CN1143390A - 合成荧光标记的蛋白质的方法 - Google Patents

合成荧光标记的蛋白质的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1143390A
CN1143390A CN95191586A CN95191586A CN1143390A CN 1143390 A CN1143390 A CN 1143390A CN 95191586 A CN95191586 A CN 95191586A CN 95191586 A CN95191586 A CN 95191586A CN 1143390 A CN1143390 A CN 1143390A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rhodanese
rrna
protein
cpm
trna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN95191586A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1098932C (zh
Inventor
W·库德利基
G·克雷默尔
B·哈德斯蒂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION
Research Development Foundation
Original Assignee
RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION filed Critical RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION
Publication of CN1143390A publication Critical patent/CN1143390A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1098932C publication Critical patent/CN1098932C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种在无细胞蛋白质合成系统中合成荧光标记的蛋白质的方法，其步骤包括：(a)将取自无细胞提取物的核糖体样品与包含目标蛋白编码序列的质粒DNA一起培养，所述的样品与带荧光标记的氨酰tRNA一起培养在偶联的转录/翻译培养基中；(b)通过将新合成的荧光标记的蛋白质与样品中其它荧光组分分离来部分纯化所述的荧光标记的蛋白质；(c)测定合成蛋白质的量；(d)测定新合成蛋白质的荧光；(e)测定新合成蛋白质的生物活性。

Description

合成荧光标记的蛋白质的方法
发明背景发明领域
本发明主要涉及分子生物学、生物技术和蛋白质合成领域。特别是，本发明涉及一种在无细胞蛋白质合成系统中合成荧光标记的蛋白质的新方法。现有技术
有证据表明，新生多肽在核糖体上获得二级和三级结构。Beckman及其同事(1990)证明Hsp70与新生蛋白相互作用，并假定发生了共翻译折叠。核糖体本身可能在折叠过程中起着重要作用。Lim和Spirin(1986)假设合成的新生肽一定呈α螺旋。已有人综述了利用荧光技术来研究新生肽和新生蛋白在核糖体上的延伸和折叠。过去，这些技术被用于说明MS2蛋白在与核糖体结合时发生折叠。
已发现伴随蛋白帮助许多蛋白从它们的变性状态折叠成活性状态，但关于这些蛋白质在翻译过程中是否在核糖体上发生作用知之甚少。Hartl及其同事提供数据表明，DnaJ是在小麦胚芽核糖体上与萤水虫萤光素酶或氯霉素乙酰基转移酶新生肽结合的第一个伴随蛋白(Hendrick等，1993)。
先前的技术缺少在无细胞蛋白质合成系统中合成荧光标记的蛋白质的有效方法。本发明实现了本领域长期存在的这种需求和期望。
                        发明概述
在本发明中，来自香豆素—马来酰亚胺基-SAcMet-tRNAf(CPM-SAcMet-tRNAf)的香豆素被掺入在细菌的无细胞转录/翻译偶联系统中核糖体上合成的新生多肽N末端。荧光技术被用于监测N末端探针的局部环境和迁移率以及伴随蛋白对来自核糖体上的新生或全长多肽的折叠、激活和释放的顺序作用。本发明显示，在新生硫氰酸酶多肽以肽基-tRNA的形式结合在核糖体上时，伴随蛋白影响它们的折叠。伴随蛋白帮助它们以酶活性蛋白的形式从核糖体上释放。
在本发明的一个实施例中，提供了一种在无细胞蛋白质合成系统中合成荧光标记蛋白的方法，包括：(a)将从无细胞提取物中获得的核糖体样品与含目标蛋白编码序列的质粒DNA一同培养，所述的样品与具有荧光标记的氨酰tRNA一起培养在偶联的转录/翻译培养基中；(b)通过将新合成的荧光标记蛋白与所述样品中的其它荧光组份分离来部分纯化所述的荧光标记蛋白；(c)测定合成蛋白的量；(d)测定新合成蛋白的荧光及(e)测定新合成蛋白的生物活性。
以下为了阐述目的，给出的本发明优选实施例的说明将明确本发明的其它及进一步的内容、特点和优点。
                        附图简述
为了达到和具体理解本发明的上述特点、优点和目的以及其它方面，参照附图中说明的某些实施例可更具体地说明以上概述的本发明。这些附图构成说明书的一部分。但需要注意的是，附图说明本发明的优选实施例，所以不应被视为其范围的限制。
图1显示了在〔14C〕亮氨酸存在下翻译得到或由CPM-SAc〔35S〕Met-tRNAf引发的游离的及与核糖体结合的硫氰酸酶的分析结果。以〔14C〕亮氨酸(160Ci/mol)或CPM-SAc〔35S〕Met-tRNAf(4,000Ci/mol)为放射活性前体，利用偶联的转录/翻译来合成硫氰酸酶。培养后，离心反应混合物。通过SDS-PAGE和放射自显影术分析上清液和重悬的核糖体。所示为放射自显影图(前2幅分别标为〔14C〕亮氨酸和CPM〔35S〕Met)。泳道1和2，得自与中间〔14C〕亮氨酸的共同培养；泳道3和4，得自与N末端CPM-SAc-〔35S〕甲硫氨酸的共同培养。泳道1和3，20ul上清液；泳道2和4，20ul重悬的核糖体。图1的第3幅(标为抗RHO抗体)显示用抗硫氰酸酶抗体探测的Western印迹。利用Amersham的ECL系统可以看到与第二抗体共价结合的辣根过氧化物酶的位置。箭头指示出得自牛肝的天然硫氰酸酶的电泳迁移率。
图2显示了利用硝基甲烷的香豆素荧光的猝灭。给出释放的或与核糖体结合的CPM-硫氰酸酶的稳态荧光强度的Stern-Volmer点，与游离CPM-SAc-Met-tRNA(线1)和与核糖体结合的该tRNA(线6)比较。线2，上清液中酶活性形式的CPM-硫氰酸酶；线3，用DnaK释放的CPM-硫氰酸酶；线4，用嘌呤霉素释放的CPM-硫氰酸酶；线5，与核糖体结合的CPM-硫氰酸酶。
图3显示与抗香豆素抗体共同培养前和后的CPM标记的硫氰酸酶的荧光发射谱。对与核糖体结合的(A)或释放入上清液的(B)CPM-硫氰酸酶进行了分析(实线)。然后加入抗香豆素IgG并再次获取发射光谱(虚线)。插入框中给出了各个被分析样品的定量荧光数据。
图4显示DnaJ影响抗香豆素IgG与核糖体结合的CPM-硫氰酸酶的相互作用。首先，获取与稀疏霉素共同培养后的核糖体上CPM-硫氰酸酶的光谱(实线)。设置三份平行样品(在核糖体上与稀疏霉素共培养的CPM-硫氰酸酶)，加入DnaJ或DnaK或以上两者。获取光谱(未示出)并进行分析。数据被发现与表VI中的一致或非常相近。然后在每一样品中加入抗香豆素IgG。室温培养10分钟后，获取光谱并在此显示。(×－×)DnaJ＋IgG；(…)DnaK＋IgG；(－－)DnaJ和DnaK＋IgG。
                      本发明的详细说明
在本发明的描述中，使用了下列缩写：RHO，硫氰酸酶；CPM，3-(4-马来酰亚胺基苯基)-4-甲基-7-(二乙基氨基)香豆素；CPM-硫氰酸酶，N末端的甲硫氨酸用CPM标记的硫氰酸酶；SDS-PAGE，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；抗-CPM IgG，抗香豆素的兔多克隆抗体；CPM-SAc-Met-tRNAf，先被甲硫氨酸氨酰化，再在甲硫氨酸的氨基通过巯基乙酸以CPM标记的起始tRNA；IgG，免疫球蛋白；Fab，IgG的木瓜蛋白酶酶解片段。
本发明还涉及一种在无细胞蛋白质合成系统中合成荧光标记的蛋白质的方法，其步骤包括：(a)将得自无细胞提取物的核糖体样品与包含目标蛋白编码序列的质粒DNA一同培养，所述的样品与具有荧光标记的氨酰tRNA一起培养在偶联的转录/翻译培养基中；(b)通过将新合成的荧光标记蛋白与所述样品中的其它荧光组份分离来部分纯化所述的荧光标记蛋白；(c)测定合成蛋白量；(d)测定新合成蛋白的荧光及(e)测定新合成蛋白的生物活性。
通常，在本发明中，荧光标记位于所述蛋白质的N末端。在某优选实施例中，用于本发明方法的氨酰tRNA是甲硫氨酰-tRNA-甲硫氨酸/f。较好的是，荧光标记与起始tRNA的氨基酸共价连接。
在本发明的方法中，转录/翻译培养基一般含有RNA聚合酶、三磷酸核苷、能量再生系统和溶于缓冲液中的氨基酸。在某优选实施例中，从称为S30的E.coli提取物中分离出核糖体。在某优选实施例中，质粒DNA是非线性化的。较好的是，培养步骤(a)在37℃进行约30分钟。而且，在本发明的方法中，部分纯化荧光标记蛋白质，其方法选自离心、离子交换色谱和凝胶过滤。
以下给出的实施例是为了说明本发明的各种实施方法，而不是为了对本发明进行任何形式的限定。
                     实施例1化学试剂
向Boehringer-Mannheim购买三磷酸核苷和E.coli tRNA；3-(4-马来酰亚胺基苯基)-7-二乙基氨基-4-甲基香豆素(CPM)购自Molecular Probes Inc.(Eugene，OR)。tRNAf Met，利福平、嘌呤霉素、稀疏霉素和其它生物化学试剂购自Sigma。核糖核酸酶A和T1的混合物(“RNase混合物”)购自Ambion(Austin，TX)。〔14C〕亮氨酸和〔35S〕甲硫氨酸购自NEN-Dupont。伴随蛋白DnaK、DnaJ、GrpE，GroEL和GroES购自Epicentre Technologies(Madison，WI)。从牛肝线粒体中分离原初硫氰酸酶质粒和硫氰酸酶，由Paul Horowitz博士(University of TexasHealth Science Center，San Antonio，TX)提供多克隆抗硫氰酸酶抗体。由Warren Tate博士(University of Otago，New Zealand)提供抗E.coli释放因子1和2的多克隆抗体。第二抗体(山羊-抗-兔IgG-辣根过氧化物酶和兔-抗-绵羊IgG辣根过氧化物酶)购自Zymed(South SanFrancisco，CA)。
                  实施例2在体外系统中
按照Kudlicki等在Anal.Biochem.206：389(1992)中所述进行质粒的增殖、SP6 RNA聚合酶的分离和E.coli的无细胞提取物(S30)的制备以及核糖体组份与S30的分离。简而言之，质粒是按标准方法(J.Sambrook等，(1989)Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press)制备的，但用Q柱色谱替代CsCl离心步骤。SP6和T7RNA聚合酶可购置。使用的核糖体组份是根据G.Zubay从E.coli K12(A19)制备的S30分离而得的。细胞在37℃培养于加有20％葡萄糖(10ml/2L培养基)的LB(Sigma)培养液中。在对数中期于37℃收获细胞，并在压碎器中裂解。然后在30,000×g离心30分钟，由此制得S30提取物。在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，苯基甲基磺酰氯，终浓度为0.5mM。将等份的S30(每份9ml)在Beckman Ti 50离心转头中以47,000rpm转速离心4小时。将沉淀的核糖体在1.0ml的20mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM Mg(OAc)2和1mM DTT中重悬成约1200A260单位/ml的悬浮液。将此核糖体组份分成小份储存于-70℃。
根据以前对用CPM标记Phe-tRNAPhe的α氨基所作的描述(Odom等，1990)制备CPM-SAcMet-tRNA。简而言之，用二硫基二乙酸酰化〔35S〕Met-tRNAf中甲硫氨酸的α氨基，然后还原成相应的硫基乙酸衍生物。其中的巯基与马来酰亚胺(CPM)反应。在兔体内诱导抗CPM抗体；如已有的描述(Picking等，1992)，从免疫的兔血清中分离IgG组份。
偶联的转录/翻译体外系统已有详细的记述(Kudlicki等，1992)。简而言之，总体积30μl的用于进行偶联的转录/翻译系统中含有：50mM Tris-乙酸(pH7.8)、14mM Mg(OAc)2，36mM NH4OAc、72mM KOAc，2mMCa(OAc)2，0.5mM EDTA、2％聚乙二醇-6000、2mM DTT、1.2mMATP、GTP、UTP和CTP各0.8mM，0.5mM cAMP、27mM磷酸烯醇式丙酮酸、0.35μg丙酮酸激酶、1μg亚叶酸、83μM14C-亮氨酸、其它19种氨基酸各330μM、20μg E.coli tRNA(Boehringer)、0.5μg利福平、0.3mM葡萄糖-6-磷酸盐、1.2A260单位E.coli核糖体组份、0.5μg质粒DNA和0.5μg SP6 RNA聚合酶。稀释14C-亮氨酸至40Ci/摩尔用于测定。在37℃培养30分钟。为了大规模合成CPM-硫氰酸酶，将反应混合物放大至0.9ml，除含上述盐和低分子量组份外另加5mM Na2S2O3。将60A260单位未洗涤过的核糖体与约10-15μg非线性化质粒(pSP65)一起培养，该质粒含有位于SP6启动子下游的硫氰酸酶编码序列。将CPM-SAc-〔35S〕Met-tRNAf(350Ci/mol)用作放射性前体；省去亚叶酸。在一些对照实验中，〔14C〕亮氨酸(40 Ci/mol)与非放射性fMet-tRNAf共用。在37℃培养30分钟后，样品加载于0.6ml蔗糖缓冲液上，45,000rpm离心45分钟。然后，收集保存上清液，去除蔗糖层；漂洗核糖体沉淀后重悬在60μl的20mM Tris-HCl，pH7.5、10mM Mg(OA)2、30mM NH4OAc、1mMDTT、5mM Na2S2O3(溶液A)中。离心后，马上用核糖核酸酶A和T1(各为0.1mg和2,000U/ml)在37℃处理上清液15分钟，以降解剩余的CPM-SAc-〔35S〕Met-tRNAf。然后将产生的反应混合物在平衡于溶液A中的Sephadex G100柱(1×20cm)上进行色谱，从含香豆素和〔35S〕甲硫氨酸的低分子量降解产物中分离出新合成的CPM标记的硫氰酸酶。
                  实施例3荧光测定
在SLM-Aminco Instruments Inc.(Urbana，IL)的8000C型光子计数荧光分光光度计上进行荧光测定。以1nm发射间隔、0.5秒/波长增加的扫描速度测定光谱；激发波长为390nm。根据以CPM-SAc-甲硫氨酸形式存在于样品中的〔35S〕甲硫氨酸的放射活性标定光谱和相应的相对量子产率。通过积分发射光谱测定相对荧光量子产率。将上清液中CPM-硫氰酸酶的相对量子产率设为1.00，其它的量子产率都是与该值的比较值。如Odom等(1984)所述在480nm发射波长测定荧光各向异性。为了进行荧光研究，将一份重悬的核糖体或一份处理后的上清液以420μl的总体积培养在比色杯中，其中含有上述偶联的转录/翻译培养基中的盐和低分子量组份但没有氨基酸和UTP及CTP(溶液B)。测得光谱后，加入最少量的待测组份。再次测定光谱前，将比色杯在37℃培养10分钟。加入的分别是：抗CPM-IgG，0.1mg；伴随蛋白GroES，1.6μg；GroEL，6μg；DnaK，4μg；DnaJ，2μg；GrpE，3μg。
                    实施例4硫氰酸酶的定量测定
用三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白质来定量测定硫氰酸酶多肽的量，以本领域熟知的方式进行SDS-PAGE和放射自显影术分析。根据Tsalkova等(1993)给出的Sorbo(1953)分析硫氰酸酶活性。简而言之，在量热实验中测定硫氰酸酶的酶活性，该实验利用该酶以S2O3 2-为底物测定CN-向SCN-的转化。通过测定该产物与铁离子的复合物在460nm处的光吸收来检测和定量形成的SCN-。一个单位定义为在该实验系统中于37℃下生成1μmol产物/分钟的酶量。
用针对释放因子1和2的胎牛抗体或兔抗硫氰酸酶抗体，再用对应的已连接辣根过氧化物酶的第二抗体检测SDS-PAGE的Western印迹。利用Amershams的ECL的产品通过化学发光检测辣根过氧化物酶。
                 实施例5N末端以香豆素标记的硫氰酸酶的折叠
为了测试伴随蛋白在新生硫氰酸酶折叠和活化中的作用，香豆素在翻译中从CPM-SAc-〔35S〕Met-tRNAf中掺入酶的N末端。利用化学反应酶衍生法形成的Met-tRNAf，然后用于引发上述的E.coli核糖体上蛋白质的合成。在用三氯乙酸沉淀体外合成的硫氰酸酶多肽后，通过放射活性检测CPM-SAc-〔35S〕甲硫氨酸在转录/翻译偶联系统中形成的多肽N末端的掺入情况。如图1所示，利用SDS-PAGE和放射自显影术鉴定产物。从上清液中分离出核糖体后进行分析。上清液中的和核糖体组份中的全长硫氰酸酶在SDS聚丙烯酰胺凝胶上的迁移率存在着差异。
为了进一步鉴定偶联的转录/翻译过程中合成的全长产物，将SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后得到的多肽转移至PVDF膜上并用抗硫氰酸酶抗体检测。图1显示被抗硫氰酸酶抗体识别的两种全长形式。由于与核糖体结合的多肽可以被转化为具有酶活性的可溶性蛋白，本发明确切显示，该多肽是可溶性酶的前体形式。
可溶性的和与核糖体结合的多肽差异的本质还不知道。一种可能性是，迁移率较低的形式与tRNA或由其衍生的核苷酸共价结合。以下观察结果表明这种假设是不正确的：电泳迁移方式不受用核糖核酸酶混合物进行的样品预培养或在pH10.5、100℃预培养10分钟的影响。肽与tRNA3’末端核糖间的酯键在后一种情况中必定被水解。而且，没有检测到具有氯霉素乙酰转移酶，蓖麻毒蛋白或二氢叶酸还原酶的核糖体结合形式的类似迁移缓慢的多肽。所以，迁移缓慢的多肽主要与硫氰酸酶有关。还没有确定迁移缓慢形式的本质，但它很可能是因为翻译通过了位于硫氰酸酶编码序列末端的UGA终止密码子，从而导致在另一同相UAG密码子位置终止前13个附加密码子的翻译。但是，令人惊奇的是这种较长前体形式在多肽的活化和释放中可以明显地充分转化为可溶性形式。
来自加入反应混合物的CPM-SAc-〔35S〕Met-tRNAf中的放射性标记的甲硫氨酰只可以出现在硫氰酸酶的N末端而不可以在内部。CPM与用巯基乙酸酰化的甲硫氨酸巯基之间的硫酯键在培养条件下具有化学和酶学稳定性。CPM-SAcMet-tRNA不会被甲硫氨酰-tRNA合成酶脱酰基化，而tRNAm Met不会在酶作用下被CPM-SAc-〔35S〕甲硫氨酸氨酰化。而且，在反应混合物中包含了大量过量的非标记的甲硫氨酸(350μM)。这大大降低了可能存在并使甲硫氨酸掺入多肽内部位置的游离〔35S〕甲硫氨酸的比放射活性。所以，香豆素的摩尔数被认为正比于〔35S〕甲硫氨酸的放射性，并用放射性标定荧光强度和光谱数据，从而使以下给出的这些参数的数据正比于荧光量子产率并可在不同实验间比较。
                          实施例6新合成的CPM标记的硫氰酸酶的分布
新合成的CPM标记的硫氰酸酶在合成后立即通过一层蔗糖溶液离心沉淀出核糖体，然后分析其分别在可溶性和核糖体组份中的分布。表I显示〔14C〕亮氨酸掺入了N末端未被香豆素修饰的硫氰酸酶多肽的内部。这种情况中，非放射性fMet-tRNAf被用于引发蛋白质的合成。这些新合成多肽中的约半数(根据〔35S〕甲硫氨酸测定为62％及根据〔14C〕亮氨酸测定为43％)被发现存在于核糖体组份中。其余新合成蛋白质中的大多数在上清液中被回收。通过分析抽干的聚丙烯酰胺凝胶中的多肽放射自显影术判断，上清液中蛋白质产物是全长硫氰酸酶(图1)。
由硫氰酸酶多肽中〔35S〕甲硫氨酸和〔14C〕亮氨酸的掺入情况来测定无细胞转录/翻译系统中合成的硫氰酸酶的摩尔数。在所述条件下，只从质粒(pSP65)转录一段编码序列，即硫氰酸酶的mRNA。无质粒的反应混合物中〔14C〕亮氨酸在肽中的掺入量低于质粒存在下掺入量的5％，并将其作为空白减去。全长硫氰酸酶每条链含24个亮氨酸残基，分子量为33,000。所以，利用已知的全长产物的百分率(对上清液组份来说近乎100％)，就可以由N末端的甲硫氨酸或内部的亮氨酸计算出合成的全长蛋白质的摩尔数。该值被用于计算硫氰酸酶的酶比活性即单位/mg硫氰酸酶。硫氰酸酶活性的单位数定为形成一摩尔硫氰酸/每分钟。
                        实施例7硫氰酸酶活性
根据掺入的〔14C〕亮氨酸测得的上清液中硫氰酸酶的酶比活性为774单位/mg硫氰酸酶。这一活性与报道的天然牛硫氰酸酶的比活性和用分离自牛肝的天然硫氰酸酶测定的值相似。所以，从核糖体上释放入上清液的翻译产物几乎全部折叠成天然构象。相反，核糖体上的新生多肽没有酶活性。由香豆素〔35S〕甲硫氨酸形成新合成的硫氰酸酶N末端时存在类似情况：上清液中的硫氰酸酶有活性而核糖体上的多肽没有酶活性。
在使用N末端探针的蛋白质合成过程中由核糖体上释放的〔35S〕甲硫氨酸标记的硫氰酸酶较少，但它的表观酶比活性(833单位/mg硫氰酸酶)比天然酶高约17％。这可能是因为有些N末端〔35S〕甲硫氨酸被从新形成的酶上去除。
                    实施例8新合成的硫氰酸酶的稳定性
直接在上清液和核糖体组份中测定新合成硫氰酸酶N末端的CPM-〔35S〕甲硫氨酸的稳定性。在37℃培养60分钟可观察到损失了约10％三氯乙酸可沉淀的放射性，而上清液中的酶活性没有损失(没有给出数据)。
天然硫氰酸酶在N末端没有甲硫氨酸。从多种蛋白质的N末端去除甲硫氨酸的特异性酶是已知的。如果是体外合成的硫氰酸酶，利用放射性不会测得在N末端没有香豆素-〔35S〕甲硫氨酸的多肽，结果低估了这些样品中存在的硫氰酸酶蛋白的量。由N末端甲硫氨酸计算而得的上清液中较高的酶比活性(833单位/mg比根据内部的亮氨酸测得的744单位/mg，表I)反映了对这些样品中存在的硫氰酸酶蛋白的低估。而且，少量的硫氰酸酶分子可能是由在制备S30组份时未除尽的非标记的内源甲酰甲硫氨酸(fmet-tRNA)引发的。必须指出，合成和离心后，立即用核糖核酸酶处理上清液，然后在Sephadex G100柱上色谱分析以将CPM标记的硫氰酸酶与低分子量荧光化合物分离。无论如何，表I显示香豆素可以掺入在硫氰酸酶的N末端，而且这些分子从核糖体上释放时是有酶活性的。
                             表I
         有酶活性的带N末端CPM-SAcMet的硫氰酸酶的合成
                 总反应混合物  核糖体组份  上清液N末端CPM-〔35S〕-Met掺入量(pmol)              3.4          2.1       1.2酶活性(单位×10-3)       32.1         0.0       33比活性(单位/mg)          -1            0.0        8333内部〔14C〕亮氨酸掺入量(pmol)             65(2.7)2     30         0酶活性(单位×10-3)      28(1.2)2     0.0        0.0比活性(单位/mg)          30.3(1.3)2   31.0       744以CPM-SAc-〔35S〕Met-tRNA或fMet-tRNAf为起始tRNA，以〔14C〕亮氨酸为放射性标记，利用偶联的转录/翻译合成硫氰酸酶。在37℃培养30分钟后，离心反应混合物制取核糖体组份和上清液，分别测定其中合成的蛋白质量和酶活性。给出的是30μl反应混合物量。天然硫氰酸酶的酶比活性约750单位/mg蛋白质。1是因为核糖体上的不完全和全长无活性硫氰酸酶多肽而没有计算。2是计算括号中酶(24亮氨酸残基/硫氰酸酶多肽)的pmol。为3该表观酶比活性始终被发现大于天然硫氰酸酶的比活性。
                     实施例9CPM标记的硫氰酸酶的荧光特性
表II概括了上清液中游离的和与核糖体结合的CPM-SAcMet-硫氰酸酶的荧光参数。图3A和3B中给出了相应的发射光谱。为了比较，表II中包括了游离在溶液中或与核糖体结合的CPM-SAc-Met-tRNAf的数据。每份样品中N末端标记的CPM-SAcfMet-tRNAf或硫氰酸酶的摩尔数(根据〔35S〕甲硫氨酸测得)相似；然后用放射性将荧光数据标定为共同的香豆素摩尔数。相对于相对量子产率设定为1.00的上清液中酶活性CPM-SAcMet-硫氰酸酶的量子产率给出荧光量子产率Q(表II)。这样，不同的图和表中的光谱和相对量子产率数据在此可直接比较。
上清液中酶活性CPM-硫氰酸酶的量子产率略高于与核糖体结合的CPM-硫氰酸酶(相对量子产率1.00比0.89)，但两者都大大高于游离在溶液中(Q＝0.43)或与核糖体的肽基转移酶中心结合(Q＝0.63)的CPM-SAcMet-tRNAf的荧光强度。后者是形成N末端带CPM-SAc甲硫氨酸的新生硫氰酸酶的肽合成引发前的状态。量子产率反映了香豆素探针的局部环境。对游离的香豆素或CPM-半胱氨酸而言，随溶剂极性的降低，在发射光谱中量子产率增加并发生红移。为了比较，在水中游离CPM-半胱氨酸的绝对量子产率和最大发射波长分别为0.31和486nm，但在乙醇中分别为0.91和470nm，在二噁烷中分别为0.51和460nm。所以，表II中的光谱数据似乎显示，与核糖体结合的CPM-SAcMet-tRNAf的香豆素探针当它位于新生肽N末端时遇到的是更具疏水性的环境，但仍以肽基-tRNA的形式结合在核糖体上。当新生的硫氰酸酶以酶活性形式释放入上清液时，量子产率进一步增加。这些差异反映了如下文所考虑的新生硫氰酸酶最终折叠成天然构象过程中的不同阶段。溶液中游离的CPM-Met-tRNAf的荧光各向异性约0.17，与核糖体结合时约0.36(表II)。与核糖体结合的硫氰酸酶的N末端CPM-Met的各向异性为0.31，但当酶从核糖体上以酶活性形式释放入上清液时下降至0.18。该差异似乎反映了由核糖体造成的荧光基团活动的限制，这是因为探针本身活动的位阻效应和/或游离硫氰酸酶溶液和与核糖体结合的硫氰酸酶的旋转松弛或旋转时间的差异。后一个参数反映硫氰酸酶和核糖体的质量差异。
                    表IICPM-SAcMet-硫氰酸酶和游离在溶液中及与核糖体结合的CPM-SAcMet-tRNA的荧光特性被测组份          EMax 1(nm)      Rel.Q2           A3A.CPM-硫氰酸酶上清液              473            1.00            0.18与核糖体结合        471            0.89            0.31B.CPM-SAcMet-tRNAf上清液              487            0.43            0.17与核糖体结合        480            0.63            0.36
用与测定表I中硫氰酸酶合成和酶活性样品相同或类似的样品测定硫氰酸酶的荧光特性。为了比较，将CPM-SAcMet-tRNA的荧光数据(上述的B)包括在内。1EMax：最大发射波长。2Rel.Q：相对荧光量子产率；由积分荧光发射光谱测得，根据〔35S〕甲硫氨酸的放射性标定，表示为与上清液中酶活性CPM-SAcMet-硫氰酸酶(参见表I)的相对值。3A：荧光各向异性。
               实施例10伴随蛋白对与核糖体结合的硫氰酸酶的作用
在伴随蛋白存在下，由核糖体上释放的酶是具有酶活性的，其比活性与天然硫氰酸酶相似，并且含有较高比例的具有天然构象的酶分子。相反，与核糖体结合的硫氰酸酶是没有酶活性的。
本发明说明了伴随蛋白(DnaJ、DnaK、GrpE、GroEL、GroES)对来自与核糖体结合的、没有酶活性的新生CPM-硫氰酸酶的作用，并将观察到的作用与酶的释放和酶比活性相关联。后一种情况被作为硫氰酸酶正确折叠成其天然构象的尺度。单独加入5种伴随蛋白中的每一种，然后在非翻译条件下同时一起加入含带全长硫氰酸酶的核糖体的反应混合物中。
表IIIA显示，伴随蛋白DnaK和GroES均引起硫氰酸酶多肽的明显释放，这一点反映在荧光各向异性的降低。相反，DnaJ产生小的但明显的各向异性的增加。伴随蛋白GrpE和GroEL对荧光的作用很小。当核糖体与所有伴随蛋白一起培养时，可以观察到对由核糖体上释放的蛋白质量和荧光的较大作用。该反应混合物然后被离心分离成核糖体和上清液组份。
表IIIB中给出上清液中硫氰酸酶多肽中〔35S〕甲硫氨酸的pmol数。与所有伴随蛋白一起培养后上清液中的硫氰酸酶的酶比活性达到天然硫氰酸酶的水平，与天然酶的745单位/mg相比为695单位/mg。被释放物质的量子产率、各向异性和最大发射波长也与具有酶活性的硫氰酸酶的很相似(参见表II)。相反，只有DnaK或GroES存在下，从核糖体上释放的硫氰酸酶基本没有酶活性，即使其90％以上由全长硫氰酸酶多肽组成(没有给出数据)。而且，它的量子产率和最大发射波长与具有酶活性的硫氰酸酶的不同，这表明该物质没有折叠成天然构象。所以，本发明证明伴随蛋白只有在一同作用于与核糖体结合的新生硫氰酸酶时，才有效地促进向天然构象折叠。DnaK和GroES引起新生链从核糖体上的部分释放，但必须有其它伴随蛋白才完成在核糖体上的折叠过程。
                      表III由伴随蛋白介导的来自与核糖体结合的CPM-SAcMet-硫氰酸酶的荧光的改变A.带CPM-SAc-〔35S〕Met-标记的硫氰酸酶的核糖体添加物               EMax 1(nm)      Rel.Q1         A1无                     471            0.89          0.31DnaJ                   471            0.92          0.32DnaK                   473            0.97          0.26GrpE                   471            0.89          0.29GroEL                  472            0.90          0.30GroES                  474            0.94          0.25全部                   475            1.03          0.21B.来自上述A的上清液添加物    EMax 1   Rel.Q1   A1    被释放的    酶比活性
      (nm)                      硫氰酸酶    (单位/
                                (pmol)      mg)无         *          *      *      0.22DnaJ       *          *      *      0.15DnaK       485        1.17   0.19   1.95        2GrpE       *          *      *      0.22GroEL      *          *      *      0.30GroES      480        1.12   0.19   1.50        3全部       473        1.00   0.18   2.61        695
含有4.5pmol新生硫氰酸酶中的CPM-SAc〔35S〕甲硫氨酸的核糖体在非翻译条件下与指定的伴随蛋白在37℃培养10分钟。直接测定(A部分)或在离心之后对上清液测定(B部分)反应混合物的荧光特性。只测定上清液的酶活性。1缩写的注释见表II。*物质量不足以进行荧光特性的可靠测定。
SDS-PAGE后进行考马斯亮蓝染色来评定商购的伴随蛋白质量。伴随蛋白产生期望的大小或电泳迁移率的单条带，但GroES含有较高分子量的污染，而DnaJ看上去是双条带的。检查全部使用的伴随蛋白中由释放因子1或释放因子2引起的污染。用相应的抗体检测SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的Western印迹。用此法在各种伴随蛋白制剂中都没有测得释放因子中的任一种(没有给出数据)。
表III显示单独的伴随蛋白都不能将无活性的与核糖体结合的硫氰酸酶转化成其天然构象。然后，对顺次加入一种或两种伴随蛋白进行检查。表IV中显示的本发明未预计到的一方面内容是，添加顺序似乎很重要。只有最先加DnaJ，然后加DnaK和GrpE，最后加GroEL和GroES(表IV的A部分)才能获得具有酶活性的硫氰酸酶。释放和活化与各向异性的减退和相对量子产率的增加相关联。相反，以GroEL/Es为最先加入的伴随蛋白，然后将与核糖体结合的硫氰酸酶多肽与其余伴随蛋白一起培养时，各向异性保持较高而且量子产率改变很小(表IV的B部分)。此时的酶活性接近检测的下限值。表IV中，在总反应混合物中测定荧光参数，但在离心后的上清液中测定酶活性。GroEL/Es可能影响仍与核糖体结合的或在其加入前已经释放的硫氰酸酶的荧光。
                        表IV伴随蛋白顺序加入的作用顺序添加物    EMax 1  Rel.Q1   A1   酶比活性
           (nm)                    (单位/mg
                                   硫氰酸酶)A.无(↓＋)              471    0.89    0.31    0DnaJ(↓然后＋)          471    0.92    0.33    0DnaK＋GrpE(↓然后＋)    474    1.01    0.26    2GroEL＋GroEs            480    1.20    0.20    217B.无(↓+)               471    0.89    0.31    0GroEL＋GroEs(↓然后＋)  473    0.91    0.29    3GrpE(↓然后＋)          473    0.91    0.29    3DnaK＋DnaJ              474    0.93    0.27    9
含有4.5pmol新生硫氰酸酶中的CPM-SAc〔35S〕甲硫氨酸的核糖体与接A或B顺序加入的指定伴随蛋白在37℃培养10分钟。如前文所述测定荧光参数，然后离心样品并测定得到的上清液中被释放的硫氰酸酶的量及其酶活性，由此计算出酶比活性。1缩写的注释见表II。2在上清液中测得。在给定条件下培养并测定荧光后，如前所述从上清液中分离出核糖体。
                     实施例11无酶活性的硫氰酸酶转化的要求
本发明还显示了没有酶活性的硫氰酸酶向酶活性构象转化的伴随蛋白和培养要求。重复表IV的A部分中直至加入DnaK/GrpE(在加入GroEL＋GroEs之前)，然后离心样品，迅速将释放的蛋白质与核糖体结合的硫氰酸酶肽分离。含有被释放的全长硫氰酸酶肽的上清液被吸回荧光比色杯中，测定荧光参数(表V，A部分，第1行)，然后加入GroES/EL(第2行)。培养10分钟后，测定光谱并如前所述计算各向异性。与之类似，含有与核糖体结合的硫氰酸酶的核糖体组份在被重悬于溶液B后进行分析，并在无GroES/EL或有GroES/EL存在下再培养。然后测定样品的光谱特性(表VB的前2栏)。最后，再次离心样品制得上清液和核糖体组份。测定上清液中被释放的硫氰酸酶的比活性(表VB的末2栏)。表V显示在与DnaJ、DnaK和GrpE共培养但不加GroES/EL后，约1.8pmol CPM-硫氰酸酶(为原样品中与核糖体结合的CPM-硫氰酸酶的约30％)被释放入上清液。该物质的各向异性较低(正如预计的)并且没有酶活性。向含有被释放的CPM-硫氰酸酶的该组份中加入GroES/EL，对各向异性没有作用而对酶活性的作用极小。与核糖体结合的硫氰酸酶在加入GroES/EL前具有很高的各向异性，因为在先前的培养中被DnaK释放的CPM-硫氰酸酶已从样品中被离心去除。加入GroES/EL后，各向异性急骤下降(表VB)，并且测到了酶活性。这种被释放的蛋白质的酶比活性与天然酶相同。
表V显示GroES/EL对已释放的多肽作用极小或没有作用，但似乎能在核糖体先与DnaK、DnaJ和GrpE分别培养后引起与核糖体结合的硫氰酸酶的活化与释放。为了比较，表VC中包括的由嘌呤霉素而从核糖体上释放的硫氰酸酶多肽的结果数据。在核糖体与嘌呤霉素培养后，各种伴随蛋白都对来自CPM-硫氰酸酶的酶活性和荧光没有可测得的作用。与之类似，单独或合用的伴随蛋白都对在原转录/翻译偶联系统中从核糖体上释放的具有酶活性的CPM-硫氰酸酶的酶活和荧光没有作用(没有给出数据)。
                  表VGroEL/ES对已释放的和与核糖体结合的硫氰酸酶的作用
         Rel.O1       A1       量(pmol)    酶比活性
                                            (单位/mg)A.被释放的硫氰酸酶(上清液)无           1.16          0.187       1.8         0GroEL/ES     1.17          0.187       1.8         6.7B.核糖体组份无           0.83          0.373       0.1         0GroEL/ES     0.98          0.221       1.4         728C.由嘌呤霉素释放的硫氰酸酶(上清液)无           1.21          0.199       2.2         0所有伴随蛋白  1.20          0.198       2.1         0
为获取表V的数据，与核糖体结合的CPM-Met-硫氰酸酶(约4.5pmol)在溶液B中与DnaK、DnaJ和GrpE一起培养。接着，离心样品，将核糖体组份重悬于同体积的溶液B中后，对上清液和核糖体组份进行分析。取用小份样品测定硫氰酸酶的光谱、含量和活性。然后在各样品中加入GroEL和GroES，并再次进行测试。对于核糖体组份，在加入GroEL/ES后，再次在airfuge(离心机)中离心样品后测定硫氰酸酶的量和酶比活性。
为获取表V中C部分的数据，与核糖体结合的CPM-硫氰酸酶与2mM嘌呤霉素在37℃培养10分钟，然后离心培养化合物。只对上清液在加或不加伴随蛋白培养后进行分析。1缩写的定义见表II。
                  实施例12稀疏霉素阻断与核糖体结合的CPM-硫氰酸酶的释放
抗菌素稀疏霉素与50S核糖体结合，Kd值约0.1M，抑制了肽基转移酶的反应。在微摩尔浓度时，稀疏霉素对来自带有CPM-硫氰酸酶的核糖体的香豆素荧光没有作用。首先，如表III所述先后单独加入稀疏霉素和伴随蛋白。表VI显示，各伴随蛋白都对被测荧光参数没有任何作用。在稀疏霉素之后将伴随蛋白组合(没有说明)或单独加入时，在各向异性方面与表IIIA中的数据相比只有很小的改变，这表明大多数CPM-硫氰酸酶仍与核糖体结合着。荧光测定后的离心证实了这一点。在稀疏霉素存在下，少于10％的硫氰酸酶分子被释放入上清液，而且这种被释放的物质是没有酶活性的(没有给出数据)。所以，稀疏霉素抑制DnaK或GroES引起的硫氰酸酶从核糖体上的释放。由于稀疏霉素干扰肽基转移酶反应，本发明证明CPM-硫氰酸酶以肽基-tRNA的形式结合在核糖体上，而由DnaK和/或GroES引起的释放与反应中的肽基转移酶中心有关，tRNA与多肽之间的键在该反应中被水解。
                         表VI稀疏霉素抑制伴随蛋白介导的来自与核糖体结合的CPM-SAcMet-硫氰酸酶的荧关的改变添加物                  Max1      Q1        A1无                      471      0.89       0.31先加稀疏霉素             471      0.90       0.30接着：DnaJ               471      0.90       0.31或DnaK                   471      0.92       0.30或GropE                  471      0.90       0.30或GroEL                  471      0.90       0.30或GroES                  473      0.91       0.29DnaJ＋DnaK               471      0.92       0.32全部一起加                471      0.90       0.29
实验条件与表III中的相同，但在单独加入各种伴随蛋白前加入4μM稀疏霉素。各种伴随蛋白都只引起百分之几的CPM-硫氰酸酶释放入上清液。
                   实施例13N末端香豆素对硝基甲烷的可及度
硝基甲烷对来自CPM-硫氰酸酶的荧光猝灭被评估作为测定探针在不同环境中的可及度。硝基甲烷是水溶性、不解离的小分子，它可以在溶液中通过与探针的碰撞有效地猝灭香豆素的荧光。图2显示了Stern-Volmer点。游离在溶液中和与核糖体结合的CPM-Met-tRNAf分别表现出最高和最低的猝灭性。游离在溶液中时，荧光团的可及度较高，但当CPM-Met-tRNAf与核糖体结合时它被极大地遮蔽了。位于酶活性硫氰酸酶N末端的CPM的可及度也较高。这与酶活性硫氰酸酶的各向异性数据(表II)和硫氰酸酶的晶体结构一致，N末端在这种结构中暴露在外。有趣的是，用DnaK或嘌呤霉素从核糖体上释放的硫氰酸酶的猝灭性明显较低。如表III和V所示，这种物质是没有酶活性的。使用两者而获得的数值相似，但低于对游离的、酶活性硫氰酸酶观察到的值。因此，本发明证明这种被释放的硫氰酸酶N末端的暴露程度不及天然硫氰酸酶，而且这部分没有折叠成它的天然构象。与核糖体结合的硫氰酸酶的更低的猝灭性可能部分由于核糖体(尤其是新生短多肽的)的遮蔽以及全长多肽的不完全折叠。
                     实施例14由抗香豆素IgG测得的中间状态
具有对CPM-荧光团高结合特异性的多克隆抗体被用于评价与核糖体结合的全长硫氰酸酶链的折叠，并与游离在溶液中的具有酶活性的硫氰酸酶进行比较。图3A和3B表明，与核糖体结合的和游离的CPM-硫氰酸酶上的探针都能被抗香豆素抗体接近。对于后一种情况，具有酶活性的硫氰酸酶通过与全部伴随蛋白共培养从核糖体上释放，然后如表II的有关描述将核糖体从反应混合物中离心去除。在来自游离的和与核糖体结合的CPM-硫氰酸酶的荧光中，抗体均引起各向异性和与红移相关联的量子产率的增加。在抗香豆素IgG存在下，两种情况中的最大发射波长都约为456nm。量子产率和最大发射波长的改变明确反映了与免疫球蛋白结合引起的探针环境疏水性的增加。由抗体引起的与核糖体结合的硫氰酸酶的量子产率的增加(图3A)低于游离在溶液中的具有酶活性的CPM-硫氰酸酶(图3B)。这种量子产率上的差异可能是因为核糖体部分遮蔽了较短的新生肽与抗体的接近。先前已经从新生的寡聚丙氨酸和新生的MS2外壳蛋白观察到这种现象。与先前CPM-SAcAla-tRNA的结果一样，结合在核糖体P位置的CPM-SAcMet-tRNAf似乎被完全遮蔽而不能被IgG靠近，因为在与抗CPM IgG共培养后，三个参数都没有发生任何改变(没有给出数据)。
为了证明伴随蛋白对与核糖体结合的新生CPM-硫氰酸酶的作用，在含有与用于图3A的相似的核糖体反应混合物中先加入稀疏霉素，再将DnaJ或DnaK单独或一起加入。在稀疏霉素存在下，很少的硫氰酸酶从核糖体上释放，正如表VI所描述的。培养后，加入抗香豆素IgG。图4显示了所得的反应混合物的发射光谱。同时给出只与稀疏霉素(不加伴随蛋白或抗香豆素IgG)一起培养的样品的发射光谱以供比较。分别或一起使用GroEL和GroES都不能引起在IgG存在下就单独的DnaJ或与DnaK一起观测到的任何光谱改变。
含有DnaK或DnaJ或这两种的样品的光谱可以直接与图3A的光谱比较，图3A的光谱取自不加伴随蛋白，但加有IgG或不加IgG的含与核糖体结合的硫氰酸酶的样品。在加入IgG后与DnaK共培养对所得的发射光谱几乎没有作用，但与DnaJ共培养的样品明显地有一条独特的双峰曲线。这一结果对同时含有DnaJ和DnaK的样品更明显。在这种情况中，明显的最大强度出现在光谱中435nm和472nm处。后者与不加IgG时游离的或与核糖体结合的硫氰酸酶的最大值十分接近(如图3A和3B中所示)。
双峰发射光谱表明，在IgG存在下，在与DnaJ或DnaJ和DnaK共培养的样品中存在着两种荧光物质。一种可能性是抗香豆素抗体能够只与部分CPM-硫氰酸酶相互作用，因为DnaJ结合在有些新生硫氰酸酶肽的N末端。Hartl及其同事提供的数据表明DnaJ能够与与核糖体结合的新生硫氰酸酶肽化学交联。但是，有几条证据表明DnaJ不与与核糖体结合的硫氰酸酶的N末端结合—至少不明显(即无法测得)作用于N末端香豆素。首先，如表III所示，单独的DnaJ对量子产率、各向异性或最大发射波长没有明显作用。其次，DnaJ似乎并不遮蔽N末端的香豆素。新生的CPM-硫氰酸酶的某些部分对IgG的遮蔽会导致与不加DnaJ的样品相比量子产率和各向异性的降低。但并没有发现这种降低(比较图4的插入表和图3的插入表)。IgG能结合两种荧光物质的香豆素(最大发射波长约440nm和470nm，图4)，这可以由IgG在发射光谱的这两个区域引起类似的荧光强度改变来证明。所以，图4表明DnaJ引起新生肽或核糖体的状态改变，这种改变某种程度地影响了新生肽与IgG结合时探针的环境。DnaK似乎有助于由DnaJ引起的这种改变。
                         实施例15
在本发明的另一应用中，由含有位于T7启动子下游编码序列的质粒在E.coli S30提取物中利用偶联的转录/翻译合成了酵母的TATA盒结合蛋白。其中，培养中加有T7 RNA聚合酶。起始tRNA是CPM-SAc〔35S〕Met-tRNAf。
在10μl反应混合物中，约合成了125ng N(香豆素)酵母TATA盒结合蛋白。将反应混合物放大62倍。培养后，将600μl含约7.5ng标记过的蛋白质的反应混合物上样在0.5ml含DEAE纤维素的柱上，该柱平衡在20mM Tris-HCl，pH7.9、100mM KCl、0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA)，5mMβ-巯基乙醇和20％甘油(缓冲液A)中。约0.75μg酵母TATA盒结合蛋白不吸附在基质上，利用加有200mM KCl的相同缓冲液洗脱回收到约1.5μg N(香豆素)酵母TATA盒结合蛋白。利用350mM KCl洗脱柱另外回收到3.0μg香豆素标记的蛋白。该物质被上样在平衡于缓冲液A中的肝素—琼脂糖凝胶柱上(1ml床层体积)。约半数被吸附的放射性标记的蛋白质通过将缓冲液A中的盐浓度提高至0.7M KCl而被洗脱。洗脱的蛋白质被用于荧光研究酵母TATA盒结合蛋白与特异性DNA序列的结合。将一段突变DNA序列作为对照。香豆素荧光的量子产率和荧光各向异性的改变表明，如本文所述纯化的体外合成的蛋白质特异性地与含有TATA盒的DNA序列相互作用。
就在此揭示的无细胞翻译系统而言，蛋白质的合成以较高的线速度进行约20分钟，然后迅速降低。在线速合成阶段具有酶活性的硫氰酸酶被合成并从核糖体上释放，但系统失效与外观为全长的硫氰酸酶多肽以肽基-tRNA的形式在核糖体的肽基转移酶中心内的积累相关联。与嘌呤霉素的反应性和稀疏霉素阻断蛋白质终止和释放的效果表明，这些积累的新生多肽以肽基-tRNA的形式位于核糖体的P位置。本文中，“终止”仅指与水解新生多肽与tRNA之间的酯键直接相关的那些反应；“释放”指蛋白质与核糖体分离。积累起来的与核糖体结合的新生硫氰酸酶是没有酶活性的，但只需将核糖体与伴随蛋白：DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL和GroES同时培养就可以将它们释放并转化为具有完整活性的酶。在所用的条件下没有可测得的氨基酸向新生蛋白质中的掺入。将核糖体先与DnaJ、DnaK和GrpE共培养，再与GroEL和GroES培养，这样可产生酶活性降低的硫氰酸酶。这似乎确立了这些反应的顺序，并得到使用DnaJ的结果的支持。
通过与嘌呤霉素反应或只与DnaK或GroES共培养而从核糖体上释放的蛋白质没有酶活性。这些被释放的硫氰酸酶不被与任何伴随蛋白组合物的共培养而活化。这有些奇怪，因为GroEL和GroES能有效促进被脲或盐酸胍变性的硫氰酸酶折叠成具有酶活性的蛋白质。GroEL和GroES是否在核糖体上介导折叠或在刚释放的蛋白质经历可阻断GroEL和GroES作用的次级反应前与之作用还有待确定。
来自新生硫氰酸酶N末端的香豆素的荧光改变反映了在活化、终止和酶从核糖体上释放过程中发生的伴随蛋白依赖性反应。来自香豆素的荧光对荧光团的局部环境十分敏感，探针在核糖体中位置的改变、与之连接的新生肽的折叠、或靠近探针的伴随蛋白的结合都易于反映在荧光的量子产率、最大发射波长和各向异性的改变中。从核糖体上释放的具有完整酶活性的CPM-硫氰酸酶和与核糖体结合的CPM-硫氰酸酶的这些参数的差异是明显的，而且反映了在蛋白质构象上的差异。例如，比较具有酶活性的可溶性CPM-硫氰酸酶(表II)和与DnaK或GroES共培养后从核糖体上释放的没有酶活性的可溶性硫氰酸酶(表III)的相对量子产率。不清楚为什么这两种与ATP明显无关的蛋白质促进了硫氰酸酶的释放。它们在这方面的活性使人想到释放因子3(RF-3)的活性，它具有GTP酶活性。
硫氰酸酶具有不同的构象得到了图2的支持，其中显示了不同状态下的蛋白质的硝基甲烷荧光猝灭的差异。这些差异可能反映了不同构象的蛋白质本身对探针遮蔽的差异。但是，一个显著的特征在于，无论是单个伴随蛋白或将它们组合都不引起与抗香豆素IgG观察到的相比的荧光明显改变(图3A和3B)。这可能表明伴随蛋白都不直接与CPM-硫氰酸酶的N末端相互作用。图4显示DnaJ促进某种会影响与核糖体结合的硫氰酸酶的反应，这可以由与抗香豆素IgG反应的结果得到证明。与DnaJ反应后，N末端的香豆素以可以被抗香豆素抗体区别的两种状态存在。最大发射波长靠近440nm的组份由单独的DnaJ产生，但在DnaK存在下被加强，这表明后者有助于被DnaJ促进的反应。可能，这些结果反应新生链具有不同的长度，如一种或一类与DnaJ或DnaK或两者反应，其它(假设较短形式)则可能不与这些伴随蛋白反应。这两种(假设的)不同长度的链可能产生了不同的出现于新生肽延伸中的折叠中间体。图4中较突出的作用只有在稀疏霉素存在下观察到。所以，最大发射波长在440nm和470nm的荧光物质反映了由DnaJ和DnaK产生的受稀疏霉素作用的不同中间状态。然后它们必须按终止反应顺序进行肽基-tRNA的密码指导的水解作用。所用的伴随蛋白是高度纯化的，而且几乎不含释放因子。在E.coli细胞中大量的释放因子1和2与核糖体偶合。
不清楚伴随蛋白介导的反应如何或为什么影响因子介导的肽基-tRNA键的水解作用，终止反应和新生蛋白质从核糖体上的释放。前面的反应受稀疏霉素的阻断，并被认为可能与肽基转移酶反应有关。人们已经注意到利用在内质网上形成的蛋白质可能产生相似的结果。信号识别颗粒与核糖体的偶合抑制了新生肽的延伸，直至信号识别颗粒°新生蛋白质°核糖体复合物与受体或内质网膜上的停靠蛋白质相互作用。
有一个问题，即终止、折叠和释放反应发生在核糖体内的什么位置。在多肽合成过程中，氨酰-tRNA和以肽基-tRNA形式的短肽牢固结合在疏水性位置即肽基转移酶中心，它位于核糖体大亚基中部隆起的基部。tRNA结合在两个核糖体亚基间界面上的特定位置，新生肽以肽基-tRNA的形式位于肽基转移酶中心。但是，电子显微摄影显示，出口区即新生蛋白质从核糖体上出现的区域位于大亚基的远端表面，距肽基转移酶中心远至90埃或90埃以上。以丙氨酸残基表示的新生聚丙氨酸肽长度被用于估计肽基转移酶中心至肽的N末端探针可被IgG或其Fab片段接触的位置的距离，对前者而言约60残基或90埃(1.5埃/螺旋构象中的氨基酸残基)，对Fab而言约40残基或60埃。与作为Fab来源的相应IgG相比，抗香豆素Fab能够与更短的肽反应，这表明其个体较小可以使它更深地向核糖体内渗透。对DnaJ与小麦胚芽核糖体上短至55个氨基酸的氯霉素乙酰基转移酶和萤火虫萤光素酶新生肽的化学交联已有所报道。这一肽链长度与上述聚丙氨酸的结果十分一致。
本发明显示，短新生肽的氨基末端在核糖体的某区域内被遮蔽，直至它们延伸至一定的长度，在该长度时它们的N末端完全离开肽基转移酶中心所在区域。该区域可能涉及最早由Yonath及其同事报道的贯穿核糖体大亚基的通道。Eisenstein等(1994)综述了核糖体结构数据，这些数据表明在核糖体大亚基内的肽基转移酶中心和出口区之间存在着一个或一个以上的通道或空腔。Crowley及其同事(1993)提供了表明新生的真核细胞膜蛋白在其合成过程中穿过类似通道的数据。本发明提出，核糖体大亚基内的该空腔提供了一个庇护所，至少部分折叠过程在此发生，此处的环境可以部分遮蔽新生蛋白质，使它不受蛋白酶和细胞质中可能存在的其它降解过程作用。
本说明书中提到的任一专利或公开文献都表明了本发明相关领域中熟练技术人员的水平。这些专利和公开文献在此以与单独所列参考文献的相同程度被引用参考。
本领域中熟练技术人员将很容易理解，本发明适合于实施文中提及的目的和获取提及的结果和优点以及与之相关的内容。在此描述的结合方法、步骤、处理方法、分子和具体化合物一起给出的实施例代表了优选的实施方法，它们是示范性的，无意于对本发明的范围进行限制。本领域中熟练技术人员将在其中进行的改变和其它用途都包含在本发明的精神之内，由权利要求的范围来界定。

Claims (9)

1.一种在原核的无细胞蛋白质合成系统中合成荧光标记的蛋白质的方法，其特征在于，其步骤包括：
(a)将取自无细胞提取物的核糖体样品与包含目标蛋白编码序列的质粒DNA一起培养，所述的样品与带荧光标记的氨酰tRNA一起培养在偶联的转录/翻译培养基中；
(b)通过将新合成的荧光标记的蛋白质与样品中其它荧光组份分离来部分纯化所述的荧光标记蛋白；
(c)测定合成的蛋白质的量；
(d)测定新合成的蛋白质的荧光；
(e)测定新合成的蛋白质的生物活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的荧光标记在所述的蛋白质的N末端。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的氨酰tRNA是起始氨酰tRNA。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的荧光标记与起始氨酰tRNA的氨基酸共价连接。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的转录/翻译培养基中含有含于缓冲液中的RNA聚合酶、三磷酸核苷、能量再生系统、利福平和氨基酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的质粒DNA是非线性化的。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的培养步骤(a)在约37℃进行约30分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的荧光标记的蛋白质利用选自离心、离子交换色谱和凝胶过滤的方法来部分纯化。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的原核的无细胞蛋白质合成系统是E.coli的无细胞蛋白质合成系统。
CN95191586A 1994-11-03 1995-11-02 合成荧光标记的蛋白质的方法 Expired - Fee Related CN1098932C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33373394A 1994-11-03 1994-11-03
US08/333,733 1994-11-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1143390A true CN1143390A (zh) 1997-02-19
CN1098932C CN1098932C (zh) 2003-01-15

Family

ID=23304030

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN95191586A Expired - Fee Related CN1098932C (zh) 1994-11-03 1995-11-02 合成荧光标记的蛋白质的方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6448033B1 (zh)
EP (1) EP0733121A4 (zh)
JP (1) JPH09507760A (zh)
KR (1) KR100405842B1 (zh)
CN (1) CN1098932C (zh)
AU (1) AU705111B2 (zh)
CA (1) CA2180176A1 (zh)
IL (1) IL115859A0 (zh)
NZ (1) NZ298206A (zh)
RU (1) RU2162104C2 (zh)
TW (1) TW299352B (zh)
WO (1) WO1996014426A1 (zh)
ZA (1) ZA959183B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100422340C (zh) * 1998-08-12 2008-10-01 普罗蒂厄斯股份公司 分离和鉴别在含有核酸的生物样品中可能存在的各种功能的方法
CN111366566A (zh) * 2020-03-18 2020-07-03 江苏支点生物科技有限公司 一种在无细胞蛋白质合成环境下进行荧光测定的方法及多孔板

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5968767A (en) * 1996-06-07 1999-10-19 Genentech, Inc. Methods for in vitro protein synthesis
AU3152797A (en) * 1996-06-07 1998-01-05 Genentech Inc. Methods for (in vitro) protein synthesis
JP4493125B2 (ja) * 1999-05-07 2010-06-30 独立行政法人理化学研究所 相互作用するタンパク質の検出方法
CA2459893C (en) 2001-09-10 2014-01-21 Meso Scale Technologies, Llc Methods and apparatus for conducting multiple measurements on a sample
US7585815B2 (en) * 2003-07-24 2009-09-08 Lawrence Livermore National Security, Llc High throughput protein production screening
EP1852701A4 (en) * 2005-02-21 2008-07-16 Olympus Corp METHOD FOR DETECTING THE REACTION OF A PROTEIN WITH A SAMPLE
KR100925345B1 (ko) * 2008-01-10 2009-11-09 주식회사 인트론바이오테크놀로지 시험관 전사법으로 준비된 ｔＲＮＡ로부터 제조된 표지자를이용한 시험관 번역법으로 생산되는 단백질의 선택적표지방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5258862A (en) * 1992-12-10 1993-11-02 Xerox Corporation Rotating disc optical synchronization system using binary diffractive optical elements

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100422340C (zh) * 1998-08-12 2008-10-01 普罗蒂厄斯股份公司 分离和鉴别在含有核酸的生物样品中可能存在的各种功能的方法
CN111366566A (zh) * 2020-03-18 2020-07-03 江苏支点生物科技有限公司 一种在无细胞蛋白质合成环境下进行荧光测定的方法及多孔板

Also Published As

Publication number Publication date
ZA959183B (en) 1997-04-30
RU2162104C2 (ru) 2001-01-20
WO1996014426A1 (en) 1996-05-17
KR100405842B1 (ko) 2004-03-24
JPH09507760A (ja) 1997-08-12
US6448033B1 (en) 2002-09-10
IL115859A0 (en) 1996-01-31
CN1098932C (zh) 2003-01-15
AU4363496A (en) 1996-05-31
TW299352B (zh) 1997-03-01
EP0733121A4 (en) 1999-10-13
KR970700776A (ko) 1997-02-12
CA2180176A1 (en) 1996-05-17
AU705111B2 (en) 1999-05-13
NZ298206A (en) 1998-01-26
EP0733121A1 (en) 1996-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shandell et al. Genetic code expansion: a brief history and perspective
US7595198B2 (en) Photocleavable isotope-coded affinity tags
CN117024548A (zh) 通过结构互补激活生物发光
CN1098932C (zh) 合成荧光标记的蛋白质的方法
Effenberger et al. The natural product N-palmitoyl-L-leucine selectively inhibits late assembly of human spliceosomes
EP1143009A1 (en) Process for producing polypeptide in cell-free protein synthesis system
JPH08508651A (ja) 蛋白質合成用無細胞システムおよびそれにおけるシャペロン蛋白質の利用
EP2894476A1 (en) Genetically Encoded Spin Label
JP2003527561A (ja) 蛋白の部位特異的標識化方法およびそのための使用
Mitra Incorporating unnatural amino acids into recombinant proteins in living cells
Ohno et al. Site-selective post-translational modification of proteins using an unnatural amino acid, 3-azidotyrosine
US20040023256A1 (en) Translation profiling
KR960705056A (ko) 단백질 및/또는 mRNA 생합성 저해제를 검출하는 시험관내 분석방법(IN VITRO ASSAY TO DETECT INHIBITORS OF PROTEIN AND/OR mRNA BIOSYNTHESIS)
JP3896460B2 (ja) 非天然蛋白質の製造方法、固定化方法及びキット
JP4310378B2 (ja) 無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法及びタンパク質合成用試薬キット
WO2007018315A1 (ja) タンパク質と他の分子との相互作用を検出するためのタンパク質プローブ
US9625466B2 (en) Signal amplification methods for the imaging of protein synthesis and neurotransmitter transport
EP1647592A1 (en) Method of modifying nucleotide chain
CA2499644A1 (en) Process for producing ligand binding protein with the use of cell-free protein synthesis system and utilization thereof
Grigoryan Expanding the Structural Biologist's Tool Chest by Chemical and Biocompatible Modification of Peptides: from Characterizing Marine Snail Toxins to OutPHOXIng Tryptophan
Yang Enzymatic Mechanisms and Chemical Probes of the Myst Family of Histone Acetyltransferases
US8329425B2 (en) Method and system for detection of chloramphenicol
JP2005095079A (ja) Ｃ末端欠損タンパク質の合成方法
WO2004035764A2 (en) PROTEIN SYNTHESIS WITH TANDEMLY ACTIVATED tRNAs

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee