9-18或IgG对照治疗后，PD-L1⁺或PD-L2⁺肿瘤细胞的平均百分比和肿瘤细胞上PD-L1或PD-L2的平均细胞表面表达水平(GMI)的柱状图。

6.发明详述

6.1.定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如本文所用，以下术语具有以下含义。

“抗原结合位点”或“ABS”是指特异性识别或结合给定抗原或表位的GAL9结合分子的区域。

如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”以其最广泛接受的临床意义使用。该术语包括但不限于减轻疾病的体征或症状；改善疾病的体征或症状；缓解症状；减轻疾病的程度；稳定(即，不恶化)疾病状态；延迟或减缓疾病进展；改善或减轻疾病状态；缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的；治愈；与如果不接受治疗的预期存活相比，延长存活。除非另有明确说明，否则“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”不意指预防或防止疾病。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指，需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农场动物，和动物园动物、运动或宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。除非另有说明，否则“患者”意指人“受试者”。

术语“足够量”是指足以产生所需效果的量，例如足以调节细胞中蛋白质聚集的量。

术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。

术语“预防有效量”是有效预防疾病症状的量。

6.2.其他解释

除非另有说明，否则本文所有提及的序列都是指氨基酸序列。

除非另有说明，否则抗体恒定区残基编号是根据www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs(2017年8月22日访问)所述的Eu索引，将其整体通过引用并入本文，并且残基编号根据残基在内源性恒定区序列中的位置来确定残基，而不管残基在本文所述的GAL9结合分子的链内的物理位置如何。

除非另有说明为“Kabat CDR”、“Chothia CDR”、“Contact CDR”或“IMGT CDR”，否则所有提及的“CDR”是指使用Martin(AbM)定义来定义的CDR。

“内源性序列”或“天然序列”是指任何序列，包括核酸和氨基酸序列，其源自生物体、组织或细胞，并且未经人工修饰或突变。

多肽链编号(例如，“第一”多肽链、“第二”多肽链等，或多肽“链1”、“链2”等)在本文中用作形成结合分子的特定多肽链的独特标识符，但并不旨在指这些不同多肽链在结合分子内的顺序或数量。

在本公开中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”、“具有(having)”、“包括(includes)”、“包括(including)”及其语言变体，具有美国专利法中赋予它们的含义，允许存在除明确列举的那些组分之外的其它组分。

如本文所用，单数格式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文另有明确说明。除非另有具体说明，否则术语“包括”、“诸如”等旨在指包括而非限制。

本文提供的范围应理解为该范围内所有值的简写，包括所述端点。例如，1至50的范围应理解为包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的任何数字、数字的组合或子范围。

除非特别说明或从上下文显见，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常容许范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。“约”可理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。

6.3.总体概述

本发明提供了半乳糖凝集素-9(GAL9)抗原结合分子，如抗-GAL9抗体及其抗原结合片段；包含GAL9结合分子的组合物；以及包含GAL9结合分子的药物组合物。本公开特别提供了各种GAL9抗原结合分子，其是刺激性的，充当免疫系统的激活剂，增加多种免疫细胞中多种细胞因子的分泌和产生，并增加刺激性分子的表面表达。

本公开还提供了通过施用免疫刺激性半乳糖凝集素-9抗体结合分子来治疗受试者的疾病或病症的方法。本公开提供的方法特别适用于治疗增殖性疾病或癌症。在一些实施方案中，癌症是病毒诱发的癌症，例如由癌病毒或肿瘤病毒感染引起的癌症。在一些实施方案中，本公开提供的组合物和方法可用于治疗免疫抑制性疾病或病症，如疟疾、HIV或AIDs等。

6.4.GAL9抗原结合分子

在第一个方面中，提供了抗原结合分子。在每个实施方案中，抗原结合分子至少包括GAL9抗原特异性的第一抗原结合位点；因此，结合分子被称为GAL9抗原结合分子或GAL9结合分子。

本文所述的GAL9抗原结合分子特异性地结合GAL9抗原。

如本文所用，“GAL9抗原”是指半乳糖凝集素-9家族成员和同源物。GAL9也称为LGALS9、HUAT、LGALS9A、肿瘤抗原HOM-HD-21和ecalectin。在特定实施方案中，GAL9结合分子具有特异性结合超过一个GAL9结构域的至少一部分(如第一和第二GAL9结构域之间的连接处)的抗原结合位点。

在具体的实施方案中，GAL9抗原是人的。GenBank登录号#NP_033665.1描述了典型的人GAL9蛋白，包括其序列和结构域特征，并且将其整体通过引用并入本文。SEQ ID NO:6提供了全长GAL9蛋白序列。

MAFSGSQAPYLSPAVPFSGTIQGGLQDGLQITVNGTVLSSSGTRFAVNFQTGFSGNDIAFHFNPRFEDGGYVVCNTRQNGSWGPEERKTHMPFQKGMPFDLCFLVQSSDFKVMVNGILFVQYFHRVPFHRVDTISVNGSVQLSYISFQNPRTVPVQPAFSTVPFSQPVCFPPRPRGRRQKPPGVWPANPAPITQTVIHTVQSAPGQMFSTPAIPPMMYPHPAYPMPFITTILGGLYPSKSILLSGTVLPSAQRFHINLCSGNHIAFHLNPRFDENAVVRNTQIDNSWGSEERSLPRKMPFVRGQSFSVWILCEAHCLKVAVDGQHLFEYYHRLRNLPTINRLEVGGDIQLTHVQT[SEQ ID NO:6]

在多种实施方案中，GAL9结合分子还特异性地结合至少一种除GAL9抗原以外的抗原。

6.4.1.GAL9抗原结合分子的功能特征

在一些实施方案中，与其接触后，GAL9抗原结合分子增加激活的免疫细胞(例如激活的人免疫细胞)的细胞因子分泌。在一些实施方案中，免疫细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是效应T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8⁺T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4⁺T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是树突细胞(DC)。

可以通过任何合适的方法测定GAL9抗原结合分子对免疫细胞的细胞因子分泌的影响。例如，可以在体内、离体或体外测定GAL9抗原结合分子对免疫细胞的细胞因子分泌的影响。在一些实施方案中，与接触对照剂(例如对照抗原结合分子或溶媒对照)的激活的免疫细胞相比，测定接触GAL9抗原结合分子的激活的免疫细胞中的细胞因子分泌。可以通过肽刺激来激活免疫细胞。例如，免疫细胞可以被已知诱导免疫应答的一种肽或多种肽激活。对照剂可以是阴性对照或阳性对照。在一些实施方案中，相对于阴性对照剂或阴性对照抗原结合分子，GAL9抗原结合分子增加免疫细胞中的细胞因子分泌。在一些实施方案中，阴性对照抗原结合分子是不结合GAL9的同种型对照结合分子。在一些实施方案中，阳性对照抗体是抗PD1抗体，如纳武单抗。在一些实施方案中，阳性对照抗体是GAL9对照抗体。GAL9对照抗体可以是Gal9抗体克隆RG9.1(目录号BE0218，InVivoMab Antibodies)或RG9.35。RG9.1和RG9.35均描述于Fukushima A，Sumi T，Fukuda K，Kumagai N，Nishida T等(2008)，“Roles of GALectin-9in the development of experimental allergicconjunctivitis in mice,”Int Arch Allergy Immunol 146:36-43，将其整体通过引用并入本文。GAL9对照抗体可以是Gal9抗体克隆ECA42(目录号LS-C179449，LifeSpanBioScience)。在一些实施方案中，相对于阳性对照抗体，GAL9抗原结合分子增加免疫细胞中的细胞因子分泌。

免疫细胞的细胞因子分泌可以通过任何合适的方法来评估。仅举例来说，体外或离体免疫细胞培养模型的细胞因子分泌，可以通过分析培养的细胞上清液的细胞因子含量来评估，例如通过细胞因子珠阵列。

在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ。在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子使激活的免疫细胞中的IFN-γ分泌增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％.105％、110％、115％或120％。在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子使激活的免疫细胞中的IFN-γ分泌增加至少10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-100％、100％-105％、105％-110％、110％-115％或115％-120％。

在一些实施方案中，细胞因子是TNF-α。在一些实施方案中，与本文所述的阴性对照剂相比，GAL9抗原结合分子使激活的免疫细胞中的TNF-α分泌增加至少100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、10,00％、10,500％、11,000％、11,500％、12,000％、12,500％、13,000％、13,500％、14,000％、14,500％、15,000％、15,500％、16,000％、16,500％、17,000％、17,500％、18,000％、18,500％、19,000％、19,500％、20,000％、20,500％、30,000％、30,500％、40,000％、40,500％、50,000％、50,500％、60,000％、60,500％、70,000％、70,500％、80,000％、80,500％、90,000％或90,500％。在一些实施方案中，与本文所述的阴性对照剂相比，GAL9抗原结合分子使激活的免疫细胞中的TNF-α分泌增加至少100％-150％、150％-200％、200％-250％、250％-300％、300％-350％、350％-400％、400％-450％、500％-550％、550％-600％、600％-650％、650％-700％、700％-750％、750％-800％、800％-850％、850％-900％、900％-950％、950％-10,000％、10,000％-10,500％、10,500％-11,000％、11,000-11,500％、11,500-12,000％、12,000％-12,500％、13,000％-13,500％、13,500％-14,000％、14,000％-14,500％、14,500％-15,000％、15,000-15,500％、15,550％-16,000％、16,000％-16,500％、17,000％-17,500％、17,500％-18,000％、17,500％-18,500％、18,500％-19,000％、19,000％-19,500％、19,500％-20,000％、20,000％-20,500％、20,500％-30,000％、30,000％-30,500％、30,500％-40,000％、40,000％-40,500％、45,500％-50,000％、50,000％-50,500％、55,500％-60,000％、60,000％-60,500％、70,000％-70,500％、70,500％-80,000％、80,000％-80,500％、85,000％-90,000％或90,000％-90,500％。

在各种实施方案中，激活的免疫细胞是T细胞、CD8⁺T细胞、NK细胞、CD4⁺T细胞或树突细胞(DC)。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子增加免疫细胞(例如人免疫细胞)上一种或多种共刺激分子的表面表达。在某些实施方案中，GAL9抗原结合分子增加激活的免疫细胞中的一种或多种共刺激分子的表面表达。在特定实施方案中，免疫细胞是T细胞。在具体实施方案中，激活的免疫细胞是CD8⁺T细胞。在某些实施方案中，激活的免疫细胞是NK细胞。在某些实施方案中，激活的免疫细胞是树突细胞。

在一些实施方案中，一种或多种共刺激分子选自4-1BB、CD 27、CD40L、ICOS和OX40。在一些实施方案中，一种或多种共刺激分子选自4-1BB、CD27、CD40L和OX40。在一些实施方案中，一种或多种共刺激分子选自4-1BB、CD40L和OX40。

可以通过任何合适的方法测定GAL9抗原结合分子对一种或多种共刺激分子的表面表达的影响。例如，可以在体内、离体或体外测定GAL9抗原结合分子对一种或多种共刺激分子的表面表达的影响。

在一些实施方案中，与用对照剂处理的激活的免疫细胞相比，GAL9抗原结合分子增加激活的免疫细胞中的一种或多种共刺激分子的表面表达。本文描述了示例性对照剂。在特定实施方案中，对照剂是不结合GAL9的同种型对照结合分子。

在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，GAL9抗原结合分子增加激活的CD8+T细胞的CD40L表面表达。在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，用GAL9抗原结合分子处理的激活的CD8+T细胞表现出CD40L表面表达至少增加约0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或大于10倍。在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，用GAL9抗原结合分子处理的激活的CD8+T细胞表现出CD40L表面表达增加约0.1倍-10倍，增加约0.5倍-5倍，增加约1倍-4倍，或增加约1.5倍-2.5倍。

在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，GAL9抗原结合分子增加激活的CD8+T细胞的OX40表面表达。在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，用GAL9抗原结合分子处理的激活的CD8+T细胞表现出OX40表面表达至少增加约0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或大于10倍。在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，用GAL9抗原结合分子处理的激活的CD8+T细胞表现出OX40表面表达增加约0.1倍-10倍、增加约0.5倍-5倍或增加约1.0倍-2.0倍。

在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，GAL9抗原结合分子增加激活的CD8+T细胞的4-1BB表面表达。在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，用GAL9抗原结合分子处理的激活的CD8+T细胞表现出4-1BB表面表达至少增加约0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或大于10倍。在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，用GAL9抗原结合分子处理的激活的CD8+T细胞表现出4-1BB表面表达增加约0.1倍-10倍、增加约0.2倍-2倍或增加约0.5倍-1倍。

在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，GAL9抗原结合分子增加激活的CD8+T细胞的CD 27表面表达。在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的CD8+T细胞，用GAL9抗原结合分子处理的激活的CD8+T细胞表现出CD27表面表达约至少增加1％、增加2％、增加3％、增加4％、增加5％、增加6％、增加7％、增加8％、增加9％、增加10％、增加11％、增加12％、增加13％、增加14％、增加15％、增加16％、增加17％、增加18％、增加19％、增加20％、增加21％、增加22％、增加23％、增加24％、增加25％、增加26％、增加27％、增加28％、增加29％、增加30％、增加31％、增加32％、增加33％、增加34％、增加35％、增加36％、增加37％、增加38％、增加39％、增加40％、增加41％、增加42％、增加43％、增加44％、增加45％、增加46％、增加47％、增加48％、增加49％、增加50％、增加51％、增加52％、增加53％、增加54％、增加55％、增加56％、增加57％、增加58％、增加59％、增加60％、增加61％、增加62％、增加63％、增加64％、增加65％、增加66％、增加67％、增加68％、增加69％、增加70％、增加71％、增加72％、增加73％、增加74％、增加75％、增加76％、增加77％、增加78％、增加79％、增加80％、增加81％、增加82％、增加83％、增加84％、增加85％、增加86％、增加87％、增加88％、增加89％、增加90％、增加91％、增加92％、增加93％、增加94％、增加95％、增加96％、增加97％、增加98％、增加99％或增加100％。在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，用GAL9抗原结合分子处理的激活的CD8+T细胞表现出CD27表面表达约至少增加1％-100％、增加5％-50％、增加10％-40％，或增加约20％-30％。

在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，GAL9抗原结合分子增加激活的CD8+T细胞的ICOS表面表达。在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，用GAL9抗原结合分子处理的激活的CD8+T细胞表现出ICOS表面表达约至少增加1％、增加2％、增加3％、增加4％、增加5％、增加6％、增加7％、增加8％、增加9％、增加10％、增加11％、增加12％、增加13％、增加14％、增加15％、增加16％、增加17％、增加18％、增加19％、增加20％、增加21％、增加22％、增加23％、增加24％、增加25％、增加26％、增加27％、增加28％、增加29％、增加30％、增加31％、增加32％、增加33％、增加34％、增加35％、增加36％、增加37％、增加38％、增加39％、增加40％、增加41％、增加42％、增加43％、增加44％、增加45％、增加46％、增加47％、增加48％、增加49％、增加50％、增加51％、增加52％、增加53％、增加54％、增加55％、增加56％、增加57％、增加58％、增加59％、增加60％、增加61％、增加62％、增加63％、增加64％、增加65％、增加66％、增加67％、增加68％、增加69％、增加70％、增加71％、增加72％、增加73％、增加74％、增加75％、增加76％、增加77％、增加78％、增加79％、增加80％、增加81％、增加82％、增加83％、增加84％、增加85％、增加86％、增加87％、增加88％、增加89％、增加90％、增加91％、增加92％、增加93％、增加94％、增加95％、增加96％、增加97％、增加98％、增加99％或增加100％。在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，用GAL9抗原结合分子处理的激活的CD8+T细胞表现出ICOS表面表达约至少增加1％-100％、增加5％-50％、增加10％-40％，或增加约20％-30％。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子增加肿瘤细胞表面上PD-L1、PD-L2或PD-L1和PD-L2两者的保留。在一些实施方案中，肿瘤细胞表面上PD-L1、PD-L2或PD-L1和PD-L2两者的保留增加，通过显微镜技术(例如共聚焦显微镜)来显示。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子增加树突细胞(DC)表面上的PD-L2表达。在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子降低树突细胞(DC)表面上的PD-L1表达。在一些实施方案中，DC是激活的DC。本文描述了免疫细胞(包括DC)的激活。可以通过任何合适的方法评估DC上蛋白质(包括PD-L1和PD-L2)的表面表达。例如，可以通过例如流式细胞术，测量表现出可检测的表面PD-L1和/或PD-L2的DC的百分比。在一些实施方案中，与用对照剂处理的对照树突细胞群相比，用GAL9抗原结合分子处理的树突细胞群表现出更高百分比的细胞为表面PD-L2阳性。本文描述了示例性对照剂。在一些实施方案中，对照剂是不结合GAL9的同种型抗原结合分子。在一些实施方案中，相对于用对照剂(例如同种型对照抗原结合分子)处理的对照树突细胞群，用GAL9抗原结合分子处理的树突细胞群表现出，呈现可检测的表面PD-L2表达的DC的百分比增加约0.1倍-100倍、0.5倍-20倍、1倍-10倍或约5倍-6倍。在一些实施方案中，相对于用对照剂(例如同种型对照抗原结合分子)处理的对照树突细胞群，用GAL9抗原结合分子处理的树突细胞群表现出，呈现可检测的表面PD-L1表达的DC的百分比减少约1％-50％、减少约5％-30％或减少约10％-20％。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子增加树突细胞(DC)中PD-L2的细胞表面聚集。在一些实施方案中，DC是激活的DC。本文描述了免疫细胞(包括DC)的激活。在一些实施方案中，PD-L2的细胞表面聚集的增加是相对于用对照剂处理的DC而言的。本文描述了对照剂。在一些实施方案中，对照剂是不结合GAL9的同种型抗原结合分子。DC中PD-L2的细胞表面聚集可以通过任何合适的手段，例如共聚焦显微镜来评估。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子增加DC的IL-12产生。DC可以是激活的DC。在一些实施方案中，相对于用对照剂处理的DC，GAL9抗原结合分子增加DC中的IL-12产生。本文描述了示例性对照剂。在一些实施方案中，对照剂是不结合GAL9的同种型抗原结合分子。在一些实施方案中，与用对照剂处理的DC群相比，用GAL9抗原结合分子处理的DC群表现出，IL-12阳性DC百分比约增加0.1倍-100倍、增加10倍-75倍、增加20倍-40倍、增加25倍-35倍或增加约28倍。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子诱导GAL9和PD-L2在免疫细胞表面上的簇集。在一些实施方案中，免疫细胞可以是DC。在一些实施方案中，免疫细胞可以是NK细胞。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子降低受试者的肿瘤负荷。受试者可以是哺乳动物。哺乳动物可以是小鼠。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子阻止受试者中肿瘤的生长。肿瘤可以是例如结肠肿瘤。在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子减少肿瘤生长。在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子使肿瘤生长减少约25％、50％或超过50％。在一些实施方案中，肿瘤是黑素瘤肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤生长的减少是相对于用对照剂治疗的受试者而言的。本文描述了示例性对照剂。在一些实施方案中，对照剂是不结合GAL9的同种型抗原结合分子。

6.4.2.可变区

本文所述的GAL9结合分子具有抗体的可变区结构域氨基酸序列，包括VH和VL抗体结构域序列。所述VH和VL序列分别在下文6.4.2.1和6.4.2.2节中更详细地描述。

6.4.2.1.VH区

本文所述的GAL9结合分子中的VH氨基酸序列是抗体重链可变结构域序列。在天然的典型抗体排布中以及在本文所述的GAL9结合分子中，特定的VH氨基酸序列与特定的VL氨基酸序列缔合以形成抗原结合位点。在多种实施方案中，VH氨基酸序列是哺乳动物序列，包括人序列、合成序列、或非人哺乳动物、哺乳动物和/或合成序列的组合，如上文6.4.2.3和6.4.2.4节中进一步详细描述的。在多种实施方案中，VH氨基酸序列是天然存在的序列的突变序列。

6.4.2.2.VL区

可用于本文所述的GAL9结合分子中的VL氨基酸序列是抗体轻链可变结构域序列。在天然抗体和本文所述的抗体构建体的典型排布中，特定VL氨基酸序列与特定VH氨基酸序列缔合以形成抗原结合位点。在多种实施方案中，VL氨基酸序列是哺乳动物序列，包括人序列、合成序列、或人、非人哺乳动物、哺乳动物和/或合成序列的组合，如下文6.4.2.3和6.4.2.4节中进一步详细描述的。

在多种实施方案中，VL氨基酸序列是天然存在的序列的突变序列。在某些实施方案中，VL氨基酸序列是lambda(λ)轻链可变结构域序列。在某些实施方案中，VL氨基酸序列是kappa(κ)轻链可变结构域序列。在优选的实施方案中，VL氨基酸序列是kappa(κ)轻链可变结构域序列。

6.4.2.3.互补决定区

VH和VL氨基酸序列包含称为“互补决定区”(CDR)的高度可变序列，通常为三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。在多种实施方案中，CDR是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在优选实施方案中，CDR是人序列。在多种实施方案中，CDR是天然存在的序列。在多种实施方案中，CDR是已经突变以改变抗原结合位点对特定抗原或表位的结合亲和力的天然存在的序列。在某些实施方案中，天然存在的CDR已经通过亲和力成熟和体细胞超突变在体内宿主中突变。在某些实施方案中，CDR已经通过包括但不限于PCR诱变和化学诱变的方法在体外突变。在多种实施方案中，CDR是合成序列，包括但不限于从随机序列CDR文库和合理设计的CDR文库获得的CDR。Martin编号方案用于确定CDR边界。参见图7A-7E。

在多种实施方案中，被鉴定为结合目的抗原的CDR被进一步突变(即，“亲和力成熟”)以实现期望的结合特征，如相对于原始CDR，对目的抗原的亲和力增加。例如，可以使用简并寡核苷酸，将多样性靶向引入CDR(包括被鉴定为结合目的抗原的那些CDR)中。可以采用各种随机化方案。例如，可以使用“软随机化”(soft-randomization)，其在给定的氨基酸位置提供对野生型序列的高偏倚性，例如允许CDR中的给定位置在所有二十种氨基酸中变化，同时通过在每个密码子位置处以非均等水平掺混四个碱基而偏向野生型序列。作为软随机化的一个举例说明性实例，如果期望实现大约50％的野生型序列，则每个密码子的每个碱基保持70％的野生型而其他核苷酸各为10％，并且使用简并寡核苷酸围绕所选CDR制备聚焦噬菌体文库，其中所得噬菌体颗粒用于噬菌体淘选，所述淘选可以根据需要在各种严格选择条件下进行。

6.4.2.4.框架区和CDR移植

VH和VL氨基酸序列包含“框架区”(FR)序列。FR通常是保守序列区，其充当散布的CDR的支架(参见6.4.2.3节)，通常在FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4排列中(从N-末端到C-末端)。在多个实施方案中，FR是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在一个优选实施方案中，FR是人序列。在多个实施方案中，FR是天然存在的序列。在多个实施方案中，FR是合成序列，包括但不限于合理设计的序列。

在多个实施方案中，FR和CDR都来自相同的天然存在的可变结构域序列。在多个实施方案中，FR和CDR来自不同的可变结构域序列，其中CDR被移植到FR支架上，其中CDR提供对特定抗原的特异性。在某些实施方案中，移植的CDR全部源自相同的天然存在的可变结构域序列。在某些实施方案中，移植的CDR源自不同的可变结构域序列。在某些实施方案中，移植的CDR是合成的序列，包括但不限于从随机序列CDR文库和合理设计的CDR文库获得的CDR。在某些实施方案中，移植的CDR和FR来自相同的物种。在某些实施方案中，移植的CDR和FR来自不同的物种。在优选的移植CDR实施方案中，抗体是“人源化的”，其中移植的CDR是非人哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴和山羊序列，并且FR是人序列。人源化抗体在美国专利No.6,407,213中更详细地讨论，其教导的全部内容通过引用并入本文。在多个实施方案中，来自一个物种的FR的部分或特定序列用于替换另一物种的FR的部分或特定序列。

6.4.3.GAL9结合分子的示例性氨基酸序列

在多个实施方案中，GAL9结合分子包含特定的VH CDR3(CDR-H3)序列和特定的VLCDR3(CDR-L3)序列。

在一些实施方案中，GAL9结合分子包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆的CDR-H3和CDR-L3。这些ABS克隆的VHCDR氨基酸序列公开于表3中。这些ABS克隆的VL CDR氨基酸序列公开于表4中。为清楚起见，每个GAL9 ABS克隆被分配唯一的ABS克隆编号，其在整个本公开中使用。

在一个目前优选的实施方案中，GAL9结合分子包含ABS克隆P9-28的CDR-H3和CDR-L3。

在一些实施方案中，GAL9结合分子包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的ABS克隆之一的所有三个VH CDR。在一个优选的实施方案中，GAL9结合分子包含来自ABS克隆P9-28的所有三个VH CDR。

在一些实施方案中，GAL9结合分子包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的ABS克隆之一的所有三个VL CDR。在一个目前优选的实施方案中，GAL9结合分子包含来自ABS克隆P9-28的所有三个VL CDR。

在一些实施方案中，GAL9结合分子包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆的所有6个CDR。在一个目前优选的实施方案中，GAL9结合分子包含来自ABS克隆P9-28的所有六个CDR。

在一些实施方案中，GAL9结合分子包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆的VH氨基酸序列、VL氨基酸序列或VH和VL氨基酸序列。表6中提供了完整免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链序列以及VH和VL氨基酸序列。在某些目前优选的实施方案中，GAL9结合分子包含来自ABS克隆P9-28的VH氨基酸序列、VL氨基酸序列或VH和VL氨基酸序列。

在一些实施方案中，GAL9结合分子包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆的完整IgG重链序列和完整IgG轻链序列。在一个目前优选的实施方案中，GAL9结合分子包含来自ABS克隆P9-28的完整IgG重链序列和完整IgG轻链序列。

6.4.4.恒定区

在GAL9结合分子中，GAL9结合分子可以具有恒定区结构域序列。如本文所述，恒定区结构域氨基酸序列是抗体的恒定区结构域的序列。恒定区可以指CH1、CH2、CH3、CH4或CL恒定结构域。

在多个实施方案中，恒定区序列是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在一个优选实施方案中，恒定区序列是人序列。在某些实施方案中，恒定区序列来自抗体轻链。在特定实施方案中，恒定区序列来自λ或κ轻链。在某些实施方案中，恒定区序列来自抗体重链。在特定实施方案中，恒定区序列是IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型的抗体重链序列。在一个具体实施方案中，恒定区序列来自IgG同种型。在一个优选实施方案中，恒定区序列来自IgG1同种型。

示例性恒定区及其修饰描述于WO2018075692中，其通过引用整体并入本文。

6.4.4.1.CH1和CL区

如本文所述，参照天然抗体重链结构的N-末端到C-末端，CH1氨基酸序列是抗体重链的第二个结构域的序列。在某些实施方案中，CH1序列是内源性序列。在多个实施方案中，CH1序列是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在一个优选实施方案中，CH1序列是人序列。在某些实施方案中，CH1序列来自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型。在一个优选实施方案中，CH1序列来自IgG1同种型。在一些优选实施方案中，CH1序列是UniProt登录号P01857的氨基酸1-98。

参照天然抗体轻链结构，可用于本文所述的GAL9结合分子中的CL氨基酸序列是抗体轻链恒定结构域序列。在某些实施方案中，CL序列是内源性序列。在多个实施方案中，CL序列是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在优选实施方案中，CL序列是人序列。

在某些实施方案中，CL氨基酸序列是lambda(λ)轻链恒定结构域序列。在一些具体实施方案中，CL氨基酸序列是人λ轻链恒定结构域序列。在一个优选实施方案中，λ轻链序列是UniProt登录号P0CG04的序列。

在某些实施方案中，CL氨基酸序列是kappa(κ)轻链恒定结构域序列。在一个优选实施方案中，CL氨基酸序列是人κ轻链恒定结构域序列。在一个优选实施方案中，κ轻链序列是UniProt登录号P01834的序列。

在某些实施方案中，CH1序列和CL序列都是内源性序列。在某些实施方案中，CH1序列和CL序列分开地分别包含内源性CH1和CL序列中的正交修饰，如下文6.4.4.1节中更详细讨论的。CH1和CL序列也可以是其部分，具有内源性或经修饰的序列，使得具有CH1序列或其部分的结构域可以与具有CL序列或其部分的结构域缔合。

6.4.4.2.CH1和CL的正交修饰

在某些实施方案中，CH1序列和CL序列分开地分别包含在内源性CH1和CL序列中的正交修饰。正交突变，总体地，在下文6.4.6.1-6.4.6.3节中更详细地描述。

在一些具体实施方案中，内源性CH1和CL序列中的正交修饰是选自以下的工程化二硫桥：CH1序列的138位和CL序列的116位、CH1序列的128位和CL序列的119位、或CH1序列的129位和CL序列的210位的工程化半胱氨酸，编号和讨论的更多细节参见美国专利No.8,053,562和美国专利No.9,527,927，其各自通过引用整体并入本文。在一个优选实施方案中，通过Eu索引编号，工程化半胱氨酸在CH1序列的位置128和CLκ序列的位置118。

在一系列优选实施方案中，提供非内源性半胱氨酸氨基酸的突变是CL序列中的F118C突变与CH1序列中的相应A141C，或CL序列中的F118C突变与CH1序列中的相应L128C，或CL序列中的S162C突变与CH1序列中的相应P171C突变，如通过Eu索引编号。

在多个实施方案中，CL序列和CH1序列中的正交突变是电荷对突变。在具体实施方案中，电荷对突变是CL序列中的F118S、F118A或F118V突变与CH1序列中的相应A141L，或CL序列中的T129R突变与CH1序列中的相应K147D，如通过Eu索引编号并且在Bonisch等(Protein Engineering,Design&Selection，2017，pp.1-12)中更详细地描述的，所述文献教导的全部内容通过引用并入本文。在一系列优选实施方案中，电荷对突变是CL序列中的N138K突变与CH1序列中的相应G166D，或CL序列中的N138D突变与CH1序列中的相应G166K，如通过Eu索引编号。

6.4.4.3.CH2区

在本文所述的GAL9结合分子中，GAL9结合分子可具有CH2氨基酸序列。如本文所述，参照天然抗体重链结构的N-末端至C-末端，CH2氨基酸序列是抗体重链的第三个结构域的CH2氨基酸序列。在多个实施方案中，CH2序列是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在一个优选实施方案中，CH2序列是人序列。在某些实施方案中，CH2序列来自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型。在一个优选实施方案中，CH2序列来自IgG1同种型。

在某些实施方案中，CH2序列是内源性序列。在特定实施方案中，所述序列是UniProt登录号P01857的氨基酸111-223。

在一系列实施方案中，GAL9结合分子具有一组以上的成对CH2结构域，所述CH2结构域具有CH2序列，其中第一组具有来自第一同种型的CH2氨基酸序列，和来自另一同种型的CH2氨基酸序列的一个或多个直系同源组。如本文所述，直系同源CH2氨基酸序列能够与来自共有同种型的CH2氨基酸序列相互作用，但不与GAL9结合分子中存在的来自另一同种型的CH2氨基酸序列显著相互作用。在特定实施方案中，所有组的CH2氨基酸序列都来自相同的物种。在优选实施方案中，所有组的CH2氨基酸序列都是人CH2氨基酸序列。在其他实施方案中，CH2氨基酸序列组来自不同的物种。在一个特定实施方案中，第一组CH2氨基酸序列与GAL9结合分子中的其他非CH2结构域，来自相同的同种型。在一个具体实施方案中，第一组具有来自IgG同种型的CH2氨基酸序列，并且一个或多个直系同源组具有来自IgM或IgE同种型的CH2氨基酸序列。在某些实施方案中，一组或多组CH2氨基酸序列是内源性CH2序列。在其他实施方案中，一组或多组CH2氨基酸序列是具有一个或多个突变的内源性CH2序列。在特定实施方案中，一个或多个突变是正交杵臼突变、正交电荷对突变或正交疏水突变。可用于GAL9结合分子的直系同源CH2氨基酸序列更详细地描述于国际PCT申请WO2017/011342和WO2017/106462中，其通过引用整体并入本文。

6.4.4.4.CH3区

参照从天然抗体重链结构的N-末端到C-末端，本文所述的CH3氨基酸序列是抗体重链的C-末端结构域的序列。

在多个实施方案中，CH3序列是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在一个优选实施方案中，CH3序列是人序列。在某些实施方案中，CH3序列来自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同种型，或CH4序列来自IgE或IgM同种型。在一个具体实施方案中，CH3序列来自IgG同种型。在一个优选实施方案中，CH3序列来自IgG1同种型。

在某些实施方案中，CH3序列是内源性序列。在具体实施方案中，CH3序列是UniProt登录号P01857的氨基酸224-330。在多个实施方案中，CH3序列是内源性CH3序列的区段。在具体实施方案中，CH3序列具有缺少N-末端氨基酸G224和Q225的内源性CH3序列。在特定实施方案中，CH3序列具有缺少C-末端氨基酸P328、G329和K330的内源性CH3序列。在特定实施方案中，CH3序列具有缺少N-末端氨基酸G224和Q225以及C-末端氨基酸P328、G329和K330的内源性CH3序列。在优选实施方案中，GAL9结合分子具有多个具有CH3序列的结构域，其中CH3序列可以指完整的内源性CH3序列以及缺少N-末端氨基酸、C-末端氨基酸或两者的CH3序列。

在某些实施方案中，CH3序列是具有一个或多个突变的内源性序列。在特定实施方案中，突变是一个或多个正交突变，其被引入内源性CH3序列中以引导特定CH3序列的特异性配对，如下文6.4.6.1-6.4.6.3节中更详细描述的。

在某些实施方案中，通过将一种同种异型的特定氨基酸替换为另一种同种异型的特定氨基酸(在本文中称为异同种异型突变(isoallotype mutation))，来工程化改造CH3序列以降低抗体的免疫原性，如Stickler等(Genes Immun.2011Apr；12(3)：213-221)中更详细描述的，所述文献的全部教导通过引用并入本文。在特定实施方案中，G1m1同种异型的特定氨基酸被替换。在优选实施方案中，在CH3序列中形成异同种异型突变D356E和L358M。

在一些实施方案中，IgG1 CH3氨基酸序列包含以下突变变化：P343V；Y349C；和三肽插入，445P、446G、447K。在其他优选实施方案中，结构域B具有带有以下突变变化的人IgG1 CH3序列：T366K；和三肽插入，445K、446S、447C。在其他优选实施方案中，结构域B具有带有以下突变变化的人IgG1 CH3序列：Y349C；和三肽插入，445P、446G、447K。

在一些实施方案中，IgG1 CH3氨基酸序列包含并入到内源性CH3序列中的447C突变。

6.4.5.抗原结合位点

在一些实施方案中，VL或VH氨基酸序列和关联VL或VH氨基酸序列缔合并形成第一抗原结合位点(ABS)。抗原结合位点(ABS)能够特异性结合抗原的表位。ABS的抗原结合在下文6.4.5.1节中更详细地描述。

在可替换的实施方案中，例如其中GAL9结合分子是单结构域抗体时，VH或VL氨基酸序列形成第一ABS。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子包含第二ABS。在一些实施方案中，第二ABS与第一ABS，对相同的GAL9抗原具有特异性。在一些实施方案中，第二ABS与第一ABS特异性地结合相同GAL9抗原的相同表位。在一些实施方案中，第二ABS与第一ABS相同。

在一些实施方案中，第二ABS对第一GAL9抗原的不同表位具有特异性。例如，如果第一ABS包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆的CDR或可变结构域，则第二ABS可包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的另一ABS克隆的CDR或可变结构域。

在一些实施方案中，GAL9抗原结合分子是多特异性的，例如，GAL9抗原结合分子的第二ABS特异性地结合的抗原，与第一ABS特异性结合的GAL9抗原不同。

6.4.5.1.通过ABS结合抗原

ABS和包含这种ABS的GAL9结合分子被认为“识别”ABS特异性结合的表位(或更一般地，抗原)，并且该表位(或更一般地，抗原)被认为是ABS的“识别特异性”或“结合特异性”。

ABS被认为以特定亲和力结合其特异性抗原或表位。如本文所述，“亲和力”是指一个分子与另一个分子之间的非共价分子间力相互作用的强度。亲和力(affinity)，即相互作用的强度，可以表示为解离平衡常数(K_D)，其中较低的K_D值指示分子之间较强的相互作用。抗体构建体的K_D值通过本领域熟知的方法测量，包括但不限于生物层干涉测量法(例如，

)、表面等离子体共振(SPR)技术(例如，

)和细胞结合测定法。出于本文的目的，亲和力是使用

通过生物层干涉测量法测量的解离平衡常数。

如本文所用，“特异性结合”是指ABS与其关联抗原或表位之间的亲和力，其中K_D值低于10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M。

本文所述的GAL9结合分子中ABS的数目定义了GAL9结合分子的“价”。具有单个ABS的GAL9结合分子是“单价的”。具有多个ABS的GAL9结合分子被称为“多价的”。具有两个ABS的多价GAL9结合分子是“二价的”，具有三个ABS的多价GAL9结合分子是“三价的”，具有四个ABS的多价GAL9结合分子是“四价的”。

在多个多价实施方案中，所述多个ABS均具有相同的识别特异性。这种GAL9结合分子是“单特异性的”、“多价”结合构建体。在其他多价实施方案中，所述多个ABS中的至少两个具有不同的识别特异性。这样的GAL9结合分子是多价且“多特异性的”。在其中ABS总共具有两种识别特异性的多价实施方案中，GAL9结合分子是“双特异性的”。在其中ABS总共具有三种识别特异性的多价实施方案中，GAL9结合分子是“三特异性的”。

在其中ABS总共对同一抗原上存在的多个不同表位具有多种识别特异性的多价实施方案中，GAL9结合分子是“多互补位的”。其中ABS总共识别同一抗原上的两个表位的多价实施方案，是“双互补位的”。

在多个多价实施方案中，GAL9结合分子的多价性提高了GAL9结合分子对特定靶标的亲合力(avidity)。如本文所述，“亲合力”是指两个或更多个分子之间的相互作用的总强度，例如，针对特定靶标的多价GAL9结合分子，其中亲合力是由多个ABS的亲和力提供的相互作用的累积强度。亲合力可以通过与用于确定亲和力的那些方法相同的方法来测量，如上所述。在某些实施方案中，GAL9结合分子对特定靶标的亲合力，使得相互作用是特异性结合相互作用，其中两个分子之间的亲合力具有低于10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M的K_D值。在某些实施方案中，GAL9结合分子对特定靶标的亲合力具有这样的K_D值，其使得相互作用是特异性结合相互作用，其中单个ABS的一个或多个亲和力不具有使其与相应的抗原或表位特异性结合的K_D值。在某些实施方案中，亲合力是由多个ABS针对共有的特异性靶标或复合物上的分开抗原(如在单个细胞上存在的多个分开抗原)的亲和力提供的相互作用的累积强度。在某些实施方案中，亲合力是由多个ABS针对共有的单个抗原上的多个分开表位的亲和力提供的相互作用的累积强度。

6.4.6.正交修饰

在本文所述的GAL9结合分子中，GAL9结合分子可具有包含正交修饰的恒定区结构域。恒定区结构域氨基酸序列更详细地描述于上文6.4.4节中。

如本文所述的“正交修饰”或其同义词“正交突变”，是抗体结构域的氨基酸序列中的一个或多个工程化突变，其增加具有正交修饰的第一结构域对具有互补正交修饰的第二结构域的结合亲和力。在某些实施方案中，正交修饰降低具有正交修饰的结构域对缺乏互补正交修饰的结构域的亲和力。在某些实施方案中，正交修饰是内源性抗体结构域序列中的突变。在多个实施方案中，正交修饰是内源性抗体结构域序列的N-末端或C-末端的修饰，包括但不限于氨基酸添加或缺失。在特定实施方案中，正交修饰包括但不限于工程化的二硫桥、杵臼突变和电荷对突变，如下文6.4.6.1-6.4.6.3节中更详细地描述。在特定实施方案中，正交修饰包括，选自但不限于，工程化二硫桥、杵臼突变和电荷对突变的正交修饰的组合。在特定实施方案中，正交修饰可以与降低免疫原性的氨基酸取代组合，如异同种异型突变，如上文6.4.4.4节更详细描述的。

6.4.6.1.正交工程化二硫桥

在多个实施方案中，正交修饰包括在第一和第二结构域之间产生工程化二硫桥的突变。如本文所述，“工程化二硫桥”是在两个或更多个结构域中提供非内源性半胱氨酸的氨基酸突变，使得当这两个或更多个结构域缔合时形成非天然二硫键。Merchant等(NatureBiotech(1998)16：677-681)中更详细地描述了工程化二硫桥，其教导的全部内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，工程化二硫桥改善特定结构域之间的正交缔合。在特定实施方案中，产生工程化二硫桥的突变是，第一或第二CH3结构域之一中的K392C突变和另一个CH3结构域中的D399C。在一个优选实施方案中，产生工程化二硫桥的突变是，第一或第二CH3结构域之一中的S354C突变和另一个CH3结构域中的Y349C。在另一个优选实施方案中，产生工程化二硫桥的突变是，在第一和第二CH3结构域两者中的447C突变，其通过延伸CH3结构域的C-末端以并入KSC三肽序列来提供。

6.4.6.2.正交杵臼突变

在多个实施方案中，正交修饰包括杵臼(knob-hole)(同义地，杵进臼)突变。如本文所述，杵臼突变是改变第一结构域表面的空间特征的突变，由此相对于与没有互补空间突变的结构域的缔合，该第一结构域将优先与具有互补空间突变的第二结构域缔合。杵-臼突变更详细地描述于美国专利No.5,821,333和美国专利No.8,216,805中，其各自以其整体并入本文中。在多个实施方案中，杵-臼突变与工程化二硫桥结合，如Merchant等(NatureBiotech(1998)16：677-681)中更详细描述的，其全部内容通过引用并入本文中。在多个实施方案中，组合杵臼突变、异同种异型突变和工程化二硫桥突变。

在某些实施方案中，杵臼突变是第一结构域中的T366Y突变和第二结构域中的Y407T突变。在某些实施方案中，杵臼突变是第一结构域中的F405A和第二结构域中的T394W。在某些实施方案中，杵臼突变是第一结构域中的T366Y突变和F405A，以及第二结构域中的T394W和Y407T。在某些实施方案中，杵臼突变是第一结构域中的T366W突变和第二结构域中的Y407A。在某些实施方案中，组合的杵臼突变和工程化二硫化物突变是，第一结构域中的S354C和T366W突变，以及第二结构域中的Y349C、T366S、L368A和Y407V突变。在优选实施方案中，组合的杵臼突变、异同种异型突变和工程化二硫化物突变是，第一结构域中的S354C和T366W突变，以及第二结构域中的Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V突变。

6.4.6.3.正交电荷对突变

在多个实施方案中，正交修饰是电荷对突变。如本文所用，电荷对突变是影响结构域表面的氨基酸电荷的突变，由此相对于与没有互补电荷对突变的结构域的缔合，该结构域将优先与具有互补电荷对突变的第二结构域缔合。在某些实施方案中，电荷对突变提高特定结构域之间的正交缔合。电荷对突变更详细地描述于美国专利No.8,592,562、美国专利No.9,248,182和美国专利No.9,358,286中，其全部教导各自通过引用并入本文中。在某些实施方案中，电荷对突变提高特定结构域之间的稳定性。在优选实施方案中，电荷对突变是第一结构域中的T366K突变和另一结构域中的L351D突变。

在一些具体实施方案中，正交突变是VH/VL界面处的电荷对突变。在优选实施方案中，VH/VL界面处的电荷对突变是VH中的Q39E与VL中相应的Q38K，或VH中的Q39K与VL中相应的Q38E，如Igawa等(Protein Eng.Des.Sel.，2010，第23卷，667-677)中更详细描述的，其教导的全部内容通过引用并入本文中。

6.4.7.三价和四价GAL9结合分子

在另一系列实施方案中，GAL9结合分子具有三个抗原结合位点，因此被称为“三价”。在多个实施方案中，GAL9结合分子具有4个抗原结合位点，因此被称为“四价”。

6.5.GAL9结合分子结构

本文所述的抗原结合位点，包括特定CDR亚组，可以形成任何结合分子结构，包括但不限于全长抗体、Fab片段、Fv、scFv、串联scFv、Diabody、scDiabody、DART、tandAb、微型抗体、骆驼科VHH和本领域技术人员已知的其它抗体片段或形式。示例性抗体和抗体片段形式，详细描述于Brinkmann等(MABS，2017，第9卷，第2期，182-212)中，其教导的全部内容通过引用并入本文中。本文所述的抗原结合位点，包括特定CDR亚组，也可以被格式化为“B-体”形式，如在美国授权前公开号US 2018/0118811和国际申请公开号WO2018/075692中更详细地描述的，其各自通过引用整体并入本文中。

6.6.其他修饰

在另一系列实施方案中，GAL9结合分子具有另外的修饰。

6.6.1.抗体-药物缀合物

在多个实施方案中，GAL9结合分子与治疗剂(即药物)缀合以形成GAL9结合分子-药物缀合物。治疗剂包括但不限于，化学治疗剂、成像剂(例如放射性同位素)、免疫调节剂(例如，细胞因子、趋化因子或检查点抑制剂)和毒素(例如，细胞毒性剂)。在某些实施方案中，治疗剂通过接头肽与GAL9结合分子连接，如下文6.6.3节中更详细讨论的。

制备适于将药物缀合至本文公开的GAL9结合分子的抗体-药物缀合物(ADC)的方法，描述于，例如，美国专利号8,624,003(pot法)、美国专利号8,163,888(一步)、美国专利号5,208,020(两步法)、美国专利号8,337,856、美国专利号5,773,001、美国专利号7,829,531、美国专利号5,208,020、美国专利号7,745,394、WO 2017/136623、WO 2017/015502、WO2017/015496、WO 2017/015495、WO 2004/010957、WO 2005/077090、WO 2005/082023、WO2006/065533、WO 2007/030642、WO 2007/103288、WO 2013/173337、WO 2015/057699、WO2015/095755、WO 2015/123679、WO 2015/157286、WO 2017/165851、WO 2009/073445、WO2010/068759、WO 2010/138719、WO 2012/171020、WO 2014/008375、WO 2014/093394、WO2014/093640、WO 2014/160360、WO 2015/054659、WO 2015/195925、WO 2017/160754、Storz(MAbs.2015年11月-12月；7(6)：989-1009)、Lambert等(Adv Ther，201734:1015)、Diamantis等(British Journal of Cancer，2016，114，362-367)、Carrico等(Nat ChemBiol，2007.3:321-2)、We等(Proc Natl Acad Sci USA，2009.106:3000-5)、Rabuka等(CurrOpin Chem Biol.，201114:790-6)、Hudak等(Angew Chem Int Ed Engl.，2012:4161-5)、Rabuka等(Nat Protoc.，20127:1052-67)、Agarwal等(Proc Natl Acad Sci USA，2013，110:46-51)、Agarwal等(Proc Natl Acad 846-851)，Barfield等(Drug Dev.and D.，2014，14:34-41)、Drake等(Bioconjugate Chem.，2014，25:1331-41)、Liang等(J Am Chem Soc.，2014，136:10850-3)、Drake等(Curr Opin Chem Biol.，2015，28：174-80)和York等(BMCBiotechnology，2016，16(1):23)，其教导的全部内容各自通过引用整体并入本文中。

6.6.2.其他结合部分

在多个实施方案中，GAL9结合分子具有包含一个或多个其他结合部分的修饰。在某些实施方案中，结合部分是抗体片段或抗体形式，包括但不限于全长抗体、Fab片段、Fv、scFv、串联scFv、Diabody、scDiabody、DART、tandAb、微型抗体、骆驼科VHH和本领域技术人员已知的其他抗体片段或形式。示例性抗体和抗体片段形式在以下文献中详细描述：Brinkmann等(MABS，2017，Vol.9，No.2，182-212)，其教导的全部内容通过引用并入本文中。

在特定实施方案中，一个或多个其他结合部分连接第一或第三多肽链的C-末端。在特定实施方案中，一个或多个其他结合部分连接第一和第三多肽链两者的C-末端。在特定实施方案中，一个或多个其他结合部分连接第一和第三多肽链两者的C-末端。在某些实施方案中，一个或多个其他结合部分的各单个部分分开地连接第一和第三多肽链的C-末端，使得所述部分形成功能性结合部分。

在特定实施方案中，一个或多个其他结合部分连接任何多肽链(例如第一、第二、第三、第四、第五或第六多肽链)的N-末端。在某些实施方案中，所述其他结合部分的各单个部分分开地连接不同多肽链的N-末端，使得所述部分形成功能性结合部分。

在某些实施方案中，一个或多个其他结合部分对GAL9结合分子内的ABS的不同抗原或表位具有特异性。在某些实施方案中，一个或多个其他结合部分对GAL9结合分子内的ABS的相同抗原或表位具有特异性。在某些实施方案中，其中修饰是两个或更多个其他结合部分，所述其他结合部分对相同的抗原或表位具有特异性。在某些实施方案中，其中修饰是两个或更多个其他结合部分，所述其他结合部分对不同的抗原或表位具有特异性。

在某些实施方案中，使用体外方法，将一个或多个其他结合部分与GAL9结合分子连接，所述体外方法包括但不限于反应性化学和亲和标记系统，如下面6.6.3节中更详细讨论的。在某些实施方案中，一个或多个其他结合部分通过Fc介导的结合(例如蛋白A/G)与GAL9结合分子连接。在某些实施方案中，使用重组DNA技术，如在相同的表达载体(例如质粒)上编码GAL9结合分子和其他结合部分之间的融合产物的核苷酸序列，将一个或多个其他结合部分与GAL9结合分子连接。

6.6.3.官能团/反应性基团

在多个实施方案中，GAL9结合分子具有包含可用于下游过程的官能团或化学反应基团的修饰，所述下游过程如连接其他部分(例如，药物缀合物和其他结合部分，如上文6.6.1和6.6.2节中更详细讨论的)和下游纯化过程。

在某些实施方案中，修饰是化学反应性基团，包括但不限于反应性硫醇(例如，基于马来酰亚胺的反应性基团)、反应性胺(例如，基于N-羟基琥珀酰亚胺的反应性基团)、“click化学”基团(例如，反应性炔基)和带有甲酰甘氨酸(FGly)的醛。在某些实施方案中，修饰是官能团，包括但不限于亲和肽序列(例如，HA、HIS、FLAG、GST、MBP和Strep系统等)。在某些实施方案中，官能团或化学反应性基团具有可断裂的肽序列。在特定实施方案中，可断裂肽通过包括但不限于以下的方式断裂：光断裂、化学断裂、蛋白酶断裂、还原条件和pH条件。在具体实施方案中，蛋白酶断裂通过胞内蛋白酶进行。在特定实施方案中，蛋白酶断裂通过胞外或膜相关蛋白酶进行。采用蛋白酶断裂的ADC疗法更详细地描述于Choi等(Theranostics，2012；2(2)：156-178.)中，其教导的全部内容通过引用并入本文。

6.6.4.效应子功能降低

在某些实施方案中，GAL9结合分子在抗体结构域的氨基酸序列中具有一个或多个工程化突变，其降低与抗体结合天然相关的效应子功能。效应子功能包括但不限于，由Fc受体与抗体的Fc部分结合导致的细胞功能，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC，也称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)、补体固定(例如C1q结合)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和调理作用。降低效应子功能的示例性工程化突变更详细地描述于美国公开号2017/0137530，Armour等(Eur.J.Immunol.29(8)(1999)2613-2624)，Shields等(J.Biol.Chem.276(9)(2001)6591-6604)和Oganesyan等(Acta Cristallographica D64(2008)700-704)，其各自通过引用整体并入本文中。

6.7.纯化方法

本文提供了纯化GAL9结合分子的方法。纯化步骤包括但不限于基于蛋白质特征，如大小(例如，大小排阻色谱)、电荷(例如，离子交换色谱)或疏水性(例如，疏水性相互作用色谱)，来纯化GAL9结合分子。在一个实施方案中，进行阳离子交换色谱。可以进行本领域技术人员已知的其他纯化方法，包括但不限于使用蛋白A、蛋白G或蛋白A/G试剂。可以进行单个纯化方法的多次迭代。可以进行纯化方法的组合。

6.7.1.复合物的组装和纯度

在本发明的一些实施方案中，至少四条不同多肽链缔合在一起形成完整的复合物，即GAL9结合分子。然而，也可以形成不含该至少四条不同多肽链的不完全复合物。例如，可以形成仅具有所述多肽链中一条、两条或三条的不完全复合物。在其他实例中，不完全复合物可含有多于三条多肽链，但不包含该至少四条不同的多肽链，例如，不完全复合物不适当地与多于一个拷贝的不同多肽链缔合。本发明的方法从不完全复合物中纯化复合物，即完全组装的GAL9结合分子。

评估纯化步骤的功效和效率的方法是本领域技术人员熟知的，包括但不限于SDS-PAGE分析、离子交换层析、大小排阻层析和质谱。还可以根据各种标准评估纯度。标准的实例包括但不限于：1)评估洗脱液中由完全组装的GAL9结合分子提供的总蛋白的百分比，2)评估用于纯化所需产物的方法的富集倍数或增加百分比，例如，将洗脱液中由完全组装的GAL9结合分子提供的总蛋白与起始样品中的总蛋白进行比较，3)评估总蛋白的百分比或不期望产物(例如，上述不完全复合物)的减少百分比，包括确定特定的不期望产物(例如，未缔合的单个多肽链、多肽链的任何组合的二聚体、或多肽链的任何组合的三聚体)的百分比或减少百分比。可以在本文所述的方法的任何组合之后，评估纯度。

6.8.制备方法

可以使用目前用于抗体制备的标准无细胞翻译、瞬时转染和稳定转染方法，通过表达，容易地制备本文所述的GAL9结合分子。在一些具体的实施方案中，产生GAL9结合分子可以使用Expi293细胞(ThermoFisher)以及来自ThermoFisher的方案和试剂，如ExpiFectamine，或本领域技术人员已知的其他试剂，如聚乙烯亚胺，如Fang等(BiologicalProcedures Online，2017，19:11)中详细描述的，所述文献教导的全部内容通过引用并入本文中。

可以使用各种纯化策略，包括但不限于使用蛋白A、蛋白G或蛋白A/G试剂，容易地将表达的蛋白质与不需要的蛋白质和蛋白质复合物分离。可以使用本领域常规使用的离子交换色谱法进行进一步纯化。

6.9.药物组合物

在另一个方面中，提供了药物组合物，其包含如本文所述的GAL9结合分子和药学上可接受的载体或稀释剂。在典型的实施方案中，药物组合物是无菌的。

在各种实施方案中，药物组合物包含浓度为0.1mg/ml-100mg/ml的GAL9结合分子。在具体的实施方案中，药物组合物包含浓度为0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、7.5mg/ml或10mg/ml的GAL9结合分子。在一些实施方案中，药物组合物包含浓度大于10mg/ml的GAL9结合分子。在某些实施方案中，GAL9结合分子以20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml或甚至50mg/ml或更高的浓度存在。在特定实施方案中，GAL9结合分子以大于50mg/ml的浓度存在。

在各种实施方案中，药物组合物更详细地描述于美国专利No.8,961,964、美国专利No.8,945,865、美国专利No.8,420,081、美国专利No.6,685,940、美国专利No.6,171,586、美国专利No.8,821,865、美国专利No.9,216,219、美国申请10/813,483、WO 2014/066468、WO 2011/104381和WO 2016/180941中，其各自以其整体并入本文中。

6.10.治疗方法

在另一个方面中，提供了治疗方法，所述方法包括以有效治疗患者的量，给患有疾病或病症的患者施用如本文所述的GAL9结合分子。

6.10.1.受试者

在一些实施方案中，受试者可以是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是小鼠。在优选实施方案中，哺乳动物是人。

6.10.2.联合疗法

GAL9结合分子可单独使用或与其它治疗剂或方法组合使用以治疗或预防疾病或病症。GAL9结合分子可以与第二治疗剂同时或依次施用，这取决于待治疗的疾病。

在一些实施方案中，抗-GAL9结合分子，与在临床中使用的或在当前护理标准范围内的药剂或程序联合使用，以治疗或预防疾病或病症(如增生性疾病或癌症)。在一些实施方案中，GAL9结合分子与免疫检查点抑制剂联合施用，所述免疫检查点抑制剂如抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、抗CTLA4抗体、抗LAB3抗体、抗TIM1抗体、抗TIGIT抗体、抗PVRIG抗体。

6.10.3.增生性疾病

在一些实施方案中，治疗包括以有效治疗受试者的量，给患有增生性疾病的受试者施用如本文所述的一种或多种GAL9结合分子。

在一些实施方案中，治疗包括施用有效量的一种或多种本文所述的GAL9结合分子，用于治疗癌症和/或癌前病变。在一些实施方案中，治疗包括，联合另一种癌症治疗剂和/或治疗方案(放射、手术等)，施用有效量的如本文所述的一种或多种GAL9结合分子。

在各种实施方案中，癌症是膀胱癌、血癌、骨癌、骨髓癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃肠道癌、牙龈癌、头癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、颈癌、头颈癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、舌癌或子宫癌。

在一些实施方案中，癌性或癌前肿瘤是赘生物、恶性肿瘤、癌瘤、未分化肿瘤、巨细胞和梭形细胞癌、小细胞癌、乳头状癌、鳞状细胞癌、头颈鳞状细胞癌、淋巴上皮癌、基底细胞癌、毛基质癌(pilomatrix carcinoma)、移行细胞癌、乳头状移行细胞癌、腺癌、胃泌素瘤(gastrinoma)、恶性肿瘤、胆管癌、肝细胞癌、合并肝细胞癌和胆管癌、小梁状腺癌(trabecular adenocarcinoma)、腺样囊性癌、腺瘤性息肉中的腺癌、腺癌、家族性结肠息肉病(familial polyposis coli)、实体癌、类癌瘤、恶性肿瘤、支气管肺泡腺癌、乳头状腺癌、嫌色细胞癌(chromophobe carcinoma)、嗜酸细胞癌(acidophil carcinoma)、嗜酸细胞腺癌(oxyphilic adenocarcinoma)、嗜碱性细胞癌(basophil carcinoma)、透明细胞腺癌、颗粒细胞癌、滤泡腺癌、乳头状和滤泡腺癌、非包囊性硬化性癌(nonencapsulatingsclerosing carcinoma)、肾上腺皮质癌、子宫内膜样癌、皮肤附件癌(skin appendagecarcinoma)、大汗腺腺癌(apocrine adenocarcinoma)、皮脂腺腺癌(sebaceousadenocarcinoma)、耵聍腺癌(ceruminous adenocarcinoma)、粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma)、囊腺癌(cystadenocarcinoma)、胰腺腺癌、胰腺导管腺癌、囊腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(PanNET)、胰腺腺鳞癌(adenosquamous carcinomas of thepancreas)、胰腺印戒细胞癌(signet ring cell carcinomas of the pancreas)、胰腺肝样癌(hepatoid carcinomas of the pancreas)、胰腺胶样癌(colloid carcinomas ofthe pancreas)、胰腺未分化癌(undifferentiated carcinomas of the pancreas)和伴有破骨细胞样巨细胞的胰腺未分化癌(undifferentiated carcinomas with osteoclast-like giant cells of the pancreas)、胰腺腺泡细胞癌(acinar cell carcinomas ofthe pancreas)、胰腺实性假乳头状瘤(solid pseudopapillary neoplasms of thepancreas)、胰母细胞瘤(pancreatoblastoma)、罕见胰腺外分泌癌(rare exocrinecancers of the pancreas)、胰腺浆液性囊腺瘤(pancreatic serous cystadenomas)、胰腺粘液性囊性瘤(pancreatic mucinous cystic neoplasms)、乳头状囊腺癌(papillarycystadenocarcinoma)、乳头状浆液性囊腺癌(papillary serous cystadenocarcinoma)、粘液性囊腺癌(mucinous cystadenocarcinoma)、粘液性腺癌(mucinousadenocarcinoma)、印戒细胞癌(signet ring cell carcinoma)、浸润性导管癌(infiltrating duct carcinoma)、髓样癌(medullary carcinoma)、小叶癌(lobularcarcinoma)、炎性癌(inflammatory carcinoma)、佩吉特氏病(Paget's disease)、乳腺腺泡细胞癌(mammary acinar cell carcinoma)、腺鳞癌(adenosquamous carcinoma)、腺癌伴鳞状化生(adenocarcinoma w/squamous metaplasia)、胸腺瘤(thymoma)、恶性、卵巢间质瘤(ovarian stromal tumor)、恶性卵泡膜瘤(malignant thecoma)、恶性颗粒细胞瘤(malignant granulosa cell tumor)、恶性雄母细胞瘤(malignant androblastoma)、恶性支持细胞癌(malignant sertoli cell carcinoma)、leydig细胞瘤(leydig cell tumor)、恶性脂质细胞瘤(malignant lipid cell tumor)、恶性副神经节瘤(malignantparaganglioma)、恶性乳房外副神经节瘤(malignant extra-mammary paraganglioma)、恶性嗜铬细胞瘤(malignant pheochromocytoma)、血管球肉瘤(glomangiosarcoma)、恶性黑素瘤(malignant melanoma)、无黑色素性黑素瘤(amelanotic melanoma)、浅表扩散性黑素瘤(superficial spreading melanoma)、巨色素痣中的黑素瘤(melanoma in giantpigmented nevus)、上皮样细胞黑素瘤(epithelioid cell melanoma)、蓝痣(bluenevus)、恶性肉瘤(malignant sarcoma)、纤维肉瘤(fibrosarcoma)、纤维组织细胞瘤(fibrous histiocytoma)、恶性粘液肉瘤(malignant myxosarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、胚胎性横纹肌肉瘤(embryonal rhabdomyosarcoma)、肺泡横纹肌肉瘤(alveolarrhabdomyosarcoma)、间质肉瘤(stromal sarcoma)、混合瘤(mixed tumor)、恶性苗勒氏混合瘤(malignant mullerian mixed tumor)、肾母细胞瘤(nephroblastoma)、肝母细胞瘤(hepatoblastoma)、癌肉瘤(carcinosarcoma)、间质瘤(mesenchymoma)、恶性布伦纳瘤(malignant brenner tumor)、恶性叶状瘤(malignant phyllodes tumor)、恶性滑膜肉瘤(malignant synovial sarcoma)、间皮瘤(mesothelioma)、恶性无性细胞瘤(malignantdysgerminoma)、胚胎性癌(embryonal carcinoma)、畸胎瘤(teratoma)、卵巢恶性甲状腺肿(malignant struma ovarii)、恶性绒毛膜癌(malignant choriocarcinoma)、中肾瘤(mesonephroma)、恶性血管肉瘤(malignant hemangiosarcoma)、血管内皮瘤(hemangioendothelioma)、恶性卡波西肉瘤(malignant Kaposi's sarcoma)、血管外皮细胞瘤(hemangiopericytoma)、恶性淋巴管肉瘤(malignant lymphangiosarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、皮质旁骨肉瘤(juxtacortical osteosarcoma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)、成软骨细胞瘤(chondroblastoma)、恶性间充质软骨肉瘤(malignantmesenchymal chondrosarcoma)、骨巨细胞瘤(giant cell tumor of bone)、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、牙源性肿瘤(odontogenic tumor)、恶性成釉细胞性牙肉瘤(malignant ameloblastic odontosarcoma)、成釉细胞瘤(ameloblastoma)、恶性成釉细胞纤维肉瘤(malignant ameloblastic fibrosarcoma)、松果体瘤(pinealoma)、恶性脊索瘤(malignant chordoma)、神经胶质瘤(glioma)、恶性室管膜瘤(malignant ependymoma)、星形胶质细胞瘤(astrocytoma)、原浆型星形胶质细胞瘤(protoplasmic astrocytoma)、纤维型星形胶质细胞瘤(fibrillary astrocytoma)、星形胶质母细胞瘤(astroblastoma)、胶质母细胞瘤(glioblastoma)、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、少突神经母细胞瘤(oligodendroblastoma)、原始神经外胚层、小脑肉瘤(cerebellar sarcoma)、神经节神经母细胞瘤(ganglioneuroblastoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、嗅神经源性肿瘤(olfactory neurogenic tumor)、脑膜瘤(meningioma)、恶性、神经纤维肉瘤(neurofibrosarcoma)、神经鞘瘤(neurilemmoma)、恶性颗粒细胞瘤(malignant granular cell tumor)、恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)、霍奇金病(Hodgkin's disease)、霍奇金副肉芽肿(Hodgkin's paragranuloma)、恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)、小淋巴细胞恶性淋巴瘤(small lymphocytic malignantlymphoma)、大细胞弥散性恶性淋巴瘤(large cell diffuse malignant lymphoma)、滤泡性蕈样肉芽肿(follicular mycosis fungoides)、其他明确的非霍奇金淋巴瘤(otherspecified Non-Hodgkin's lymphomas)、恶性组织细胞增多症(malignanthistiocytosis)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、肥大细胞肉瘤(mast cellsarcoma)、免疫增生性小肠疾病(immunoproliferative small intestinal disease)、白血病(leukemia)、淋巴样白血病(lymphoid leukemia)、浆细胞白血病(plasma cellleukemia)、红白血病(erythroleukemia)、淋巴肉瘤细胞白血病(lymphosarcoma cellleukemia)、骨髓性白血病(myeloid leukemia)、嗜碱性白血病(basophilic leukemia)、嗜酸性白血病(eosinophilic leukemia)、单核细胞白血病(monocytic leukemia)、肥大细胞白血病(mast cell leukemia)、巨核母细胞白血病(megakaryoblastic leukemia)、髓系肉瘤(myeloid sarcoma)或毛细胞白血病(hairy cell leukemia)。.

在一些实施方案中，癌症是病毒诱发的癌症，例如，由致瘤病毒或肿瘤病毒(也称为“癌症病毒”)感染引起的癌症。在一些实施方案中，癌症病毒是DNA病毒。在一些实施方案中，癌症病毒是RNA病毒。

在一些实施方案中，癌性或癌前肿瘤与癌症病毒相关或由癌症病毒引起。癌症病毒的非限制性实例包括：Epstein-Barr病毒(EBV)、乙肝病毒、丙肝病毒、人乳头瘤病毒、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KHSV)、Merkel细胞多瘤病毒或巨细胞病毒。

在一些实施方案中，癌性或癌前肿瘤与癌症病毒相关或由癌症病毒引起，所述癌症病毒直接诱导感染的宿主细胞的转化，从而调节宿主细胞的生长和存活，或备选地引发DNA损伤反应，这又在宿主细胞基因组中增加遗传不稳定性和加速致癌突变的获得。

在一些实施方案中，癌性或癌前肿瘤与诱导宿主慢性炎症的癌症病毒相关或由该癌症病毒引起。例如，HBV和HCV感染可诱导与氧化性DNA损伤相关的慢性肝炎，随后是肝硬化，在某些情况下导致肝细胞癌的发展。

在一些实施方案中，癌性或癌前肿瘤与癌症病毒相关或由癌症病毒引起，所述癌症病毒不是致癌性的，但抑制宿主的免疫系统、破坏免疫监视，从而允许突变的恶性细胞的出现，例如HIV感染的患者。

在一些实施方案中，治疗包括将一种或多种如本文所述的GAL9结合分子施用于患有感染性疾病(例如HIV、HCV、HBV、EBV或HPV感染)的受试者。

在一些实施方案中，治疗包括将一种或多种如本文所述的GAL9结合分子以有效治疗受试者的量施用于患有HIV或AIDs的受试者。

6.10.4.施用

GAL9结合分子可以通过本领域已知的任何途径施用于受试者。例如，通过例如静脉内、皮下、肌内、皮内、动脉内、腹膜内、鼻内、肠胃外、肺、局部、口服、舌下、瘤内、瘤周、病灶内、滑膜内、鞘内、脑脊髓内或病灶周围施用，将GAL9结合分子施用于人受试者。GAL9结合分子可以以本身或作为药物组合物施用于受试者。本文描述了示例性药物组合物。

实施例

提供以下实施例是为了举例说明而非限制。特别地，如下文更详细描述的，用于表达和纯化各种抗原结合蛋白的方法及其在各种测定中的应用，是非限制性和举例说明性的。

6.11.1.方法

6.11.1.1.Expi293表达

根据制造商的说明书(Thermo Fisher Scientific)，使用Expi293瞬时转染系统，表达了受试的各种抗原结合蛋白。简言之，除非另有说明，否则将编码各条链的质粒以1：1的质量比混合，并用ExpiFectamine 293转染试剂盒转染到Expi 293细胞中。将细胞在37℃，8％CO₂，100％湿度和125rpm振荡下培养。转染的细胞在转染16-18小时后补料一次。在第5天通过以2000g离心10分钟来收获细胞。收集上清液用于亲和色谱纯化。

6.11.1.2.ExpiCHO表达

根据制造商的说明，使用ExpiCHO瞬时转染系统，测试和表达各种GAL9抗原结合蛋白。简言之，将编码各条链的质粒以例如1:1的质量比混合，并用ExpiFectamine CHO转染试剂盒转染到ExpiCHO中。

在37℃、8％CO₂、100％湿度和125rpm振荡下培养细胞。转染的细胞通常在转染16-18小时后补料一次。在第5天通过2000g离心10分来收获细胞。然后收集上清液用于亲和色谱纯化。

6.11.1.3.蛋白A纯化

使用蛋白A(ProtA)树脂或抗CH1树脂，在重力流纯化器上，分离含有各种抗原结合蛋白的澄清上清液。在进行头对头比较的实施例中，将含有各种抗原结合蛋白的上清液分成两个相等的样品。对于ProtA纯化，用PBS(5mM磷酸钠钾pH 7.4，150mM氯化钠)平衡1mL蛋白A柱(GE Healthcare)。将样品以5mL/min加载到柱上。使用0.1M乙酸钠pH 3.5洗脱样品。通过280nm处的吸光度监测洗脱，并合并洗脱峰用于分析。通过280nm处的吸光度监测洗脱，并合并洗脱峰用于分析。

6.11.1.4.SDS-Page分析

通过还原和非还原SDS-PAGE，分析含有各种分离的抗原结合蛋白的样品中是否存在完全产物、不完全产物和总体纯度。将2μg每种样品加入15μL SDS上样缓冲液中。将还原样品在10mM还原剂存在下于75℃孵育10分钟。将非还原样品在70℃下在没有还原剂的情况下孵育5分钟。将还原和非还原样品加载到含有运行缓冲液的4％-15％梯度TGX凝胶(BioRad)中，并在220伏下运行30分钟。运行完成后，用去离子(DI)水洗涤凝胶，并使用GelCode Blue Safe Protein Stain(ThermoFisher)染色。在分析之前用DI水对凝胶进行脱色。使用标准图像分析软件，进行脱色凝胶的扫描图像的光密度分析，以计算每个样品中条带的相对丰度。

6.11.1.5.IEX色谱

通过阳离子交换色谱，分析含有各种分离的抗原结合蛋白的样品中完全产物与不完全产物和杂质的比例。在AKTA纯化器FPLC上用5mL MonoS(GE Lifesciences)分析澄清的上清液。用缓冲液A(10mM MES pH 6.0)平衡MonoS柱。将样品以2mL/min加载到柱上。使用0-30％梯度的缓冲液B(10mM MES pH 6.0，1M氯化钠)经6个柱床体积(CV)洗脱样品。通过280nm处的吸光度监测洗脱，并通过峰积分计算样品的纯度，以鉴定单体峰和污染物峰的丰度。将单体峰和污染物峰分别合并，用于通过如上所述的SDS-PAGE进行分析。

每个样品的分析SEC色谱，将1mg/ml以1ml/min加载到柱上。使用PBS的等度流，1.5CV洗脱样品。通过280nm处的吸光度监测洗脱，并通过峰积分分析洗脱峰。

6.11.1.6.质谱

通过质谱分析含有各种分离的抗原结合蛋白的样品，以通过分子量确认正确的种类。所有分析均由第三方研究组织进行。简言之，用酶混合物处理样品以除去糖基化。以还原形式测试样品，以通过分子量特异性地鉴定每条链，并在非还原条件下鉴定样品中所有复合物的分子量。质谱分析用于基于分子量鉴定独特产物的数量。

6.11.1.7.通过噬菌体展示发现抗体

使用标准方案进行人Fab文库的噬菌体展示。人GAL9蛋白购自Acro Biosystems(人Gal9 His-tag目录号LG9-H5244)，并使用标准方案使用EZ-Link NHS-PEG₁₂-生物素(ThermoScientific目录号21312)进行生物素化。使用标准方案，通过噬菌体ELISA，筛选能够结合GAL9蛋白的噬菌体克隆。

简言之，使用能够在噬菌体(也称为噬菌粒)中复制和表达的表达载体，构建Fab形式的噬菌体文库。重链和轻链都在相同的表达载体中编码，其中重链与噬菌体外壳蛋白pIII的截短变体融合。将轻链和重链-pIII融合体表达为单独的多肽，并在细菌周质中组装，其中的氧化还原电位允许形成二硫键，以形成含有候选ABS的噬菌体展示抗体。

使用源自特定人重链可变结构域(VH3-23)和特定人轻链可变结构域(Vk-1)的序列，来形成文库。对于筛选文库，将VH结构域的所有三个CDR多样化，以匹配人抗体库(humanantibody repertoire)中发现的CDR长度的位置氨基酸频率。产生筛选文库内的轻链可变结构域，其中多样性仅引入VL CDR3(L3)中；轻链VL CDR1(L1)和CDR2(L2)保留人种系序列。

噬菌体展示文库中使用的重链支架(SEQ ID NO：2)、轻链支架(SEQ ID NO：4)、全长重链Fab多肽(SEQ ID NO：1)和全长轻链Fab多肽(SEQ ID NO：3)如下所示，其中小写字母“x”代表改变以形成文库的CDR氨基酸。

噬菌体展示VH支架[SEQ ID NO:2]:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFxxxxIHWVRQAPGKGLEWVAxxxxxxxxxxxYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARxxxxxxxxxxxxxDYWGQGTLVTVSSAS

噬菌体展示VL支架[SEQ ID NO:4]:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQxxxxxxTFGQGTKVEIKRT

噬菌体展示重链Fab多肽[SEQ ID NO:1]:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFxxxxIHWVRQAPGKGLEWVAxxxxxxxxxxxYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARxxxxxxxxxxxxxDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC

噬菌体展示轻链Fab多肽[SEQ ID NO:3]:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQxxxxxxTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDSQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

通过Kunkel诱变产生多样性，其中使用引物将多样性引入VH CDR1(H1)、VH CDR2(H2)、VH CDR3(H3)和VL CDR3(L3)中，以模拟天然抗体库中发现的多样性，如Kunkel，TA(PNAS 1985年1月1日，82(2)488-492)中更详细描述的，其全部内容通过引用并入本文中。简言之，使用标准程序从分离的噬菌体制备单链DNA，并进行Kunkel诱变。然后将化学合成的DNA电穿孔到MC1061F-细胞中。用限制酶(Bam HI和Xba I)消化从过夜培养物获得的噬菌粒以除去野生型序列。将消化的样品电穿孔到TG1细胞中，然后回收。将回收的细胞传代培养并用M13K07辅助噬菌体感染以产生噬菌体文库。

使用标准程序进行噬菌体淘选。简言之，用固定在链霉亲和素磁珠上的靶标进行第一轮噬菌体淘选，其中所述链霉亲和素磁珠用来自制备的文库的～5×10¹²个噬菌体在1mL体积中在PBST-2％BSA中处理。孵育一小时后，使用磁性支架将珠结合的噬菌体与上清液分离。将珠洗涤三次以除去非特异性结合的噬菌体，然后加入OD₆₀₀～0.6的ER2738细胞(5mL)中。20分钟后，将感染的细胞在25mL 2xYT+氨苄青霉素和M13K07辅助噬菌体(终浓度，～10¹⁰pfu/ml)中传代培养，并使其在37℃下剧烈振荡生长过夜。第二天，使用标准程序，通过PEG沉淀，制备噬菌体。在淘选之前，预清除对SAV包被的珠具有特异性的噬菌体。使用标准程序，使用KingFisher磁珠处理器，以100nM珠固定的抗原进行第二轮淘选。总共进行3-4轮噬菌体淘选，以富集展示对靶抗原具有特异性的Fab的噬菌体。使用多克隆和单克隆噬菌体ELISA，确认靶特异性富集。使用DNA测序来确定含有候选ABS的分离的Fab克隆。

将在上述噬菌体筛选中鉴定的VL和VH结构域，重新形成为二价单特异性天然人全长IgG1结构。

天然人全长IgG1重链结构[SEQ ID NO:5]:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFxxxxIHWVRQAPGKGLEWVAxxxxxxxxxxxYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARxxxxxxxxxxxxxDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[SEQ ID NO:5]

天然人全长IgG1轻链结构：

等同于噬菌体展示轻链Fab，参见[SEQ ID NO:3]。

6.11.1.8.结合动力学的Octet测定

为了测量发现的GAL9结合物的定性结合亲和力，将重新形成的IgG1形式的结合物，固定于Octet(Pall ForteBio)生物层干涉仪的生物传感器上。

然后将可溶性GAL9抗原加入该系统中，并测量结合。通过可视化octet传感图的解离阶段从最弱(+)到最强(+++)的斜率，来评估定性结合亲和力。由传感图的解离阶段的微小下降表示的缓慢解离速率，表明紧密结合的抗体(+++)。为了获得单价亲和力的准确动力学常数，在缔合步骤中测量了稀释系列，所述系列涉及至少五个浓度的GAL9分析物(范围从大约10至20×K_D至0.1×K_D值，2倍稀释)。在解离步骤中，将传感器浸入不含GAL9分析物的缓冲液中，使传感器表面上结合的复合物解离。使用Octet动力学分析软件，基于结合和解离速率曲线，计算动力学和平衡结合常数。进行全局分析(全局拟合)，其中同时从实验中包括的所有分析物浓度得到动力学常数。

6.11.1.9.表位分箱(binning)

使用基于Octet的“串联”测定法，以成对方式，测试如上所述的格式化为二价单特异性天然人全长IgG1的抗-GAL9候选物的GAL9结合。简言之，将生物素化的GAL9固定在链霉亲和素传感器上，并将两个抗-GAL9候选物串联结合。产生竞争性阻断谱，确定给定的抗GAL9候选物是否阻断一系列的其他抗GAL9候选物与GAL9的结合。将竞争相同或非重叠结合区的抗-GAL9候选物分组在一起，并称为属于相同的箱(bin)。

6.11.1.10.PBMC激活和半乳糖凝集素9抗体处理

根据制造商的说明，制备PepMix HCMVA(pp65)(>90％)蛋白质ID：P06725(目录号PM-PP 65-2，JPT Peptide Technologies)的各个等分试样。PepMix^TMHCMVA(pp65)是人巨细胞病毒(HHV-5)的65kDa磷酸化蛋白(pp65)(Swiss-Prot ID:P06725)的重叠15mer肽的跨完整蛋白的混合物。将PepMix的等分试样用于PBMC的免疫刺激，以评估免疫细胞应答。

根据标准条件，解冻冷冻的人外周血单核细胞，然后重悬于生长培养基(RPMI中的10％FBS)中。

将重悬的PBMC以5×10⁵个细胞接种在96孔板中。将细胞与2μg/mL PepMix^TMHCMVA(pp65)加40μg/mL候选GAL9抗体或对照抗体，在生长培养基中，在37℃、5％CO₂下孵育24小时。

6.11.1.11.LEGENDplex人Th细胞因子测定

如下，通过PepMix HCMVA(pp65)激活PBMC和半乳糖凝集素9抗体处理后，在24小时和72小时，通过细胞因子珠阵列评估了PBMC和特异性免疫细胞亚群的细胞因子分泌。

收集200μl细胞培养上清液并离心以沉淀细胞碎片。使用LEGENDplex^TM人Th1组(5-plex)(目录号740009，Biolegend)，分析所得上清液。LEGENDplex^TM人Th1组是基于珠粒的测定，以允许使用流式细胞术同时定量人细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α。

简言之，根据制造商的说明，制备细胞因子标准品和捕获珠混合物。制备1:1:1捕获珠混合物:生物素化检测抗体和测定缓冲液的测定母混合物。

将12.5μl上清液样品或细胞因子标准品与37.5μl测定母混合物一起温育。将板密封，用箔覆盖，并在室温下以600rpm振荡2小时。然后将孔与链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(SA-PE)在室温下以600rpm振荡孵育30分钟。然后将珠洗涤两次并重悬，然后根据制造商的说明进行流式细胞术分析。

6.11.1.12.用标志物抗体染色PBMC

在如上所述的PBMC激活和半乳糖凝集素9抗体处理后，根据以下程序，用标志物抗体染色PBMC免疫细胞。

将细胞以5×10⁶个细胞/mL重悬于生长培养基(RPMI中的10％FBS)中。将200μL重悬的细胞等分到96孔板中，然后与可固定活力染料

在2-8℃下孵育30分钟，以不可逆地标记死细胞。然后洗涤细胞，然后与人Fc封闭溶液(目录号14-9161-73，eBiosciences)在室温下孵育10分钟。

根据下表制备抗体混合物工作溶液。

将孔用10μL稀释的抗体混合物在2-8℃孵育30分钟。然后洗涤细胞并重悬，并通过流式细胞术分析进行分析。

为了分析免疫刺激性标志物CD 27、CD40L、ICOS、4-1BB和OX 40，遵循上面提供的相同方案，但是如下面表2中详述的，将细胞用替换的抗体混合物一起孵育：

6.11.2.实施例1：GAL9结合臂发现

如上所述，使用单克隆噬菌体ELISA格式，针对GAL9抗原筛选在Fab CDR中引入多样性的化学合成Fab噬菌体文库。对表达识别GAL9的Fab的噬菌体克隆进行测序。

该筛选最初鉴定了52个GAL9结合候选物(抗原结合位点克隆)。将这些克隆的可变区重新格式化为二价单特异性人IgG1格式后，进行功能测定，鉴定了22种具有免疫激活性特性的抗体。

表3列出了来自22个激活性ABS克隆的VH CDR1/2/3序列，仅显示在构建文库中已经变化的CDR的残基。

表4列出了来自鉴定的ABS克隆的VL CDR1/2/3序列；轻链CDR1和CDR2序列是不变的，并且仅显示在构建文库中变化的CDR3残基。

表5呈现，根据本领域公认的多种定义方式，22个候选抗GAL9免疫激活性抗体的完整CDR序列。

表6呈现格式化成二价单特异性人全长IgG1结构的各种ABS候选物的完整免疫球蛋白重链和完整免疫球蛋白轻链序列、以及VH和VL序列。

分析选择的GAL9结合候选物的结合特性：与鼠GAL9的交叉反应性结合、定性结合、表位分箱(箱2-候选物与来自LS Bio[LS-C179448]的商业抗体克隆ECA8分箱在一起；箱3-候选物与来自LS Bio[LS-C179449]的商业抗体克隆ECA42分箱在一起，抗体克隆ECA42是图3中述及的“工具抗体”)，和单价亲和结合。分析结果示于表7中。

进一步分析选择的GAL9结合候选物的序列基序，所述序列基序可能不利地影响与临床开发相关的抗体性质，如稳定性、突变性和免疫原性。根据Kumar和Singh(Developability of biotherapeutics：Computational approaches.Boca Raton：CRCPress，Taylor&Francis Group，2016)进行计算分析。分析结果呈现在表8中，说明在所列克隆中存在有限数量的不利序列基序，表明用于进一步临床开发的潜力。

6.11.3.实施例2：用抗-GAL9候选物处理增加由人PBMC产生的细胞因子

将候选GAL9 ABS格式化为二价单特异性天然人全长IgG1重链和轻链结构(分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:3)，并测试它们对肽刺激后PBMC产生细胞因子的影响。基本上如上文6.11.1节中所述，刺激PBMC。简言之，从已知应答人CMV病毒(HCMV)的人供体收获PBMC，置于培养基中，用HCMV PepMix刺激以引发抗原特异性反应，并用以下之一处理：对照IgG、比较工具激活性mAb(克隆ECA42)、α-PD1(纳武单抗)或候选抗-GAL9抗体。在处理后24和72hr通过珠细胞因子阵列，测量细胞因子分泌。IFN-γ和TNF-α的结果分别描绘于图3A和3B中。图3A-3B中所示的数据在下面提供的表9和10中更详细地描述。

值得注意的是，相对于IgG对照和GAL9比较工具抗体(克隆ECA42)，用候选物P9-15、P9-18、P9-21和P9-28处理的PBMC在刺激后表现出提高的IFN-γ和TNF-α分泌。此外，相对于用商业α-PD1抗体处理，用候选物P9-15、P9-18、P9-21和P9-28处理的PBMC在刺激后也显著地表现出提高的TNF-α产生。因此，用选择的抗-GAL9候选物处理PBMC，能够提高肽刺激后的细胞因子分泌。用P9-54处理导致了中性应答，TNF-α和IFN-γ分泌没有显著差异(数据未显示)。

6.11.4.实施例3：用抗-GAL9候选物处理增加自然杀伤(NK)细胞的TNF-α产生

将候选GAL9 ABS格式化为二价单特异性天然人全长IgG1重链和轻链结构(分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:3)，并在肽刺激72小时后测试它们对NK细胞(谱系，CD56+)分泌TNF-α的影响。用对照抗体克隆55、GAL9抗体候选物P9-15(克隆15)或GAL9抗体候选物P9-18(克隆18)以5μg或20μg的剂量处理NK细胞。处理后，通过流式细胞术评估细胞的TNF-α分泌水平。分泌TNF-α的NK细胞(CD56⁺)的百分比的代表性数据呈现于图6中。

相对于克隆P9-55(阴性对照)，用GAL9抗体候选物P9-18或候选物P9-15处理，增加了刺激后TNF-α染色阳性的NK细胞的百分比。用5μg对照抗体处理的NK细胞群中，7.75％的该NK细胞(CD56+)是TNF-α阳性的。相比之下，用5μg P9-18处理的NK细胞群中，12.0％的该NK细胞是TNF-α阳性的。而用5μg P9-15处理的NK细胞，22.5％的该NK细胞是TNF-α阳性的。参见图6。

在用20μg对照抗体处理的NK细胞群中，10.3％的该NK细胞(CD56⁺)是TNF-α阳性的。相比之下，在用20μg P9-18处理的NK细胞群中，16.9％的该NK细胞是TNF-α阳性的。而用20μg的P9-15处理的NK细胞，28.5％的该NK细胞是TNF-α阳性的。参见图6。

因此，用选择的抗GAL9候选物处理，能够增加刺激后NK细胞的TNF-α产生。参见图6。

6.11.5.实施例4：用抗-GAL9候选物处理增加树突细胞的IL-12产生

将候选GAL9 ABS格式化为二价单特异性天然人全长IgG1重链和轻链结构(分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:3)，并测试它们对肽刺激后树突细胞(谱系阴性，II类⁺，CD11c⁺细胞)分泌IL-12的影响。如实施例2中所述处理包括树突细胞(DC)群的PBMC，然后按照制造商方案，使用IL-12分泌测定-检测试剂盒(PE)Human(目录号130-092-124，MiltenyiBiotec))，评估IL-12分泌水平。分泌IL-12的DC的百分比的代表性数据呈现于图5中。

值得注意的是，相对于IgG对照，用GAL9抗体候选物P9-18处理，增加了刺激后IL-12染色阳性的DC的百分比。在用对照IgG处理的DC群中，0.26％的该DC是IL-12阳性的。相比之下，在用P9-18处理的DC群中，7.74％的该DC是IL-12阳性的，相对于IgG对照处理的群体，IL-12阳性DC增加28倍。因此，用选择的抗-GAL9候选物处理PBMC能够增加刺激后DC的IL-12产生。

6.11.6.实施例5：用抗-GAL9候选物处理增加CD8+T细胞上共刺激分子的表面表达

测试了已经格式化为二价单特异性天然人全长IgG1重链和轻链结构(分别为SEQID NO:5和SEQ ID NO:3)的候选GAL9 ABS，对肽刺激后CD8^-T细胞的免疫刺激性表面标志物表达的影响。如实施例2中所述处理包括CD8⁺T细胞群的PBMC，用如本文所述的标志物抗体染色，然后收获用于流式细胞术。在CD8⁺T细胞上评估了免疫刺激性表面标志物CD27、CD40L、ICOS、4-1BB和OX40的水平。数据显示在图4中。“％值”表示具有可检测水平的相关标志物的CD8⁺T细胞的％。图4表明，与Ig对照抗体克隆ECA42相比，用αGAL9抗体候选物P9-15、P9-18、P9-21和P9-28处理增加了CD8⁺T细胞中的免疫刺激性表面标志物CD27、CD40L、ICOS、4-1BB和OX40。

免疫刺激性表面标志物染色阳性的CD8⁺T细胞的百分比代表性数据列于下表11中。

值得注意的是，相对于IgG对照、GAL9比较工具抗体(克隆ECA42)和α-PD1，用候选物P9-18或P9-21处理的PBMC展示了刺激后各种免疫刺激性表面标志物染色阳性的CD8⁺T细胞的百分比增加，包括CD40L和OX40染色阳性的CD8⁺T细胞的百分比增加2倍以上。因此，用选择的抗-GAL9候选物处理PBMC能够提高刺激后CD8⁺T细胞的免疫刺激性表面标志物表达。用低应答PBMC细胞(供体5)观察到相同的免疫刺激反应(数据未显示)。

6.11.7.实施例6：用抗-GAL9候选物处理改变树突细胞(DC)上的PD-L1和PD-L2细胞表面表达

将候选GAL9 ABS格式化为二价单特异性天然人全长IgG1重链和轻链结构(分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:3)，并测试它们对肽刺激后树突细胞(谱系阴性，II类，CD11c⁺细胞)上PD-L1和PD-L2细胞表面表达的影响。如实施例2中所述处理包括树突细胞(DC)群的PBMC，然后收获用于流式细胞术，并在DC上评估PD-L1和PD-L2的水平。PD-L1和PD-L2染色阳性的DC的百分比以及几何平均荧光强度(GMI)的代表性数据呈现于下表12中。

值得注意的是，相对于IgG对照和GAL9比较工具抗体(ECA42)，用候选P9-18处理的PBMC展示了刺激后PD-L2染色阳性的DC的百分比增加。P9-18和P9-21两者均展示了DC上PD-L1的百分比降低以及PD-L1的几何平均荧光(GMI)降低。因此，用选择的抗-GAL9候选物处理PBMC能够改变刺激后DC的PD-L1和PD-L2表面表达。

6.11.8.实施例7：用抗-GAL9候选物处理导致GAL9和PD-L2在树突细胞的细胞表面上的簇集

候选GAL9 ABS格式化为二价单特异性天然人全长IgG1重链和轻链结构(分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:3)，并测试它们对树突细胞(“DC”)细胞表面上GAL9、PD-L1和PD-L2簇集的影响。

如实施例2所述处理包括树突细胞(DC)群的PBMC，然后固定用于共聚焦成像分析以评估GAL9、CD11c和PD-L2在树突细胞上的分布。

结果/结论

显示了用IgG对照(图8A)、P9-18(图8B)和P9-21(图8C)处理的树突细胞的共聚焦图像。蓝色染色显示DNA(DAPI)，红色染色显示PD-L2，绿色染色显示CD11c，而黄色染色显示GAL9。未标记的图像是明视场；在附图中以灰度呈现。

与IgG对照相比，用候选P9-18或P9-21处理，显示GAL9和PD-L2在DC上的共定位和聚集(图8B-8C)。因此，在刺激后，用P9-18或P9-21处理可以诱导GAL9和PD-L2在DC的细胞表面上的共定位和聚集。

6.11.9.实施例8：用抗-GAL9 P9-18处理保留肿瘤细胞上的PD-L2和PD-L1表达

测试了抗-GAL9候选物P9-18对PD-L2和PD-L1在肿瘤细胞中的细胞保留和分布的影响。

抗体

将候选GAL9 ABS格式化为二价单特异性天然人全长IgG1重链和轻链结构(分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:3)。抗PD-L2克隆TY25和抗PD-L1克隆10F.9G2获自BioXcell(Lebanon，NH)。

细胞培养和免疫染色

培养CT26肿瘤细胞并用抗GAL9候选物P9-18或IgG对照处理。将细胞固定并用DAPI、抗PD-L2和抗PD-L1染色用于共聚焦成像分析。

结果/结论

图9A和9B显示了用P9-18或IgG对照处理后CT26肿瘤细胞的代表性共聚焦图像。蓝色染色显示DNA(DAPI)，红色显示PD-L2和绿色显示PD-L1；在附图中以灰度呈现。图像显示，与IgG对照相比，用P9-18处理后PD-L2和PD-L1保留在CT26肿瘤细胞的表面上。参见图9A和9B。图9B中的斑点突出显示了增加的PD-L2和PD-L1蛋白表达。

6.11.10.实施例9：用抗-GAL9 P9-18或P9-21处理抑制结肠和黑素瘤肿瘤模型中的肿瘤生长

进行这项研究以确定抗-GAL9候选物P9-18和P9-21是否能够抑制结肠和黑素瘤肿瘤模型中的肿瘤生长。

抗体

候选GAL9 ABS在小鼠IgG2a骨架上格式化为二价单特异性形式。

动物和治疗

BALB/c小鼠皮下植入CT26肿瘤系，并用抗-GAL9候选物P9-18、P9-21或IgG对照处理。在第7、11、15和19天腹膜内(I.P.)200μg治疗，每个治疗组10只小鼠。通过测量肿瘤体积来评估肿瘤生长。如果肿瘤达到～1000mm³的体积，则对小鼠实施安乐死。

C57BL/6小鼠皮内植入B16.F0肿瘤系，并用抗GAL9候选物P9-18、P9-21或IgG对照处理。在第3、7、11和15天以200μg I.P.施用治疗，每个治疗组10只小鼠。

结果/结论

用P9-18或P9-21治疗的小鼠显示了CT26肿瘤的完全消退，而用IgG对照治疗的小鼠显示出持续的肿瘤生长。参见图1。与用IgG对照处理的小鼠相比，用P9-18或P9-21治疗的小鼠表现出降低的B16.F0肿瘤生长。参见图2。因此，P9-18或P9-21可以抑制结肠和黑素瘤肿瘤模型中的肿瘤生长，包括在一些情况下肿瘤完全消退。

6.11.11.实施例10：用抗-GAL9 P9-15治疗导致更少的Epstein-Barr病毒(EBV)诱导的肿瘤并降低病毒载量

在人源化小鼠模型中，进行这项研究以确定抗-GAL9 P9-15候选物对Epsetin-Barr病毒(EBV)诱发的肿瘤的作用。

Epstein-Barr病毒(EBV)是感染人B细胞的γ-疱疹病毒。然而，许多人类病毒不感染小鼠。因此，为了测试抗-GAL9 P9-15对EBV诱导的肿瘤的作用，我们使用了植入人CD34⁺造血干细胞的人源化小鼠，来产生用人免疫系统细胞重建的小鼠模型。

人源化小鼠的感染和治疗

图10A显示了用于研究的总体治疗方案的示意图。简言之，向免疫缺陷小鼠静脉内注射CD34⁺人干细胞，并允许在接下来的12周内植入。然后用EBV感染人源化小鼠并孵育3周以允许感染发生。在感染期结束时，在第22天和第26天用两个剂量的抗-GAL9 P9-15或IgG对照治疗小鼠。治疗后10天，对活小鼠实施安乐死并进行分析。

人源化NRG小鼠(hu-NRG)的产生

每个治疗组使用5只雌性NRG(NOD-Rag1^null IL2rg^null，NOD ragγ)。Rag1^null突变使得小鼠缺乏B和T细胞，并且IL2rg^null突变阻止通过多种受体的细胞因子信号传导，导致缺乏功能性NK细胞。因此，NRG小鼠是极端免疫缺陷的，允许植入人CD34⁺造血干细胞。

以每剂275cGy(总共550cGy)，间隔3-4小时，照射小鼠两次，并静脉内注射5×10⁴CD34⁺人干细胞，然后允许其植入三周以产生人源化NRG(“hu-NRG”)小鼠。每两周称重hu-NRG小鼠，持续12周以评估其健康。此外，在施用人CD34⁺干细胞后第4周、第8周和第12周进行尾部放血，通过流式细胞术分析检测人CD45⁺细胞，包括总单核细胞(CD45⁺)、T细胞(CD3⁺)和B细胞(CD19⁺)，来监测和确认小鼠中的稳定植入。

脾肿瘤

除了小鼠死亡或由于伦理原因而被安乐死的情况外，安乐死后切出脾脏并检查，以确定肉眼可见的肿瘤的数量、细胞数量和重量。

EBV病毒载量的评估

使用实时PCR测量脾和血液中的EBV载量。

统计分析

使用GraphPad Prism 7软件(San Diego，CA)进行基于双侧尾的Mann-Whitney U检验。

结果/结论

与来自IgG对照治疗的小鼠的脾相比，用抗-GAL9 P9-15治疗的小鼠的脾显示出了较少的肉眼可见的肿瘤。参见图10B。与IgG对照治疗的小鼠(平均0.224g/脾，p-值<0.0079)相比，P9-15治疗的小鼠具有更轻的脾重量(平均0.100g/脾)、以及显著更少的脾细胞(在P9-15治疗的小鼠中22.14×10⁶个，与IgG治疗的对照中51.04×10⁶个相比，p-值<0.0159)。参见图10C-10D。数据显示为平均值；误差条为±SEM。

此外，用P9-15治疗将病毒载量控制了88％。P9-15治疗的小鼠具有平均0.32×10⁶个拷贝/μg的EBV，而IgG治疗的小鼠具有平均2×10⁶个拷贝/μg的EBV(p值<0.0079)。参见图10E。数据显示为平均值；误差条为±SEM。这些结果说明，用P9-15治疗可以减少EBV诱发的肿瘤发展以及控制病毒载量。

6.11.12.实施例11：用抗-GAL9 P9-28治疗导致更少的Epstein-Barr病毒(EBV)诱发的肿瘤

进行这项研究，以确定在人源化小鼠模型中GAL9 P9-28候选物对EB病毒(EBV)诱发的肿瘤的影响。

动物、人源化小鼠的感染和治疗

这项研究如上述实施例10所述进行。

结果/结论

与IgG对照相比，抗-GAL9 P9-28治疗的小鼠在脾上没有显示肉眼可见的肿瘤。参见图11。从小的脾尺寸和低细胞数推断，抗-GAL9 P9-23治疗的小鼠不太可能在脾内具有肿瘤。这些结果表明，用P9-28治疗可以减少EBV诱发的肿瘤发展。

6.11.13.实施例12：抗-GAL9沉默Fc P9-18(sFcP9-18)具有抗肿瘤作用；sFcP9-18和P9-18可以建立抗肿瘤免疫记忆

进行这项研究，以测试Fc区对免疫激活性抗GAL9抗体的抗肿瘤作用的贡献。此外，进行再攻击研究，以确定P9-18或sFcP9-18是否可以建立抗肿瘤免疫记忆。

抗体

在鼠IgG1骨架、鼠IgG2a骨架上、或在具有Fc受体结合无效突变(sFc)的鼠IgG2a骨架上，格式化P9-18抗原结合位点。通过进行消除Fc与Fc受体结合的关键点突变，来制备沉默Fc(sFc)P9-18抗体。

CT26细胞

在5％CO₂和95％空气的气氛中，在37℃的潮湿培养箱中，在RPMI培养基中培养CT26肿瘤细胞。

小鼠和治疗方案

给7-10只小鼠皮下植入1×10⁵个CT 26肿瘤细胞，然后在第7、11、15和19天I.P.200μg对照IgG(小鼠IgG2a)、P9-18-IgG1(鼠IgG1骨架)、FcR沉默sFcP9-18(具有Fc受体结合无效突变的鼠IgG2a骨架)或P9-18(鼠IgG2a骨架)进行治疗。

肿瘤体积生长

监测小鼠长达143天，每1-3天用卡尺测量肿瘤。根据下式计算肿瘤体积(mm³)：肿瘤长度×肿瘤宽度×2/2。

完全消退反应(CR)

该研究的完全消退定义为研究期间连续20次测量的肿瘤体积为0mm³。在研究期间每1-3天对动物进行完全消退(CR)事件评分。

CT26肿瘤的再攻击

在肿瘤清除后，允许在最初的肿瘤清除研究中存活的无肿瘤小鼠休息65-70天。在第107天，在动物中重新植入1×10⁵个CT26肿瘤细胞，没有其他治疗。在第113天向新对照小鼠施用IgG2a对照治疗。然后允许肿瘤再生长36天。对于第107-143天，如上所述测定肿瘤体积。

结果/结论

肿瘤生长研究的结果显示在图12A中。在施用IgG(IgG2a)对照抗体

的小鼠中，在最初的50天期间肿瘤达到900-1000mm³。相比之下，用P9-18-IgG2a的治疗

具有77％(7/9)CR，并且用sFcP9-18-IgG2a的治疗

具有70％(7/10)CR。这些结果证明了抗肿瘤作用不需要P9-18抗体的Fc区。

在IgG1骨架中重新格式化的P9-18 ABS

不抑制肿瘤生长，显示与对照相似的肿瘤生长。

再次攻击研究的结果显示于图12B中。没有其他治疗，最初用P9-18-IgG2a治疗的小鼠对新肿瘤具有100％(7/7)CR。同样，没有其他治疗，最初用sFcP9-18-IgG2a治疗的小鼠对新肿瘤具有100％(7/7)CR。用对照IgG(IgG2a)抗体的治疗

显示出与最初肿瘤清除研究相似的肿瘤生长。这些数据说明，用P9-18-IgG2a或sFc9-18-IgG2a初始治疗后，用P9-18或sFc9-18治疗的小鼠已经建立了对CT26肿瘤细胞的抗肿瘤免疫记忆。

6.11.14.实施例13：用抗-GAL9 P9-18治疗增加肿瘤相关树突细胞和肿瘤细胞上的PD-L2表达

测试抗-GAL9 P9-18对肿瘤相关树突细胞和肿瘤细胞上PD-L1和PD-L2细胞表面表达的影响。

动物和治疗

给3-5只BALB/c小鼠皮下植入CT26肿瘤细胞，并用在小鼠IgG2a骨架上格式化的P9-18ABS或用小鼠IgG2a对照治疗。所有治疗在第7和11天以200μg施用(I.P.)。

流式细胞术

在第13天解剖肿瘤，消化并分离。接着，使用抗CD45.1磁珠(Miltenyi Biotec，德国)分离了CD45.1⁺细胞群，其包括免疫细胞和肿瘤细胞。标记CD45.1⁺细胞群并通过流式细胞术分析肿瘤相关的树突细胞(CD11c+)和肿瘤细胞上的PD-L1和PD-L2细胞表面表达。使用的试剂显示在以下表13中。

*使用Lightning-Link Rapid DyLight 488标记试剂盒标记。

统计分析

使用GraphPad Prism 7软件(San Diego，CA)进行Welch校正的非配对t检验。

结果/结论

图13显示，用P9-18(鼠IgG2a骨架)或对照治疗后，PD-L1⁺或PD-L2⁺肿瘤相关树突细胞(CD11c⁺)的平均百分比和PD-L1或PD-L2在肿瘤相关树突细胞(CD11c⁺)上的平均细胞表面表达水平(GMI)。用P9-18治疗显著增加了PDL2⁺肿瘤相关树突细胞的百分比。与对照相比，肿瘤相关树突细胞上PD-L1和PD-L2表达量(GMI)也显著增加。参见图13。数据显示为平均值；误差条为±SEM。

图14显示，用P9-18(鼠IgG2a骨架)或IgG对照治疗后，PD-L1⁺或PD-L2⁺肿瘤细胞的平均百分比和肿瘤细胞上PD-L1或PD-L2的平均细胞表面表达水平(GMI)。用P9-18治疗显著增加了肿瘤细胞上PD-L2细胞表面表达的量(GMI)，但不增加PD-L1细胞表面表达。参见图14。数据显示为平均值；误差条为±SEM。不希望受任何理论束缚，我们推测PD-L2⁺肿瘤细胞可以抑制PD-L1与肿瘤上的PD-1结合。

7.等同方案

虽然已经举例说明和描述了各种具体实施方案，但是上述不是限制性的。应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种改变。在阅读本说明书后，许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。

Claims (67)

1.一种半乳糖凝集素-9(GAL9)抗原结合分子，其包含：对第一GAL9抗原的第一表位具有特异性的第一抗原结合位点(ABS)，其中所述第一抗原结合位点包含来自选自P9-28、P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆的所有三个VHCDR。

2.一种半乳糖凝集素-9(GAL9)抗原结合分子，其包含对第一GAL9抗原的第一表位具有特异性的第一抗原结合位点(ABS)，其中所述第一抗原结合位点包含来自选自P9-28、P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆的所有三个VLCDR。

3.一种半乳糖凝集素-9(GAL9)抗原结合分子，其包含对第一GAL9抗原的第一表位具有特异性的第一抗原结合位点(ABS)，其中所述第一抗原结合位点包含来自选自P9-28、P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

4.一种半乳糖凝集素-9(GAL9)抗原结合分子，其包含对第一GAL9抗原的第一表位具有特异性的第一抗原结合位点(ABS)，其中所述第一抗原结合位点包含来自选自P9-28、P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆的VL序列和VH序列。

5.权利要求4的GAL9抗原结合分子，其中第一抗原结合位点(ABS)还包含第一IgG重链多肽和第一IgG轻链多肽。

6.权利要求1-5任一项的GAL9抗原结合分子，其中GAL9抗原是人GAL9抗原。

7.权利要求1-6任一项的GAL9抗原结合分子，其中GAL9抗原结合分子还包含第二抗原结合位点(ABS)。

8.权利要求7的GAL9抗原结合分子，其中第二ABS对GAL9抗原是特异性的。

9.权利要求7的GAL9抗原结合分子，其中第二ABS对第一GAL9抗原的第二表位是特异性的。

10.权利要求7的GAL9抗原结合分子，其中第二ABS对第一GAL9抗原的第一表位是特异性的，并且与第一ABS相同。

11.权利要求7-10任一项的GAL9抗原结合分子，其中第二ABS包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的另一ABS克隆的所有三个VHCDR、所有三个VL CDR，或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

12.权利要求11的GAL9抗原结合分子，其中第二抗原结合位点包含来自所述另一ABS克隆的VL序列和VH序列。

13.权利要求12的GAL9抗原结合分子，其中第二抗原结合位点包含含有来自所述另一ABS克隆的VH序列的全长免疫球蛋白重链序列和含有来自所述另一ABS克隆的VL序列的全长免疫球蛋白轻链序列。

14.权利要求7的GAL9抗原结合分子，其中第二抗原结合位点对第一GAL9抗原之外的抗原是特异性的。

15.前述任一项权利要求的GAL9抗原结合分子，其中第一抗原结合位点包含来自选自P9-18、P9-15、P9-21、P9-22、P9-28和P9-32的任一ABS克隆的所有三个VH CDR、所有三个VLCDR，或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

16.权利要求1-14任一项的GAL9抗原结合分子，其中第一抗原结合位点包含来自选自P9-18、P9-15、P9-21和P9-28的任一ABS克隆的所有三个VH CDR、所有三个VL CDR，或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

17.权利要求1-14任一项的GAL9抗原结合分子，其中第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-15的所有三个VH CDR、所有三个VL CDR，或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

18.权利要求1-14任一项的GAL9抗原结合分子，其中第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-18的所有三个VH CDR、所有三个VL CDR，或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

19.权利要求1-14中任一项的GAL9抗原结合分子，其中第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-21的所有三个VH CDR、所有三个VL CDR，或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

20.权利要求1-14任一项的GAL9抗原结合分子，其中第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-28的所有三个VH CDR、所有三个VL CDR，或所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

21.权利要求1-20任一项的GAL9抗原结合分子，其中GAL9抗原结合分子包含选自全长抗体、Fab片段、Fv、scFv、串联scFv、Diabody、scDiabody、DART、tandAb、微型抗体和B-体的抗体形式。

22.权利要求1-21任一项的GAL9抗原结合分子，其中GAL9抗原结合分子在接触后增加激活的免疫细胞的TNF-α分泌，其中相对于用对照剂处理的激活的免疫细胞，所述增加为大于80倍的增加。

23.权利要求1-22任一项的GAL9抗原结合分子，其中GAL9抗原结合分子在接触后增加激活的免疫细胞的IFN-γ分泌，其中相对于用对照剂处理的激活的免疫细胞，所述增加为大于1.2倍的增加。

24.权利要求1-23任一项的GAL9抗原结合分子，其中GAL9抗原结合分子在接触后增加激活的CD8+T细胞的CD40L表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，所述增加为大于2倍的增加。

25.权利要求1-24任一项的GAL9抗原结合分子，其中GAL9抗原结合分子在接触后增加激活的CD8+T细胞的OX40表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，所述增加为大于2倍的增加。

26.权利要求1-25任一项的GAL9抗原结合分子，其中GAL9抗原结合分子在接触后增加激活的树突细胞(DC)的IL-12产生，其中相对于用对照剂处理的激活的DC，所述增加为大于20倍的增加。

27.权利要求1-26任一项的GAL9抗原结合分子，其中GAL9抗原结合分子在接触后增加激活的树突细胞(DC)上的PD-L2表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的DC，所述增加为大于4倍的增加。

28.权利要求22-27任一项的GAL9抗原结合分子，其中对照剂是阴性对照剂或阳性对照剂。

29.权利要求28的GAL9抗原结合分子，其中对照剂是对照抗体。

30.权利要求29的GAL9抗原结合分子，其中对照抗体选自：ECA42克隆抗GAL9抗体、RG9.1克隆抗GAL9抗体、RG9.35克隆抗GAL9抗体、抗PD1抗体和非GAL9结合性同种型对照抗体。

31.权利要求22-30任一项的GAL9抗原结合分子，其中激活的免疫细胞、激活的CD8+T细胞或激活的DC是通过肽刺激，例如通过已知诱导免疫应答的一种肽或多种肽来激活的。

32.GAL9抗原结合分子，其中所述GAL9抗原结合分子增加激活的免疫细胞的TNF-α分泌，其中相对于用对照剂处理的激活的免疫细胞，所述增加为大于80倍的增加。

33.GAL9抗原结合分子，其中所述GAL9抗原结合分子增加激活的免疫细胞的IFN-γ分泌，其中相对于用对照剂处理的激活的免疫细胞，所述增加为大于1.2倍的增加。

34.GAL9抗原结合分子，其中所述GAL9抗原结合分子增加激活的CD8+T细胞的CD40L表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，所述增加为大于2倍的增加。

35.GAL9抗原结合分子，其中所述GAL9抗原结合分子增加激活的CD8+T细胞的OX40表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，所述增加为大于2倍的增加。

36.GAL9抗原结合分子，其中所述GAL9抗原结合分子增加激活的树突细胞(DC)的IL-12产生，其中相对于用对照剂处理的激活的DC，所述增加为大于20倍的增加。

37.GAL9抗原结合分子，其中所述GAL9抗原结合分子增加激活的树突细胞(DC)上的PD-L2表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的DC，所述增加为大于4倍的增加。

38.GAL9抗原结合分子，其中所述GAL9抗原结合分子展示以下一个或多个性质：

A)增加激活的免疫细胞的TNF-α分泌，其中相对于用对照剂处理的激活的免疫细胞，所述增加为大于80倍的增加，

B)增加激活的免疫细胞的IFN-γ分泌，其中相对于用对照剂处理的激活的免疫细胞，所述增加为大于1.2倍的增加，

C)增加激活的CD8+T细胞的CD40L表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，所述增加为大于2倍的增加，

D)增加激活的CD8+T细胞的OX40表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的CD8+T细胞，所述增加为大于2倍的增加，

E)增加激活的树突细胞(DC)的IL-12产生，其中相对于用对照剂处理的激活的DC，所述增加为大于20倍的增加，

F)增加激活的树突细胞(DC)上的PD-L2表面表达，其中相对于用对照剂处理的激活的DC，所述增加为大于4倍的增加。

39.权利要求32-38任一项的GAL9抗原结合分子，其中对照剂是阴性对照剂或阳性对照剂。

40.权利要求39的GAL9抗原结合分子，其中对照剂是对照抗体。

41.权利要求40的GAL9抗原结合分子，其中对照抗体选自：ECA42克隆抗GAL9抗体、RG9.1克隆抗GAL9抗体、RG9.35克隆抗GAL9抗体、抗PD1抗体和非GAL9结合性同种型对照抗体。

42.权利要求32-41任一项的GAL9抗原结合分子，其中激活的免疫细胞、激活的CD8+T细胞或激活的DC是通过肽刺激，例如通过已知诱导免疫应答的一种肽或多种肽来激活的。

43.权利要求32-39任一项的GAL9抗原结合分子，其包含对第一GAL9抗原的第一表位具有特异性的第一抗原结合位点，其中第一抗原结合位点包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

44.权利要求43的GAL9抗原结合分子，其包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆的VL序列和VH序列。

45.权利要求44的GAL9抗原结合分子，其包含含有VH序列的全长免疫球蛋白重链序列和含有VL序列的全长免疫球蛋白轻链序列，其中VH序列和VL序列来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的任一ABS克隆。

46.权利要求32-45任一项的GAL9抗原结合分子，其中GAL9抗原是人GAL9抗原。

47.权利要求32-46任一项的GAL9抗原结合分子，其中GAL9抗原结合分子还包含第二抗原结合位点。

48.权利要求47的GAL9抗原结合分子，其中第二抗原结合位点对GAL9抗原是特异性的。

49.权利要求48的GAL9抗原结合分子，其中第二抗原结合位点与第一抗原结合位点相同。

50.权利要求47的GAL9抗原结合分子，其中第二抗原结合位点对第一GAL9抗原的第二表位是特异性的。

51.权利要求50的GAL9抗原结合分子，其中第二抗原结合位点包含来自选自P9-02B、P9-04、P9-05、P9-08、P9-09、P9-10、P9-15、P9-16、P9-18、P9-19、P9-20、P9-21、P9-22、P9-27、P9-28、P9-31、P9-32、P9-36、P9-39、P9-49、P9-54和P9-58的另一ABS克隆的所有三个VHCDR和所有三个VL CDR。

52.权利要求51的GAL9抗原结合分子，其中第二抗原结合位点包含来自另一ABS克隆的VL序列和VH序列。

53.权利要求52的GAL9抗原结合分子，其中第二抗原结合位点包含含有来自另一ABS克隆的VH序列的全长免疫球蛋白重链序列和含有来自另一ABS克隆的VL序列的全长免疫球蛋白轻链序列。

54.权利要求47的GAL9抗原结合分子，其中第二抗原结合位点对第一GAL9抗原之外的抗原是特异性的。

55.权利要求43-54任一项的GAL9抗原结合分子，其中第一抗原结合位点包含来自选自P9-15、P9-18、P9-21、P9-22、P9-28和P9-32的任一ABS克隆的所有三个VH CDR和所有三个VLCDR。

56.权利要求43-54任一项的GAL9抗原结合分子，其中第一抗原结合位点包含来自选自P9-15、P9-18、P9-21和P9-28的任一ABS克隆的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

57.权利要求43-54任一项的GAL9抗原结合分子，其中第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-15的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

58.权利要求43-54任一项的GAL9抗原结合分子，其中第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-18的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

59.权利要求43-54任一项的GAL9抗原结合分子，其中第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-21的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

60.权利要求43-54任一项的GAL9抗原结合分子，其中第一抗原结合位点包含来自ABS克隆P9-28的所有三个VH CDR和所有三个VL CDR。

61.权利要求32-60任一项的GAL9抗原结合分子，其中GAL9抗原结合分子包含选自全长抗体、Fab片段、Fv、scFv、串联scFv、Diabody、scDiabody、DART、tandAb、微型抗体和B-体的抗体形式。

62.一种GAL9抗原结合分子，其与前述任一项权利要求的GAL9抗原结合分子结合相同的表位。

63.一种GAL9抗原结合分子，其与前述任一项权利要求的GAL9抗原结合分子竞争结合。

64.前述任一项权利要求的GAL9抗原结合分子，其是纯化的。

65.一种药物组合物，其包含前述任一项权利要求的GAL9抗原结合分子和药学上可接受的稀释剂。

66.一种用于治疗受试者癌症的方法，所述方法包括给受试者施用治疗有效量的权利要求65的药物组合物。

67.权利要求66的方法，其中癌症选自：胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、黑素瘤、尤文肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、B-ALL、血液学癌症、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、子宫癌和病毒诱发的癌症。

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