TW299352B - - Google Patents

Description

A7 B7

經濟部中央揉準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（1 ) 本發明背畺 本發明大體有關分子生物學、生物技術及蛋白質合成 之領域〇更明確言之，本發明有關在一無細胞蛋白質合成 系統內合成一螢光標記蛋白質之新潁方法〇 相關技薤說明 若干條證據指示新生多肽在核糖體上獲得二次及三次 結構〇貝及其夥伴（ 1990 )提供Hsp70與新生蛋白質交 作之證明以及假設之併發轉譯性折疊〇核糖體本身可能在 該折叠程序中扮演重要角色〇李史皮爾^86)假設新 生蛋白質必須予合成爲一 C(螺旋。使用螢光技術硏究新生 肽及蛋白質在核糖體上之伸展及折疊曾加以評估。早先， 此等技術曾用以證實新生MS2蛋白質在結合於核糖體時折 曼〇伴隨蛋白質經顯示性便利多種蛋白質自其變性狀態折 叠，但鮮少知嘵此等蛋白質是否在轉譯期間作用於核糖體 上〇 夥伴曾發表資料指示DnaJ爲結合於螢火蟲蟲 螢光素鰣或小麥胚核糖體上氯霉素乙醯基轉移酶之第一伴 v cHevx^br； >> 隨蛋白質（亨德1 993) 〇 舊法之不足爲欠缺在無細胞蛋白質合成系統內合成一 螢光標記蛋白質之有效抑制手段。本發明滿足業界長久以 來,之需要及希求〇 本發明綜沭 在本發明中，得自香豆素順丁烯二醯亞胺基-SAcMet-tRNAf (CPM-SAcMet-tRNAf )予滲入在一細菌性無細胞之偶 聯轉錄/轉錄系統中合成於核糖體上之新生多脉之N-末端 ----—I----(丨裝------iT； ί I 系 .:Μ.請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 299352 A7 B7 五、發明説明（2 ) 內。螢光技術係用以監控C局部環境^^變化 f端探子λ 進而伴隨蛋白質對新生或全長度多肽之折叠、活性及自核 糖體釋出之效應。本發明顯示伴隨蛋白質在硫m鹽酶多肽 結合於核糖體上作爲肽基tRNA時對其等會有影響。伴隨蛋 白質便利其等自核糖體釋出作爲酶活性蛋白質。 在本發明之一具體形式中，所提供者爲一在無細胞蛋 白質合成系統中合成一螢光標記蛋白質之方法，包含以下 步驟：（a)用含有一相關蛋白質用編碼序列之質體（質粒 )DNA培育一得自無細胞萃取物之核糖體試樣，所述試樣 係培育於一偶聯轉錄/轉譯培養基以及一具有螢光標記之 胺基醯基tRNA內；（b)使新合成之螢光標記蛋白質與所述 試樣內之其他螢光成份分離將所述螢光標記蛋白質部份純 化；（c)測量所合成蛋白質之量；（d)測定新合成蛋白質 之螢光；以及（e )測定該新合成蛋白質之生物活性。 本發明之其他及進一步情形、特色、及優點將因以下 對目前就揭示目的所提出之本發明各較佳具體形式所做說 明而成爲明顯〇 簡要圖說 爲獲致上述本發明特色、優點及目的以及其他將變明 確之事物並詳實了解，以上簡要綜述之本發明可就其一些 例示於各附圖中之具體形式而有較特定之說明〇此等圖式 構成說明書之一部份〇然而，請住意各附圖例示本發明之 各種較佳具體形式，因此不應視爲受限於其範疇。 第1圖顯示在存在[14c]白胺酸時予以轉譯或用CPM_ ]木紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐）在 ----------^訂，.^. * ί i (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 胳 10.2 2 修 JE 年月Π B7 五、發明説明（3) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 3八(：-[3<^；^以“心蚧起始之游離及核糖體結合硫^(酸^"^ 分析。硫m酸酶係藉偶聯轉錄/轉譯作用用[14c]白胺酸 (160 Ci/mol)用 CPM-SAc-[36S]Met-tRNAf( 4,000 Ci/mol) 作爲放射性前體予以合成〇培育後，反應混合物予離心〇 藉SDS-PAGE及放射自顯影術分析上澄液及再懸浮之核糖體 0放射自顯影照片予以顯示（首二部份分別標記成14C-白 胺酸及CPM[36S]Met ) 〇徑跡1及2係用內P4C]白胺酸 培育所得者；徑跡3及4係用N-端CPM-SAc-[〃S]甲硫胺 酸培育所得。徑跡1及3爲20 “ 1之上澄液；徑跡2及4 爲20U1之再懸浮核糖體。第1圖之第三部份（標記成抗 RHO ab)顯示用抗硫氰酸_抗體探測之Western斑。共價 鍵接於第二抗體之辣根過氧化物龜之位置係用Amer sham之 ECL·系統顯像。箭頭指示牛肝天然硫氰酸酶之電泳淌度。 ,(SVeVn： 第2圖顯示香豆素螢光藉硝基甲烷之淬滅作用。 一佛定狀態螢光强度繪圖係就釋出之或結合於核 糖體之CPM-硫m酸酶相較於游離CPM-SAC-Met-tRNA(直線 1 )及結合於核糖體之此tRNA (直線6 )作成。直線2爲 上澄液內以_活性形式存在之CPM-硫氰酸廯；直線3爲用

DnaK釋出之CPM-硫氰酸_ ;直線4爲用瞟昤霉素釋出之CPM- 硫氰酸酶；直線5爲結合於核糖體之CPM-硫氰酸酶〇 , 第3圖顯示CPM-標記硫氰酸_在成抗香豆素抗體培育 前或後之螢光發射光譜〇分析結合於核糖體（A )或釋入上 澄液（B)之CPM-硫氰酸酶（實線）〇然後，添加抗香豆素 IgG並再取得光譜（虛線）〇此項挿入提供所分析各個試 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4規格（2丨0X297公； —,-----j I裝------V—：---r -線 (請先閱讀背面之注$項再填寫本頁) 6 299352 A7 B7 五、發明説明（4) 樣之定量螢光資料0 第4圖顯示DnaJ影響抗香豆素IgG與核糖體結合CPM-硫氰酸_間之交作0首先，在用稀疏霉素培育後取得CPM-硫氰酸_在核糖體上之光譜（實線）〇建立三份平行試樣 (在核糖體上用稀疏霉素培育之CPM-硫氰酸酶），對其添 加DnaJ或DnaK單項或二者一起。取得光譜（未示出）並分 析〇資料經發現相同於或極類似於表VI中所列示者〇然後 譲各試樣接受抗香豆素IgG 〇於室溫培育10分鐘後取得光 譜並顯示於茲 〇 U-x) DnaJ + IgG ;(..·) DnaK + IgG ; (--) DnaJ 及 DnaK + IgGo 本發明詳述 本發明係用以下簡稱說明：RHO ，硫氰酸_ ; CPM ， 3_ (4-順丁烯二醯亞胺基苯基）-4-甲基-7-(二乙基胺基）香 豆素；CPM-硫氰酸_，在N-端甲硫胺酸標記以CPM之硫氰 酸酶；SDS-PAGE，十二硫酸鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳；抗 CPM IgG ，抗香豆素兔多株抗體；CPM-SAc-Met-tRNAf ， 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 已用甲硫胺酸予胺基醯基化然後經由硫醇基乙酸在甲硫胺 酸胺基團以CPM標記之起始因子tRNA ; IgG ，免疫球蛋白 ;Fab ，其木瓜蛋白||產生片段。 本發明之標的亦爲一種在無細胞蛋白質合成系統中合 成一螢光標記蛋白質之方法，包含以下步驟：（a)用含有 —相關蛋白質用編碼序列之質體（質粒）DNA培育一得自 無細胞萃取物之核糖體試樣，所述試樣係培育於一偶聯轉 錄/轉譯培養基以及一具有螢光標記之胺基醯基tRNA內； 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 A 7 B7 五、發明説明（5) (b)使新合成之螢光標記蛋白質與所述試樣內之其他螢光 成份分離將所述螢光標記蛋白質部份純化；（c)測量所合 成蛋白質之量；（d)測定新合成蛋白質之螢光；以及（e) 測定該新合成蛋白質之生物活性〇 —般而言，在本發明中，螢光標記係在所述蛋白質之 N-端上〇在一較佳具體形式中，本發明方法中所用之胺基 醯基tRNA係一甲硫胺醯基tRNA甲硫胺酸/ f〇較佳爲該螢光 標記共價附接於一起姶因子tRNA之胺基酸上。 在本發明方法中，轉錄/轉譯培養基通常將RNA聚合 酶、三磷酸核t、一能量產生系統及胺基酸含於緩衝鹽溶 液內〇在一較佳具體形式中，質體DNA爲非線性化〇較佳 爲步驟U)之培育於約37°C時爲約30分鐘。又，在本發明 方法中，螢光標記之蛋白質係以一由離心、離子交換層析 術及凝膠過濾所組成集圑中選出之方法予部份純化〇 以下實例之提出係作例示本發明各種不同具體形式之 用，故無意以任何方式對本發明設限〇 實例1 化學品 三礙酸核甘及 E. coli tRNA 得自 Boehringer-Mannheim 購得；3-( 4-順丁烯二醯亞胺基苯基）-7-二乙基胺基-4-甲 基香豆素（CPM)得自Molecular Probes公司（奧勒岡州尤 金市）〇 tRNA«*4、利福平、瞟昤霉素、稀疏霉素及所有 其他生物化學品均得自Sigma 〇核糖核酸_ A及T1 ( *調 混核糖核酸龜"）得自Ambion (德州奧斯汀市）〇 [14C] 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0X297公釐} ----------- • f (請先Η讀背面之注再填寫本頁) 訂 線 8 299352 A7 B7 修正 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 五、發明説明（6 ) 白胺酸及[3 6 s]甲硫、胺酸係購自NEN-Dupont 〇伴隨蛋白質 DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL 及 GroES係購自 Epicentre技術 公司（威斯康辛州麥迪森市）〇原始硫氰酸酶質體、由牛 v t4〇r〇vj<tz.>v 肝粒線體分離之硫m酸_抗體得自保羅何ίΓ維i£W± (德 州聖安東尼市德州大學健康科學中心）〇對抗E . c 〇 1 i釋 x (.yJaurreyt Tatov 放因子1及2之多株抗體係由_倫塔:紐西蘭歐塔 哥大學）提供。第二抗體（山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶 及兔抗綿羊IgG辣根過氧化物_)係購自Zymed (加州南 舊金山市）〇 實例2 活體外系統 質體之繁殖、SP6 RNA聚合脑之分離及E. coli無細 胞萃取物（S30)之製備以及核糖體分量之由S30分離係如 WSWSX Anal . Biochem. 206:389 ( 1992 )所述予以實 施〇基本上，質體製品係以標準步驟（j.山、魯^7^， v jCoid spr{^t\ ( 1989 ) Molecular Cloning , &泉港實驗室刊物）製成，~ 唯CsCl離心步驟以Q匣式（Bio-Rad)層析術替代〇SP6及 TJ RNA聚合晦可自市面購得。所用核糖體分量係依照G.祖 貝由E. coli K12 (A19)所製備之S30分量分離出。各細 胞.於37 t：生長於添加有20%葡萄糖（每升培養基10毫升） 之LB (Sigma)醪內。細胞於37t：在中對數相內收穫並在一 壓力槽內溶解。然後以30,000 X g將細胞離心30分鐘而製 備S30萃取物。將一蛋白_抑制劑，.苯基甲基磺醯氟，添 加至溶解緩衝液獲得一爲0 . 5 mM之最終濃度。在 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210 X 297公釐） 1' 1^1 ^^1 l·— i— ( I 1 * (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -if 丨線 五、發明説明（7 ) A7 B7 肪.m2 修 年Λ

Κ ， 1992) 〇 v Cl^Lutlicfex (:SWWWX 50旋轉器內以47,000 rpm將S30之等分置（各爲9毫升） 離心4小時。將沉降之核糖體再懸浮於1.0毫升之20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM Mg(0Ac)2 及 1 mM DTT內產生 約120Q A26()單位/毫升之懸浮液。此核糖體分量於_70 ’C以小等分量儲存。 CPM-SAcMet-tRNAf 係如前用 CPM 標記 Phe-tRNAp»·之

V COctovn) J α胺基圑（歐，1990)所述者製備。簡言之，在 [35S]Met-tRNAf內甲硫胺酸之α胺基團係用二硫二甘醇酸 醯化，然後還原成相應之硫甘醇酸衍生物〇其氫硫基團與 順丁烯醯亞胺（CPM)反應。於兔體內培育抗CPM抗體；如 所述由免疫兔之血清製備IgG分量（皮金等人，1992.: 偶聯轉錄/轉譯用活镡外系統曾經詳述 ，：L992) 〇簡言之，所用以實施偶聯轉錄/轉譯之系統含

容於總體積爲30微升之：50mM Tris-HCl (pH 7.8)、14mM

Mg(0Ac ) 2 n 36mM NH4 OAc > 72mM KOAc、2mM Ca(0Ac)2、0.5 mM EDTAn 2¾ 聚乙二醇一 6000、2mM DTT、1.2mM ATP、各 爲 0.8 mM 之 GTP、UTP 及 CTP 、0.5mM c AMP n 27mM磷酸烯醇 丙酮酸、0.3 5微克丙酮酸激酶、1微克亞葉酸、83/χΜ之 « 14 C-白胺酸、各爲3 30 η Μ之其他十九種胺筹酸、20微克Ε. coli tRNA (Boehringer) n 0.5 微克鈿福平''"ClTs mM葡荀 糖-6-磷酸鹽、1.2 A26。單位之E. co li核糖體分量、0.5 微克質體DNA 、以及0.5微克SP6 RNA聚合酶〇 HC-白胺 酸予稀釋成4 0居里/摩爾供分析用。培育於37’C進行3 0分 鐘〇對於CPM-硫氰酸酶之大規模合成而言，反應混合物加 -----------1 —裝-------1T--^----f I線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局貝工消費合作杜印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） 10 經濟部中央標準局員工消費合作杜印裝 A7 _B7_ 五、發明説明（8 ) 大成0.9毫升並含有以上列出之鹽類及低分子量成份加上 5mM Na2S2 0 3 〇在SP6啓動區下用約10-15微克含有硫氰 酸酶編碼序列之非線性化質體（PSP65)培育約60 A26。單 位之未沖洗核糖體〇 CPM-SAc[35S]Met-tRNAf ( 350居里/ 摩爾）係用作放射性前體；亞葉酸予省略。在一些對照組 實驗中，P 4 C]白胺酸（4〇居里/摩爾）係與非放射性之 fMet-tRNAf併同使用。於37¾培育30分鐘後，將試樣載於 0.6毫升之經緩衝蔗糖上並以45,000 rpm離心45分鐘。然 後，收集上澄液並儲存，將蔗糖層移除；清洗核糖體丸粒 ，然後再懸浮於60微升之20mM Tris-HCl (pH 7.5)、10mM Mg(0Ac)2 n 30 mM NH4 OAc n ImM DTT > 5mM Na2S203 (A 溶液 )中。緊接離心之後，於37 °C用核糖核酸酶A及T1 (分別 爲0.1毫克及2, 000單位/毫升）處理上澄液分量（約爲 0.9毫升）以降解剩餘之CPM-SAC[35S]Met_tRNAf 〇所得 反應混合物於是在平衡於溶液A中之Sephadex G100柱（ 1X20厘米）上進行層析以由含有香豆素及[35S]甲硫胺 酸之低分子量降解產物分離出新合成之CPM標記之硫氰酸 酶。 實例3 螢光測量 螢光測量係在一購自SLM-Aminco Instruments公司（ 伊利諾州爾巴納市）之8000C型光子計數用螢光分光計上 實施。以1塵米發射間隔及每波長增量0.5秒鐘之掃描速 率測量各光譜；激發波長爲39 0塵米。光譜及相對量子產 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 裝 訂 务 • < { {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7

五、發明説明（9 ) 率係以試樣內以CPM-SAc-甲硫胺酸存在之[35S]甲硫胺酸 之放射性爲基礎予正常化〇相對螢光量子產率係由整合發 射光譜測定〇上澄液分量內CPM-硫氰酸酶之相對量子產率 取爲1.0 0而所有其他量子產率均相對於此値獲得〇螢光向 ^ (Odom), 異性係如歐δ!Τ^^( 1 984 )所述以480塵米之發射波長測 定〇爲進行螢光硏究，將一等量之平常核糖體或已處理上 澄液分量在總體積爲420微升之含有以上供偶聯轉錄/轉 譯用鹽類及低分子量成份但無胺基酸且無UTP及CTP (溶 液Β )之杯內培育。在取得光譜後，將待測試之各成份添 加於一最小體積內。再次取得光譜前，於37它培育該杯10 分鐘〇各種添加物爲：抗CPM-IgG，0.1毫克；伴隨蛋白質 GroES，1.6微克;GroEL，6微克；DnaK，4 微克;DnaJ， 2微克；GrpE ; 3微克。 實例4 硫m酸龅定量 以三氯乙酸（TCA)沉澱蛋白質將硫氰酸酶多肽、SDS-PAGE分析及放射自顯影術均如業界所熟知者實施。硫氰酸 、CTsa\lu>VA > j v cSgrVo) j 酶，活性係如U 9 9 3 )中所列示依照佘δ'ΤΐΤ5 3 )加 以分析。基本上，硫m酸酶之_活性係在一用S 2 0 3 2 ·作底 質測量藉_將〇心轉化成SCN·之熱量計分析中予以測定。 以460塵米測量此生成物與多數鐵離子間之一複合體之吸 光率偵測及定量所形成之SCN- 〇於37 ΐ；在此分析系統內產 生1微摩爾之龜量係定義成一個單位0 得自SDS-PAGE之Western斑用對抗因子1及2之牛抗 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -------- 裝------命I-^---^ -線 I (請先Μ讀背面之注$項再填寫本頁) 經濟部中央樣準Α貝工消費合作社印装 12 399352 A7 B7 五、發明説明（10 ) 體或用兔抗硫氰酸_抗體，然後用已鏈接有辣根過氧化物 酶之各個第二抗體予以探測。用Amersham之ECL產品藉化 學發光偵測過氧化物酶。 實例5 在N-端以香豆素標記之硫m酸_之析# 爲伴隨蛋白質在新生硫m酸齡折叠及活化期間之效應 ，香豆素以轉譯方式滲入由CPM-SAC[36S]Met-tRNAf所得 _之恥端〇以_方式形成之Met-tRNAf藉化學反應加以衍 化，然後如上述用以啓動在E. coli核糖體上之蛋白質合 成〇 CPM-SAc[36S]甲硫胺酸之滲入一偶聯轉錄/轉譯系統 內所形成多肽之N-端係在三氯乙酸將活體外合成硫氰酸酶 多狀沉澱之後藉放射性監控之。生成物如第1圖中所示由 SDS-PAGE加以確認。分析係在核糖體與上澄液分量分離後 實施。上澄液及核糖體分量中各自之全長硫氰酸_之SDS-聚丙烯醯胺凝膠上之移行間有差異〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注$項再填寫本頁) 爲進一步確認偶聯轉錄/轉譯期間所合成生成物之此 等全長形式，將得自SDS-聚丙烯醯胺凝膠之多肽轉移至一 PVDF膜並用抗硫氰酸_抗體探測。第1圖指示二者全長形 式均由抗硫m酸酶抗體予以辯識0由於核糖體結合多肽可 轉化成齒活性可溶蛋白質，故本發明結論顯示多肽乃可溶 性酶之前體形式。 可溶性與核糖體結合多牀間之性質差異不明〇 —種可 能性爲較緩慢之移行形式係共價鏈接於tRNA或由其衍生之 核f酸片段〇此項假設由以下觀察指示爲屬不正確：電泳 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） 13 299352 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7_五、發明説明（11 ) 移行圖案不因試樣之用核糖核酸_調混物預培育或於wo •C以pH 10.5預培育10分鐘而受影響。肽與tRNA之3’端核 糖間之酯鍵應在後者之條件下水解〇此外，一可匹擬之緩 慢移行多肽未以¥霉素乙醯基轉移_、篦麻蛋白或二氫葉 酸鹽還原酶之核糖體結合形式偵測出0緩慢移行形式之性 .質未予建立，但其最有可能經由硫m酸_編碼序列末端之 UGA終止密碼子轉譯作用在終止發生於一同相UAG密碼子 處之前造成十三個額外密碼子之轉譯而產生〇然而，頗出 人意表，此較長前體形式顯然係在多肽活化及釋出期間定 量轉化成可溶形式〇 由反應混合物內所添加CPM-SAC[3 6 S]Met-tRNAf獲得 之放射性標記甲硫胺酸僅可發生於硫氰酸_之N-端而非內 部〇 CPM與硫醇基乙酸所醯化之甲硫胺酸之硫醇間之硫酯 鍵在所用培育條件下爲化學及酶穩定。甲硫胺醯基tRNA合 成_不將CPM-SAcMet-tRNA去醯基化，而tRNA“tn不能用 CPM-SAc[36S]甲硫胺酸以_方式予胺基醯基化。此外，在 反應混合物內包括有大幅超量之未標記甲硫胺酸（350UM) 〇此大幅降低可能存在而提供甲硫胺酸滲入多肽內一內部 位置之任何游離[3 6 S ]甲硫胺酸之專一放射性〇因此，香 豆素之摩爾量直接與[36S]甲硫胺酸之放射性成比例取用 並用該放射性將螢光强度及光譜資料正常化，以使以下列 示之此等參數値直接與螢光量子產率成比例而可在不同實 驗間作比較〇 實例6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（21〇x靖）14 (請先閱讀背面之注項再填寫本頁) .裝· *τ 線 五、發明説明（12 ) 新合成CPM糟gR硫氰酸_之分布 新合成CPM標記硫氰酸_分別在可溶性及核糖體分量 內之分布係在核糖體緊接其合成後通過一層蔗糖溶液予離 心沉澱之後進行分析。表I顯示[14C]白胺酸係滲入N-端 未用香豆素改性之硫氰酸_多肽內之內部位置。在此情況 下，非放射性fMet-tRNAf係用以啓動蛋白質合成。約一半 之此等新合成多肽（62%以[36S]甲硫胺酸爲準而43%以 [14C]白胺酸爲準）發現於該核糖體分量內。在上澄液內 回收大部份之剩餘新形成蛋白質0在上澄液分量內之蛋白 質生成物如以其上對多脉加以分析之乾燥聚丙烯醯胺凝膠 進行放射自顯影術所判斷係整體爲全長硫氰酸_ (第1圖 )0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 無細胞轉錄/轉譯系統內所合成硫氰酸_之摩爾量係 由[36S]甲硫胺酸或[14C]白胺酸之滲入硫氰酸_多肽內 予以測定〇在所述條件下，僅—編碼序列係由質體（Psp6 5 ) 即硫氰酸酶之mRNA所轉錄。[14C]白胺酸滲入欠缺質體之 反應混合物中之狀內之量小於存在質體者之渗入量之5 % ，並予減除作爲對照。全長硫氰酸_每鏈含有24白胺酸殘 基並具有33, 000之分子量〇因此’在已知全長生成物之百 分率（上澄液分量爲接近%)時，所合成全長蛋白質 之摩爾量可由N-端甲硫胺酸或所滲入內部白胺酸加以計算 〇此値係用以計算專—_活性，單位/毫克硫氰酸酶。硫 氰酸_活性之單位係測定成每分鐘所形成硫基氰酸鹽之摩 爾數〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1 3 ) 實例7 硫m酸齙活性 上澄液分量內之硫氛酸廳具有廳活性，其專一廳活性 以所滲入之[14C]白胺酸爲準爲744單位/毫克硫m酸酶 〇此活性類似天然牛硫m酸廳之已報導專一活性且類似使 用由牛肝所分離天然硫氰酸酶求出之値。因此，幾近全部 之由核糖體釋入上澄液分量內之轉譯生成物均折疊成天然 構形〇反之，核糖體上之新生多肽不具有酶活性。一類似 情況存在於香豆素[36S]甲硫胺酸形成新合成硫氰酸酶之 N-端時：上澄液內之硫氰酸_具有活性而核糖體上之多肽 無_活性。 較少[36S]甲硫胺酸標記之硫氰酸酶在蛋白質合成期 間隨N-端探子自核糖體釋出，但其視專一酶活性（83 3單 位/毫克硫氰酸_)高出天然_約達17%。此似因一些N-端[36S]甲硫胺酸之移離新形成_所致。 實例8 新合成硫氰酸_之穩宙怖 新合成硫氰酸酶N-端上CPM-[36S]甲硫胺酸之穩定性 分別在上澄液及核糖體分量內直接測試。於37 t：培育60分 鐘後在上澄液分量內觀察到約10%之三氯乙酸可沉澱放射 性損失而無酿活性損失（數據未示出）。天然硫氰酸酶欠 缺N-端甲硫胺酸〇將甲硫胺酸自多數蛋白質之N-端移除之 專用_爲屬已知〇在活體外合成硫氰酸_之情況下，欠缺 N-端香豆素-[36S]甲硫胺酸之多肽不以放射性偵測，結果 本紙張;適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21GX297公釐）16 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· -9 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（l4 ) 低估存在於此等試樣內之硫氰酸_蛋白質量。由N-端甲硫 胺酸所計算之上澄液分量之較高專一酶活性（ 8 33單位/ 毫克相對於以內部白胺酸爲準之74 4單位/毫克，表I ) 似反映此一對試樣內所存在硫氰酸_蛋白質之低估。又， —小部份之硫m酸酶分子可能已用得自製備s3〇分量期間 未予消除之fMet-tRNA之未標記內生甲醯基甲硫胺酸予以 啓動〇應請注意，緊接合成及離心之後，上澄液係用核糖 核酸酶處理，然後在Sephadex G10Q上層析以使CPM-標記 之硫氰酸_與低分子量螢光化合物分離〇在任何情況下， 表I指示香豆素可在硫氰酸_之N-端滲入而且此等分子在 釋離核糖體時具有_活性。 ^^1 I ^ 線 * ί - ί (請先閲讀背面之注項再填寫本頁)

表 I 用N -端CPM-SAcMet合成胞活怖硫氡酸親 總反應罈合物 核糖體分畺 N-端 CPM[15 S1 上澄液 甲硫胺酸 渗入量（P m ο 1 ) 3.4 .2.1 1.2 _活性 (單位 X 10- 3 ) 32.1 0.0 33 專一活性 (單位/毫克） 內部[J_1 C ]白胺酴 1 0.0 83 33 白胺酸 滲入量（P m ο 1 ) 65(2.7)2 30 0 _活性 (單位 X 10- 3 ) 28(1.2)2 0.0 0.0 專一活性 (單位/毫克） 30.3(1.3)2 31.0 744 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） 17 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 _B7______ 五、發明説明（1〇 硫氰酸酶係藉偶聯轉錄/轉譯用CPM_SAc[3 6 S]Met-tRNA作 爲起始因子tRNA或用fMet-tRNAf作爲起姶因子tRNA而[14C] 白胺酸作爲放射性標記予以合成0於37 D培育30分鐘後’ 將反應混合物離心獲得核糖體分量及上澄液，分別分析所 合成蛋白質之量及_活性。各量係對微升反應混合物獲 得。天然硫m酸酶之專一酶活性約單位/毫克蛋白質 ο1未計算，由於核糖體上之不完全且全長之鈍性硫氰酸 _多肽所致。2括號內爲_之算出(24白胺酸殘基/ 硫m酸酶多取）。3此視專一酶活性一致發現爲大於天然 硫m酸_之專一活性。 實例9 CPM-標記硫氡酸脤之螢光特性 不論游離於上澄液內或結合於核糖體之CPM-SAcMe t硫 氰酸酶之螢光參數均摘述於表II 〇對應發射光譜列示於第 3A及3B圖中。爲作比較，表II包括游離於溶液內或結合於 核糖體之CPM-SAc-Met-tRNAf之資料〇 N-端標記CPM-SAcf Met-tRNAf或硫氰酸_ (以[36S]甲硫胺酸爲準）之摩爾 量在每一試樣中均類似；於是藉放射性將螢光資料正常化 成香豆素之一共同摩爾量。螢光量子產率Q相對於上澄液 分量中酶活性CPM-SAcMet硫氰酸_之量子產率表示，後者 賦與1.00之相對量子產率（表II) 〇因此，本文中不同圖 式及表中表示之光譜及相對量子產率値可直接比較〇 上澄液分量中之_活性cpm-硫氰酸酶之產率稍高於結 合於核糖體之CPM-硫氰酸酶（相對量子產率爲1 ·〇〇對0.89 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS 規格（2丨OX297公釐） 18 ---------裝------灯 線 ( · ( (請先閱讀背面之注意事命再填寫本頁) 299352 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（16 ) )，但二者顯著高於不論爲得自溶液中之游離CPM-S Ac Met -tRNAf (Q= 0.43)或結合入核糖體肱基轉移_者（Q = 0.63)之螢光。後者爲肽合成用CPM-SAc甲硫胺酸在其N-端啓動以形成新生硫氰酸酶前之狀況〇量子產率反映香豆 素探子之局部環境。對於游離香豆素或CPM-半胱胺酸而言 ，量子產率隨發射光譜中溶劑極性漸減之紅移而增加〇相 比較，游離CPM-半胱胺酸之絕對量子產率及發射最大値在 水中分別爲〇 .31及486塵米，但此等數値在95 %乙醇中爲 0.91及470塵米，在環氧己烷中爲0.51及460塵米。因此 ，表K光譜資料似指示結合於核糖體之CPM-SAcMet-tRNAf 之香豆素探子在其存在於一新生肽之N-端時遭遇一更疏水 性之環境*但仍以肽基tRNA持留在核糖體上。在新生硫氰 酸酶以_活性形式釋入上澄液分量時量子產率有進一步之 增加〇此等差異似反映新生硫m酸_最終折疊成天然構形 之不同階段，如以下進一步所考量〇螢光異向性對游離於 溶液內之CPM-Met-tRNAf約爲0.17而當結合於核糖體時約 爲0.36 (表II) 〇核糖體結合硫氰酸酶N-端上CPM-Met之 異向性爲〇 . 31，但在酶以酶活性形式由核糖體釋入上澄液 時降至0.18。此差異似反映探子本身之移動位阻及/或分 別在無硫氰酸酶之溶液及核糖體結合硫m酸酶內旋轉鬆驰 或顚動時間差異而由核糖體所引起之螢光基因移動限制0 後項參數反映硫氰酸_及核糖體之質量差異0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇 X 297公釐）i 9 (請先閲讀背面之注意事f再填寫本頁) -'5

T 經濟部中央標準局貞工消費合作社印製 A7 ____ B7 五、發明説明（17 ) 表 11 遊盤於溶液內及結合於核糖體之CPM-SAcMet硫m酸趣以及 CPM-SAcMet-tRNA之螢光特性 受分析分量 Emax1 (塵米） 相對Q 2 A 3 Α· CPM-硫氰酸酶 上澄液 473 1.00 0.18 核糖體結合 471 0.89 0.31 B . CPM-SAcMet-tRNAf 上澄液 487 0.43 0 .17 核糖體結合 480 0.63 0.36 硫m酸酶之螢光特性係用相同或類似於測定表I中所 列示硫m酸11合成及afe活性所用之試樣予以測定。爲做比 較而包括CPM-SAcMet-tRNA之螢光資料（上B.) Emax :最大發射波長〇2相對Q :相對螢光產率；係由整合螢 光發射光譜測定，在[36S]甲硫胺酸放射性之基礎上正常 化並相對於上澄液分量內_活性CPM-SAcMet硫氰酸驗之量 子產率（參考表I)予以表現。3 A :螢光異向性。 實例10 伴隨蛋白質對核糖體結合CPM-硫氰酸廳之效應 在存在伴隨蛋白質時釋離核糖體之酶爲具_活性，而 專一活性類似於天然硫m酸酶，並含有高比例之天然構形 酶分子。反之，核糖體結合硫m酸_爲廳鈍性。 本發明例示伴隨蛋白質（Dna J、DnaK、GrpE、GroEL、 Gr 〇ES)對由酶活性之新生核糖體結合CPM-硫氰酸_所得螢 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ——--------^------1T-------ά. - ( - - ί (請先閲讀背面之注意事V再填寫本頁) 五、發明説明Ο8 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 光之效應，並將所觀察之效應與_之釋出及專一酶活性相 關。後者取作硫氰酸_正確折疊成其天然構形之量度〇個 別添加五種伴隨蛋白質中之每一種，然後在不轉譯條件下 全部一起添加於含有核糖體與全長硫m酸_之反應混合物 表11IA顯示伴隨蛋白質DnaK及GroES各自引起如由螢 光異相性之減小所反映之硫氰酸_多肽顯量釋出。相形之 下，DnaJ引起小量但顯著之異向性增加。伴隨蛋白質GrpE 或Gro EL對螢光具有極小之效應。在核糖體用所有伴隨蛋 白質一起培育時對釋離核糖體之蛋白質及螢光之量觀察到 可觀之較大效應〇然後藉離心將反應混合物分離成核糖體 及上澄液各分量〇 表III B列示上澄液分量中硫氰酸酶多肽內之[3 6 S ]甲 硫胺酸pmol量。在用所有伴隨蛋白質一起培育後在上澄液 分量內之硫氰酸_專一_活性接近天然硫氰酸_ : 695單 位/毫克相較於天然_之745單位/毫克。所釋出物質之 量子產率、異向性及最大發射値亦極類似_活性硫m酸_ (參考表II) 〇相形之下，在僅有DnaK或GroES存在時由 核糖體釋離之硫氰酸酶即令由多於90 %之全長硫氰酸_多 肽組成（資料未示出）仍實質上爲_鈍性。又，其量子產 率及發射最大値不同於鵬活性硫m酸鰣，暗示該物質不折 叠成天然構形〇因此，本發明證實伴隨蛋白質僅在其等於 核糖體結合之新生硫m酸_上一起作用時促進有效之折叠 成天然構形〇 DnaK或GroES引起一些新生鏈釋離核糖體， 但其他伴隨蛋白質需要在核糖體上完成折疊程序〇 〇 請 先 閲 讀 背 之 注 意 再 填 寫 本 頁 裝 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公簏〉 21 五、發明説明（19 ) A7 B7 表 111 由結合於核糖體之CPM-SAcMe t硫m酸is所得蒂光少 各種伴隨蛋白質媒介镦化 添加於 A.具有 CPM-[_1 i S 1 M e t槱iR硫m酸龜之核糖體 Emax1 (塵米） 相對Q 1 A 1 Μ /w\ 471 0.89 0.31 Dn a J 471 0.92 0.32 DnaK 473 0 . 97 0 . 26 G r p E 471 0.89 0.29 G r p EL 472 0 . 90 0.30 G r ο E S 474 0.94 0.25 一起 475 1.03 0.21 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 B. 由上A所得上潸液分量 Emax 1 (塵米） 相對 Q 1 A 1 釋出之硫m 酸與（pmo1) 專一酶活性 (單位/毫克） 姐 氺 本 氺 0.22 Dna J 木 * % 0.15 DnaK 485 1 .17 0 .19 1.95 2 G r p E 氺 氺 氺 0.22 Gr pEL 氺 氺 氺 0 .30 Gr oES 480 1.12 0 .19 1.50 3 一起 473 1.00 0 .18 2.61 695 rPM-SAc[36S]甲在新生硫氰酸酶肽中含有4·5 Pm〇1之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS >八4規格（2I0X297公釐） 22 A7 B7

85.10.2 2 經濟部中央標準局負工消費合作社印«. 五、發明説明（20) 硫胺酸之核糠體在不轉譯條件下於3TC用所指示伴隨蛋白 質培育10分鐘。反應混合物之螢光特性係直接測定（A部 份）或僅在離心後對上澄液分量加以測定（B部份）〇酿 活性僅對上澄液分量加以测定〇 1簡寫如表11中所解釋〇 #非可靠測量螢光之適當物質〇 Γ 商用伴隨蛋白質之品質係由SDS-PAGE繼以庫瑪 予以評估〇伴隨蛋白質顯示一具有預期大小或電泳移行度 之單一帶，唯含有一些較高分子量汚染物及可看出爲二聯 體之DnaJ之GroES例外。所用伴隨蛋白質全部藉釋放因子 1或釋放因子2檢驗各汚染物。由SDS-聚丙烯醯胺凝膠所 得Western斑用個別抗體探測。無一釋放因子以此步驟於 任一伴隨蛋白質製品中偵測出（無資料顯示）〇 表《1顯示無單一伴隨蛋白質能將鈍性核糖體結合硫氰 酸酶轉化成天然構形。其次，檢驗一或二伴隨蛋白質之連 績添加〇表IV中所例示本發明之一意外情況爲添加之順序 似關緊要。酶活性硫氰酸晦僅在首先添加Dna J繼以DnaK及 GrpE而最後爲GroEL·加GroES時獲得（表IV之A部份）〇 釋放及活化與異向性之減小及相對量子產率之增加相關連 。相較之下，在核糖體結合硫m酸酶多肽首先用伴隨蛋白 質GroEL/ES繼用餘留伴隨蛋白質培育時，異相性維持高 値而量子產率改變極小（表IV中B部份）〇酶活性在此情 況下接近偵測之下限〇在表IV中，螢光參數係在整體反應 混合物之測定，而酿活性係於離心後在上澄液分量中測定 〇 GroEL/ES可能影響仍然結合於核糖體或在添加GroEL/ 本紙張尺度通用中國國家橾準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） m n In m ^ - I - (婧先M1*背面之注意事項-ft填寫本頁)

-1T i線 23 A7 B7 專~廳活性2 (單位 /毫克硫m酸虛_1_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

無（ D n a J (i然後+) DnaK+GrpE (i然後+) GroEL+GroES B. 無（、< + ) GroEL+GroES (vl然後+) Gr pE (、，然後+ ) DnaK+DnaJ 五、發明説明（21 ES之前釋放之螢光硫氰酸_分子。

表 IV

連續添加伴隨蛋白質之效應 連績 Emax1 相對 A 添加_(塵米） Q」_ 471 0.89 0.31 0 471 0.92 0.33 0 474 1.01 0.26 2 480 1.20 0.20 217 471 0 .89 0.31 0 473 0.91 0.29 3 473 0.91 0.29 3 474 0.93 0 . 27 9 新生硫氰酸_多肽之含有4.5 pmol之CPM-SAC[3 6 s]甲 硫胺酸之核糖體係用指示之伴隨蛋白質依A或B下之順序 各於37 ·〇培育1〇分鐘。螢光參數如前測定，然後將試樣離 心並分析所得上澄液之硫氰酸_釋放量及其用於計活 性之酶活性〇 1簡寫如表II中所解釋0 2於上澄液中測量 裝 II 订 III線 • C 〆 ( (请先閲讀背面之注意事V再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 24 經濟部中央標率局貝工消費合作杜印製 A7 _B7 _ 五、發明説明（22 ) 〇於旣定條件下培育及測量螢光後，核糖體如上述與上澄 液分離〇 實例11 _鈍性硫m酸ife轉化之要件 本發明亦顯示用以將酶鈍性硫氰酸_轉化成一酶活性 構形之伴隨蛋白質及培育要件〇表IV中A部份所示工作係 通過添加DnaK/GrpE (在添加GroEL+GroES之前）之點重 複，然後將試樣離心以迅速將釋放之蛋白質與核糖體結合 硫氰酸_肽分離。將含有已釋放全長硫氰酸酶肽之上澄液 吸回螢光杯內，測定螢光參數（表V，A部份，第1行） 並添加GroES/EL第2行）〇在培育10分鐘後，再取得光譜 並如前計算異向性〇同樣，將含有核糖體結合硫m酸鹏之 核糖體分量在其已再懸浮於B溶液內之後予以分析，並在 無或有GroES/EL存在時予再培育。然後測定試樣之光譜性 質（表VB首二欄）〇最後，再次將試樣離心以獲得一上 澄液及核糖體分量。測定已釋放硫氰酸酶存在於此上澄液 分量內之量及專一酶活性（表VB最後二欄）。表V顯示 約1.8 pmol之CPM-硫氰酸酶在用DnaJ、DnaK及GrpE但不添 加GroEL/ES予以培育後釋放（約30%之核糖體結合CPM-硫 氰酸_)於上澄液內。此物質具有低異向性（如所預期） 且無_活性。將GroEL/ES添加於此一含有已釋放CPM-硫氰 酸酶之分量對異向性不具效應且對虜活性僅有最小之效應 〇與核糖體聯合之CPM-硫氰酸酶在〇1'〇£1^/£3添加之前具有 極高之異向性，因爲在前行培育期間已藉DnaK釋放之CPM- 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公釐）25 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 線- 299352 A7 B7 五、發明説明（23 ) 硫氰酸_已藉離心自試樣消除。異向性在添加GroEL/ES時 劇烈下降（表V B )且偵測_活性。此已釋放蛋白質之專 活性爲天然_所具有者。 表V證實GroEL/ES對已釋放硫氰酸_多肽之效應小或 無，但似乎在一先前用DnaK、DnaJ及GrpE之單獨核糖體培 育後造成核糖體結合硫m酸酶之活化及釋放。爲作比較， 表vc包括硫氰酸酶多肽藉瞟昤霉素釋離核糖體之結果。 伴隨蛋白質中無一對用瞟昤霉素培育核糖體後得自CPM-硫 m酸酶之廳活性或螢光具有效應。同樣，無一伴隨蛋白質 在單獨或合併時對原始偶聯轉錄/轉譯期間由核糖體釋離 之活性cpm-硫m酸_之_活性或螢光具有任何效應（資 料未示出）〇

表 V

GroEL/ES對已釋放及核糖體結合硫氰酸_之效應 相對 A 1 量 專一_活性 Q.—_(pmol) (軍位 / 亳克） 請 先 閲 讀 背 之 注 意 再 頁 訂 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 A . R釋放硫m酸 (上澄液分量） 無 1.16 0.187 1.8 0 GroEL/ES 1.17 0.187 1.8 6.7 B. 核糖體分量 無 0.83 0.373 0.1 0 GroEL/ES 0.98 0.221 1.4 728 c. 用嘌吟霍素釋放之硫m酸廳(上澄液分量） 伴質 之白 部蛋 無全隨 1.21 0.199 2.2 0 1 .20 0.198 2.1 0 本紙张尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 26 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（24) 對表V而言，結合於核糖體之CPM-Met-硫氰酸廳（約 4.5 pmol)係用DnaJ、DnaK及GrpE在B溶液中培育。其次 ，將試樣離心並在後者已再懸浮於相同體積之B溶液中之 後分析上澄液及核糖體分量〇取得光譜，由一小等分量測 定硫氰酸_之量及活性。然後對每一試樣添加GroEL以及 GroES並重複測量。對於核糖體分量，在添加GroEL/ES後 ，試樣於空氣離心機內再次離心並測定硫氰酸_之專一酶 活性〇 對表V，C部份而言，結合於核糖體之CPM-硫氰酸酶 係用2 mM瞟昤霉素於37 t：培育10分鐘，然後將培育混合物 離心〇在另一次用或不用伴隨蛋白質之培育後僅分析所得 之上澄液〇 1簡寫標示於表11中〇 實例12 稀疏霉素阻斷核糖體結合CPM-硫氡酸酿之釋放 抗生性稀疏霉素結合於Kd約0.1 Μ之50S核糖體次單 位並抑制肽基轉移酶反應。在微摩爾濃度中，稀疏霉素對 由載有CPM-硫氰酸應之核糖體所得香豆素螢光無效應〇首 先，如表111中所述個別添加稀疏霉素然後各伴隨蛋白質〇 表VI顯示無一伴隨蛋白質對所測量之螢光參數具有任何可 偵測之效應〇當伴隨蛋白質在稀疏霉素後團體（未示出） 或個別添加時，異向性之改變與表111Α中所列示之資料相 較僅爲極小，指示大部份之CPM-硫氰酸_多肽維持結合於 核糖體〇此在螢光測量完成後將試樣離心予以證實〇少於 ίο %之硫m酸_分子在存在稀疏霉素時釋入上澄液內，而 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 2 7 ----------装— . { (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___B7 _ 五、發明説明（25 ) 此已釋放之物質爲_鈍性（資料未示出）〇因此，稀疏霉 素防止硫氰酸酶藉DnaK或GroES釋離核糖體。由於稀疏霉 素干擾肽基轉移Sfe反應，故本發明證實CPM-硫氰酸1¾係以 肽基tRNA持留於核糖體上，而且DnaK及/或GroES之釋放 作用涉及在一將tRNA與多肽間之鍵水解之反應中之取基轉 移龜中心〇

表 VI 稀疏雹棄防止由結合於核糖體之CPM-S Ac Met硫氰酸虛 所得锩光之伴隨蛋白晳媒介變化 添加物 max1 Q 1 A 1 川、 471 0.89 0.31 先稀疏霉素 471 0.90 0.30 然後： Dn a J 471 0.90 0.31 或 DnaK 471 0.92 0.30 或 GrpE 471 0.90 0.30 或 G r o EL 471 0.90 0.30 或 G r ο Ε S 473 0.91 0.29 DnaJ + DnaK 471 0.92 0.32 —起 471 0.90 0.29 實驗條件相同於表111，唯於個別添加每一伴隨蛋白質 前添加4u Μ稀疏霉素〇無一伴隨蛋白質使多於一小百分率 之CPM-硫氰酸_釋入上澄液內。 實例13 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨ΟΧ297公釐） 28 (請先閲讀背面之注意事巩再填寫本X) -裝. 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 85.a22降正 A7 邛月 f i. -；~ _____補无_ 五、發明说明（26 ) 稀疏霍素阻斷核糖體結合CPM-硫氰酸齙之釋放 以硝基甲烷淬滅得自CPM-硫氰酸酿之螢光係評估成探 子在不同情況下接近能力之量度〇硝基甲烷爲一水溶性之 未離子化小分子，有效在溶液內藉與探子之碰撞將香豆素 螢光淬滅。史登一7弗爾默圖示於第2圖中。游離於溶液 內及結合於核糖體之CPM-Me t-tRNAf分別顯示最高及最低 之淬滅作用0游離於溶液內之螢光基因較易接近，因其在 CPM-Me t-tRNAf結合於核糖體時廣大部份被硝基甲烷遮蔽 〇溶液內_活性硫氰酸酶N-端之CPM亦較易接近。此與豳 活性硫氰酸臨之異向性資料（表II)及N-端片段經暴露之 硫氰酸酿:晶體結構一致。有趣者爲淬滅作用對已用DnaK或

瞟昤霉素釋離核糖體之硫氰酸_顯著較低。此物質如表III 及V中所示爲_鈍性。二者所得之値類似，但較低於對游 離酶活性硫氰酸_所觀察者。因此，本發明證實此已釋放 物質之N-端較天然硫氰酸ϋ之暴露程度小而且此蛋白質不 折叠成其天然構形。核糖體結合硫m酸酿之甚至更低淬滅 « 作用可能部份因核糖體尤其新生短肽者之遮蔽以及全長多 肽之不完全折疊所致。 實例14 由抗香豆素I gG所偵測之中間狀熊 對CPM-螢光基因具有高結合專一性之多株抗體予用以 評估結合於核糖體之全長硫氰酸酶鏈相較於游離於溶液中 之ft活性硫氰酸酶之折疊作用。第3A及3B圖指示探子可接 近核糖體結合及游離CPM-硫氰酸豳二者上之抗香豆素抗體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --------^ 1^------ix--：---- (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 29 299352 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（27 ) 〇對後者而言，_活性硫氰酸_係藉所有伴隨蛋白質之培 育由核糖體釋放，然後如相對於表II所述藉離心將核糖體 移離反應混合物0抗體導致異向性及量子產率增加，此與 游離及核糖體結合CPM-硫氰酸_二者之螢光紅移相關連。 在存在抗香豆素IgG時，發射最大値（約456塵米）在二 者情況中相同0量子產率及發射最大値之改變顯然反映因 結合於免疫球蛋白所致探子環境疏水性之增高0因抗體所 致量子產率之增加在核糖體結合硫氰酸酶（第3A圖）時較 游離於溶液內之晦活性CPM-硫m酸龜（第3B圖）爲小。此 量子產率差異可能因核糖體使抗體之較短新生Μ部份折疊 所致。此現象先前已就新生聚丙胺酸及新生MS2外殼蛋白 觀察到。如同先前就CPM-SAcAla-tRNA所得結果，結合於 核糖體P位點內之CPM-SAcMet-tRNAf似完全遮離IgG ，因 爲該三參數中無一在用抗CPM IgG培育時有任何變化（資 料未顯示）〇 爲證實伴隨蛋白質對核糖體結合新生CPM-硫氰酸酶之 效應，首先將稀疏霉素、然後Dna J或DnaK個別或一起添加 於含有類似第3A圖所用核糖體之反應混合物內。如相對於 表VI所討論者，在存在稀疏霉素時有極少之硫氰酸酶釋離 核糖體。培育之後，添加抗香豆素IgG 〇所得混合物之發 射光譜顯示於第4圖。一僅用稀粗疏霉素（不添加伴隨蛋 白質或抗香豆素IgG )培育之試樣之發射光譜列示供比較 用oGroEL及GroES單獨或一起均不引起任何如DuaJ在存 在IgG時無或有DnaK之情況之光譜變化。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 線 30 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7__ 五、發明説明（28) 含有DnaK或DnaJ或二者之試樣之光譜可直接與第3A圖 中由一含有核糖體結合CPM_硫氰酸龜之有或無1gG之試樣 在欠缺伴隨蛋白質時獲得之光譜比較0用DnaK繼用1 gG培 育對所得發射光譜之效應小，但用DnaK培育之試樣明顯有 —清晰之雙峰曲線0此效應對含有DnaK&DnaJ二者之試樣 更爲顯著〇在此情況中，明顯之最大値出現於光譜中435 塵米及472塵米處。後者極接近游離或核糖體結合硫氰酸 _在欠缺IgG時之最大値，如第3A及3B圖所示。該雙峰發 射光譜指不在存在IgG時》用DnaJ或DnaJ加DnaK之試樣中 存在二種螢光物種。一可能性爲抗香豆素抗體僅能與部份 之CPM-硫m酸_交作，因爲DuaJ結合於一些新生硫氰酸_ 狀之N-端。哈投及其夥伴曾發表資料指示DnaJ可以化學方 式交聯於核糖體結合新生多肽。然而，若干證據暗示DnaJ 不結合於核糖體結合硫m酸_之N-端--至少不以可偵測方 式影響N-端香豆素之途徑。首先，DnaJ本身對量子產率、 異向性或發射最大値不具有明顯之效應，如表111所示〇其 次，DnaJ似不遮蔽N-端香豆素。將新生CPM-硫氰酸酶之某 些部份遮離IgG與不含DnaJ之試樣相較會造成量子產率及 異向性之減小〇此一減小不明顯（將第4圖之挿入物與第 3A圖之挿入物相比較）〇 IgG係結合於二者螢光物種（最 大約44 0塵米及470塵米，第4圖）一節爲由IgG在該二 者發射光譜區域內所導致螢光强度之類似變化予以指示〇 因此，第4圖指出DnaJ引起新生肽或核糖體之狀態改變， 而以一在探子結合於IgG時影響其環境之方式影響新生肚 本紙張尺度適财關家料（CNS〉A4规格（21GX297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（29 ) 〇 DnaK似方便此種因DnaJ所引起之改變〇 實例15

在本發明之另一應用中，酵母TATA盒結合用蛋白質係 在一 E. coli S30萃取物中藉偶聯轉錄/轉譯由—含有在 T7啓動區下之編碼序列之質體合成。在此情況中，T7 RNA 聚合酶包括在培育工作內。起始因子爲CPM-SAc[36S]Met-t RN A f ο 在一10微升反應混合物中，約合成125塵克N(香豆素） 酵母TATA盒結合用蛋白質。反應混合物予放大62倍〇培育 後，將600微升之含有約7.5微克已標記蛋白質之反應混 合物荷載於一含有DEAE纖維素之已平衡於20mM Tris-HCl (pH 7.9)、100mM KC1、0.5mM 乙二胺四乙酸（EDTA)、5mM /5硫醇基乙醇及20%乙二醇（A緩衝液）內之0.5毫升柱 上。約0.7 5微克之酵母TATA盒結合用蛋白質不吸收於基質 上，約1.5微克之N(香豆素）酵母TATA盒結合用蛋白質係 用200 mM KC1在相同緩衝溶液中流洗予以回收。以35 0 mM KC1流洗該柱回收額外之3.0微克香豆素標記蛋白質。此 物質荷載於一經平衡於A緩衝液內之肝素一瓊脂糖柱（1 毫升床體積）上〇大約一半之放射標記蛋白質被吸收並增 高A緩衝液內之鹽濃度至0.7M KC1予以流洗〇藉螢光將經 流洗之蛋白質用以硏究酵母TATA盒結合用蛋白質之結合於 專一 DNA序列。將一突變之DNA序列用作對照組〇番豆素 螢光量子產率及螢光異向性之改變指出，如所述加以純化 之活體外合成蛋白質與含有該TATA盒之DNA專一交作。 --I I I— I — I I I I I I 訂— I I I I 線 • 一 - · ( (請先閲讀背面之注意事爭再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（2丨OX297公嫠> 32 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（30 ) 使用本文中所揭示無細胞轉譯系統時，蛋白質合成以 一較高之線性速率在該速率迅速下降之前進行約2 0分鐘〇 酶活性硫m酸_在線性合成期間形成並釋離核糖體，但系 統之失敗與明顯爲全長之硫氰酸多肽在核糖體之牀基轉 移_中心累積成肽基tRNA相關連。此等累積之新生多肽以 牀基tRNA存在於核糖體P位點一節係由其等與嘌昤霉素之 反應力以及稀疏霉素在阻斷後續終止及蛋白質釋放方面之 效應予以指示0如本文中所用，'"終止"僅指直接有關新 生多取與tRNA間酯鍵之水解作用之反應，而本文中所用“ 釋放"係指蛋白質與核糖體分離。累積之核糖體結合新生 硫m酸酶爲_鈍性，但僅藉由核糖體之同時用五種伴隨蛋 白質DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL及GroES培育予以釋放及 轉化成完全活性在所用條件下之此培育期間，胺基酸 之滲入新生蛋白質不能偵測出。具有低_活性之硫m酸 係先用DnaJ、DnaK及GrpE培育核糖體繼用GroEL及GroES 第二次培育核糖體而產生〇此似乎確立此等反應之序列而 由使用DnaJ之結果予以支持。 與瞟呤霉素反應或用DnaK或GRoES培育而釋離核糖體 之蛋白質爲爲酶鈍性〇此釋放之蛋白質不因使用任何伴隨 蛋白質組合而活化。此多少譲人意外，因爲GroEL及GroES 有效促進再折叠成已用胍· HC1予以變性之硫氰酸酶之_ 活性蛋白質〇Gr〇EL及GroES是否中介在核糖體本身上之 折疊作用或與新釋放之蛋白質在其經歷將GroEL及GroES 阻斷之二次反應前作用仍有待確立〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 一~~ 裝 訂 線 . 一 ^ (請先閱讀背面之注意事命再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7_ _ 五、發明説明（31 ) 新生硫m酸酶N-端之香豆素螢光改變反映在酶活化、 終止及由核糖體釋放期間發生之伴隨蛋白質相依反應〇番 豆素之螢光對螢光基因之局部環境極爲敏感，故探子在核 糖體內位置之改變、其所鏈接新生肽之折疊作用、或一接 近探子之伴隨蛋白質之結合作用均由螢光量子產率、發射 最大値及異向性予以反映。核糖體所釋放完全酶活性CPM-硫氰酸酶及核糖體結合CPM-硫氰酸_之此等參數差異爲屬 明顯且似乎反映蛋白質構形之差異〇舉例言之，將酶活性 可溶性CPM-硫氰酸酶之相對量子產率（表II)與用DnaK或 GroES培育而自核糖體釋放之_鈍性可溶性硫氰酸酶（表 ΠΙ )相比較。此二明顯無關之具有ATP之蛋白質何以促進 硫m酸_之釋放爲屬不明。其等在此方面之活性爲溯及具 有GTP酶活性之釋放因子3 (RF-3)之活性。 硫氰酸ϋ以不同構形存在係由第2圖予以支持，其中 例示不同狀態蛋白質之硝基甲烷淬滅作用差異〇此等差異 有可能反映不同構形蛋白質本身對探子之遮蔽作用之差異 〇然而，一突出之特徵爲無一個別或組合之伴隨蛋白質導 致可匹擬於就抗香豆素IgG所觀察到之顯著螢光變化（第 3A及3B圖）〇此似指示無一伴隨蛋白質直接與CPM-硫氰酸 膦之N-端交作。第4圖顯示DnaJ促進一影響核糖體結合新 生硫氰酸_之反應，如抗香豆素I gG之結果所證明。繼與 DnaJ反應後，N-端香豆素以二種可由抗香豆素抗體區別之 不同狀態存在。發射最大値接近44〇塵米之成份由DnaJ單 獨產生，但在有DnaK存在時增强，暗示後者便利DnaK所促 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）3 • - III 11II11 訂-— i ^ 線 (請先閲讀背面之注^4^再填寫本頁) 399352 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（32 ) 進之反應〇此等結果有可能反映不同長度之新生鏈，例如 —與DnaJ或DnaK或二者交作之物種或類別，而其他假定爲 較短形式者則可能不與此等伴隨蛋白質反應。此二（假設 爲）不同長度之類別可能代表在新生肽伸展時出現之不同 折疊中間物〇第4圖中所見之顯著效應僅在有稀疏霉素存 在時觀察到。因此，最大値接近44 0及47 0塵米之螢光物 種反映由稀疏霉素所包陷之DnaJ及DnaK產生之中間狀態。 推論之，其等必然在終止反應序列中發生於肽基tRNA之密 碼子導引水解作用之前〇所用伴隨蛋白質均高度純化且似 乎不含釋放因子〇 —高比例之釋放因子1及2與E. coli 細胞內之核糖體相關連〇 伴隨蛋白質媒介反應如何或爲何影響牀tRNA鍵之因子 媒介水解作用、終止、及新生蛋白質之釋離核糖體均屬未 明。前述反應受稀疏霉素阻斷而認爲涉及肽基轉移_反應 〇 —可能之效應已就形成於內質網上之蛋白質加以注意〇 信號識別粒子與核糖體之聯結抑制新生牀之伸長直到信號 識別粒子•新生蛋白質•核糖體複合體與內質網膜上之受 體或泊塢蛋白質交作爲止〇 一疑問爲：終止、折疊及釋放等反應發生於核糖體內 何處？在多肽合成期間，胺基醢基tRNA及短牀如肽基tRNA 係剛性持於一位於大核糖體次單位之中央結節底部之疏水 性位點內（肽基轉移中心）〇 t RN A係結合於二核糖體次 單位間界面上之特定位點，新生牀係以取基tRNA形式位於 肽基轉移晦中心內。然而，電子顯微照片顯示出口域（新 (請先閲讀背面之注意事r再填寫本頁) 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐〉 35 A7 B7

經濟部中央橾準扃貞工消費合作社印«. 五、發明説明（33 生蛋白質自核糖體出現之區域）位於大型次單位之遠端表 面與脒基轉移酶中心相距長達90埃或更多。在丙胺酸殘基 內之新生聚丙胺酸長度係用以估計肱基轉移_中心至肽之 N-端探子變成可接近IgG或其Fab片段之點之距離，對前 者約60殘基或90埃（1.5埃/螺旋形胺基酸）而對Fab爲 殘基或60埃。抗香豆素Fab可與平均長度較其所衍生之 對應IgG爲短之肽反應，暗示其較短之尺寸容許其更深透 於核糖體內部。曾報導DnaJ在小麥胚核糖體上以短至5 5胺 基酸之長度以化學方式交_於氯霉素乙醯基轉移酶及螢火 蟲蟲螢光素酶之新生脒〇此牀長度與以上所指示之聚丙胺 酸結果間合理相符〇 本發明顯示短新生肽之胺基酸端係遮蔽於核糖體之一 區域內直到長度伸展到其N-端充份移離肱基轉移酶中心之 區域外爲止〇此區域可能如尤納斯及其夥伴所原始報導者 v ( )) 包含通過大型核糖體次單位之通道。艾森f坦"^777 1994 ) 對核糖體結構資料之評論指出，有一或更多之通道或孔穴 存在於大型核糖體次單位內介於肽基轉移酶中心與出口域 v cCrov^ley >」 間夥伴（ 1993)提出之資料指出，新生眞核生物 膜蛋白質之信號序列在其合成期間通過一類似之通道移動 〇本發明暗示此在大型核糖體次單位內之孔穴提供一處所 ，在其內至少有部份之折疊程序發生於一將新生蛋白質部 份遮離蛋白酶及其他發生於細胞之細胞質內之降解程序之 環境內〇 所有在本說明書中所提及之專利及刊物均指示本發明 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐）36 ——^------I—裝-------ITI-1---—線 - (請先閏讀背面之注$項再填寫本頁) 五、發明説明（34 ) 相關業界熟練 程度上以指述 自指示成以指 業界熟練 獲得所述之結 其中所述方法 在目前代表較 發明範疇之限 練人士思及， 神內。 人士之技術 方式納入本 述方式納入 人士將迅即 果及利益以 、步驟、處 佳之具體形 制〇其中之 故涵蓋於如 A7 B7 位準〇所有專利及刊 文，猶如每篇刊物均 Ο 認知本發明極適合實 及其所固有者〇目前 理方法、分子以及特 式，均爲例示性，且 改變以及其他使用均 各申請專利項所定義 物均在相同 予專屬且各 施各目標並 各實例以及 定化合物均 無意用作本 將由業界熟 之本發明精 請 先 閲 讀 背 * 之 注 意 事 再 裝 訂 線 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210 X 297公嫠）

Claims (1)

1. AS B8 C8 D8

   經濟部中央梂準局ec工消费合作社印製 (85 .10.21 .修正） 六、申請專利範圍 I—種在無細胞蛋白質合成系統 質之方法，由以下步驟組成： (a )以內含—相關蛋白質用編碼 DNA培育一得自無細胞萃取物之核糖 糖體分量試樣係在一偶聯轉錄/轉澤 螢光標記之胺基醯基tKNA如以培育； (b)使部份純化之新合成螢光標 內之其他螢光成份分離； (c )測量所合成螢光標記蛋白質 (d )測定新合成螢光標記蛋白質 U )’測定該新合成螢光標記蛋白 其中所述螢光標記係由香豆素及 fc基苯基）-4-甲基-7-(二乙基胺基） 之集團中選出〇 2 .如申請專利範圍第1項之方法 係在所述蛋白質之N-端上〇 3 .如申請專利範圍第1項之方法. tRNA係一起始因子一胺基醯基tRNAo 4 .如申請專利範圍第1項之方法 係共價鍵接於一起始因子一胺基醯基 5 .如申請專利範圍第1項之方法 譯培養基MKNA聚合_、三磷酸核苷 利^酸含於一緩衝鹽溶液內 6 .如申請專利範圍第1項之方法 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS )八4規格（210X297公釐） 內合成螢光標記蛋白 序列之質體（質粒） 體分量試樣，所述核 培養基內併同一具有 記蛋白質與所述試樣 之量； 之螢光；以及 質之生物活性， 3-U-順丁烯二醯亞 香豆素（CPM)所組成 ，其中所述螢光標記 ，其中所述胺基醯基 ，其中所述螢光標記 tRNA之胺基酸上。 ，其中所述轉錄/轉 、一能董產生系統、 Ο ，其中所述質體DNA ---^------^ ·裝------訂—----~ 線 (請先閲讀背面之注意事項再填商本頁) A8 B8 C8 D8 六、申請專利範園 爲非線性化〇 7 .如申請專利範圍第1項之方法，其中所述步驟（a ) 之培育約在37 t)進行3Q分鐘。 8 .如申請專利範圍第1項之方法，其中所述螢光標記 蛋白質係由一自離心法、離子交換層析術及凝膠過濾法所 組成集團中選出之方法予以部份純化〇 ---^-----—{ —裝------灯------(線 « · (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央梯準局負工消费合作社印裝 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（’210X297公釐）