JP2005095079A - Ｃ末端欠損タンパク質の合成方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 可溶化タンパク質の作製を簡便にするための手段を提供すること。
【解決手段】 ＲＮＡ転写を停止させる物質を含む基質を用いて、ＲＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡからのＲＮＡ転写反応を行い、得られる３’末端欠失ＲＮＡを翻訳することによりＣ末端欠損タンパク質を得ることを特徴とする、Ｃ末端欠損タンパク質の合成方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、Ｃ末端欠損タンパク質の合成方法、及び可溶化タンパク質の作製方法に関する。具体的には、本発明は、Ｃ末端アミノ酸配列をランダムに欠損させたタンパク質の集合体を合成する方法に関する。

タンパク質を遺伝子工学的に製造する方法としては、遺伝子ＤＮＡから細胞を用いてタンパク質を製造する方法（非特許文献１）や、遺伝子ＤＮＡから無細胞的にタンパク質を製造する方法（非特許文献２及び３）が知られている。
また、遺伝子ＤＮＡから３’側をランダムに欠損したＤＮＡの集合体を合成する方法（非特許文献４）が公知であり、この方法はＤＮＡの塩基配列決定に用いられている。

一般的な生化学・分子生物学等の研究分野においては、可溶化タンパク質及び可溶化しうるタンパク質のドメインペプチドを得ることは、そのタンパク質・ペプチドの機能を解析・利用する上で極めて重要である。しかし、タンパク質の合成においてはしばしば目的とするタンパク質が不溶性になることが知られている。例えば、大腸菌などの細胞を用いた系においては、外来タンパク質は封入体に封じ込められることが多い（例えば非特許文献５に概説されている）。

タンパク質の可溶化ドメインをバイオインフォマティクスに基づいて予測する方法（非特許文献６及び７）も公知である。これにより、予測した可溶化ドメインを発現するように実験を設計することによって、予測を行うことなく可溶性タンパク質を作製しようとする場合よりも効率的に可溶性タンパク質を作製することが可能である。しかしながら、予測した可溶化ドメインが実際に可溶化するかどうかは実験してみないとわからないという問題点がある。

細胞を用いないタンパク質発現系（無細胞系）においても、タンパク質のアミノ酸配列、アミノ酸組成によってはほぼ完全に沈澱することがしばしばある。このような場合、塩酸グアニジンや尿素などを加えることによってタンパク質を変性させ、構造を回復させることで活性のある可溶化タンパク質を得る方法（非特許文献８〜１０）が知られているが、これらの方法はタンパク質ごとに条件を検討するなど相当の労力を要し、また一般的には収量も低い。

そのため、特に可溶化しにくいタンパク質については、可溶化しうるドメイン領域を発見することは重要な意義があり、またタンパク質を可溶化させるための手法も望まれている。

Studier, F.W. et al. Methods Enzymol. (1990) 185, 60-89 Spirin, A.S. et al. Science (1988) 242, 1162-1164 Kigawa, T. et al. FEBS Lett. (1999) 442, 15-19 Sanger, F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74, 5463-5467 Hockney, R.C. Trends Biotechnol. (1994) 12, 456-463 Miyazaki, S. et al. J. Struct. Funct. Genomics (2002) 2, 37-51 Rost, B. & Liu, J. Nucleic Acids Res. (2003) 31, 3300-3304 Shirley, B.A. Methods Mol. Biol. (1995) 40, 177-190 Mukhopadhyay, A. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol (1997) 56, 61-109 Rudolph, R. & Lilie, H. FASEB J.(1996) 10, 49-56

そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、可溶化タンパク質の作製を簡便にするための手段を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、Ｃ末端側のアミノ酸配列をランダムに欠損した変異タンパク質を集合体として合成し、その集合体の中から目的とする可溶性タンパク質を選択することによって、効率的かつ簡便に可溶化ドメインを決定し、可溶性タンパク質を作製することができると考え、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ＲＮＡ転写を停止させる物質を含む基質を用いて、ＲＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡからのＲＮＡ転写反応を行い、得られる３’末端欠失ＲＮＡを翻訳することによりＣ末端欠損タンパク質を得ることを特徴とする、Ｃ末端欠損タンパク質の合成方法である。
上記方法において、ＲＮＡ転写を停止させる物質は、例えば３’−ｄＡＴＰ、３’−ｄＧＴＰ、３’−ｄＣＴＰ、３’−ｄＵＴＰからなる群より選択される少なくとも１つの３’−ｄＮＴＰである。また、基質中の３’−ｄＮＴＰとＮＴＰの混合比率は、１〜１０：１００、好ましくは１〜３：１００とすることができる。

また本発明は、ＤＮＡ増幅を停止させる物質を含む基質を用いて、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡからのＤＮＡ増幅反応を行い、得られるＤＮＡ増幅産物を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写反応を行い、得られる３’末端欠失ＲＮＡを翻訳することによりＣ末端欠損タンパク質を得ることを特徴とする、Ｃ末端欠損タンパク質の合成方法である。
上記方法において、ＤＮＡ増幅を停止させる物質は、例えば２’−３’−ｄｄＡＴＰ、２’−３’−ｄｄＧＴＰ、２’−３’−ｄｄＣＴＰ、及び２’−３’−ｄｄＴＴＰからなる群より選択される少なくとも１つの２’−３’−ｄｄＮＴＰである。
上記方法は、その転写反応及び／又は翻訳反応を、無細胞タンパク質合成系において行うことが好ましい。

さらに本発明は、上記合成方法のいずれかにより合成されたＣ末端欠損タンパク質から可溶性タンパク質を選択することを特徴とする、可溶性タンパク質の作製方法である。

またさらに本発明は、上記合成方法のいずれかにより合成されたＣ末端欠損タンパク質から可溶性タンパク質を選択することを特徴とする、可溶化ドメインの決定方法である。

本発明により、一度の反応で迅速かつ簡便に、Ｃ末端側のアミノ酸残基がランダムな位置で欠損したタンパク質の集合体を合成することができる。かかるＣ末端欠損タンパク質の集合体は、目的とするタンパク質の特定領域の機能などを調べるために有効であり、例えば、可溶性タンパク質を作製したり、可溶化ドメインを決定するために用いることができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、Ｃ末端欠損タンパク質を作製する方法に関し、
（１）ＲＮＡ転写を停止させる物質を含む基質を用いて、ＲＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡからのＲＮＡ転写反応を行い、３’末端が欠失したＲＮＡの集合体を作製するか、又は
（２）ＤＮＡ増幅を停止させる物質を含む基質を用いて、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡからのＤＮＡ増幅反応を行い、得られるＤＮＡ増幅産物を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写反応を行い、３’末端が欠失したＲＮＡの集合体を作製し、
その後、上記３’末端欠失ＲＮＡを翻訳することによりＣ末端欠損タンパク質を作製する。これにより、Ｃ末端側のアミノ酸残基がランダムな位置で欠損したタンパク質の集合体が得られる。

本発明における「Ｃ末端欠損タンパク質」とは、あるタンパク質のＣ末端側のアミノ酸残基が欠損しているタンパク質を指す。また、「Ｃ末端欠損タンパク質の集合体」とは、あるタンパク質のＣ末端側のアミノ酸残基がランダムな位置で欠損しているタンパク質の集合体を指す。

また本発明は、上記のように得られたＣ末端欠損タンパク質の集合体の中から可溶性タンパク質を選択することによって、タンパク質の可溶化ドメインを決定し、可溶性タンパク質を作製するものである。

１．３’末端欠失ＲＮＡの集合体の作製
本発明においては、まずＣ末端欠損タンパク質を作製しようとするタンパク質に対応する３’末端欠失ＲＮＡの集合体を作製する。このタンパク質は、特に限定されるものではなく、Ｃ末端欠損タンパク質を作製しようとするものであればよい。例えば、可溶化することが望まれるタンパク質（ヒトＳＩＩＴ１、ヒトＰ５３、ヒトＨＳＰＣ１８９など）等が挙げられる。

本発明においては、上記タンパク質をコードする遺伝子（二本鎖ＤＮＡ）から、以下に記載するようにＲＮＡ転写又はＤＮＡ増幅を利用することによって、そのタンパク質に対応する３’末端欠失ＲＮＡの集合体を作製する。

（１）ＲＮＡ転写を利用した３’末端欠失ＲＮＡの集合体の作製
本発明においては、その１つの方法として、ＲＮＡ転写を利用して３’末端欠失ＲＮＡの集合体を作製し、Ｃ末端欠損タンパク質の集合体を作製する。この方法の概要を図１に示す。

まず、鋳型の二本鎖ＤＮＡ（四角）からのＲＮＡ転写反応を行う。この二本鎖ＤＮＡにおいて、「Ｔ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ」及び「Ｔ７ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」とは、それぞれＴ７プロモーター配列及びＴ７ターミネーター配列を示す。また、斜線部分はリンカー配列を示す。この鋳型二本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（楕円）が、ＲＮＡ転写基質を利用して転写反応を行い、ＲＮＡが合成される。

本発明においては、このＲＮＡ転写反応の基質中に、通常の基質であるＮＴＰ（ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，ＵＴＰ）に加えて、ＲＮＡ転写を停止させる物質（例えばコルジセピン−５’−三リン酸；３’−ｄＡＴＰ）を混入させる。これにより、ＲＮＡ転写停止物質を取り込んだ後、ＲＮＡ転写反応は停止する。この停止により、その後のＲＮＡ合成が進まなくなるため、得られるＲＮＡ転写産物はその３’末端が欠失したものとなる。また、転写反応の停止は、ＲＮＡ転写停止物質を取り込んだ時点で起こるため、その停止の起こる位置によって３’末端の欠失位置も異なり、結果として、３’末端がランダムに欠失したＲＮＡ転写産物の集合体が得られることとなる（図１参照）。

ＲＮＡ転写反応は、当技術分野で周知であり、当業者であれば反応条件、反応溶液などを適宜選択して行うことができる。また、後述する無細胞タンパク質合成系を利用してＲＮＡ転写反応を行うことも可能である。ここで、通常のＲＮＡ転写反応を行う際に、使用する基質に対し、ＲＮＡ転写を停止させる物質を添加する。ＲＮＡ転写停止物質は、ＲＮＡの合成反応中に取り込まれ、かつＲＮＡの転写反応を停止させる物質であれば特に限定されるものではない。そのような物質としては、例えば３’−ＮＴＰ（３’−ｄＡＴＰ、３’−ｄＧＴＰ、３’−ｄＣＴＰ、３’−ｄＵＴＰ）などが挙げられ、本発明においては３’−ｄＡＴＰが好ましく使用される。

基質に対するＲＮＡ転写停止物質の量は、ＲＮＡ転写反応を完全に阻害する量でなければ特に限定されるものではない。本発明の意図するＣ末端欠損タンパク質の集合体を得る目的から、基質中のＲＮＡ転写停止物質の量は、全転写産物の５０〜９５％程度である。例えばＲＮＡ転写停止物質として３’−ｄＡＴＰを用いる場合には、基質中の３’−ｄＡＴＰとＡＴＰとの混合比率は、約１〜１０：１００、好ましくは約１〜３：１００である。

（２）ＤＮＡ増幅を利用した３’末端欠失ＲＮＡの集合体の作製
本発明においては、別の方法として、ＤＮＡ増幅を利用して３’末端欠失ＲＮＡの集合体を作製し、Ｃ末端欠損タンパク質の集合体を作製する。この方法の概要を図２に示す。

まず、鋳型の二本鎖ＤＮＡ（四角）からのＲＮＡ転写反応を行う。この鋳型二本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（楕円）が、デオキシリボ核酸基質を利用して増幅反応を行い、ＤＮＡが合成される。

本発明においては、このＤＮＡ増幅反応の基質中に、通常の基質であるｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）に加えて、２’−３’−ｄｄＮＴＰ（Ｎは、Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔのいずれかを表す）を混入させる。これにより、２’−３’−ｄｄＮＴＰ基質を取り込んだ後、ＤＮＡ増幅反応は停止する。この停止により、その後のＤＮＡ伸長が進まなくなるため、得られるＤＮＡ増幅産物はその末端が欠失したものとなる。また、増幅反応の停止は、２’−３’−ｄｄＮＴＰを取り込んだ時点で起こるため、その停止の起こる位置によって末端の欠失位置も異なり、結果として、末端がランダムに欠失したＤＮＡ増幅産物の集合体が得られることとなる（図２参照）。

ＤＮＡ増幅反応は、当技術分野で周知であり、当業者であれば反応条件、反応溶液などを適宜選択して行うことができる。ここで、通常のＤＮＡ増幅反応を行う際に、使用する基質に対し、ＤＮＡ増幅を停止させる物質を添加する。ＤＮＡ増幅停止物質は、ＤＮＡの合成反応中に取り込まれ、かつＤＮＡの増幅反応を停止させる物質であれば特に限定されるものではない。そのような物質としては、例えば２’−３’−ｄｄＮＴＰ（２’−３’−ｄｄＡＴＰ、２’−３’−ｄｄＴＴＰ、２’−３’−ｄｄＧＴＰ、２’−３’−ｄｄＣＴＰ）が挙げられる。

基質に対するＤＮＡ増幅停止物質の量は、ＤＮＡ増幅反応を完全に阻害する量でなければ特に限定されるものではない。

続いて、末端がランダムに欠失したＤＮＡ増幅産物の集合体を用いて、ＲＮＡ転写反応を行う。図２に示すように、鋳型となるＤＮＡ増幅産物はその末端が欠失しているため、転写されるＲＮＡもその３’末端が欠失したものとなる。このようにして、末端がランダムに欠失したＤＮＡ増幅産物の集合体を用いたＲＮＡ転写反応を行うことによって、３’末端がランダムに欠失したＲＮＡ転写産物の集合体が得られる。

以上のように３’末端欠失ＲＮＡの集合体は、理論的には一度の反応で網羅的に調製することが可能であり、簡便かつ効率的に作製することができる。

２．３’末端欠失ＲＮＡの集合体からのタンパク質翻訳
前項「１．３’末端欠失ＲＮＡの集合体の作製」に記載のようにして作製された３’末端欠失ＲＮＡから翻訳を行うことにより、Ｃ末端欠損タンパク質を得ることができる。

ＲＮＡからのタンパク質翻訳は、当技術分野で公知の手法を利用して行うことができる。好ましくは、ＲＮＡからのタンパク質翻訳は、後述する無細胞タンパク質合成系を利用して行う。

合成したＣ末端欠損タンパク質は、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、Ｃ末端欠損タンパク質を単離精製することができる。例えば、アフィニティー精製法を利用する場合には、ＲＮＡ転写又はＤＮＡ増幅反応を行う際に、鋳型ＤＮＡに精製を容易にするためのタグを付加してもよい。例えば、ヒスチジンタグがタンパク質のＮ末端に付加されるように反応を行うことによって、得られるＣ末端欠損タンパク質の精製が容易になる。
Ｃ末端欠損タンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等により確認することができる。本発明の方法により得られるＣ末端欠損タンパク質は、ランダムな位置でＣ末端を欠損したタンパク質の集合体として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で広範囲に分布して（スメア状に）可視化されることになる。
さらに、得られたタンパク質の理化学的性質又は機能を調べるため、種々の試験を行うことができる（例えば、Ｘ線結晶解析、ＣＤスペクトル解析、ＮＭＲ解析等）。

３．無細胞タンパク質合成系における反応
本発明の方法は、その簡便性及び迅速性の点から、無細胞タンパク質合成系において実施することが好ましい。

本発明における「無細胞タンパク質合成系」とは、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系とｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系の両者を包含する。
本発明の無細胞タンパク質合成系によるＣ末端欠損タンパク質製造は従来から知られる無細胞タンパク質合成のための材料、すなわち無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、目的タンパク質をコードする鋳型となる核酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンホスフェート等の高エネルギーリン酸結合含有物）等を用いて行うことができる。

「無細胞タンパク質合成用細胞抽出液」とは、リボソーム、ｔＲＮＡなどのタンパク質インビボ合成に関与する翻訳系又は転写系／翻訳系に必要な成分を含む植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞からの抽出液をいう。具体的には、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母等の抽出液が挙げられる。細胞抽出液の調製は、例えばPratt, J.M.ら、Transcription and trasnlation-a practical approach(1984)、pp.179-209に記載の方法に従い、上記細胞をフレンチプレスやグラスビーズにて破砕し、タンパク質成分やリボソームを可溶化するための数種類の塩を含有する緩衝液を加えてホモジナイズし、遠心分離にて不溶成分を沈殿させることによって行うことができる。

好ましい細胞抽出液としては大腸菌Ｓ３０細胞抽出液を例示することができる。
当該Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌Ａ１９株（ｒｎａ，ｍｅｔ）、ＢＬ２１ ｓｔａｒ、ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ等から既知の方法（Zubayら(1973)Ann.Rev.Genet.7:267-287）により調製することができ、また市販品（Ｐｒｏｍｅｇａ社やＮｏｖａｇｅｎ社からも入手可能）を用いてもよい。

前記「１．３’末端欠失ＲＮＡの集合体の作製」に記載のようにして作製された３’末端欠失ＲＮＡの集合体の無細胞タンパク質合成用反応液（以下、反応液ともいう）への添加濃度は、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液のタンパク質合成活性、合成するタンパク質の種類等によって適宜設定することができるが、例えば、通常０．１〜１０ｎＭ程度とされる。

上記無細胞タンパク質合成系におけるエネルギー源は、生体内でエネルギー源として利用される物質であれば特に限定はされないが、好ましくはＡＴＰ，ＧＴＰ，クレアチンリン酸等の高エネルギーリン酸結合を有する物質が挙げられる。また、当該エネルギー源の反応液への添加濃度は、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液のタンパク質合成活性、合成するタンパク質の種類等によって適宜設定することができる。

上記反応液には、必要に応じて、ＡＴＰ再生に関与する酵素（例えば、ホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組み合わせ又はクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組み合わせ）、各種のＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ等）、タンパク質の三次元構造を形成する働きを持つシャペロンタンパク質類（例えば、ＤｎａＪ、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ及びＨＳＰ７０等）を添加してもよい。

また、上記反応液には、必要に応じて、非タンパク質性成分を補強することができる。非タンパク質性成分とは、もともと無細胞タンパク質合成用細胞抽出液中に含まれている成分であるが、別途添加することでタンパク質合成能を向上させることができる成分であり、例えばｔＲＮＡが挙げられる。

さらに、上記反応液は、必要に応じて、タンパク質やＲＮＡの保護及び／又は安定化のための各種の添加剤を含有させてもよい。当該添加剤としては、例えば、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）阻害剤（胎盤ＲＮａｓｅインヒビター等）；還元剤（ジチオトレイトール等）；ＲＮＡ安定化剤（スペルミジン等）；プロテアーゼ阻害剤（フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）等）などが挙げられる。これらの反応液への添加濃度は、使用する無細胞タンパク質合成用細胞抽出液のタンパク質合成活性、合成する目的タンパク質の種類等に応じて適宜設定すればよい。

無細胞タンパク質合成には、従来から知られているバッチ法、透析法のいずれの方法を用いてもよい。

例えば、バッチ法を用いる場合、反応液には３’末端欠失ＲＮＡの集合体、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、目的タンパク質の構成材料となるアミノ酸混合物、ＬＭ ｍｉｘｔｕｒｅ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）、緩衝液、塩類、ＲＮアーゼ阻害剤、抗菌剤のほか、必要によりＴ７ ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを鋳型として用いる場合）、ｔＲＮＡなどを含むことができる。また、本発明においては、ＲＮＡ転写反応における基質中にＲＮＡ転写を停止させる物質（例えば３’−ｄＮＴＰ）を添加してもよい。その他、ＡＴＰ再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組み合わせ又はクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組み合わせ、ポリエチレングリコール（例えば＃８０００）、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸類、還元剤（例えばジチオトレイトール）などを含むことができる。

ここで、緩衝液としては、例えばＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃのような緩衝剤が使用できる。塩類としては、例えば酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸カリウム、塩化カルシウムなどを用いることができ、抗菌剤としては、例えばアジ化ナトリウム、アンピシリンなどを用いることができる。

反応条件は、使用する無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、合成する目的タンパク質等によって適宜設定すればよいが、温度は通常２０〜４０℃、好ましくは２３〜３７℃であり、時間は通常１〜５時間、好ましくは３〜４時間である。

また、透析法を用いて連続的に目的タンパク質を製造する場合、上記バッチ式の反応液を透析内液とし、反応液の５〜１０倍容量の透析外液に対して透析を行い、生成した目的タンパク質を透析内液又は透析外液から回収する。透析外液は、透析内液組成から無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、ＲＮアーゼ阻害剤、鋳型ＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼを除いたものが使用できる。従って、透析外液は、例えば、緩衝液、ＬＭ ｍｉｘｔｕｒｅ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）、塩類、目的タンパク質の構成材料となるアミノ酸混合物、ＡＴＰ再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼ、抗菌剤などを含んでいればよい。

透析内液と透析外液を隔てる透析膜の分画分子量は、３，５００〜１００，０００、好ましくは１０，０００〜５０，０００である。透析は、通常２０〜４０℃、好ましくは２３〜３７℃にて攪拌しつつ行い、定期的（通常２４時間毎）に新しい外液と交換する。また、新たな核酸（好ましくはｍＲＮＡ）を定期的（通常２４時間毎）に反応液に補給してもよい。透析外液は反応速度が低下した時点で新鮮なものと交換することが望ましい。

透析は、透析膜を介して内液と外液とを隔離して含む振とう若しくは攪拌（回転攪拌など）可能な透析装置を用いて行うことができる。小スケール反応用装置としては、例えばＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｚｅｒ（登録商標）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）やＳｌｉｄｅａｌｙｚｅｒ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ社製）等を用いることができる。また、大スケール反応用装置としては、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析用チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）等を用いることができる。また、振とう速度若しくは攪拌速度は低速、例えば１００〜２００ｒｐｍとし、反応時間は目的タンパク質の生成を監視しながら適当に選択することができる。
合成したタンパク質の精製は、生細胞からの分離と比べて混在する汚染物質の量及び種類が格段に少ないため、比較的容易に行うことができる。精製法としては、例えば硫酸アンモニウム若しくはアセトン沈殿、酸抽出、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト、等電点クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング等が挙げられ、精製はこれらの方法を当該タンパク質の性質に応じて単独に又は適宜組み合わせて行うことができる。また、当該タンパク質に付加したタグを特異的に認識し吸着することを利用したアフィニティー精製法を用いることができる。

４．可溶性タンパク質の作製
上述のようにして得られたＣ末端欠損タンパク質は、ランダムな位置でＣ末端を欠損するタンパク質の集合体として得られるため、その集合体の中には種々の変異タンパク質が含まれることとなる。従って、当該集合体の中から、可溶性タンパク質を選択することも可能である。
タンパク質の集合体の中から可溶性タンパク質を選択する手法については特に制限されないが、具体的には後述する実施例に示すように、遠心分離操作を利用する方法が挙げられる。すなわち、合成したタンパク質溶液を滅菌蒸留水と混合し、これを遠心分離して上清画分を得、これにアセトン等を加えて再び遠心分離して沈殿画分を得る。そしてこの沈殿画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による電気泳動解析を行うことにより、可溶性タンパク質を同定することができる。さらに、質量分析やアミノ酸配列解析の手法を併用すれば、可溶性タンパク質における可溶化ドメインペプチドの領域をアミノ酸レベルで決定することが可能である。
可溶化ドメインの決定方法としては、例えば質量分析の場合、用いたタンパク質のアミノ酸配列はすでにわかっているので、可溶化ドメインのＣ末端のアミノ酸部位が分子量解析により特定できる。これにより、可溶化ドメインの始めのアミノ酸及び終わりのアミノ酸の位置を知ることができる。
また、Ｃ末端欠損タンパク質の集合体は、種々の変異タンパク質を含むため、結合アッセイと、電気泳動、質量分析などの方法を併用することにより、この集合体の中から、特定の分子（タンパク質・薬剤など）と特異的に相互作用する変異タンパク質を見出すことも可能である。またそのような変異タンパク質から、相互作用に関与するドメインを見出すことも可能である。そのような相互作用を検出する方法（アッセイ）は、特に限定されるものではなく、当業者に公知の方法を使用することができる。

以下、実施例を用いて本方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕３’−ｄＮＴＰ存在下におけるＲＮＡ転写
本実施例においては、ＲＮＡ転写反応における３’−ｄＮＴＰ（３’−ｄＡＴＰ）の存在がＲＮＡ転写産物の末端欠失に及ぼす影響を検討した。

配列番号１に示すＴ７プロモーター配列の下流に配列番号２に示すクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のＤＮＡを結合したプラスミド（ｐＣＡＴ）を用いて、３’−ｄＡＴＰを含む又は含まない反応液を用いて種々の条件下にて転写実験を行った。反応は３７℃で、１〜３時間行った。

使用した反応液Ａの組成は、下記表１の通りである：

また、反応後は、１．５％アガロースゲル電気泳動を１００Ｖ定圧で約３０分間行い、同ゲルをエチジウムブロマイドで染色した後ＵＶ照射にてＤＮＡを可視化した。可視化した像を図３に示す。図３における各レーンの反応条件は、以下の通りである。

レーン１：ＤＮＡ分子量マーカー
レーン２：プラスミドの代わりに滅菌蒸留水を用いて１時間反応させたサンプル（対照）。反応液Ａを使用して反応は３７℃で１時間行った。反応液２０μｌのうち５μｌを泳動した
レーン３：レーン２と同じ組成で３時間反応させたサンプル（対照）。反応液Ａを使用して行った。反応液２０μｌのうち５μｌを泳動した
レーン４：プラスミドｐＣＡＴのみを泳動した（対照）
レーン５：３’−ｄＡＴＰを加えず反応を行わせたサンプル（対照）。反応液Ａに最終濃度１０ｎｇ／μｌのプラスミドｐＣＡＴを添加し、反応は３７℃で１時間行った。反応液２０μｌのうち５μｌを泳動した
レーン６：３’−ｄＡＴＰとＡＴＰの混合比率を０．３：１００で反応を行わせたサンプル。反応液Ａに最終濃度１０ｎｇ／μｌのプラスミドｐＣＡＴ及び最終濃度１．５ｎＭの３’−ｄＡＴＰを添加し、反応は３７℃で１時間行った。反応液２０μｌのうち５μｌを泳動した
レーン７：３’−ｄＡＴＰとＡＴＰの混合比率を１：１００で反応を行わせたサンプル。反応液Ａに最終濃度１０ｎｇ／μｌのプラスミドｐＣＡＴ及び最終濃度５ｎＭの３’−ｄＡＴＰを添加し、反応は３７℃で１時間行った。反応液２０μｌのうち５μｌを泳動した
レーン８：３’−ｄＡＴＰとＡＴＰの混合比率を３：１００で反応を行わせたサンプル。反応液Ａに最終濃度１０ｎｇ／μｌのプラスミドｐＣＡＴ及び最終濃度１５ｎＭの３’−ｄＡＴＰを添加し、反応は３７℃で１時間行った。反応液２０μｌのうち５μｌを泳動した
レーン９：３’−ｄＡＴＰとＡＴＰの混合比率を１０：１００で反応を行わせたサンプル。反応液Ａに最終濃度１０ｎｇ／μｌのプラスミドｐＣＡＴ及び最終濃度５０ｎＭの３’−ｄＡＴＰを添加し、反応は３７℃で１時間行った。反応液２０μｌのうち５μｌを泳動した

反応スケールは全て２０μｌで行った。

その結果、図３のレーン５〜８に示されるように、３’−ｄＡＴＰとＡＴＰの混合比率が１〜３：１００で反応を行った場合に、種々の長さのＲＮＡ転写産物が広範囲に分布し、スメア状に広がることが判明した。従って、３’−ｄＡＴＰの存在下においてＲＮＡ転写を行うことによって、ランダムな位置で３’末端が欠失したＲＮＡ転写産物が得られることがわかった。

〔実施例２〕２’−３’−ｄｄＮＴＰ存在下におけるＤＮＡ増幅
本実施例においては、可溶性タンパク質であり、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するヒトＳＩＩＴ１タンパク質（Umeharaら、Gene、167、297-302(1995)）のＣ末端欠損集合体を得ることを目的として、遺伝子ＤＮＡを鋳型とした増幅反応における２’−３’−ｄｄＮＴＰの影響を調べた。

（１）ヒスチジンタグの付加
配列番号３に示すヒトＳＩＩＴ１タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端側にヒスチジンタグを付加したペプチドのＣ末端欠損集合体を得ることを目的として、配列番号４に示すヒトＳＩＩＴ１遺伝子のＤＮＡを含むプラスミドを用いて、下記の表２の反応組成と表３のＰＣＲサイクル条件により、１段階目のＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応においては、以下に示す２種類のプライマーを使用した。

５’側プライマー：CCAGCGGCTCCTCGGGAATGATGGGCAAGGAAGAG（配列番号５）
３’側プライマー：GGGCGGGGATCAATCAATCATTATCAGCAGAACTTCCAGCG（配列番号６）

次に、配列番号７に示すＴ７Ｐ−Ｎｈｉｓ−ＮＬ１プライマー、配列番号８に示すＴ７Ｔ−ＤＴ２プライマー、及び配列番号９に示すＵ２プライマーを用いて、下記表４の反応組成と上記表３のＰＣＲサイクルに従い、２段階目のＰＣＲを行った。

１段階目のＰＣＲ産物の配列は、配列番号５に示すＤＮＡ断片の５’末端から１６塩基よりなる配列、及び配列番号６に示すＤＮＡ断片の５’末端から２２塩基よりなる配列のリンカー配列を含むことから、ＰＣＲにより配列番号７及び配列番号８の配列と連結することができる。また得られるＰＣＲ産物は、配列番号１に示すＴ７プロモーター配列を有するため、これをＴ７ＲＮＡポリメラーゼと混合・保温することにより、ポリメラーゼによるＲＮＡ転写の活性化が可能となる。またこのＰＣＲ産物は、配列番号１０に示すＴ７ターミネーター配列を有することから、この産物を鋳型とするＲＮＡの転写反応はこの配列において終結する。さらに合成されるタンパク質のＮ末端側には配列番号１１に示すアミノ酸配列が付加されることから、ニッケルやコバルトと結合したアガロースなどを用いることによって合成されたタンパク質を容易にアフィニティー精製できることになる。

なお、本実施例で用いた１本鎖ＤＮＡプライマー配列は、下記の基準を満たすように設計した：
・Ｔｍ＝２×（Ａ＋Ｔ）＋４×（Ｇ＋Ｃ）で計算されるＴｍ値が７８以上であること
・配列中の（Ｇ＋Ｃ）の割合が３３．３％以上であること
・プライマーの３’末端のヌクレオチドがＣ又はＧとなること。

（２）２’−３’−ｄｄＮＴＰ存在下におけるＤＮＡ増幅
上述の通り得られたＰＣＲ産物の４μｌに対し、０．１６μＭのＵ２プライマー（配列番号９）、及び最終濃度が４０％になるようにＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｐｒｅ−ｍｉｘｔｕｒｅ溶液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のロット０３０２６３を使用）を加えて希釈し、反応量１０μｌとした。この反応液を用いて、ＰＣＲ反応（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分）を２５サイクル行った。ここで用いたＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｐｒｅ−ｍｉｘｔｕｒｅ溶液は、通常のＤＮＡの基質（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）以外に２’−３’−ｄｄＮＴＰを微量含んでいる。

この増幅反応の結果を図４に示す。レーン１の泳動パターンは、２’−３’−ｄｄＮＴＰ存在下における反応の結果を示す。またレーン２は、この反応液にマングマメのヌクレアーゼを最終濃度が５％になるように混合し、３７℃１時間保温して反応させた結果である。いずれの場合も、種々の長さのＤＮＡが増幅され、スメア状に展開されたことが確認できた。従って、２’−３’−ｄｄＮＴＰ存在下にてＤＮＡ増幅反応を行うことによって、ランダムに末端が欠失したＤＮＡが集合体として形成されることがわかった。

〔実施例３〕末端欠失ＤＮＡの集合体を用いたタンパク質合成
本実施例においては、実施例３において得られたＤＮＡ増幅産物を用いてタンパク質合成を行った。具体的には、Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社のＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（ｃａｔ．Ｋ４５００−０１）を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯに連結し、このプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。この形質転換体を培養した後、ＶＩＯＧＥＮＥ社のプラスミド抽出キットを用いてプラスミドを純化した。
上記のように調製したプラスミドを用いて、透析法による無細胞タンパク合成を行った。

タンパク質合成の反応液（透析内液）の組成を表５に示す。また、タンパク質合成基質溶液（透析外液）の組成は表６に示す。表５及び表６中、ＬＭＣＰＹとは、１．８ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３．１４ｍｌの４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、５．６２ｍｇのチロシン、２．０９ｍｌの３Ｍグルタミン酸カリウム、０．１ｍｌの０．５５Ｍ ＤＴＴ、０．１１ｍｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、０．２７ｍｌのＮＴＰｓ混合液（各１００ｍＭ）、０．４ｍｌの２．７ｍｇ／ｍｌ フォリン酸カルシウム、０．２ｍｌの１００ｍＭ ｃＡＭＰ・Ｎａ、０．３９ｍｌの２．２Ｍ 酢酸アンモニウム、２．５１ｍｌの１Ｍクレアチンホスフェート、０．２７ｍｌの滅菌蒸留水からなる溶液（総量１１．２８ｍｌ）である。また、Ｓ３０バッファーは、１０ｍｌの６Ｍ酢酸カリウム、１０ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ（ｐＨ８．２）、１０ｍｌの１．４Ｍ酢酸マグネシウム、１５４．２５ｍｇのＤＴＴ、９７０ｍｌの滅菌蒸留水からなる溶液（総量１０００ｍｌ）である。

３０μｌの透析内液を入れたＤｉｓｐｏ／Ｄｉａｌｙｚｅｒ ＣＥ（分子量限界１００００もしくは５００００，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）を、１０００〜１５００μｌの透析外液の入った２４穴平底（またはＵ底）プレート内に固定し、透析膜が透析外液に常時接するようにする。試験管用振とう培養器で３０℃、２００〜５００ｒｐｍで振とうすることによりタンパク質合成を行った。

合成したタンパク質溶液（透析内液の約３０μｌ）は、６０μｌの滅菌蒸留水と混合し、そのうち１５μｌを分注した。残りのサンプルは、５３００ｒｐｍ×１０分の遠心分離操作を行い、その上清１５μｌを別に分注した。それぞれの溶液に３０μｌのアセトンを混合し、氷上で５分冷却した後、５３００ｒｐｍ×３０分の遠心分離操作で沈澱画分を取得した。この沈澱画分を６０〜６５℃で１０分乾燥した後、下記の組成で示すＳＤＳサンプルバッファー（２０〜３０μｌ）で沈澱物を完全に溶解した。この溶液を１００℃で３〜５分熱処理した後、５〜１０μｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による電気泳動解析を行った。

ＳＤＳサンプルバッファー：
０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）：２０ｍｌ
ＳＤＳ：４ｇ
グリセロール：２０ｍｌ
β−メルカプトエタノール：１２ｍｌ
ブロモフェノールブルー：１００ｍｇ
滅菌蒸留水：４８ｍｌ

以上のタンパク質発現実験の結果を図５に示す。タンパク質発現を、実施例３のようにＤＮＡ増幅停止物質（２’−３’−ｄＮＴＰ）の存在下におけるＤＮＡ増幅産物を用いて行った場合（＋）と、通常のＤＮＡ鋳型を用いて行った場合（−）のタンパク質の発現・可溶性・部分精製の状態をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルはＳＹＰＲＯオレンジにより染色し、ＦＵＪＩ ＬＡＳ−１０００を用いた蛍光強度観察により発現タンパク質の質と量を検出した。

図５中のＴは、無細胞タンパク質合成で得られた反応後の画分を示す。Ｓは、このＴの画分を５３００ｒｐｍ×１０分で４℃にて遠心分離して得られた上清画分を示す。Ｅは、Ｓの画分をＴＡＬＯＮコバルトアガロースと混合し、そのコバルトアガロースを溶液（７５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＮａＰｉ）で洗浄後、イミダゾールを含む溶液（５００ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＮａＰｉ）で溶出した画分を示す。Ｍは分子量マーカーを示し、各バンドの分子量はゲルの左側に示した。電気泳動に用いたタンパク質の量は基本的には１／１０量であるが、増幅を試みた場合のＥ（最も右のレーン）だけは全量を電気泳動解析した。

この実験により、２’−３’−ｄｄＮＴＰを用いた反応においてコバルトアガロースに吸着・解離する特異的なバンドが複数本確認することができた。ヒスチジンタグはこれらのタンパク質のＮ末端側にのみ存在するよう設計されていることから、コバルトアガロースに新たに吸着したペプチドはＮ末端にヒスチジンタグ配列を有し、Ｃ末端側領域の配列を欠損するヒトＳＩＩＴ１タンパク質の部分的なペプチドであると結論づけられた。

以上の結果から、２’−３’−ｄｄＮＴＰを含む基質を用いたＤＮＡ増幅反応の工程を加えることにより、本来のサイズ（約４２ｋＤａに検出されている）よりも低分子量側（下側）にＣ末端領域を欠損したタンパク質とみられるペプチドが複数、特異的に溶出されたことが確認できる。従って、本発明の方法により、Ｃ末端がランダムに欠損したタンパク質の集合体が得られることがわかった。

本発明により、一度の反応で迅速かつ簡便に、Ｃ末端側のアミノ酸残基がランダムな位置で欠損したタンパク質の集合体を合成することができる。かかるＣ末端欠損タンパク質の集合体は、目的とするタンパク質の特定領域の機能などを調べるために有効であり、例えば、可溶性タンパク質を作製したり、可溶化ドメインを決定するために用いることができる。

ＲＮＡ転写を停止させる物質（３’−ｄＮＴＰ）の存在下にて転写反応を行い、Ｃ末端欠損タンパク質を合成する方法を模式的に示した図である。 ＤＮＡ増幅を停止させる物質（２’−３’−ｄｄＮＴＰ）の存在下にて増幅反応を行い、Ｃ末端欠損タンパク質を合成する方法を模式的に示した図である。 ３’−ｄＡＴＰ存在下におけるＲＮＡ転写を行った実験結果を示す図である。 ２’−３’−ｄｄＮＴＰ存在下におけるＤＮＡ増幅を行った実験結果を示す図である。 タンパク質発現を、２’−３’−ｄＮＴＰの存在下におけるＤＮＡ増幅産物を用いて行った場合（＋）と、通常のＤＮＡ鋳型を用いて行った場合（−）のタンパク質の発現・可溶性・部分精製の状態をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって検出した図を示す。

配列番号１：合成オリゴヌクレオチド
配列番号２：合成遺伝子
配列番号５〜１０：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１１：合成ペプチド

Claims (9)

1. ＲＮＡ転写を停止させる物質を含む基質を用いて、ＲＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡからのＲＮＡ転写反応を行い、得られる３’末端欠失ＲＮＡを翻訳することによりＣ末端欠損タンパク質を得ることを特徴とする、Ｃ末端欠損タンパク質の合成方法。
2. ＲＮＡ転写を停止させる物質が、３’−ｄＡＴＰ、３’−ｄＧＴＰ、３’−ｄＣＴＰ、３’−ｄＵＴＰからなる群より選択される少なくとも１つの３’−ｄＮＴＰである、請求項１記載の方法。
3. 基質中の３’−ｄＮＴＰとＮＴＰの混合比率が１〜１０：１００である、請求項２記載の方法。
4. 基質中の３’−ｄＮＴＰとＮＴＰの混合比率が１〜３：１００である、請求項３記載の方法。
5. ＤＮＡ増幅を停止させる物質を含む基質を用いて、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡからのＤＮＡ増幅反応を行い、得られるＤＮＡ増幅産物を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写反応を行い、得られる３’末端欠失ＲＮＡを翻訳することによりＣ末端欠損タンパク質を得ることを特徴とする、Ｃ末端欠損タンパク質の合成方法。
6. ＤＮＡ増幅を停止させる物質が、２’−３’−ｄｄＡＴＰ、２’−３’−ｄｄＧＴＰ、２’−３’−ｄｄＣＴＰ、及び２’−３’−ｄｄＴＴＰからなる群より選択される少なくとも１つの２’−３’−ｄｄＮＴＰである、請求項５記載の方法。
7. 転写反応及び／又は翻訳反応を無細胞タンパク質合成系において行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により合成されたＣ末端欠損タンパク質から可溶性タンパク質を選択することを特徴とする、可溶性タンパク質の作製方法。
9. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により合成されたＣ末端欠損タンパク質から可溶性タンパク質を選択することを特徴とする、可溶化ドメインの決定方法。

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