JPH07503125A

JPH07503125A - 合成ｔＲＮＡ

Info

Publication number: JPH07503125A
Application number: JP5505225A
Authority: JP
Inventors: ハーディスティ，ボンド; ピキング，ウエンディ　エル．
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 1992-08-21
Publication date: 1995-04-06
Anticipated expiration: 2018-08-25
Also published as: NZ244124A; DE69230404T2; IL102924A0; DE69230404D1; GR3032899T3; US5358862A; FI940912A0; RU2111250C1; NO309608B1; ATE187492T1; CA2115050A1; WO1993005062A1; CN1086261A; NO940670L; CN1056188C; JP3439763B2; EP0601117A4; DK0601117T3; EP0601117A1; FI111464B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称　合成ｔＲＮＡ且班豊１見本発明は一般的にはペプチドのイン・ビトロでの合成に関するものであり、より具体的には、合成ｔＲＮＡ種を用いての大腸菌リボゾーム上での発生期ペプチドの合成に関するものである。

科学者たちは長い間、生きている細胞外での効率的に蛋白質を修正したりつくりだしたりすることを可能にする方法の開発と取り組んできた。こうした努力のひとつの技術的な内容は酵素によるアミノアシル化のための変更アンチコドンあるいは認識部位によるｔＲＮへの修正である。この修正されたｔＲＮＡは一連の修正ＬＲＮＡのそれぞれによって読み取ることができる単一の新しいコドンを発生させることにより、蛋白質の目標部位の種々のアミノ酸の置換を比較的簡単にしてくれる。

一連の修正ｔＲＮ＾を、それぞれ別のアミノ酸に対してひとつずつ用いることにより、特定のアミノ酸を蛋白質の標的部位に組み込ませることができる。はとんどの環境の下では、どの系でも唯一種類の蛋白質が合成されるだけであるが、ポリペプチドの活性に対するアミノ酸置換の影響は、各アミノ酸置換のためのクローンをつくらなくても、そして、多くの場合表現と、それに続くもとの細胞内につくりだされる蛋白質のテストに関する問題と直面せずに、直接測定することができる。

最終的には蛋白質の三次構造をそのアミノ酸配列から推定する能力がより向上した時に、わずか２０のコドンを含んでいるｍＲＮＡを、それに対するコドンが万能遺伝暗号内に存在している２０種類の自然由来のアミノ酸のそれぞれに対してひとつのコドンを用いることにより、完全に設計した通りの蛋白質をつくりだすことができるようになるであろう。また、未使用の４１のコドンの一部に対するアンチコドンを含んでいる修正ｔＲＮＡを用いることで、蛋白質のひとつ、あるいは複数のより特殊なサイトにアミノ酸を組み込むこともできる。さらに酵素によってではなく、化学的な方法による修正ｍＲＮＡのアミノアシル化を用いることによって、自然由来の対応部分を持っていないアミノ酸をこれら「人工蛋白質」に組み入れることも可能になるであろう。これにより、生きた生物の体内では起き得ない触媒メカニズムや基質を用いる人工酵素の設計、テストおよび生産も可能になるであろう。

特殊なアミノ酸を用いてのｔＲＮＡのアシル化は、化学反応でも酵素反応でも行うことができるが、後者の場合はアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＡＳ）を用いて行われる。ｔＲＮＡの化学的アミノアシル化に関する手順はすでに公知である。Ｓ、　Ａ。

Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら（１９８９）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１７　：　９６４９−９６６０　；　Ｍ。

Ｈａｇｅｎら（１９８８）　Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　５３　：　５０４０ −５０４５゜生体システムにおいては、　ＡＳはアミノアシル化されるべきアミノ酸とｔＲＮＡの両方を高い個別性を持って識別しなければならない、　ＡＳによるｔＲＮＡ種の認識はｔＲＮＡにおける特殊な構造的特徴に基づいている。種々のｔＲＮＡにおいて、その同族ＡＳによる認識を規定する単一の、構造的特徴の組み合わせが存在するわけではない、Ｃ，ｄａ　Ｄｕｖｅ　（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３３　：　１１７−１１８、　ｔＲＮＡに関する構造的特徴の多くは、種々の生物における特定のｔＲＮＡ種に対して、非常に限定的に保存されているのではないようである０合成ｔＲＮＡのアミノアシル化に関する個別性におけるかなりの変異が大腸菌、イースト菌、およびウサギ網状赤血球から得られるＡＳを使って見いだされており、さらにアミノアシル化を行うための条件（塩およびスペルミンまたはスペルミジン濃度、温度）においてもいろいろの変異が認められている。同族ＡＳよるＬＲＮＡ認識に関するいくつかの原理が認められ始めている。一部のＡＳはアンチコドンのすべてに関して厳しい要求を持っているようであるが、池のものはアンチコドンの一部を認識するだけである６Ｍｅｔ −ｔＲＮＡＡＳはＣＡＵアンチコドンに対する依存性が極めて高いようである（Ｇ、Ｇｈｏｓｈら（１９９０）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２９　：　２２２０−２２２５）　；他のｔＲＮＡに対するＡＳはアンチコドンの第二または第三ヌクレオチドを必要とする場合がある。

他のアミノ酸の場合、アンチコドンに依存してはいるが、ｔＲＮＡ構造のどこかに存在しているポジティブな認識部位、場合によってはネガティブは認識部位に対応するｔＲＮＡの特徴を識別できるようである。　Ｓｃｈｉｍｎ＋ｅｌおよびＨｏｕによる実験結果は、ｔＲＮＡ　というアミノ酸幹の０３−Ｃ７０塩基対はＡｌａ−ｔＲＮＡ　ＡＳに対する主要認識部位である。　Ｙ９Ｍ、Ｈｏｕら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３３　：　１４０−１４５゜今では、酵素によって７ミノアシル化され、無細胞翻訳システムにおいて用いることができる合成ｔＲＮＡを設計、生産することが潜在的には可能になっている。これらの合成ｔＲＮＡはりボゾーム機能、特にリボゾーム内部での発生期ペプチドの動きと、その積極的な確認にとって重要な価値を持つ可能性がある１発生期ペプチドがリボゾーム内で形成される時の正確な位置と確認の機序は現在までまだ解明されていない。

几班五ｌ稚したがって、本発明の目的のひとつは合成ｔＲＮＡの提供である。

本発明のもうひとつの目的は合成ｔＲＮＡをつくりだす方法の提供である。

本発明のさらに別の目的は、合成ｔＲＮＡを用いて、イン・ビトロで強化ポリペプチドを提供することである。

本発明によれば、ｔＲＮＡ　、　ｔＲＮＡ　、　ｔＲＮＡ、およびｔＲＮＡ、は図ＩＡ−Ｄに示されているＤＮＡ配列によってコード化される。

旦ｊ亘医飼岸ｊ」１丑新規性を有すると信じられるこの発明の特徴については添付する特許請求の範囲に明記されている６しかしながら、発明自体と、その目的および利点は、以下の説明と関連図面とを参照することによって理解することができるであろう。

図１はｐｃｙｓ、　ｐＳＥＲ，ｐＡＬＡおよびｐＦＭＥＴの配列を示している。

ｔＲＮＡ　（ＯＣＡ）およびｔＲＮＡ　（ＧＧＡ）の配列はＭ、　５ｐｒｉｎｚｌ　ら（１９８４）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１２　：　ｒ　１−ｒ１３１がらのものである。

制限部位および１７塩基Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの位置が示されている。それぞれの配列の上に示されている文字は置き換えられた野生型配列におけるヌクレオチドを示している。それぞれのｔＲＮＡで、＾ＡＡアンチコドンに下線が付しである。　ＩＡ：ｔＲＮＡ　（ＡＡＡ）遺伝子（ｐＣＹＳまたはＳＥＱ、　ＩＤ。

Ｎｏ、　１　）はアニールされ、Ｈｉｎ　ｄＩｎ／Ｂａｌ１旧−消化ｐＵｃ１８に結さくされた４つの合成オリゴマーから構成されたものである。

これら４つのオリゴマーはｐＣＹＳ配列の上および下の実線で示しである。　ｐＣＹＳの上の星印は塩基が挿入された箇所を示している。ｌ　Ｂ　：　ｔＲＮＡ　（ＡＡＡ）遺伝子（ｐＳＥＲまたはＳＥＱ、　ＩＤ、　Ｎｏ。

２）は２つの特殊なプライマーを用いたＰＣＨによって大腸菌ゲノムからのｔＲＮＡ　（ＧＧＡ）遺伝子をコピーすることによって構成された。これらのＰＳＥＲ配列の上と下の実線で示しである。

ｐＳＥＲで、ＴからＡへの置換はアミノアシル化を増大することで行われた。Ｉ　Ｃ：　ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）遺伝子（ｐＡＬＡまたはＳＥＱ。

ＩＤ、Ｎｏ、　３　）はＰＣＨによって大腸菌からのｔＲＮＡ　（ＧＧＣ）遺伝子をコピーすることによって構成された。ＩＤ　：　ｔＲＮＡ、（ＡＡＡ）遺伝子（ｐＦＭＥＴまたはＳＥＱ、　ＩＤ、　Ｎｏ、　４　）はＰＣＨによって大腸菌からのｔＲＮＡ、　（ＣＡＴ）をコピーすることによって構成された。

ＰＦＭＥＴ配列の上の星印は塩基が挿入された箇所を示す。

図２はポリ（Ｕ）方向への伸長中の発生期ペプチドの７ミノ末端におけるプローブからの蛍光異方性を示している。ポリペプチド合成はＣＰＭ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡ　（Ａ　）またはＣＰＭ−５ｅｒ−ｔＲＮＡ（Ｂ　）を用い、異方性を繰り返しモニターすることによって開始された。ＡとＢとで、ポリフェニルアラニン合成は三角形と点線（・・・・・・）で、ポリシスティン合成は白丸と破線＜−− −−−−＞で、そしてポリセリン合成は黒丸と実線（□）でそれぞれ示しである。異方性の測定は２０℃の温度下、３８５ｎｍの波長での蛍光励起と４７５Ωｍの波長での放射を６０分続けることによって行われる。

図３はｔＲＮＡ＠（ＡＡＡ）を用いての、ポリアラニンのポリ（Ｕ）指向合成を示している。ポリアラニンの合成を促進するために、ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）の０．３Ａ、、、　（オープン・シンボル）またはＯ，ｌＡ、、、　ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）　（クローズド・シンボル）を伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）　ｔＲＮＡとして最終体積０．１ｍｌで用いて、ＡｃＰｈｅ−ｔＲＮＡ　（０，５μＭ）をポリ（Ｕ）−プログラム化リボゾーム（０，５μＭ）に予め結合された。［” Ｃｌアラニンの組み込みは、図示されている時間だけ３７℃の温度下で培養した後、０．５ＭＮａＯＨですべてのアミノアシル化されたｔＲＮＡを脱アシル化し、その後、ポリアラニンを５ｍｌ水冷１０％トリクロロ酢酸に浸し、沈殿物の放射活性を測定することによって行われた。比較の目的で、４μＮエリスロマイシンの存在下でのポリアラニン合成の測定も行われた（−−−−−−）。

図４は遊離およびリボゾーム結合エロンゲータおよびイニシエータＣＰＭ−Ａｌａ−ｔ、ＲＮＡ”’　（ＡＡＡ）の放射スペクトルを示している。Ａ、測定は最終体積６００μｍで遊離ＬＲＮＡ　（−−−−）とりボゾーム結合（−−−−− −）　ｔＲＮＡに関して行われた。リボゾームを加えた後、反応混合物を３７℃ の温度下で１５分間培養した。

３８５ｎｍの励起波長を用いて、２０℃の温度下で、蛍光測定が行われた。＠定終了後、エリスロマイシンを最終濃度が４μ間となるように加え、各リボゾーム結合ｔＲＮＡのスペクトルに対するエリスロマイシン結合の影響を測定した（・・・・・・）。Ｂ。

別の実験で、リボゾーム結合後の各ｔＲＮＡの放射スペクトルが測定された。その後、スパルソマイシンが加えられた（最終濃度＝５μＭ）。放射スペクトルが測定された。その後、ビューロマイシンを加えて、０．０５ｍＭの濃度とした。

そして再度、放射スペクトルの測定が行われていた（−・・−・・）、ビューロマイシンの存在下で放射スペクトルを測定した後、ビューロマイシン反応性を示す異方性の低下が起きていないことを確認するために、各サンプルの蛍光異方性の測定が行われた。

ましい　の最終的なペプチド生成物がどのように組み込まれるかを判定する場合、リボゾームから伸長した時点での、発生期ペプチドの構造が重要な意味を持つらしい。天然のｍＲＮＡからつくりだされる一部の、おそらくはすべての発生期ペプチドが大型リボゾーム・サブユニット外面の、ペプチジルトランスフェラーゼ中心部に対して遠位点でそのリボゾームから出ていくという強力な証拠が報告されている。Ｃ，Ｂｅｒｎａｅｕら（１９８０）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９　：　３１１１−３１１５０発生期ペプチドの３０−４０のアミノ酸を含んでいる部分がリボゾームによるプロトコリシス（ｐｒｏｔｃｏｌｙｓｉｓ）から保護されている。Ｌ。

１、　Ｍａｋｉｎら（＋９６７）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、２６　：　３２９−３４６．これはペプチジルトランセフェラーゼ中心部および出口領域との間に広がるのに必要な長さを反映しているかもしれない。

天然の発生期ペプチドがペプチジルトランセフェラーゼ中心部を離れる時の構造はまだ知られていない、讐、Ｄ。

Ｐｉｃｋｉｎｇら（＋９９０）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２６６　：　１５３４−１５４２）は伸長しつつある発生期フェニルアラニンとりシンが、それぞれポリ（ｔＪ）およびポリ（Ａ）と組み合わされている時まったく違ったふるまいを示すことを証明した。こうした知見の原理を理解するために、ポリペプチドのポリ（Ｕ）指向合成を促進する合成ＬＲＮＡ種がつくられた。

−水ｌ」Σよ工」Ｌ直本願では以下の略語が用いられているがそれらの定義は以下の通りである。ＥＤＴＡ　：エチレンジアミン・テトラ酢酸・二ナトリウム塩、　ＨＥＰＥＳ　：　Ｎ−（２−ヒドロキシ）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、ＴＲｌ５ニドリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン；ポリ（Ｕ）：ポリウリジル酸；ポリ（Ａ）：ポリアデニル酸；　ＡｃＰｈｅ（ＲＮＡ、そのα−アミノ基にアシル化されたＰｈｅ−ＬＲＮＡ　；　ＣＰＭ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡ　：そのα−アミノ基でメルカプトアセチル化され、その後でＣＰＭと反応させられたＰｈｅ−ｔＲＮＡ　；　ＣＰＭ−５ｅｒ−ｔＲＮＡ　：そのα−アミノ基でメルカプトアセチル化され、その後ＣＰＭと反応させられた５ｅｒ−ｔＲＮＡ′（ＡＡＡ）　；ＣＰＭ：３−（４−マレイミドフェニル）−７−ジエチルアミド−４−メチルクマリン；　ｔＲＮＡゝ（ＡＡＡ）　：　ＡＡＡアンチコドンを含んでいる合成ｔＲＮＡ”　；　ｔＲＮＡ”（ＡＡＡ）　：　ＡＡＡアンチコドンを含んでいる合成ｔＲＮＡ　；　ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）　：　ＡＡＡアンチコドンを含んでいる合成エロンゲータｔＲＮＡ　；　ｔＲＮＡｌ　（ＡＡＡ）　：　ＡＡＡアンチコドンを含んだ合成イニシエータｔＲＮＡ　；　ＬＢ　：　Ｌｅｎｎｏｘ　ＬＢ培地；　Ｘ−ｇａｌ　：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、　ＰＣＲ：ポリメラーゼ鏡反応。

ブラズミドｐＵｃ１８がＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）から購入シた。オリゴテオキシリホヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋ｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）の３８１Ａシンセサイザーで合成し、同社のＯＰｃカラムでメーカー側の指示に基づいて精製した。　ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ片、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｉｎ、および制限エンドヌクレアーゼはＰｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｕｅｃ社（Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ）から購入した。

Ｂｓｔ　ＮｌおよびＢｓｔ　Ｂｌ制限エンドヌクレアーゼはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社（Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）から購入した。　ＰＣＲ試薬はＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ　（Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ）から購入した。二重鎖シーケンスはＵｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ１ｃａｌｓ社（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）からのシーケナーゼ■キットを用いて行った。［α−”＠Ｓ］ｄＡＴＰ、［”Ｓ］システィン、［”Ｃ］フェニルアラニン、および［１Ｃ］セリンはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社（Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）がらそれぞれ購入した。デオキシ−およびリボヌクレオチドおよびグアノシン・モノフォスターゼはＰｈａｒｎ＋ａｃｉａ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ。

ＮＪ）から入手した。　ＣＰＭはＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社（ＪｕｎｃｔｉｏｎＣｉｔｙ、　ＯＲ）から入手した。イーストｔＲＮＡ”はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社（ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｏ、）から入手した。精製大腸菌翻訳開始因子２　（ＩＦ−２）はＣ，Ｇｕａｌｅｒｚｉ博士（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−１ｎｓｔｉｔｕｔ。

ｆｕｒ　Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒｅ　ＧｅｎｅＬｉｋ、　Ｂｅｒｌｉｎ）がらの寄贈を受けた。

ＮｕＳｉｅｖｅ　ＧＴＧアガロースはＦＭＣ社（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）から入手した。スペクトラ−ゲルＡ　２０２はＦｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｒ＋ｔｉｆｉｃ社（Ｈｏｕｓｔｏｎ。

ＴＸ）から購入した。　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼはブラズミドｐＡＲ１２１９を持っている大腸菌ＢＬ２１から分離し、Ｐ、Ｄａｖａｎｌｏｏら（＋９８４）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　９４９　：　７１−７８の手順に従って精製した。大腸菌に１２、ストレインＡＩ９はベルリンのＫ。

Ｎ１ｅｒｈａｕＳおよびＨｏＧ、ＷｉＬＬｍａｎｎ　Ｂｅｒｌｉｎ両博士によって我々に提供されたものである。これらの生物の成長、保持およびリボゾーム・サブユニットの分離はＯｌＯｄｏｍら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９　：　５９４７−５９５４に述べられている。

匹路辺盗炭スティン−スルフヒドリル基を発蛍光団のマレイミドまたはアルキルハライド誘導体と反応させる場合の簡単さおよび選別性とから、システィンでアミノアシル化されるべき合成ｔＲＮＡを合成のために選んだ。これまでの研究で、Ｃｙｓ− ｔＲＮＡシンセターゼがｔＲＮＡアクセプター・ステムの３ニア０塩基対を識別し、そのアンチコドンの塩基組成を認識しないことが示されている。　Ｙ、　Ｍ、　Ｈｏｕら（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３　二１４０−１４５゜したがって、無細胞翻訳システムでポリ（Ｕ）を認識するＣｙｓ−ｔＲＮＡを形成することができる。

図ＩＡに示すように、Ｈｉｎ　ｄＩ１１部位、Ｔ７１’ｌＮＡポリメラーゼ・プロモーター、ミュータント大腸菌遺伝子、ＢｓｔＮＩ部位、およびＢａｎ　ＨＩ部位を含むｔＲＮＡＣｎ（ＡＡＡ）遺伝子（ｐＣＹＳまたはＳＥＱ。

ＩＤ、　Ｎｏ、　１　）の合成が行われた。できるだけ野生型ｔＲＮＡ　との類似性を維持するために、その塩基配列で３つの部位だけを変更した。先ず、アンチコドンをＡＣＡからＡＡＡに変えた０次に、形質変換スクリーニングと、その後の遺伝子操作ができるように、２つの内部制限部位がつくられた。Ｐｓｔ１部位は塩基Ａ２１およびＴ２４をそれぞれＣ２１と０２４にそれぞれ変更することによりＤステムにつくられた。そのステム内での塩基対合を保持するために、ＡＩＯをＧＩＯに変更した。５ｐｅＩ部位はＵ４２とＣ４３との間にＡを付加することにより、エキストラ・アーム（ｅｘｔｒａ　ａｒｍ）内にツ＜ッた。

別の反応で、５’−３’、　３’−５’Ｈｉｎ　ｄＩ［ｌ／ＰｓｔＩオリゴマー、および５’−３’と３’−５’Ｐｓｔ　Ｉ　／Ｂａａ　Ｈｌオリゴマーを６５ ℃まで加熱しその後２５℃までゆっくり冷却することによって、アニールした。

その結果できる二重鎖・オリゴマーを、それら３つの断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼと共に１６℃の温度下で一品夜培養することにより、阻ｎ　ｄｍ／Ｂａｎ　ＨＩ−消化ｐｔｌｃ　１Ｂに結さく、挿入した。大腸菌ＸＬＩＢは結さく混合体（ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｍ１ｘｔｕｒｅ）を使って形質変換し、アンビリシリンおよびＸ−ｇａｌを含んでいるＬＢ寒天平板上に塗布した。ミニリセイト（ｍｉｎｉｌｙｓａｔｅ）　・ブラズミドＤＮＡのＳｐｅ　Ｉ制限分析を用いて、完全なｔＲＮＡ　（ＡＡＡ）遺伝子の存在を確認するために、インサート（ｉｎｓｅｒｔ）を含んだブラズミドを有する形質変換因子のスクリーニングが行われた、その後でインサートの両方のストランドの配列決定を行った。

鄭且狂υ１広Ｃｙｓ−ｔＲＮＡシンセターゼの場合と同様、５ｅｔ−ｔＲＮＡシンセターゼはｔＲＮＡのアンチコドン以外の部分を認識する。　Ｊ、　Ｎ□ｒｍａｎｌｙおよびＪ、Ａｂｅｌｓｏｎ　（１９８９）　Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５８　：　１０２９−１０４９、したがって、ポリ（Ｕ）指向翻訳システムで遣うために合成Ｓｅｒ　ｔＲＮＡを合成することができる。完全はｔＲＮＡ”　（ＡＡＡ　）遺伝子配列ｐＳＥＲまたはＳＥＱ、　ＩＤ、　Ｎｏ、　２　）を化学的に合成するのではなく、２つのオリゴマー合成し、大腸菌グロモゾームから遺伝子をコピーするために用いた（図ＩＢ）。５′プライマーは５′端、５’−３ ’）ｔｉｎ　ｄＩ［Ｉ配列、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、およびＡＡＡアンチコドンを含んでいるｔＲＮＡの４３の塩基に４つのエキストラ・ヌクレオチドを含んでいた。３′プライマーは４つのエキストラ・ヌクレオチド、３′−５’ＢａｍＩ［ｌおよびＢｓｔ　Ｎｌ配列、そしてｔＲＮＡの１２の塩基を含んでいた。野生型ｔＲＮＡ　とは対照的に、ｔＲＮＡ　のＴループ内にＢｓｔ　Ｂｌ制限部位が発生するので、スクリーニング目的の新しい制限部位は不必要である。

各プライマー１００１００ｐ、大腸菌クロモシームＤＮＡ２０ｎｇ、そしてＴａｇ　ＩポリメラーゼＩＯ単位を含む反応系に鉱油を含ませ、９４℃で５分の１サイクル、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で３分を２９サイクル、そして９４℃で１分、５５℃で２分、および７２℃で１０分を１サイクル行った。サイクリング後、反応混合物をクロロフォルムで抽出して、生成物を、４０ｍＭ　トリス−アセテート（ｐＨ７，８）　、２ｍＭ　ＥＤＴＡを用いて４％ＮｕＳｉｅｖｅ　ＧＴＧアガロース上で電気泳動することにより、分離した。主な生成物は期待された１２４ｂｐ片であった。フェノール抽出によってアガロースを取り除いた後、１２４ｂｐ片の端部をＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ片を用いて平滑化させ、Ｂｉｎ　ｄＩ［ＩおよびＢｉｎ旧で消化した。そしてこの断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼを使って１６℃の温度下で一昼夜培養した後、Ｈｉｎ　ｄｍ／Ｂａ鳳旧消化ｐＵｃ１８にう、イゲートした。ミニリセイト（ｍｉｎｉｌｙｓａｔｅ）　・ブラズミドＤＮＡを用いてＢｓｔ　Ｂｌ制限分析を行うことによって、完全１ｔＲＮＡ　（ＡＡＡ）遺伝子の存在を確認するために、インサート（ｉｎｓｅｒｔ）を有するブラズミドを含んだ大腸菌ＸＬＩＢ形質変換因子のスフリーリングを行った。このインサートの両方のストランド共配列決定が行われた。

Ｂｓｔ　ＮｌでｐＣＹＳおよびｐＳＥＲを消化した結果、ｔＲＮＡの３′末端アデノシンと対して相補的な単一の５′オーバーハンギング（ｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ）　・チミジンを有する線形転写テンプレートがもたらされた。したがって、Ｂｓｔ　Ｎｌで消化したｐＣＹＳまたはｐＳＥＲのランオフ転写はそれぞれ、ｔＲＮＡの３　’　ＡＣＣＡＣＣ上プター・ステムで終端している７５または８８−ヌクレオチドＲＮＡをつくりだすことが予想される。最終濃度がＯ，ｌａｇ／ｍｌのＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＤＮＡテンプレートｌμｇあたり７−８μｇのｔＲＮＡがつくりだされた。ＭｉｌｌｉｇａｎおよびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ（（１９８９）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１８０　：　５ｌ−６２）は小型のＲＮＡを転写する場合短い不稔転写がっくりだされることが報告されているが、２０％変性ゲルで電気泳動を行った結果では、ゲルろ過クロマトグラフィー（データは示さず）後たったひとつの大型ＲＮＡ生成物が残っているのが示された。

ＡＬＡ゛よびＦＭＥＴの　Ｊ他の二つの新しいｔ、ＲＮＡがっくりだされた。これらのｔＲＮＡは酵素によりアラミンでアミノアシル化され、ポリ（Ｕ）テンプレートの識別ができるようにＡＡＡアンチコドンを有している。第一のｔＲＮＡ、　ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）は大腸菌伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）ｔＲＮＡ””と類似するように構成された。Ｍ、　５ｐｒｉｎｚｌ　ら（１９８５）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３　：　ｒ　１−　ｒ　１０４．　ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）遺伝子（ｐＡＬＡまたはＳＥＱ、　ＩＤ、　Ｎｏ、　３　）はＰＣＨにより大腸菌ゲノムがらのｔＲＮＡ　（ＧＧＣ）をコピーすることにより、構成された。アンチコドンはＧＧＣからＡＡＡに変えられた。ｐＳＥＲの平滑化、消化、ライゲート形質変換およびスクリーニングはｐＡＬＡの場合と同様に行われた。

第二のｔＲＮＡ、””（ＡＡＡ　）は開始因子ｔＲＮＡごと類似しており、それをコピーすることによりつくられた。Ｍ、５ｐｒｉｎｚｌ　ら（＋９８５）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄａ、Ｒｅｓ、１３　：　ｒ　１−　ｒ　１０４．イン・ビトロでの転写およびアミノアシル化を円滑に行わせるように、このｔＲＮＡの一次構造を修正したが、開始機能に必要と考えられる特徴は残された。それらの特徴とは、アクセプター・ステムの末端の非−ワトソンークリック塩基対（Ｂ、　Ｌ、　Ｓｅｏｎｇら（１９８７）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４　：　３３４−３３８　：　ＨｌＷａｋａｏら（１９８９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ａ、２６４　：　２０３６３−２０３７１）　、ジヒドロウリジン・ステムのピリミジン−１１−プリン−２４塩基対（Ｂ、　Ｌ。

Ｓｅｏｎｇら（１９８７）　）　、および３つの連続し九〇−Ｃ塩基対を形成しているアンチコドン内のひと続きのグアニンおよびシトシン（Ｂ、　Ｌ、　Ｓｅｏｎｇら（１９８７）　）　。

ｔＲＮＡ、（ＡＡＡ）遺伝子（ｐＦＭＥＴまたはＳＥＱ、　ＩＤ、Ｎｏ、　４　 ”）の作成において、野生型ｔＲＮＡ、”　（ＡＡＡ　）において以下の修正が行われた：Ａ′はＡＡＡアンチコドンを形成している遺伝子のアンチコドンの塩基ＣおよびＴと置換された。Ｇ′は塩基ｌＣおよび３Ｃと置換された。Ｔ′は塩基７０Ｇおよび７２Ａと置換された。そして、Ａは遺伝子の塩基１７Ｇと１７ａＴの間に挿入された。

その後、ｐＳＥＲの平滑化、消化、ライゲート形質変換およびスクリーニングと同じ手順でｐＦＭＥＴがつくられた。

ン・ビトロでの転写を行うために、Ｂｓｔ　Ｎ１（３）Ｕ／μｇを用いて６０℃の温度下で消化を行うことによって、ブラズミドＤＮＡがつくられた。

この混合物をフェノール抽出し、ＤＮＡをエタノール沈析した。この直線化ＤＮＡ　（４０μｇ）を、５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７，６）、１０ｍＭジチオストレイトール、５０ｍＭ　ＮａＣ１，４吐スペルミジン、２５ｎ＋Ｍ　ＭｇＣ１，、１，６ｍＭ　ＧＴＰ、４ｍＭ　ＧＰＭ、　ＡＴＰ、　ＣＴＰ、　ＵＴＰ１５０ＵＲＮａｓｉｎ、および０．Ｉｍｇ／ｍｌ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを含む２−ｍ１転写反応系に加えた。３７℃の温度下で培養した後、テンプレートＤＮＡをＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ　Ｉ　１００Ｕを用いて消化した。

］ＯｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐｈ７．６）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、および１５０ｎ＋Ｍ　ＮａＣ１を用いて均衡させたスペクトラ−ゲルＡ２０２を用いるゲルろ過によって、ｔＲＮＡ転写から、短い不稔転写、ｄＮＴＰ、およびｒＮＴＰを分離した。フェノール／クロロフォルム／イソアミル・アルコール（２５：２４：１）を一度、クロロフォルム／イソアミル・アルコール（２４：１）を一度、さらにエタノールでの沈析を二度行って、ｔＲＮＡフラクションの抽出を行った。

ｔＲＮＡの　々ノ　シル０−７０％硫酸アンモニウム沈析５１５０蛋白質内に存在する小麦生殖細胞を用いて、合成ＲＮＡのアミノアシル化が行われた。　Ｓ、Ｌａｘら（１９８６）　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１１８　：　１０９−１２８．標準的な混合物はｌ００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７，８）　、　１５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）、。

２＋ｍＭスペルミジン、５ｍＭジチオトレイトール、５＋ｎＭ　ＡＴＰ、　３０ μＭ対応放射性アミノ酸（１００Ｃｉ／ｍｏｌ）　、　０．８ｍｇ／ｍｌシンセターゼ・フラクションおよびｔＲＮＡ／ｍｌあたり、０．５−　Ｌ　Ａ、、、を含んでおり、２７℃の温度下で２０分間培養を行った。アミノアシル化の効率はｔ、ＲＮＡをトリクロロ酢酸に含浸させ、液体シンチレーションをカウントすることによって、ろ過された沈殿物内で放射活性を測定することによって測定された。

大腸菌野生型ＬＲＮＡ　の遺伝子からはｔＲＮＡｃ″（ＡＡＡ）がつくられたが、大腸菌５Ｉ５０フラクシヨンのシンセターゼでのアミノアシル化はできなかった。小麦胚遺伝子Ｓ　１５０の０−７０％硫酸アンモニウム・フラクションを含んでいるシンセターゼはｔＲＮＡ　（ＡＡＡ）を７ミノアシル化した。この酵素フラクションも効率的に合成ｔＲＮＡ　（ＡＡＡ）をアミノアシル化した。大腸菌５１５０フラクシヨンだけを含んだ翻訳反応に基づいて、ｔＲＮＡ”（ＡＡＡ）も大腸菌シンセターゼを用いてかなりアミノアシル化することができた（表１）。

イーストｔＲＮＡＰｌ’ｍはアミノアシルｔＲＮＡ−シンセターゼ源として大腸菌５１５０フラグジヨンを用いてアミノアシル化された。　Ｂ、　Ｈａｒｄｅｓｔｙら（１９７１）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　２０　：　３１６−３３０゜ｔＲＮＡ”（ＡＡＡ）　、ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）およびｔＲＮＡＩ（ＡＡＡ）は上に述べた小麦胚シンセターゼ・フラクションを用いてアミノアシル化された。翻訳を酵素作用で開始するために使用する目的で、Ｐｈｅ−ｔＲＮＡ、　５ｅｒ−ｔＲＮＡ、　Ａｌａ−ｔＲＮＡ、””（ＡＡＡ）およびｔＲＮＡ、”” （ＡＡＡ）をＲａｐｐｏｐｏｒｔおよびＬａｐｉｄｏｔ　（（＋９７４）Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、２９　：　６８５−６８８）の手順によってそのα−アミノ基上でアシル化した。

アミノアシル化の効率は合成ｔＲＮＡ種によって異なっていた。

イン・ビトロで転写されたｔＲＮＡ”　（ＡＡＡ）は２０％程度アミノアシル化されただけだったが、小麦胚シンセターゼを用いて５５％以上のｔＲＮＡ”’　（ＡＡＡ　）がアミノアシル化された（データは示さず）。残念なことに、Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ”　（ＡＡＡ　）は不安定で、アミノアシル化後の分離はできなかった。

Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ”　ＣＡＡ＾）の不安定性はその後の精製を不可能にしたが、今後の研究を行うために、そのアミノアシル化し反応を大腸菌翻訳反応と組み合わせることはできた。逆に、５ｅｔ−ｔＲＮＡ”’（ＡＡＡ）は精製およびクマリンでラベルするために繰り返し操作を行っても、非常に安定していた。

小麦胚シンセターゼまたはｔＲＮＡ枯渇大腸菌Ｓ−１５０フラグジヨンをアミノしＲＮＡシンセターゼ源として用いることによって、ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）のアミノアシル化により定常的に６０％程度（のｔＲＮＡ　ｐｍｏｌあたりのｐｍｏｌ　Ａｌａの組み込み）が達成された。どちらのシンセターゼ合成でも２０％程度のｔＲＮＡ、（ＡＡＡ）のアミノアシル化が達成された。どの場合においても、アラニン以外のアミノ酸でのｔＲＮＡのアミノアシル化は観察されなかった（データは示さず）。

五−上ポリフェニルアラニン、ポリシスチン、およびポリセリンのボＩＪ（ｔＪ）指向合成。すべての反応は６０ｐｍｏｌのＡｃＰｈｅ−ｔＲＮＡまたはＡｃ５ｅｒ” ｔＲＮＡ　（リボゾームと等しい濃度）を３７℃の温度下で５分間予め結合することにより、酵素作用にはよらないで開始された。すべてのサンプルは３７℃で３０分間培養され、それからＮａＯＨ内で０．１ＭとしてｔＲＮＡ−アミノ酸結合を加水分解するために室温で１５分間培養した。この反応混合物における蛋白質をトリクロロ酢酸で沈殿してろ過した。ろ過されたものを乾燥して、その放射活性を測定した。［”’Ｓ］システィン組み込みの測定を行う前に、サンプルを２８℃で１２０分間培養した。

以下余白ＡＣＰｈｅ−ｔＲＮＡで開始ボ１バＰｈｅ）　３７　１５４９　− １６１７　＋　−５ポリ（Ｃｙｓ）　３７　９９　− ポリ（Ｓｅｔ）　３７　４９９　− ４７　＋９１ＡｃＳｅｒ−ｔＲＮＡで開始ポリ（Ｐｈｅ）　３７　１８０１　− １７９７　＋　０ポリ（Ｃｙｓ）’　２８　１７６　− １１６　＋　３４ポリ（Ｓｅｒ）　３７　５９３　− ム　ｔＲＮＡを　いての　ン°ビ　ロ゛のｔＲＮＡ”　（ＡＡＡ）およびｔＲＮＡ＝　（ＡＡＡ　）に対する合成（Ｓｙｎｔｈｅｔ、ｉｃ）の活性を調べるために、それぞれを用いてポリ（Ｕ）依存ポリペプチド合成を行った。　Ｏ，Ｏｄｏｍら（１９８０）に述べられている方法で、ポリフェニルアラニンに対する［” Ｃ］フェニルアラニンのポリ（Ｕ）に依存する組み込みの測定を行った。

酵素作用に依存しないで翻訳を開始するために、ポリ（Ｕ）の存在下で、０．６　ｐ　Ｍ　ＡｃＰｈｅ−ｔＲＮＡまたはＡｃ５ｅｒ−ｔＲＮＡを０．６μＭの大腸菌リボゾームと、３７℃の温度下で、１０分間、予め結合した。Ｗ、Ｄ、Ｐｉｃｋｉｎｇら（＋９９０）　、　ｘリスロマイシンの感受性を調べるために、予備培養ステップを行う前に抗生物質を最終濃度が５μ阿となるように添加した。

ポリセリンへの［”Ｃ］セリンの組み込みは、１．１７Ａｓｓ＊／”合成ｔＲＮＡ”’　（ＡＡＡ）で大腸菌ＬＲＮＡ′を置換した他はポリフェニルアラニンの場合と同様に行った。伸長は大腸菌Ｓ　１５０フラクシヨンを最終体積が１００ μｌとなるように添加することによって開始された。

翻訳アッセイはポリシスティンのポリ（Ｕ）依存合成を円滑にできるように修正された。上に述べたように、ＡｃＰｈｅ−ｔＲＮＡまたはＡｃ５ｅｒ−ｔＲＮＡ　（６０ｐａ＋ｏｌ）が６０ｐｍｏｌのリボゾームと予め結合された０次に、ｔＲＮＡおよびアミノ酸を除いて、翻訳に必要なすべてのものを含めて、この混合物を１００μｌとした。

ポリシスティン合成を開始するために、それぞれ等しい念を加えて、上反応系の最終的な体積が２００μｌとなるようにして、上に述べたＣｙｓ−ｔＲＮＡ”　（ＡＡＡ）アミノアシル化反応系を翻訳混合物と結びつけた。次にこの反応系を３７℃で３０分間または、２８℃で１２０分間培養して、小麦胚システイニルーｔＲＮＡシンセターゼによる再アミノアシル化ができるようにした。各発生期ペプチドの構造とその環境を調べるために、ＣＰＭ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡおよびＣＰＭ−Ｓｅｒ−ｔＲＮＡの両方を予め結合させた。はとんどの発蛍光団が実際に結合されていることを確認するために、蛍光アミノアシル−ｔＲＮＡ類似物の濃度をリボゾーム濃度の１０％程度に減少した。天然および合成ｔＲＮＡに対して、２つの合成［”Ｃ］アラニル−ｔＲＮＡのそれぞれのアミノ酸基のＣＰＭラベリングも上に述べた方法で行われた。ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡは、基本的にはＣＰＭ−Ｓｅｒ−ｔＲＮＡ”　（ＡＡＡ）に関して述べたのと同じｃ、逆転相高性能液体クロマトグラフィーによって精製された。

合成Ｃｙｓ−および５ｅｒ−ｔＲＮＡ、および野生型ｔＲＮＡＦ′を用いてのイン・ビトロでの転写の結果を表１に示す、システィンの組込みは２８および３７ ℃の両方の温度で測定した。温度が低い場合、小麦胚酵素によるｔＲＮＡ”　（ＡＡＡ）の再アミノアシル化がより活発に行われた。すべての転写反応はボ１バＵ）の存在下でｌ：ｌのモル比でリボゾームと予め結合されたＡｃＰｈｅ−ｔＲＮＡまたはＡｃ５ＥＲ−ｔＲＮＡによって、酵素の作用には依存しないで開始された。発生期ポリペプチドを含む６つのタイプのりボゾームとの反応混合物がつくられ、そのうちの３つはアミノ端にＮ−ＡｃＰｈｅおよびＮ−Ａｃ５ｅｒを持っていた。各ポリペプチドの合成の５μＭエリスロマイシンによる抑制への感受性についてもテストした。それと平行して、ビ”　］　ＡｃＰｈｅ−ｔＲＮＡを用いて、各タイプの発生期ペプチドの合成において十分な活性を示す（データは示さず）リボゾームの数を調べるために、ラベルしていないアミノ酸の存在下で各ポリペプチドの翻訳を行った。

エリスロマイシンが存在している状態と、存在していない状態で、＋５００ｐｍｏ１以上のフェニルアラニンのポリフェニルアラニンへの組込みが行われていた（表１）０反応混合物内のりボゾームの３０％（ｌｏｐｍｏｌ）がポリフェニルアラニンの合成において活性を示すことが認められた。この値を用いて計算したところ、ポリフェニルアラニン・ペプチドは長さ方向で８０程度のアミノ酸で構成されているという結果が得られた。

合成ｔＲＮＡ　（ＡＡＡ）は大腸菌Ｓ　１５０フラクシヨンによってアミノアシル化できたので、ポリフェニルアラニン合成と同じ方法でポリセリン合成が行われた。しがしながら、この場合、５００ｐｍｏｌ程度のセリンがポリセリンに組み込まれただけであった。この合成はエリスロマイシンによって９０％程度抑制された。しかしながら、ポリセリン合成で活性を示したのは１０％程度だけで、この場合もペプチドの平均的な長さがアミノ酸の数にして８０程度という結果が得られた（データ示さず）。

３７℃の温度下で、３０分後に９９ｐｍｏｌのシスティンがポリシスティンに組み込まれたが、エリスロマイシンによって４１％抑制された（表１）。リボゾームの１５％（１０ｐｍｏｌ）がポリシスティン合成において活性を示すと判定されたが、この値はアミノ酸の１０個の平均ペプチド長に相当する。なお、この合成は結合小麦胚アミノアシル化二大腸菌転写システムによって行われた。３７℃ では、小麦胚シンセターゼによるｔＲＮＡの再アミノアシル化は非常に限定した範囲でしが行われない。これを調節するために、ポリシスティン合成も２８℃の温度で開始され、この温度で１２０分間行われた（表１）。この場合、２４７ｐｍｏｌのシスティンの組込みが行われた。、３７℃の場合と同様、１０ｐｍｏｌのりボゾームがポリシスティン合成において活性を示し、このことは平均ペプチド長がアミノ酸２５程度であることを示している。

ボ１バＵ）指向翻訳システムにおけるポリフェニルアラニン合成の量が多い（つまり、平均ペプチド長がより大きく、発生期ペプチドを含むリボゾームの割合がより高い）ことは、フェニルアラニン・ペプチドの非類型的な性質を反映しているのかもしれない、短いフェニルアラニン・ペプチドはセリンやシスティンの短いペプチドよりドルクロロ酢酸により簡単に沈殿するように見える。このことはフェニルアラニン組み込み総量が相対的により大きなことと関係している可能性があり、ポリセリンまたはポリシスティン合成において活性を示すと忠われるリボゾームの割合が相対的により低いことを関係があるかもしれない。フェニルアラニン組み込み総量の値が比較的大きいことに関係しているもうひとつの要因はポリフェニルアラニンが形成されている時のペプチド合成の路線形速度が維持される時間の長さである。ポリフェニルアラニン以外のほとんどのペプチドで観察されるペプチド合成の速度の低下は生成抑制を反映している。５ｐｉｒｉｎら（（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４２　：　１１６２−１１６４）は合成の路線形速度を長時間観察し、ペプチド生成物が形成されるときに、反応混合物から取り除かれるかどうかを調べた。発生期ポリフェニルアラニン・ペプチドは非常に非可溶性であるので、それらが反応において溶液から力、果的に除去され、継続フロー転写システムにおいてつくりだされるのと同じような状況がつくりだされる可能性がある。

表１に示されている結果も、合成ｔＲＮＡからのポリシスティンおよびポリセリンのポリ（Ｕ）指向合成がエリスロマイシンによる抑制に対して感受性があることを示している。対照的に、ポリフェニルアラニン合成は同じ条件下で抗生物質を使っても抑制されない。このことはこれまでの観察（（Ｇ。

Ｃｈｉｎａｌｉら（１９８８）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ、　Ａｃｔａ　９４９　：　７１−７８　；　Ｔ。

０ｔａｋａら（＋９７５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７２　：　２６４９−２６５２　；　Ｄ、Ｖａｓｑｕｅｚ　（＋９７９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、　ｖｏｌ、　３０．ｐ、３１２）と一致しており、エリスロマイシンに対する感受性の差は発生期ペプチド自体の性質によるものだという仮定を裏づりている。

Ａｌａ−ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）およびＡｌａ−ｔＲＮＡ４　（ＡＡＡ）を用いて、ポリ（Ｕ）に依存したポリペプチド合成を試みた０円】ｅ−ｔＲＮＡ、　Ａｌａ−ｔＲＮＡＩ（ＡＡＡ）およびＡｌａ−ｔＲＮＡＩ（ＡＡＡ）のＮ−アセチル誘導体を予め結合することによってポリペプチド合成をより円滑に行えるようにした。アミノアシル−ｔ、ＲＮＡのＮ−アセチル化はＲａｒ）ｐＯｐｏｒｔおよびＬａｐｉｄｏｔ　（１９７４）の方法に従って、酢酸のＮ−ヒドロキシサクシンイミド・エステルを使って行われた。

リボゾームへの酵素によらないｔＲＮＡの結合は５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７，５）　、］０００ｍＭＮＨ，ＣＩ、１５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）、、５ｍＭ２− メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍｌポリ（Ｕ）、０．５μＭリボゾームおよび０．５μＭアシル化ｔＲＮ＾で行われた。ポリアラニン合或は、ポリフェニルアラニンに関連して上に述べた方法（Ｗ、　Ｄ。

Ｐｉｃｋｉｎｇら（＋９９１）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６６　：　１５３４−１５４２）および、アミノ酸およびｔＲＮＡ源として［”Ｃ］アラニンおよびｔＲＮＡ、””（ＡＡＡ）かＬＲＮＡ、””　（ＡＡＡ　）のいずれがを用いた点を除けばポリセリンに関して上に述べたのと同じ方法で行った。すべてのポリアラニン・アッセイでのアミノアシル化ｔＲＮＡの量をほぼ等しくするために、ｔＲＮＡ、””　（ＡＡＡ　）は最終濃度Ｉ　Ａ、、、ユニット／ｍｌで用い、ｔＲＮＡ、””　（ＡＡＡ　）は濃度的３Ａ０．ユニット／ｍｌで用いた。［”Ｃ］アラニンのポリアラニンへの組み込みの判定はり、Ｄ、Ｐｉｃｋｉｎｇら（１９９１）が述べた方法で行った。

ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）だけがポリ（Ｕ）依存ポリアラニン合成を支持したく図２）。合成伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）　ｔＲＮＡ依存ポリアラニン合成は３７ ℃の温度下で６０分間以上線形をしめしく図２）、さらに２０℃では２時間より長い時間線形を示した（データは示さず）。逆に、ｔＲＮＡ、（ＡＡＡ）を用いた場合、ポリアラニン合成はバックグラウンド・レベルを多少上回った程度であった（図２）。ポリアラニン合成の興味深い特徴は、それがエリスロマイシンによる抑制に対して感受性を示すことである（図２）。これは、エリスロマイシンに対して抵抗性を示すポリフェニルアラニン合成の場合と対照的である（Ｗ、Ｄ。

Ｐｉｃｋｉｎｇら（＋９９１）　）。

この後、ＡｃＡｌａ−ｔＲＮＡ、””（ＡＡＡ）またはＡｃＡｌａ−ｔＲＮＡｌｌ””（ＡＡＡ）がポリアラニン合成をより円滑に行わせるために、酵素の作用に依存しないでリボゾームに予め結びつけることができるかどうかを調べるために、テストが行われた。アラニンのＡｌａ−ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）がらのポリアラニンへの組み込みは、ＡｃＡｌａ−ｔＲＮＡｌｌ（ＡＡＡ）　、　ＡｃＡｌａ−ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）　、またはＡｃＰｈｅ−ｔＲＮＡが予めポリ（Ｕ）でプログラム７０Ｓリボゾームに予め結びつけていられるかどうかには関係なく、はぼ同様であった（表２）１合成された発生期ポリアラニン鎖の数は、予め結びつけたＡｃ−［”Ｃ］アミノアシル−ｔＲＮＡからの放射能でラベルしたアミノ酸の組込みを測定し、その後、ラベルしていないアラニンの存在下でポリアラニン合成を行うことによって、判定した。並行的に放射活性を示すアラニンの組込みを調べ、合成された発生期銀の数をカウントすることで、発生期ポリアラニン鎖の長さを調べることも可能であった。つくりだされた発生期ペプチドの長さは、反応を開始するために用いるｔＲＮＡの種類には関係なく、はぼ同様であった（表２）、これらのデータの重要な特徴は、ｔ、ＲＮＡ、　（ＡＡＡ）がペプチドの伸長に何の役割も果さないのに対して、それがリボゾームＰサイトで結びついて、酵素によらないで始められるペプチド合成を開始できることである。なお、ポリアラニン合或は反応を開始するために使われるアシル−ｔＲＮＡの種類には関係なく（ＡｃＰｈｅ−ｔＲＮＡであっても：データは示さず）、エリスロマイシンによって抑制される。

以下余白表　２３つの異なったＮ−ブロックアミノアシル−ｔＲＮＡを予め結びつけた後でのポリアラニン合成反応開始発生期　組み込みＡｌａの　発生期銀の　鎖。長すｔＲＮＡ　ｐｍｏｌ　ｐｍｏｌＡｃＰｈｅ−ｔＲＮＡ　６７６　１８　３８ＡｃＡｌａ−ｔＲＮＡ　”’−６２６１３５２ＡｃＡ１ａ−ｔＲＮＡ　、”′ｍ６１４　１４　４４形成された発生期銀の数を調べるために、非発光性アラニンの存在下で、Ａｃ［”Ｃ］アミノアシル−ｔＲＮＡを用いた。

ポリアラニンに組み込まれたＡｌａのｐｍｏ　ｌを測定するために、［゛Ｃ］アラニンを用いた。発生期ポリアラニンの平均的な長さは「方法Ｊの箇所で述べた発生期銀ｐｍｏｌあたりのＡｌａ／ｐｍｏｌで示しである。

これら二種類のアミノアシル化アラニンｔＲＮＡのα−アミノ基上のＣＰＭ残滓の蛍光特性は、それらｔＲＮＡが溶液中で遊離しているか、あるいはりボゾームに結びついている時の、発蛍光団周辺の局所環境を反映している。ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、””（ＡＡＡ）は７０Ｓリボゾ一ムニ結合シ、ＣＰＭ−Ｐｈｅ− ｔＲＮＡおよび合成ＣＰＭ−３ｅｒ−ｔＲＮＡ　（ＡＡＡ）についてＷ、　Ｄ、Ｐｉｃｋｉｎｇら（１９９１）で報告されているのと同様の特性の多くを示す。

しかしながら、ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、（ＡＡＡ）の場合、蛍光異方性に関するデータは、二〇発蛍光団が、それぞれ溶液中で遊離している場合のその伸長対応部のそれよりしっかり保持されていることを示している、逆に、イニシエーターｔＲＮＡ類似体上の発蛍光団は、それが７ＯＳリボゾームと結びつくと、伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）　ｔＲＮＡ上の同じプローブより自由に動き回るようである。加えて、各蛍光性ｔＲＮ＾はりボゾーム”Ｐサイト”に結びつくが、それぞれのその後のエリスロマイシンとの結合に対しては異なった反応を示す。こうした結果をむすびつけて考えると、ＣＰＭプローブと、そして多分それが結びつくアラニンとは、その機能から判断して、それら２つのｔＲＮＡが°°Ｐサイドパにある場合に、同じ位置に存在しているのではないと考えられる。

エリスロマイシンの結合部位に対する結合におけるこうした差は、こうした合成がＮ−ブロック化伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）、Ａｌａ−ＬＲＮＡ、イニシエーターＡｌａ−ｔＲＮ＾またはＰｈｅ−ｔＲＮＡのいずれを予め結合して開始されたかどうかには関係なく、抗生物質がポリアラニン合成を抑止することを妨げない。

これらの機能上の差はイニシェークーおよび伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）ｔＲＮＡの構造における細胞を反映している。原核生物イニシエーターｔＲＮＡの間にかなり保持されている多くの領域があり、これらが伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）　ｔＲＮＡと際立って異なる点である。

Ｂ、　Ｌ、　Ｓｅｏｎｇら（１９８７）　；　ＩＬ　Ｗａｋａｏら（＋９８９）　；およびＣ１０、Ｇｕａｌｅｒｚｉ　ら（１９９０）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、２９　：　５８８１−５８８９゜これらの特徴には残滓と７２の間にワトソンークリック塩基対の不在、ジヒドロウリジン・ステム（Ｄ−ステム）内のプリン１１− ピリミジン２４塩基対の存在、およびアンチコドン・ステム内での３つの連続したＧ、Ｃ塩基対の存在などである。Ｂ、　Ｌ、　Ｓｅｏｎｇら（１９８７）　、後者の特徴はイニシエーターｔＲＮＡを伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）　ＬＲＮＡから区別する機序に関与している可能性があり、リボゾームに対するＰ−サイト固有結合が行われるための必要条件である。Ｂ、Ｌ、　Ｓｅｏｎｇら（＋９８７）　、アンチコドン・ステムのこの部分のサイト固有突然変異はｔＲＮＡ「　に対するイニシエーター機能の進行的ロスをもたらすことが示されている。これら３つのＧ、Ｃ塩基対の出現もイニシエータ−ｕＲＮＡのアンチコドンに特殊な構造的および電磁特性を与えることが示唆されている。Ｋ、Ａ、　５ｈａｒｐら（１９９０）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

２９　：　３４０−３４６゜！　ポリペブチぐの　２のパ− 先ず、ポリフェニルアラニン、ポリシスティン、およびポリセリンのポリ（Ｕ）依存合成を開始するために、ＣＰＭ−Ｐｈｅ−Ｌ　ＲＮ　ＡまたはＣＰＭ−５ｅｒ−ｔＲＮＡを用いた。イーストＰｈｅ−ｔＲＮＡのα基のＣＰＭラベリングについては、Ｏ，Ｏｄｏｍら（１９９０）に述べられている。５ｅｒ−ｔ［ＮＡ′ （ＡＡＡ）もセリル成分のα基も同様にラベルされた。蛍光ｔＲＮＡ類似物は、ＣＰＭ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡに関連して述べたのと同様の方法で、Ｃ１カラム上で逆相１（ＰＬＣによって精製した。

恒常蛍光測定は、Ｗ、Ｒｙｃｈｌｉｋら（（＋９８３）　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ２２　：　８５−９３）に述べられている方法にしたがって、ＳＬＭ− Ａｍｉｎｃ。

Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製のモデル８０００光子力ウンテイング分光蛍光計を使って行われた。波長増分に対して０．５秒の走査速度でｌ−ｎｍ間隔で測定を行って、スペクトル・データを蓄積した。

すべての測定は光電倍増管感受性の波長依存性に合わせて、自動的に調整された。蛍光測定は伸長を意図的に遅らせるために、０．５ｍｌの体積で、励起波長で０．１以下の吸収度、および２０℃の温度で行われた。恒常蛍光異方性測定はＯ，Ｏｄｏｍ（（＋９８４）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３　：　５０６９− ５０７６）に述べられている方法にしたがって行われた。

これらのアミノ酸上のＣＰＭプローブからの蛍光の異方性を発生期ペプチドの形成時に追跡調査した。ＣＰＭ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡをリボゾームのペプチジル・トランスフェラーゼ・センターに結合すると、蛍光異方性が０．１８から０．３６程度に増大した。蛍光異方性がこのように高いのは、ＣＰＭ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡのアミノ酸がそのペプチジル・トランスフェラーゼ・センターに保持されている強さを反映している。　Ｗ、　Ｄ、　Ｐｉｃｋｉｎｇら（１９９０）　、ポリフェニルアラニンの最初のいくつかのペプチド結合を合成を合成した結果、異方性が低下し、その後で、発生期ペプチドが拡張するにつれて異方性が増大した。対照的に、ポリ（Ｕ）に依存したポリリシン合成を行った結果では、ペプチジル・トランスフェラーゼ・センターからアミノ末端プローブが伸びていくと、異方性が急速に低下し、その後の異方性の増大は認められなかった。

ＣＰＭ−Ｐｈｅ−ＬＲＮＡを用いてのポリシスティンあるいはポリセリン合成を開始すると、異方性は、ポリリシンの場合で認められたのと同じような形態で急激に低下した（図３Ａ）。しかしながら、ボｌｊリシンの場合とは違って、これら発生期ペプチドの異方性は再び低下する前に、短い期間、かなり水平化したく図３Ａ）。両方の発生期ペプチドのアミノ末端がペプチジルｔＲＮＡセンターからいくつかのアミノ酸分の長さのりボゾームを励起しているのであれば、こうした結果は予想できたであろう。発生期セリン・ペプチドはシスティンのそれより長く（表１）、これは前者の最終異方性が低いことに対応しているのかもしれない。この結果およびこれまでの結果に基づいて、ポリシスティンおよびポリセリン発生期ポリペプチドが、ポリ（Ａ）指向発生期ポリリシンの場合とほとんど同様、取り巻いている溶液中に直接伸びていくものと考えることができる。

上に述べた結果が翻訳を開始する前に用いられたＣＰＭ−Ｐｈｏ−ｔＲＮＡの結果ではないという証拠を更に得るために、ポリフェニルアラニンを含めた各発生期ポリペプチド種をＣＰＭ−３ｅｒ−ｔＲＮＡを用いて形成した。ペプチドが伸長している時に起きる蛍光の変化を上に述べたのと同様の方法でモニターした。

上にも述べたように、ポリフェニルアラニンの最初のペプチド結合が形成された場合異方性が低下し、その後、ペプチドが伸長すると再び増大した（図３　Ｂ　；Ｗ、　Ｄ、Ｐｉｃｋｉｎｇら（１９９０）　）。ポリシスティンおよびポリセリンの最初のペプチド結合が形成された場合も、ＣＰＭ−５ｅｒプローブの異方性はかなり低下した。しかし、ポリフェニルアラニンの場合の結果とは対照的に、ポリペプチドの伸長が行われた時に、その異方性は低下しなかった。興味深いことに、異方性の低下はアミノ末端ＣＰＭ−５ｅｒに少数のアミノ酸（３あるいは４）が加わるとしばらくの開停止した（図３Ｂ）、この結果はＣＰＭ−Ｐｈｅでペプチドの形成を開始した場合に得られるものと類似している。こうした結果の背景に何があるかは今のところ不明である。それは、短い発生期ペプチド、またはペプチドが最初に伸長を始める時にプローブが遭遇するりボゾームの特殊な構造的特徴の確認を反映しているのかもしれない。

発生期ポリアラニン鎖の平均的な長さく表２に示す）を推定するためには、上に述べたポリ（Ｕ）依存ポリペプチド・アッセイにおける活性リボゾームの数を経験的に判定することが必要であった。これを行うために、蛋白合成のために必要な他の成分を追加する前に、３７℃の温度下で１５分間培養することによって、５５ｐｍｏ　ＬのへＣビ＠Ｃ］　Ｐｈｅ−ｔＲＮＡ　（１００Ｃｉ／ｍｏｌ）　、　Ａｃ　［”ＣコＡｌａ−ｔＲＮＡ、（ＡＡＡ）またはＡｃ　［”　Ｃ］　Ａｌａ−轟１ｍｔＲＮＡ４　（ＡＡＡ）　（５０Ｃｉ／ｍｏｌ）をボ１バＵ）プログラム化（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　）リボゾーム（５０ｐｍｏｌ　）に予め結合した。　Ａｃ　［”Ｃ］アミノアシル−ｔＲＮＡを予め結びつけた後、ポリペプチド合成を、トリクロロ酢酸沈析物に組み込まれる放射能が予め結合させたアミノ酸からのものだけとなるように、放射能でラベルしていないアラニンを用いた点を除いては、上と同じ方法で行った。

これにより、予め結合された［１Ｃ］ラベルＡｃ−ａａ−ｔＲＮＡが後で発生期ポリアラニンに組み込まれるリボゾームを測定することができる。（上に述べた）ポリアラニンに組み込まれたアラニンの総ｐｍｏｌの測定が行われれば、その値を（合成された発生期銀を測定することにより判定された）活性リボゾームの数で割って、発生期ポリアラニン鎖の平均的な長さをめることができる。

表　３ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、およびＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡｌ　の蛍光特性遊離　０，１８５　０．３９３　４７９結合（Ｐサイト）　０．３４６　０．５０３　４７３遊離　０．２０５　０．４４９　４７８結合（Ｐｆイト）　０，３１０　０．５１６　４７５結合（Ａサイト）’　０．２０８　０．４６６　４７８この場合も、上述のような恒常蛍光測定を行うために、ＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（Ｌｌｒｂａｎａ、　ＩＬ）からのモデル８０００光子カウンターを用いた。蛍光ｔＲＮＡを、これらｔＲＮＡの濃度を、ｔＲＮＡ結合が最大限に行われるようにリボゾーム濃度の１０％程度に減らしたことを除けば、上に述べたのと同じ方法で、リボゾームに結合させた。励起波長を３８５ｎｍとして、波長増分あたり０．５秒の走査速度でｌ−ｎｍ放射間隔でスペクトルを測定した。異方性および相対強度測定は４７５ｎｍの放射波長で行われた。ａ定は充電倍増管の感度に波長に対する依存性に合わせて自動的に修正された。蛍光測定は０．６ｍｌの体積で、２０℃の温度で行われた。すべての測定は励起波長での０．１以下の単一吸収（ｓｉｍｐｌｅ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）で行われ、蛍光異方性測定は上と同様、Ｗ、　Ｌ、　Ｐｉｃｋｉｎｇら（１９９１）が述べたのと同じ方法で行われた。ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、（ＡＡＡ）およびＣＰ　Ｍ　−Ａ　ｌ　ａ　−ｔ　ＲＮＡ　ｒ””（ＡＡＡ）の量子収量は２５℃で０．５０８の量子収量を有している０、０５Ｍ　Ｈ，ＳＯ１内での硫酸キニンとの比較で判定された（ＲｏＡ。

Ｖｅｌａｐｏｌｄら（＋９８０）　”Ａ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　５ｔａｎｄａｒｄ　ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭａｎｕａｌ　：　Ｑｕｉｎｅ　５ｕｌｆａＬｅ　Ｄｉｈｙｄｒａｔｅ”、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｏｆＳｔａｎｄａｒｄｓ　５ｐｅｃｉａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　２６０−６４．米国政府印刷局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，）　。

興味深いことに、蛍光異方性および量子収量はテストで用いられた条件下で、２つのｔＲＮＡによってそれぞれ異なっていた。遊離ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）　（０，１８５）の異方性は天然伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）　ｔＲＮＡ　ＣＰＭ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡ”　（０，１８１）および、合成伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）　ｔＲＮＡ　ＣＰＭ−Ｓｅｔ−ｔＲＮＡ　（ＡＡＡ）　（０，１７５）で認められたのと同様である。７０Ｓリボゾームに結合すると、ＣＰＭ −Ａｌａ−ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）の異方性および量子収量は、前に調べたｔＲＮＡ　（讐、　Ｄ、Ｐｉｃｋｉｎｇら（１９９１）　；表３）と同じように増大した。逆に、ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡｌ（ＡＡＡ）は、遊離（０，１８５）およびＰサイト結合（０，３４６）　ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）と比較して、溶液中で遊離している場合は異方性が高＜　（０，２０５）、また、リボゾームＰサイトに結合した場合は異方性が低かった（０．３１０）。各ｔＲＮＡのＰサイト結合が起きたことはビューロマイシンの添加で確認された。これにより、各ＣＰＭ−Ａｌａ−ビューロマイチン生成物が形成され、その後でリボゾームから解放されノテ、ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）　（０，１７５へ）およびＣＰＭ−Ａ　ｌ　ａ−ｔＲＮＡ　、”′″（ＡＡＡへ）の異方性の大幅な低下が起きた（データは示さず）。

ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、””（ＡＡＡ）のＡサイト結合を促進するために脱アシル化ｔＲＮＡ　を７ＯＳリボゾームに予め結合させると、量子収量、異方性、および放射スペクトルには変化が起きず、このことは結合が起きなかったことを示している（表３）。このことは、脱アシルｔＲＮＡ　を予め結合した後、反応成分をセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ−３００でゲルろ過で分離した場合に、ＣＰＭ−ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）がリボゾーム・フラクションと共に残らないことを実証した実験によって確認された。逆に異方性の増大（０，３１２）および量子収量（０，４７２）の増大から判断されるように、ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）はりボゾームＡサイトに結合するようである。標準的に、ビューロマイシンとの反応性を示したのは、このＡサイト結合ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、””（ＡＡＡ）の１０％以下であった（データは示さず）。

このデータは合成イニシェーターｔＲＮＡが天然性ｔＲＮＡ、”の結合特性を保持していることを示唆している。これらの特性は伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）　ｔＲＮＡのものによっては異なる蛍光特性と類似している。

また、ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、”’（ＡＡＡ）およびＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡｌ　（ＡＡＡ）（２５ｐｏｍｌ　）を用いて、３０Ｓおよび７ｏＳリボゾームへのｔＲＮＡの結合に対するＩＦ−２の影響を調べた。３０Ｓサブユニツト（１９５ｐｍｏｌ　）および５０Ｓサブユニツト（１９５ｐｍｏｌ）を連続的に加えた後、精製したＩＦ−２（１０５ｐｍｏｌ）が存在している場合と、存在していない場合の両方の条件で、蛍光異方性と量子収量を調べた。測定は５０吐トリス塩酸（ｐＨ７，５）　、６ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）、。

５０１ＮＨ，Ｃ１，１吐ＧＴＰ、　５吐ジチオエリスリトール、および０．２ｉｇ／＋１ポリ（Ｕ）を最終体積が６００μｌになるように調製して行った。これらの測定終了後、Ｍｇ’＋濃度を１５ｍＭに上げて、酵素作用によらないでｔＲＮＡ結合が円滑に進むようにし、その後、異方性と量子収量を再び測定した。その結果は、ＩＦ−２でのペプチド形成にはメチオニンもＡｔＪＧも不必要なようである。実際、ＵＬＩＣおよびＧＵＣコドンを認識するように編成され、それぞれフェニルアラニンとバリンとでアミノアシル化されたイニシエータ−ｔＲＮＡは、ｍＲＮＡがイニシエーターコドン位置に適切なコドンを有していれば、イン・ビトロで酵素的活性を有するβ−ガラクトシダーゼを形成することが示されている。　Ｒ，Ｃｈａｔｔａｐａｄｈｙａｙら（１９９０）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２９　：　４２６３−４２６８゜同様の研究で、開始アンバー・コドンを認識するように変性されたイニシエータ−ｔＲＮＡが存在していると、おそらくはグルタミンによって、アンバー（ｔＪＡＧ）コドンがら活性クロラフェニコル・アセチルトランスフェラーゼの形成が開始されることが示されている。　Ｕ、　Ｖａｒｓｈｎｅｙら（１９９０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８７　：　１５８６−１５９０゜表４ＩＦ−２はＣＰＭ−＾１ａ−ｔＲＮＡ、””″のりボゾームに対する結合を仲介する。

＋３０Ｓ　Ｏ，２０４０，４５０＋５Ｏ５０，２３８０，４５３＋９ｍＭ　Ｍｇ”　０．３０８　０．５０３＋ＩＦ−２＆３０Ｓ　Ｏ，２３２０，４４０＋５Ｏ５Ｏ，３０００，５１６＋９ｍＭ　Ｍｇ＋０．３０６　０．５１２五ｌａ／ＡＡｉＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、　なし　０，１８２　０．３９３＋３０５　０．１８７　０．３８９＋５０Ｓ　Ｏ，２０００，３９３＋〇馴Ｍｇ＋０．３４０　０．４８３＋ＩＦ−２＆３０Ｓ　０．１８８　０．３９３＋５Ｏ５Ｏ，１９７０，３９７＋９ｍＭ−＋　０．３４３　０．４８８蛍光を測定するために、１Ｆ−２および／または３０Ｓリボゾーム・サブユニットを、６ｍＭＭｇ”＋の存在下で、３７ ℃の温度下で蛍光ｔＲＮＡを用いて培養した。その後−回添加する度に、反応混合物を、蛍光測定に先立って、（蛍光測定に使われるキュベツトで）３７℃の温度下で１０分間、そして２０℃の温度下で１５分培養した。すべての反応は、ｒ方法」の箇所で述べたように、最終体積６００μｌで行われた。リボゾームの添加後、蛍光性ｔＲＮＡの酵素作用によらない結合を可能にするように、＋ｇＩ“ の濃度を（＠終濃度を１５畦とするように）９ｍＭに増大した。その後、比較の目的で、異方性および孟子収員の測定を再び行った。

ｔＲＮＡ、（ＡＡＡ）が酵素によるペプチド形成において一定の役割を果す能力をテストするために、精製大腸菌イニシエータ−２（ＩＦ−２）を用いて、ｔＲＮＡを３Ｏ３および７０Ｓリボゾームに（６ｎ＋ＭＭｇ”の下で）結合させた。

１Ｆ−２はＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡｌ””（ＡＡＡ）の３ＯＳサブユニツトへの結合を促進し、それは異方性および量子収量の増大で確認された（表４）。その後、５０Ｓを反応混合物に加えると、８０％以上のＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡｌ　（ＡＡＡ）が５ｍＭＭｇ’＋内で７０５リボゾームに結合し、これも蛍光異方性の増大で示された（表４）、上に述べたように、ｔＲＮＡの非酵素的結合を促進するために、反応混合物内でｌ’１ｇ”＋濃度を１５畦に増大させたところ、結合性のわずかな上昇が観察された（表４　）　、　６ｍＭ　Ｍｇ”十で、ポリ（Ｕ）を用いた場合、ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡｌ　（ＡＡＡ）はＩＦ−２が存在しないと３ＯＳリボゾーム・サブユニットには結合しなかったが、７０Ｓリボゾームに対してはわずかに結合したく表４）。Ｆｌ−２が不在の場合、Ｍｇ” ＋の濃度を１５畦に増大した後でだけ、イニシエーターｔＲＮＡがポリ（Ｕ）プログラム化リボゾームに結合した。これらのデータはＩＦ−２が６ｎ＋ＭＭｇ’ ！内でのＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡｌ　（ＡＡＡ）の３ＯＳリボゾーム・サブユニットまたは７０Ｓリボゾームへの結合を促進した。

対照的に、ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）は、ＩＦ−２が存在していても、存在していなくても、６ｍＭＭｇ”十内で３０Ｓまたは７０Ｓリボゾームには結合しなかった。しかし、それぞれの場合、Ｍｇ″＋の濃度を１５ｍＭに増大すると、急速に結合した。　Ｍｇ”十の濃度が高い場合、ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）の蛍光異方性および量子収量は、前にリボゾーム結合で認められた値まで増大した（表３参照）。

ＣＰＭのクマリン成分からの蛍光は、プローブが非常に近くに接近していると、疎水性、電荷およびその他のファクターに対して非常に敏感に反応した。上に述べたＣＰＭ−Ｓｅｒ−ｔＲＮＡの場合と同様、これら環境に対する感受性を利用して、２つのＣＰＭ−Ａ　ｌ　ａ−ｔＲＮＡを異なった条件で比較した。ＣＰＭ −Ａｌａ−ｔＲＮＡ、””（ＡＡＡ）およびＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡｌ　（ＡＡＡ）の蛍光放射スペクトルを、それらのｔＲＮＡが溶液中で遊離している場合、ポリ（Ｕ）プログラム化リボゾームと結合している場合、そしてリボゾームに結合している場合について、スパルソマイシンとビューロマイシンを同時に用いて測定した（図４ＡおよびＢ）。この実験室では、スパルソマイシンが７ＯＳリボゾームと結合して、ビューロマイシンの結合を妨げることなく、ビューロマイシンのＰサイト結合Ｎ−アクリル−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡとの反応性を抑制することが示されている（Ｏｄｏｉ＋および１（ａｒｄｅｓｔｙ、作成中の手積）。

リボゾームに結合すると、ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ　””（ＡＡＡ）の放射スペクトルの強度が増大し、同時にかなりの前方変位（６ｎｍ）が発生する（図４Ａ、破線対実践）。リボゾームへの結合で、ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡｌ　（ＡＡＡ）の蛍光強度も、上と同様の、ただし多少程度の弱い増大をしめしく図４Ｂ、破線）、また前方変位も多少起きる（３ｎｍ）。

すでにＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）を含んでいるリボゾームにエリスロマイシンが結合すると、相対蛍光強度の１５％程度の上昇が認められ、また最大放射において、さらに３ｎ＋ｉの前方変位が認められる（図４Ａ、点線）、興味深いことに、エリスロマイシンは結合ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ１　（ＡＡＡ）に対しては相対強度において３％程度の増大しか示さず、放射スペクトルの前方変位も２ｎｎ＋であった（図４Ｂ、点線）、これらの観察結果は、イニシエーターｔＲＮＡのＣＰＭ−Ａｌａ成分がリボゾーム上で、エリスロマイシン結合部位に対して異なった位置にあるのではないかということを示唆している。こうした可能性について調べるために、（ポリ（Ｕ）プログラム化リボゾームへの結合後）、スパルソマイシンとビューロマイシンを連続的に添加して、各ｔＲＮＡの蛍光について調べた。スパルソマイシンだけの場合は、いずれの蛍光性ｔＲＮＡの放射スペクトルに対してもほとんど影響を及ぼさなかった（データは示さず）、シかしながら、この抗生物質はビューロマイシンのりボゾームＰ部位に結合したアシル−ｔＲＮＡとの反応の抑制因子である。このことは各ｔＲＮＡの蛍光に対するビューロマイシン結合の影響を調べることを可能にしてくれた（図４Ａおよび図４Ｂ）、ビューロマイシン結合は結合ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ１　（ＡＡＡ）の蛍光強度の２６％の増大をもたらし、さらに、最大放射において、４ｎｍの前方変位が認められた（図４Ａ、破／点線）、異方性における強度は認められなかった。この結果は、スパルソマイシンが存在している場合のビューロマイシンの反応性の抑制を裏づけるものである。逆に、ビューロマイシン結合は、結合ＣＰＭ−Ａｌａ−ｔＲＮＡ１　（ＡＡＡ）の蛍光をの６％の上昇しかもたらさず、前方変位は４ｎｍであった（図４Ｂ、破／点線）。

エリスロマイシンおよびスパルソマイシン／ビューロマイシンを使った実験の結果は、イニシェーターＲＮＡのＣＰＭ−Ａｌａ部分が伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）　ｔＲＮＡの同じ部分にではなく、リボゾームの違った位置に保持されているのだという結論を裏づけでいる。これらの結果の興味深い点は、いずれがのＡｃＡｌａ−ｔＲＮＡで開始されるポリアラニン合成がエリスロマイシンで抑制され、そして各Ｎ−アシル−ｔＲＮＡがリボゾームＰ部位に結合している場合、（スパルソマイシンが存在していなければ）ビューロマイシンに対して反応を示す点である。このことは、イニシエータ−ｔＲＮＡのＣＰＭ−Ａｌａ部分が伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）　ＲＮＡの同じ場所にではなく、エリスロマイシンおよびビューロマイシンの結合部位との関連でそれぞれ異なって保持されており、いずれの抗生物資の作用にも明らかな影響を及ぼしていないことを示唆している。　ＣＰＭ−Ａｌａ位置のこの相違が何を意味するかは明らかではないが、最も可能性が高いのは、ペプチジル転移における機能ではなく、ｔＲＮＡ構造の相違を反映しているということである。

要約すると、合成ｔＲＮＡ　（ＡＡＡ）は、アミノアシル化の程度は低いが、ポリ（Ｕ）指向ポリ゛システィン合成には効率的に用いることができた６合成ＬＲＮＡ　（ＡＡＡ）はアミノアシル化のための基質としてはずっと優れており、ポリ（Ｕ）指向翻訳システムにおいて効果的に用いられた。ポリシスティンおよびポリセリンのポリ（Ｕ）指向合成の興味深い点は、それぞれが、Ａｃ５ｅｒ−ｔＲＮＡおよび＾ｃＰｈｅ−ｔＲＮＡのいずれを用いて非酵素的に開始されようが、予め結合されたエリスロマイシンによる抑制に対する感作性を示す点であった。これは、Ａｃ５ｅｒ−ｔＲＮＡおよびＡｃＰｈｅ−ｔＲＮＡのいずれを用いようと、エリスロマイシンの影響を受けないポリフェニルアラニン合成とは著しい対照をなしている。これらのデータはエリスロマイシン感受性が発生期ペプチドの機能であって、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡの機能ではないことを示唆している。

これらのデータをさらに裏づけるために、ポリフェニルアラニン、ポリシスティン、あるいはポリセリンが形成される場合の、アミノ末端フェニルアラニンあるいはセリンに取りつけたＣＰＭプローブの蛍光特性をモニターした。ＣＰＭ−ポリフェニルアラニン、ＣＰＭ−セリンのいずれで開始されようとも、ポリフェニルアラニンは一貫した挙動を示し、ペプチジル・トランスフェラーゼ中心部近くで不溶性の物質として形成されるように思われた。一方、システィンまたはセリンで伸長された発生期ペプチドは、Ａｃ５ｅｒ−ｔＲＮＡとＡｃＰｈｅ−ｔ、ＲＮＡのいずれで開始されようと、ペプチジル・トランスフェラーゼ中心部から周囲を取り巻く溶液中に直接量ていくように見えた。この結果はポリリシンで観察された結果と同様である。

これら２つの合成アラニンｔＲＮＡを比較すると、イン・ビトロ翻訳および蛍光法の両方で判断されるように、伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）　ｔＲＮＡ　（ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）　）とイニシエータ−ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ、（ＡＡＡ）　）は、リボゾーム上でのペプチド合成中に異なった挙動を示した。ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ）はポリアラニン・ペプチドのポリ（Ｕ）指向伸長には関与しないようであるが、対応するｔＲＮＡ、（ＡＡＡ）はこのプロセスに用いて有効であった。

逆に、両方のＡｃＡｌａ−ｔＲＮＡとも、＋５＋＋＋Ｍ　Ｍｇ”の存在する条件の下で、ポリ（Ｕ）プログラム化リボゾームのＰ部位への非酵素的結合を行うことができた。このように、それぞれ、ｔＲＮＡ、””ＣＡＡＡ）が存在している条件の下で、ポリアラニン合成を開始するために、伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）　ｔＲＮＡ源として用いることができた。しかしながら、イニシエーターｔＲＮＡ類似物だけが酵素作用により、６＋ｕＭＭｇ”の存在下で、ＩＦ−２と結合した。この結果は、ｔＲＮＡ、　（ＡＡＡ　）がイニシエーター機能を保持しているのに対して、ペプチド伸長機能に関してはｔＲＮＡ、（ＡＡＡ）だけが関与することを示唆している。

本発明は上に述べたような課題を解決し、その目的や利点、さらにはそれと本質的に付随する目的や利点を達成するためによく適合している。現時点において好ましい実施例を開示の目的で述べたが、合成や使用法の詳細において、本発明の範囲、および以下に添付する特許請求の範囲を逸脱せずに可能である。したがって、本発明は開示された具体的な形態に限定されるものではなく、本発明は本発明および以下に添付される特許請求の範囲に合致するすべての修正、代替構造、およびそれらと同等物を対象とするものである。

以下余白、配置区］− （１）　一般的情報（ｉ）　出願者：　Ｈａｒｄｅｓｔｙ、　ＢｏｙｄＰｉｃｋｉｎｇ、　Ｗｅｎｄｙ　Ｌ。

（ｉｉ）　発明の名称：合成ｔＲＮＡ（ｉｉｉ）　配列数＝４（ｉｖ）　連絡住所：（Ａ）　住所：　Ｊａｍｅｓ　Ｆ、　Ｗｅｉｌｅｒ、　Ａｔｔｏｒｎｅｙ−ａｔ −Ｌａｗ（Ｂ）　ストリート：　Ｏｎｅ　Ｒｉｖｅｒｗａｙ、　５ｕｉｔ、ｅ　１５６０（Ｃ）　市：　Ｈｏｕｓｔｏｎ（Ｄ）　州：　Ｔｅｘａｓ（Ｅ）　国：　ＵＳＡ（Ｆ）　ＺＩＰ　：　７７０５６（Ｖ）　コンピュータ読み取り形式：（Ａ）　媒体形式：フロッピー・ディスク（Ｂ）　コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣ互換機（Ｃ）　オペレーティング・システム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−［）ＯＳ（Ｄ）　ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　ｔｔ　１．０゜Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃　１．２５（ｖＬ）　本願データ：（Ａ）　出願番号：（Ｂ）　出願臼：（Ｃ）　分類：（■）　弁理士／事務所に関する情報；（Ａ）　氏名：　Ｗｅｉｌｅｒ、　Ｊａ＠ｅｓ　Ｆ。

（Ｂ）　登録番号：　１６，０４０（Ｃ）　参照／整理番号：　Ｄ−５３７５＜ｉｘ）　通信に関する情報；（Ａ）　ｉｉｉ話：　７１３−６２６−８６４６（Ｂ）　ファックス：　７１３ −９６３−５８５３（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　ｌ　：に関する情報（ｉ）　配列特性：（Ａ）　長さ：１０２塩基対（Ｂ）　タイプ：核酸（Ｃ）　ストランド性二二ｍ（Ｄ）トポロジー二不明（ｉｔ）　分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｉｉ）　不確定性：あり（ｘｉ）　配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ｌ　：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２　：に関する情報（ｉ）　配列特性：（Ａ）　長さ：１２４塩基対（Ｂ）　タイプ：核酸（Ｃ）　ストランド性二二重（Ｄ）トボロジー：不明（１ｉ）　分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｉｉ）　不確定性：あり（ｘｉ）　配列説明：ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　２　：ＧＡＧＡ　１２４（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　３に関する情報（ｉ）　配列特性：（Ａ）　長さ：１０４塩基対（Ｂ）　タイプ：核酸（Ｃ）　ストランド性：二重（Ｄ）トポロジー二不明（ｉｌ）　分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｉｉ）　不確定性：あり（Ｘｉ）　配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３　：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　４に関する情報（ｉ）　配列特性：（Ａ）　長さ：１０６塩基対（Ｂ）　タイプ：核酸（Ｃ）　ストランド性二二重（Ｄ）トボロジー：不明（ｉｊ）　分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｉｉ）　不確定性：あり（ｘｉ）　配列説明：ＳＥＱ　ｒｏ　Ｎｏ：　４　：以下余白時間ＦＩＧ、　２時間（分）波長ｎｍＦＩＧ、　４Ａ波長ｎｍ補正書の写しく翻訳文）提出ｌｉ（特許法第１８４条の８）平成６年２月２２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．合成ｔＲＮＡを含むＤＮＡ配列において、該ＤＮＡ配列がＡＡＡアンチコドンとＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターと対象となるアミノ酸の特定ｔＲＮＡシンセターゼ認識部位を含んでいるｔＲＮＡ遺伝子と、そして少なくとも、２つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいることを特徴とするＤＮＡ配列。
２．該ＤＮＡ配列がＨｉｎｄＩＩＩ部位、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、突然変異体大腸菌遺伝子、ＢｓｔＮＩ部位、およびＢａＨＩ部位と含んでいる、請求項のＤＮＡ配列。
３．さらに、塩基Ａ２１およびＴ２４をそれぞれＣ２１とＣ２４に変えることによってつくられるＰｓｔＩ部位と、該ＤＮＡ配列内のＴ４２とＣ４３との間にＡを加えることによってつくられるＳｐｅＩ部位とを含んでいる、請求項２のＤＮＡ配列。
４．以下の核酸配列を有する、ｔＲＮＡＣｙｍ（ＡＡＡ）遺伝子と呼ばれる、請求項３のＤＮＡ配列【配列があります】
５．５′−３′および３′−５′ＨｉｎｄＩＩ／ＰｓｔＩオリゴマー、および５ ′−３′および３′−５′ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩオリゴマーをつくるステップと、該５′−３′および３′−′５′ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩオリゴマー、および５′−３′および３′−５′ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩオリゴマーをアニールするステップと、該アニールされたオリゴマーとＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨ１消化ｐＵＣ１８プラズミドの結さく混合物をつくるステップと、該ライゲート混合物と培養するステップと、該培養されたライゲート混合物で大腸菌の形質変換を行うステップと、該形質変換された大腸菌をアンピチリンおよびＸ−ガルに露出させるステップと完全なｔＲＮＡＣｙｍ（ＡＡＡ）遺伝子の存在に関するインサートを含んでいるプラズミドにより、該形質変換された大腸菌をスクリーニングするステップと、そして該インサートの両方の配列決定を行うステップとで構成される、請求項４のｔＲＮＡＣｙｍ（ＡＡＡ）を調製する方法。
６．さらに、該核酸配列のＴループ内にＢｓｔＢＩ制限部位を含んでいる、請求項２のＤＮＡ配列。
７．以下の核酸配列を有する、ｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＡＡ）遺伝子と呼ばれる、請求項６のＤＮＡ配列。Ｇ【配列があります】
８．大腸菌ゲノムからのｔＲＮＡＳａｒ（ＧＣＡ）遺伝子をコピーするステップとＡＡＡアンチコドンを形成する該遺伝子内のＧＧをＡＡと置換するステップと該置換された遺伝子の末端の平消化するステップと、該平滑化された遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化するステップと、該消化された遺伝子をｐＵＣ１８プラズミド内にライゲートするステップと該ライゲートされたプラズミドで大腸菌を形質変換するステップと、完全なｔＲＮＡＳａｒ（ＡＡＡ）遺伝子の存在に関するインサートを有するプラズミドを含む該形質変換された大腸菌をスクリーニングするステップと、そして該インサートの両方のストランドの配列を行うステップとで構成される、請求項７のｔＲＮＡＳａｒ（ＡＡＡ）遺伝子を調製する方法。
９．以下の核酸配列を有する、ｔＲＮＡ■Ａｌａ（ＡＡＡ）と呼ばれる、請求項６のＤＮＡ配列。【配列があります】
１０．大腸菌ゲノムからのｔＲＮＡ■Ａｌａ（ＧＧＣ）遺伝子をコピーするステップとＡＡＡアンチコドンを形成する該遺伝子内のＧＧＣをＡＡＡと置換するステップと該置換された遺伝子の末端の端を平滑化するステップと、該平滑化された遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化するステップと、該消化された遺伝子をｐＵＣ１８プラズミド内にライゲートするステップと該ライゲートされたプラズミドで大腸菌を形質変換するステップと、完全なｔＲＮＡ■Ａｌａ（ＡＡＡ）遺伝子の存在に関するインサートを有するプラズミドを含む該形質変換された大腸菌をスクリーニングするステップと、そして該インサートの両方のストランドの配列を行うステップとで構成される、請求項９のｔＲＮＡ■Ａｌａ（ＡＡＡ）遺伝子を調製する方法。
１１．以下の核酸配列と有する、ｔＲＮＡｉＡｌａ（ＡＡＡ）と呼ばれる、請求項６のＤＮＡ配列。【配列があります】
１２．大腸菌ゲノムからのｔＲＮＡｆＭｅｌ（ＣＡＴ）遺伝子をコピーするステップとＡＡＡアンチコドンを形成する該遺伝子のアンチコドン内の塩基ＣおよびＴをＡと置換するステップと、塩基１Ｃおよび３ＣとＧと、そして該置換された遺伝子の塩基７０Ｇと７２ＡをＴと置換するステップと、該置換された遺伝子の塩基１７Ｃと１７ａＴとの間にＡを挿入するステップと、該置換された遺伝子の末端の端を平滑化するステップと、該平滑化された遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化するステップと、該消化された遺伝子をｐＵＣ１８プラズミド内にライゲートするステツプと該ライゲートされたプラズミドで大腸菌を形質変換するステップと、完全なｔＲＮＡｉＡｌａ（ＡＡＡ）遺伝子の存在に関するインサートを有するプラスミドを含む該形質変換された大腸菌をスクリーニングするステップと、そして該インサートの両方のストランドの配列決定を行うステップとを含む、請求項１１のｔＲＮＡｉＡｌａ（ＡＡＡ）を調製する方法。