NO309608B1 - DNA-sekvens som koder for syntetiske tRNA samt fremgangsmåte for fremstilling av tRNA - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt in vitro syntese av peptider og spesifikt syntese av voksende peptider på Escherichia coli ribosomer ved anvendelse av syntetiske tRNA arter.

Forskere har i lang tid forsøkt å utvikle en metodologi som vil gjøre det mulig og effektivt modifisere og produsere proteiner utenfor levende celler. En teknisk komponent ved dette er modifikasjon av tRNA med endrede antikodon eller gjenkjenningsseter for enzyamtisk aminoacylering. Modifiserte tRNA gjør det relativt enkelt å substiuere forskjellige aminosyrer med et målsete til et protein ved å danne et enkelt nytt kodon som kan bli avlest av forskjellige serier modifiserte tRNA.

Ved anvendelse av en serie modifiserte tRNA, et hver for en forskjellig aminosyre, kan den spesifikke aminosyren bli inkorporert i. proteinet ved setet (ene)ft<y>interesse.. På grunn av at det under de fleste tilfellene bar kan sysnteti-seres et protein i et hvilket som helst system, kan virkningen av aminosyresubstitusj onene på aktiviteten til polypeptidet bli målt direkte uten å produsere en klon for hver aminosyresubstitusjon og uten problemer som ofte er tilknyttet med ekspressjon og påfølgende testing av et protein produsert i inntakte celler.

På grunn av at evnen til å bestemme den tertiære strukturen til et protein fra dets aminosyresekvens er raffinert er det mulig å produsere konstruerte proteiner ved anvendelse av mRNA som bare inneholder 20 kodoner, et for hver av de 20 naturlig forekommende aminosyrene som det er et kodon for i den universelle genetiske koden. Aminosyrer kan også bli innkorporert inn i et eller flere spesifikke seter i proteinet ved anvendelse av modifiserte tRNA inneholdende antikodoner for noen av de ubrukte 41 kodonene. Ved anvendelse av kjemisk, i stedenfor enzymatisk aminoacylering av modifiserte tRNA, vil det være mulig å innkorporere amino syrer som ikke har noen naturlig forekommende motstykker inn i disse "kunstige proteinene". Dette vil gjøre det mulig å konstruere, teste og produsere kunstige enzymer som anvender katalytiske mekanismer og substrater som ikke oppstår i levende organismer.

Acylering av tRNA med en spesifikk aminosyre kan bli utført ved enten kjemiske eller enzymatiske reaksjoner og sistnevnte ved anvendelse av aminoacyl-tRNA syntetaser (AS). Prosedyrer for kjemisk aminoacylering av tRNA er kjent. S.A. Robertson et al. (1989) Nucl. Acid Res. 17:9649-9660; M. Hagen et al.

(1988) J. Org. Chem. 53:5040-5045.

I levende systemer må en AS gjenkjenne med høy spesifisitet både aminosyren og tRNA som skal bli aminoacylert. Gjenkjenning av en tRNA art ved AS avhenger av spesifikke strukturelle trekk i tRNA. Det er ikke et enkelt sett av strukturelle trekk i forskjellige tRNA som spesifiserer gjenkjenningen derav av deres beslektede AS. S. de Duve

(1988) Nature 333:117-118. Mange av de strukturelle trekkene for tRNA identitet ser ikke ut til å være kun konservert for en spesifikk tRNA art i forskjellige organismer. Stor variasjon i spesifisiteten for aminoacylering av syntetiske tRNA er blitt oppdaget med AS fra E. coli, gjær og kanin reticulocyter og for tilstander (salt og spermin eller spermidinkonsentrasjon, temperatur) hvor aminoacylering utføres. Noen prinsipper for tRNA gjenkjenning ved beslektet AS er fremkommet. Noen AS ser ut til å ha bestemte krav for alle antikodoner, mens andre gjenkjenner bare en del av antikodonet. Met-tRNA AS ser ut til å være meget avgengig av CAU antikodonet (G. Ghosh et al. (1990) Biochem. 29:2220-2225), AS for andre tRNA kan trenge andre eller tredje nukleotidet til antikodonet.

Når det gjelder andre aminosyrer ser de ut til å gjenkjenne trekk ved tRNA som er uavhengige av antikodonet, men reagerer overfor positive, og i noen tilfeller negative, gjen kjenningsseter andre steder i tRNA strukturen. Resultatet til Schimmel og Hou demonstrerer at G3-C70 base paret i amino-syrestammen til tRNA<A>^<a>er det primære gjenkjenningssetet for Ala-tRNA AS. Y.M. Hou et al. (1988) Nature 333:140-145.

Det er nå potensielt mulig å konstruere og produsere syntetiske tRNA in vitro som blir enzymatisk aminoacylert og kan bli anvendt i celle-frie translasjonssystemer. Disse syntetiske tRNA kan være av stor verdi for å bestemme ribosomfunksjonen spesielt med hensyn på bevegelsen av voksende peptid innenfor ribosomet og foldingen derav til en aktiv konfirmasjon. Den nøyaktige posisjonen og bekreftelse på voksende peptid når de blir dannet i ribosomer er fortsatt ukjent.

Foreliggende oppfinnelse vedrører DNA som koder for et syntetisk tRNA, kjennetegnet ved at det omfatter en RNA polymerase promoter, et mutant E. coli tRNA-gen, som inkluderer et AAA antikodon og spesifikke tRNA syntetasegjen-kj enningsseter for en aminosyre som er en annen enn Phe; og minst to restriksjonseter.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling avtRNA<Cvs>(AAA) genet som tidligere beskrevet, kjennetegnet ved å danne 5'-3' og 3'-5' Hindll/Pstl oligomerene og 5'-3' og 3'-5' Pstl/BamHI oligomerene, sammensmeltning av nevnte 5'-3' og 3'-5' Eindlll/Pstl oligomerene og 5'-3' og 3'-5' Pstl/BamHI oligomerne, danne en ligeringsblanding av nevnte sammensmeltede oligomerer og et Hindlll/BamHI-spal rt pUC18 plasmid, inkubering av nevnte ligeringsblanding, transformering av E. coli med nevnte inkuberte ligeringsblanding, eksponerer nevnte transformerte E. coli for ampicillin og X-gal, screening av nevnte transformerte E. coli med plasmider inneholdende et innskudd for tilstedeværelse av hele tRNA<C>v<s>(AAA) gener og sekvensering av begge trådene til nevnte innskudd.

Ifølge foreliggende oppfinnelse blir tRNA^<ys>, tRNA^<er>, tRNA<Ala>og tRNA<Ala>kodet av DNA sekvensene vist i fig. 1A-D.

Trekkene ifølge oppfinnelsen som antas å være nye er angitt spesielt i kravene. Selve oppfinnelsen og fordeler derav fremkommer i de vedlagte tegningene hvor: fig. 1 viser sekvensene for pCYS, pSER, pALA og pFMET. Sekvensene for tRNA<cys>(GCA) og tRNASer(GGA) er fra M. Sprinzl et al. (1984) Nucl. Acid. Res. 12:rl-rl31. Posisjonene til restriksjonssetene og 17 base T7 RNA polymerasepromoteren er vist. Bokstavene vist over hver sekvens representerer nukleotider i vill-type sekvensen som er blitt erstattet. For hvert tRNA er AAA antikodonet understreket. IA: tRNA^ys(AAA) genet (pCYS eller SEQ ID. NO. 1) ble konstruert fra 4 syntetiske oligomerer som ble sammensmeltet og ligert inn i Hindlll/BamHI-spaltet pUC18. De fire oligomerene er vist med stiplede linjer over og under t>CYS sekv©ns©n.Stjernen ov& t pCYS sekvensen indikerer hvor en base er blitt skutt inn. IM: tRNA<Ser>(AAA) genet (pSER eller SEQ. ID: NO. 2) ble konstruert ved kopiering av tRNA^<er>/GGA) genet fra E. coli genomet ved pSER ved anvendelse av to spesifikke primere. Disse primerene er vist ved stiplede linjer over og under pSER sekvensen. I pSER ble T til A substitusjonen utført for å øke aminoacyleringen. 1C. tRNAe<A1>(AAA) genet (pALA eller SEQ ID. NO. 3) ble konstruert ved kopiering av tRNA<Ala>(GGC) genet fra E. coli genomet ved PCR. ID: tRNA1Ala(AAA) genet (pFMET eller SEQ. ID. NO. 4) ble konstruert ved å kopiere tRNAf<Met>(CAT) genet fra E. coli genomet ved PCR. Stjernen over pFMET sekvensen indikerer hvor en base er blitt skutt inn.

Fig. 2 er anisotrofi av fluorescensen fra prober ved den aminoterminale enden til voksende peptider i løpet av poly(TJ )-rettet enongering. Polypeptidsyntesen ble initiert med enten CPM-Phe-tRNA (A) eller CPM-Ser-tRNA (B) og anisotrofien ble registrert over tid. I A og B er polyfenylalanin syntesen vist med åpne trekanter og stiplede linjer

( ), polycystein syntesen er vist med åpne sirkler og faste linjer ( ). Anisotrofi blir målt over en 60 min. periode ved 20°C med fluorescens eksitasjon ved en bølge-lengde på 385 nm og emissjon ved en bølgelengde på 475 nm.

Fig. 3 er poly(U)-rettet syntese av polyalanin med tRNAe<Ala->

(AAA). AcPhe-tRNA (0,5 pm) ble på forhånd bundet til poly(U)-programmerte ribosomer (0,5 pm) for å lette syntesen av polyalanin med enten 0,3 Ag^otRNA^Ala(AAA) (åpne symboler) eller 0,1 A26otRNAeAla(AAA) (lukkede symboler) som elong-erende tRNA kilde i et sluttvolum på 0,1 ml. [<14>C] alanin inkorporeringen ble målt etter inkubasjon ved 37°C i tidspunktene indikert ved deacylering av alle aminacylerte tRNA med 0,5 TM NaOH og deretter presipitering av polyalanin med 5 ml iskald 10$ trikloreddiksyre og å bestemme radioaktiviteten til presipitåtet. Polyalaninsyntesen i nærvær av 4 pm erythromycin ble også målt for sammenligning ( ).

Fig. 4 viser emulsjonsspektrene til fri og ribosom-bundet elongator og initiator CPM-Ala-tRNA<Ala>(AAA). A. Målingene var i et sluttvolum på 600 pl for frie ( ) og ribosom-bundede ( ) tRNA. Ribosomene var til stede ved 0,5 pm. Etter at ribosomene var tilsatt ble reaksjonsblandingene inkubert i 15 min. ved 37°C. Fluorescensmålingene ble utført ved 20° C med en eksitasjons bølgelengde på 385 nm. Etter at målingene var fullført ble erythromycin tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 4 pm og virkningene av erythromycin bindingen på spekteret til hver ribosom-bundet tRNA ble registrert (...). B. I et annet eksperiment ble emissjonsspekteret til hver tRNA målt etter ribosom-bindingen. Sparsomycin ble deretter tilsatt (sluttkonsentrasjon = 5 pm). Emissjonsspekteret ble tatt. Deretter ble puromycin tilsatt for å tilveiebringe en konsentrasjon på 0,5 mM. Emissjonsspekteret ble på ny målt (-..-..). Etter måling av emissjonsspekteret i nærvær av puromycin ble fluorescens anisotrofien til hver prøve målt for å forsikre at det ikke var oppstått noe fall i anisotrofien som kunne indikere puromycin reaktiviteten.

Formen til det voksende peptidet når det rager ut av ribosomet synes å være kritisk for og bestemme hvordan det endelige peptidproduktet blir foldet. Overbevisende tegn er blitt rapportert om at noen, kanskje alle voksende peptider produsert fra naturlige mRNA går ut av ribosomet på den ytre overflaten av den store ribosomale subenheten ved et punkt som er distalt for peptidyl transferanse senteret. C. Bernaeu et al. (1980) Proe. nati. Acad. Sei. USA 79:3111-3115. En del av de voksende peptidene inneholdende 30 til 40 aminosyrer blir beskyttet fra proteolyse av ribosomet. L.I. Makin et al.

(1967) J. Mol. Biol. 26:329-346. Dette kan reflektere lengden på peptidet som er nødvendog for å dekke avstanden mellom peptidyltransferasesenteret og utgangsdomenen.

T<opf ormas j o^en til. de naturlige voksende peptidene når de forlater peptidyltransferase senteret er ukjent. W.D. Picking et al. ((1990) J. Biol. Chem. 266:1534-1542) har demonstrert at elongering av voksende fenylalanin og lysin oppfører seg forskjellig når de blir dannet med henholdsvis poly(U) og poly(A). Et forsøk på å forstå disse funnene ble syntetiske tRNA arter som fremmer poly(U)-rettet syntese av polypeptider dannet.

Følgende forkortelser blir anvendt heri og er som definert: EDTA, etylendiamintetraeddiksyre, dinatriumsalt; HEPES, N-(2-hydroksyl)piperazin-N'-2-etansulfonsyre, TRIS, tris-(hy-droksymethl)aminometan, poly(U), polyuridylsyre, poly(A), polyadenylsyre, AcPhe-tRNA, Phe-tRNA som ble acylert på cx-aminogruppen, CPM-Phe-tRNA,Phe-tRNA som ble merkaptoacetylert ved dets a-aminogruppe og deretter omsatt med CPM, CPM-Ser-tRNA, Ser-tRNASer(AAA) , som ble merkaptoacetylert ved dets ot-aminogruppe og deretter omsatt med CPM, CPM, 3-(4-maleimido-fenyl)-7-dietylamino-4-metylcoumarin, tRNA<cys>(AAA), syntetisk tRNAc<ys>som inneholder et AAA antikodon, tRNASer(AAA), syntetisk tRNA<Ser>som inneholder et AAA antikodon, tRNAe<Ala->

(AAA), syntetisk elongator tRNA som inneholder et AAA antikodon, tRNA^<Ala>(AAA), syntetisk initiator tRNA som inneholder et AAA antikodon, LB, Lennox LB medium, X-gal, 5-brom-4-klor-3-indolyl-p-D-galaktopyranosid, PCR, polymerase-kjede reaksjon.

Plasmid pUC18 ble oppnådd fra Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD). Oligodeoksyribonukleotidene ble syntetisert på Applied Biosystems (Foster City, CA) 318A Synthesizer og renset på Applied Biosystems OPC kolonner ifølge instruk-sjonene. Klenow fragmentet til DNA polymerase, T4 DNA ligase, RNasin og restriksjonsendonukleasene ble oppnådd fra Promega Biotec (Madison, WI), BstNI og BstBI restriksjonsendonukleasene ble oppnådd fra New England BioLabs (Beverly, MA). PCR reagensene var fra Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT). Dobbelt-trådet sekvensering ble utført med sekvenase II kittet fra United States Biocheisicals (Cleveland, OH) . —<35>D]dATP, [<35>S]cystein,[14C]fenylalanin og [<1>4C]serin ble oppnådd fra New England Nuclear (Boston, MA). Deoksy- og ribonukleot idene og guanosinmonof osf at ble oppnådd fra Pharmacia (Piscataway, NJ). CPM var fra Molecular Probes (Junction City, OR). Gjær tRNA<Pne>var fra Sigma Chemical Co.

(St. Louis, Mo.)#Renset E. coli initieringsfaktor 2 (IF-2) var en gave fra Dr. C. Gualerzi (Max-Planck-Insti tut for Moekulare Genetik, berlin). NuSieve GTG agarose var fra FMC (Rockland, ME). Spectra-Gel A202 var oppnådd fra Fisher Scientific (Houston, TX). T7 RNA polymerase ble isolert fra E. coli BL21 inneholdende plasmid pAR1219 og renset ifølge fremgangsmåten til P. Savanloo et al. (1984) Proe. nati. Acad. Sei. USA, 949:71-78. E. coli K12, stamme A19, ble opprinnelig gitt av Drs. K. Nierhaus og H.G. Wittmann, Berlin. Veksten og opprettholdelsen av disse organismene og isolering av ribosomale subenheter er blitt beskrevet av 0. Odom et al. (1980) Biochemistry 19:5947-5954.

Konstruksjon av pCYS

Et syntetisk tRNA som skal bli aminoacylert med cystein ble valgt for syntesen på grunn av hvor lett og spesifikt cystein-sulfhydryl gruppene kan bli omsatt med maleimid eller alkylhalidderivatene til fluoroforer. Tidligere studier har vist at Cys-tRNA syntetase gjenkjenner 3:70 basepar av tRNA akseptorstammen og ikke basesammensetningen til antikodonet. Y.M. Hou et al. (1988) Nature 33:140-145. Man kan dermed danne et Cys-tRNA som kan gjenkjenne poly(U) i det celle-frie translasjonssystemet.

tRNA°<ys>(AAA) genet (pCYS eller SEQ ID. NO: 1) inneholdende et Hindi11 sete, T7 RNA polymerasepromoter, mutant E. coli gen, BstNI sete og BamHI sete ble syntetisert som vist i fig. IA. For å opprettholde så mye likhet med vill-type tRNA<cys>som mulig ble bare 3 seter endret i basesekvensen. Først ble antikodonet endret fra ACA til AAA. Deretter for å muliggjøre t r sn s f ornif.i! t s c reen ing og y+toni i'gof>fi genetisk mani pul. as jon ble to indre restriksjonsseter dannet. Pstl setet ble dannet i D stammen ved å forandre basene A21 og T24 til C21 og C24. For å opprettholde baseparingen i stammen ble A10 forandret til G10. Et Spel sete ble dannet i den ekstra armen ved tilsetning av en A mellom U42 og C43.

I separate reaksjoner ble 5'-3', og 3'-5' Hindlll/Pstl oligomerer og 5'-3' og 3'-5' Pstl/BamHI oligomerene sammensmeltet ved oppvarming til 65°C og sakte avkjøling til 25°C. De to resulterende dobbelt-trådede oligomerene ble ligert og skutt inn i Hindlll/BamHI-splatet pUC18 ved inkubering av de tre fragmentene over natt ved 16°C med T4 DNA ligase. E. coli XL1B ble transformert med 1igeringsblandingen og spredd på LB agarskåler inneholdende ampicillin og X-gal. Transformanter med plasmider inneholdende et innskudd ble screenet for tilstedeværelse av fullstendig tRNA<cy>s(AAA) gen ved anvendelse av Spel restriksjonsanalyse av minilysat plasmid DNA. Begge trådene av innskuddet ble deretter sekvensert.

Kons truks. i on av pSER

Som tilfellet med Cys-tRNA syntetase gjenkjenner Ser-tRNA syntetase deler av tRNA som er forskjellige fra antikodonet. J. Normanly og J. Abelson (1989) Am. Rev. Biochem. 58;1029-1049. Et syntetisk Ser-tRNA kan dermed bli produsert for anvendelse i poly(U)-rettet translasjonssystem. I stedenfor kjemisk syntetisering av den fullstendige tRNA<Ser>(AAA) gensekvensen pSER eller SEQ ID. NO. 2), ble de to oligomerene syntetisert og anvendt som PCR primere for å kopiere genet fra E. coli kromosomet (fig. IB). 5' primeren inneholdt fire ekstranukleotider ved 5'-enden, 5'-3' Hindlll sekvensen, T7 RNA polymerase promoteren og 43 baser av tRNA inkludert AAA antikodonet. 3'-primeren innbefattet 4 ekstra nukleotider, 3'-5' Bamlll og BstNI sekvensene og 12 baser av tRNA. I kontrast til vill-type tRNA<cys>oppstår et BstBI restriksjonssete innenfor T løkken til tRNA<Ser>og danner et nytt restriksjonssete for screening unødvendig.

En 0,1 ml PCR-reaksjon inneholdende 100 pmol av hver primer,.

20 ng E. coli kromosomalt DNA og 10 enheter Taql DNA polymerase ble belagt med mineralolje og utsatt for en syklus på 5 min ved 94 °C, 20 sykluser på 1 min ved 94°C, 2 min ved 55°C, 3 min ved 72°C og 1 syklus på 1 min ved 94°C, 2 min ved 55°C, 10 min ved 72°C. Etter syklisering ble reaksjonsblandingen ekstrahert med kloroform og produktene separert ved elektroforese på en 4$ Nusieve GTG agarosegel ved anvendelse av 40 mM Tris-acetat (pH 7,8), 2 mM EDTA. Hovedproduktet var det ventede 124 bp fragmentet. Etter at agarosen var fjernet ved fenol-ekstrahering ble endene til 124 bp fragmentet gjort butt ved anvendelse av Klenow fragmentet til DNA polymerase og spaltet med HindiII og BamHI. Fragmentet ble deretter ligert inn i Hindlll/BamHI-spaltet pUC18 ved inkubering over natt ved 160 C med T4 DNA ligase. E. coli XL1B transformanter inneholdende et plasmid med et innskudd ble screenet for tilstedeværelse av det fullstendige tRNA^<er>(AAA) genet ved BstBI restriksjonsanalyse ved anvendelse av minilysatplasmld DNA. Begge trådene av innskuddet ble sekvensert.

Spaltning av pCYS og pSER med BstNI resulterer i et lineært transkripsjonstemplat med et enkelt 5' overhengende thymidin som er komplementært med 3' terminal aenosin til tRNA. Løpende transkripsjon av BstNI spaltet pCYS eller pSER vil bli ventet å produere enten 75 eller 88 nukleotid RNA som ender 3' ACCA akseptorstamsekvensen til tRNA. Ved anvendelse av en 0,1 mg/ml sluttkonsentrasjon av T7 RNA polymerase ble 5-8 pg tRNA produsert pr. pg DNA templat. Til tross for at Milligan og Uhlenbeck ((1989) meth. Enzymol. 180:51-62) har rapportert at korte aborterende transkripter blir produsert når små RNA blir transkribert viser elektroforese på 20% denaturerende geler bare et hoved RNA produkt som er igjen etter gelfiltreringskromatografi (data ikke vist).

Konstruksjon av txALA or pFMET

To andre nye tRNA ble dannet. Disse tRNA ble enzymatisk aminoacylert med alanin og har et AAA antikodon som muliggjør gjenkjenning av et poly(U) templat. Det første tRNA, tRNAe^<la>(AAA) ble konstruert å være analogt med E. coli elongator tRNA<Ala>. M. Sprinzl et al. (1985) Nucl. Acids Res. 13:rl-rl04. tRNAe<Ala>(AAA) genet (pALA eller SEQ ID NO. 3) ble konstruert ved kopiering av tRNA<ala>(GGC) genet fra E. coli genomet ved PCR. Antikodonet ble forandret fra GGC til AAA. prosedyren som ble anvendt var butt-gjørelse, spaltning, ligering, transformering og screening av pSER ble deretter utført for å danne pALA.

Den andre, tRNA^^-'-a( AAA) er analog med å konstruert ved kopiering av E. coli initiator tRNAf<Met>. M. Sprinzl et al.

(1985) Nucl. Acids Res. 13:rl-rl04. Til tross for at den primære strukturen til dette tRNA ble modifisert for å lette in vitro transkripsjonen og aminoacyleringen var det antatt at trekkene var nødvendige for å opprettholde initiator-funksjonen. Disse trekkene innbefatter et ikke-Watson-Crick basepar i enden av akseptor stammen (B.L. Seong et al. (1987) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:334-338: H. wakao et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:20363-20371), et pyrimidin-ll-purin-24 basepar i dihydrouridin stammen (B.L. Seong et al (1987)) og en serie guanin og cytosin residier i antikodon stammen som danner tre på hverandre følgende G-C basepar (B.L. Seong et al. (1987)).

Følgende modifikasjoner ble utført på vill-type tRNAf^<et>for å danne tRNA-^<1>^AAA) genet (pFMET eller SEQ ID NO. 4): A ble erstattet med basene C og T i antikodonet til genet som danner som et AAA antikodon, G ble erstattet med basene 1C og 3C, T erstattet med basene 70G og 72A og et A ble skutt inn mellom basene 17C og 17aT til genet. Prosedyren anvendt for butt-gjøring, spaltning, ligering, transformering og screening av pSER ble deretter utført for dannelsen av pFMET.

Tn vjtyp transkripsjon

Plasmid DNA ble dannet for transkripsjon ved splatning med BstNI (3) U/pg i 1 time ved 60° C. Blandingen ble fenol-ekstrahert og DNA ble etanol-presipitert. Linearisert DNA (40 pg) ble tilsatt til en 2-ml transkripsjonsreaksjon inneholdende 50 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 10 mM dithiothreitol, 50 mM NaCl, 3 mM spermidin, 25 mM MgCl2, 1,6 mM GTP, 4 mM GMP, ATP, CTP, UTP, 50 U RNasin og 0,1 mg/ml T7 RNA polymerase. Etter inkubering i 2 timer ved 37° C ble templat DNA spaltet med 100 U RNase-fri DNase I. Korte avbrutte transkripter, dNTP og rNTP ble separert fra tRNA transkr iptene ved gelfiltrering ved anvendelse av Spectra-Gel A202 ekvilibrert med 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1 mM EDTA og 150 mM NaCl. tRNA fraksjonen ble ekstrahert en gang med fenol/kloroform/isoamyl alkohol (25:24:1), en gang med kloroform/isoamylalkohol (24:1) og deretter etanol-presipitert to ganger.

Aminoacylering av tRNA

Syntetiske RNA ble aminoacylert ved anvendelse av hvetekim syntetase til stede i 0-70$ ammoniumsulfat presipiterte proteiner til S150. S. Lax et al (1986) Meth. Enzymol. 118:109-128. En vanlig blanding Inneholdt 100 mM Hepes-KOH (pH 7,8), 15 mM Mg(0Ac)2, 2 mM spermidin, 5 mM dithiothreitol, 5 mM ADT, 30 pm respektive radioaktive aminosyrer (100 Ci/mol), 0,8 mg/ml syntetasefraksjon og 0,5-1 Agfco tRNA/ml og ble inkubert til 20 min ved 27°C. Aminoacylerings-effektiviteten ble bestemt ved presipitering tRNA med trikloreddiksyre og måling av radioaktiviteten i det filtrerte presipitatet ved væskescintillasjonstelling.

Til tross for at tRNA<C>v<s>(AAA) ble dannet fra genet for E. coli vill type tRNA<cys>, var det ikke mulig å aminoacylere det ved syntetase i E. coli S150 fraksjonen. Syntetaser inneholdende 0.70$ ammoniumsulfat fraksjonen av hvetekim S150 aminoacylerte tRNA<cys>(AAA). Denne enzymfraksjonen aminoacylerte også effektivt det syntetiske tRNA<Ser>(AAA). Baser på translasjonsreaksjonene som bare inneholder E. coli S150 fraksjonen var det mulig å aminoacylere tRN.A^er(AAA ^ betraktelig av E. coli syntetaser (tabell 1).

Gjær tRNA<Phe>ble aminoacylert ved anvendelse av en E. coli S150 fraksjon som aminoacyl tRNA-syntetasekilde. B. Hardesty et al. (1971) Meth. Enzymol. 20:316-330. tRNA<Ser>(AAA), tRNAeAla( AAA) og tRNA^Ala( AAA) ble aminoacylert ved anvendelse av hvetekim syntetase fraksjonen beskrevet ovenfor. For anvendelse ved ikke-enzymatisk initiering av translasjonen ble Phe-tRNA, Ser-tRNA, Ala-tRNAe<Ala>(AAA) og tRNA^A-'-a( AAA) acylert på deres a-amino gruppe ifølge fremgangsmåten til Rappoport og Lapidot ((1974) Meth. Enzymol. 29:685-688).

Effektiviteten ved aminoacylering var forskjellig for de syntetiske tRNA artene. In vitro trnaskribert tRNA<cys>(AAA) kunne bli aminoacylert til bare omtrent 20$, mens over 55$ av tRNA^<er>(AAA) ble aminoacylert av hvetekinsyntetaser (data ikke vist). Cys-tRNA<cys>(AAA) var derimot ustabil og forhindret isolering etter aminoacylering.

Ustabiliteten til Cys-tRNA^v<s>(AAA) forhindret påfølgende rensning, men aminoacyleringsreaksjonen kunne bli kombinert med E. coli translasjonsreaksjonen for ytterligere studier. Ser-tRNA<Ser>(AAA) var meget stabil i løpet av de gjentatte manipuleringene når det renset og merket med coumarin.

Aminoacylering av tRNAc^-1-a( AAA) nådde rutinemessig omtrent b0% (pmol Ala inkorporert/pmol tRNA) ved anvendelse av hvetekim syntetaser eller tRNA-tappet E. coli S-150 fraksjon som kilde for amino-tRNA syntetase. Aminoacylering av tRNAi<A>la(AAA) nådde omtrent 20$ ved hver syntetase-preparering. Det var ingen tilfeller hvor tRNA ble observert å bli aminoacylert med annen aminosyre enn alanin (data ikke vist).

TABELL 1

Poly(U)-rettet syntese av polyfenylalanin, polycystein og polyserin. Alle reaksjonene var ikke-enzymatisk initiert ved forbinding av 60 pmol AcPhe-tRNA eller AcSer-tRNA (ved en konsentrasjon som er lik den til ribosomene) i 5 min. ved 37° C. Alle prøvene ved 37°C ble inkubert i 30 minutter og ble gjort 0,1 M i NaOH og inkubert 15 min ved romtemperatur for å hydrolysere tRNA-aminosyrebindingen. Proteinene i reaksjonsblandingen ble deretter presipitert med trikloreddiksyre og filtrert. Filtrene ble tørket og radioaktiviteten bestemt. Prøvene ved 28°C ble inkubert i 120 min før [<35>S]cystein inkorporeringen ble målt.

In vitro translasjon ved anvendelse av syntetisk tRNA

For å bestemme aktiviteten til syntetisk tRNA^<vs>(AAA) og tRNA^<er>(AAA) ble hver anvendt for poly(li j-avhengig polypeptidsyntese. Poly(U)-avhengig inkorporering av [14C]fenylalanin i polyfenylalanin ble målt som beskrevet i 0.Odom et al. (1980). For ikke-enzymatisk initiering ble 0,6 pm AcPhe-tRNA eller AcSer-tRNA på forhånd bunet til 0,6 pm E. coli ribosomer i nærvær av poly(U) i 10 min. ved 37°C. W. D. Picking et al. (1990). For å undersøke erythromycin sensitiviteten ble antibiotikaet tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 5pm før preinkuberingstrinhet. [<l4>C]serin inkorporeringen til polyserin ble utført nøyaktig som polyfenylalaninsyntesen med unntagelse av at E. coli tRNA<Phe>ble erstattet med 1,17<A>26o/ml syntetisk tRNA<Ser>(AAA). Elongeringen ble begynt ved tilsetning av en E. coli S150 fraksjon i et sluttvolum på

100 pl.

Translasjonsanalysen ble modifisert for å lette poly(U)-avhengig syntese av polycystein. AcPhe-tRNA eller AcSer-tRNA (60 pmol) ble på forhånd bundet til 60 pmol ribosomer som beskrevet ovenfor. Blandingen ble deretter justert til 100 pl med alt som er nødvendig for translasjon unntatt tRNA og aminosyre. For å begynne polycysteinsyntesen ble Cys-tRNA<c>2y<s>(AAA) aminoacyleringsreaksjon beskrevet ovenfor koblet til reaksjonsblandingen ved tilsetning av like volum av hver og ga et endelig reaksjonsvolum på 200 pl. Reaksjonen ble deretter inkubert ved 37° C i 30 min eller ved 28° i 120 min for å muliggjøre reaminoacylering av tRNA^<vs>(AAA) ved hvetekim cysteinyl-tRNA syntetase. For å undersøke konfor-masjonen og miljøet til hvert voksende peptid ble enten CPM-Phe-tRNA og CPM-Ser-tRNA på forhånd bundet som beskrevet ovenfor. For å forsikre at det meste av fluoroforen var bundet ble konsentrasjonen til fluorescensaminoacyl-tRNA analogene redusert til omtrent 10$ av ribosom konsentrasjonen. CPM merking av aminosyregruppen til hver av de to syntetiske [<14>C]alanyl-tRNA ble også utført som tidligere beskrevet for naturlige og syntetiske tRNA. CMP-Ala-tRNA ble renset ved C^revers-fase høy ytelse væskekromatografi vesentlig som beskrevet for CPM-Ser -tRNASer(AAA).

Resultatene av in vitro translasjonen ved anvendelse av syntetiske Cys- og Ser-tRNA og vill-type tRNA<Phe>er vist j tabell 1. Cystein inkorporeringen ble målt ved både 28 og 37°C. Den lavere temperaturen gjorde det mulig med høyere reaminoacylering av tRNA<Cvs>(AAA) til hvetekim enzymet. Alle translasjonsreaksjonene ble ikke-enzymatisk initiert med AcPhe-tRNA eller AcSER-tRNA som var på forhånd bundet i et 1:1 molart forhold med ribosomene i nærvær av poly(U). Seks typer av reaksjonsblandingene med ribosomer som bærer voksende polypeptider ble dannet og tre hver med N-AcPhe og N-AcSer ved amino-terminusen. Sensitiviteten til syntesen av hvert polypeptid overfor inhibisjon med 5 pm erythromycin ble også testet. Parallelt ble [<14>C]AcPhe-tRNA anvendt for å initiere hver av polypeptidene i nærvær av umerket aminosyre for å bestemme antall ribosomer som er fullstendige aktive for syntetisering av hver type voksende peptid (data ikke vist).

Over 1500 pmol fenylalanin ble inkorporert i polyfenylalanin i nærævr eller fravær av erythromycin (tabell 1). Det ble bestemt at 30$ (18 pmol) av ribosomene i reaksjonsblandingen var aktive i polyfenylalanin syntesen. Ved anvendelse av denne verdien ble det beregnet at voksende polyfenylalanin-peptider hadde lengde på omtrent 80 aminosyrer. På grunn av at syntetiske tRNA<Ser>(AAA) kan bli aminoacylert av rå E. coli S150 fraksjonen ble polyserin syntesen utført på samme måte som polyfenylalanin syntesen. I dette tilfellet ble derimot bare omtrent 500 pmol serin inkorporert i polyserin. Denne syntesen ble inhibert med omtrent 90% av erythromycin (tabell 1). Bare omtrent 10% av ribosomene var aktive i polyserin syntesen som derimot også gir en gjennomsnittlig peptidlengde på omtrent 80 aminosyrer (data ikke vist).

Ved 37° C ble 99 pmol cystein inkorporert i polycystein i 30 minutter som ble inhibert i il% av erythromycin (tabell 1).<p>io+ tøi£ vurdert at 15$ (10 pmol av ribosomene var aktive i polycysteinsyntesen og tilsvarer en gjennomsnittlig peptidlengde på omtrent 10 aminosyrer. Det er å bemerke at denne syntesen ble utført med en koblet hvetekim aminoacylering: E. coli translasjonssystem. Bare meget begrenset reaminoacylering av tRNA ved hvetekim syntetasen kan oppstå ved 37°C. For å justere for dette ble polycysteinsyntesen også initiert ved 28°C og utført ved denne temperaturen i 120 min (tabell 1). I dette tilfellet ble 247 pmol cystein inkorporert. Som ved 37° C var 10 pmol ribosomer aktive i polycysteinsyntesen og tilveiebringer en gjennomsnittlig peptidlengde på omtrent 25 aminosyrer i dette tilfellet.

En større mengde polyfenylalaninsyntese (lengre gjennomsnittlig peptidlengde, høyere proporsjon av ribosomer med voksende peptider, i det poly(U)-rettede translasjonssystemet kan reflektere de atypiske egenskapene til fenylalaninpeptidene. Korte fenylalaninpeptider ser ut til å presipitere lettere med trikloreddiksyre enn korte peptider av serin eller cystein. Dette kan bidra til relativt større totalmengde av fenylalanin inkorporeringen og er sannsynligvis en hoved-faktor ansvarlig for den relativt lavere prosentandelen av ribosomer som ser ut til å være aktiv i polyserin eller polycystein syntesen. En annen faktor som kan bidra til den relativt store verdien for total fenylalanin inkorporering er den lange tiden som det tar for at nesten lineær peptidsyntese rate blir opprettholdt når polyfenylalanin blir dannet. Reduksjonen i raten av peptidsyntese som blir observert med de fleste peptidene andre enn polyfenylalanin kan reflektere produktinhibisjonen. Spirin et al. ((1988) Science 242:1162-1164) er observert nesten lineære syntese-rater i mange timer dersom peptidproduktet blir fjernet fra reaksjonsblandingen når det blir dannet. Voksende polyfenyl-alaninpeptider er så uoppløselige at de kan bli effektivt fjernet fra oppløsningen i reaksjonen og dermed føre til en situasjon som er tilsvarende den som dannes i det kontinu-erlige strømningstranslasjonssystemet.

Resultatene presentert i tabell 1 demonstrerer også at poly(U)-rettet syntese av polycystein og polyserin fra syntetisk tRNA er følsomme for inhibisjon ved erythromycin. Fenylalaninsyntesen er derimot ikke inhibert av antibiotikaet under de samme betingelsene. Det er i samsvar med tidligere observasjon ((G. Chinali et al. (1988) Biochim. Biophy. Acta 949:71-78; T. Otaka et al. (1975) Proe. nati. Acad. Sei. USA 72:2649-2652; D. Vasquez (1979) Molecular Biology Bio-chemsitry and Biophysics Spinger-Verlag, Berlin, vol. 30, s. 312) og understøtter hypotesen om at denne forskjellen i sensitivitet og for erythromycin er et resultat av egenskapene til selve det voksende peptidet.

Poly(U)-avhengig polypeptidsyntese ble forsøkt ved anvendelse av Ala-tRNAe<Ala>(AAA) og AlatRNAiAla(AAA).

Polypeptidsyntesen ble gjort lettere ved å forbinde N-acetyl derivatene til Phe-tRNA, Ala-tRNAe<Ala>(AAA) og Ala-tRNA^<Ala>(AAA). N-acetylering av aminoacyl-tRNA ble utført med N-hydroksysuccinimidesteren til eddiksyren ifølge fremgangsmåten til Rappoport og Lapidot (1974). Ikke-enzymatisk tRNA binding til ribosomer ble utført i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NH2C1, 15 mM Mg(0Ac)2, 5 mM 2-merkaptoetanol, 0,2 mg/ml poly(U), 0,5 pm ribosomer og 0,5 pm acylert tRNA. Polyalanin syntesen ble initiert som tidligere beskrevet for polyfenylalanin (W.D. Picking et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:1534-1542) og polyserin som beskrevet ovenfor med unntagelse av at[14C]alanin og enten tRNAeAla(AAA) eller tRNAe<Ala>(AAA) ble anvendt som aminosyre og tRNA kilder. tRNAe<Al&>(AAA) ble anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 1 A2£,q enheter/ml mens tRNAiAla(AAA) ble anvendt ved en konsentrasjon på omtrent 3 A260enheter/ml for å nå nesten lignende mengder av aminoacylert tRNA i alle polyalaninanalysene. Inkorporering av [<14>C]alanin til polyalanin ble bestemt som tidligere beskrevet i W. D. Picking et al. (1991).

i<cli t i.ivx» ri C ^ilAiiJ llUUCi dLøluEt pulj^u "a v iiCiigig y \- l . L y cj. J. cilj. j. j.1 syntesen (fig. 2). Syntetisk elongator tRNA-avhengig polyalaninsyntesen var lineær i mer enn 60 min ved 37°C (fig.

2) og lengre enn 2 t ved 20°C (data ikke vist). Når tRNAi<Ala->

(AAA) derimot ble anvendt ble hver polyalaninsyntese bare delvis over bakgrunnsnivåene (fig. 2). Et interessant trekk ved polyalaninsyntesen i dette systemet er at det er følsomt for inhibisjon av erythromycin (fig.2 ). Dette er i kontrast til polyfenylalaninsyntesen som er motstandsdyktig overfor erythromycin (W.D. Picking et al. (1991)).

Forsøkene ble deretter utført for å bestemme om AlAla-tRNAiAla(AAA) eller AcAla-tRNAe<Ala>(AAA) kunne bli ikke-enzymatisk på forhånd bundet til ribosomene for å lette polyalaninsyntesen. Inkorporering av alanin i polyalanin fra Ala-tRNAeAl<a>(AAA) var det samme om AcAla-tRNAeAla(AAA), AcAla-tRNA1<Ala>(AAA) eller AcPhe-tRNA ble på forhånd bundet til poly(U)-programmerte 70S ribosomer (tabell 2). Antall voksende polyalaninkjeder syntetisert ble bestemt ved måling av inkorporering av radiomerket aminosyre fra forbundet Ac-

[<14>C]aminoacyl-tRNA etterfulgt av polyalaninsyntese i nærvær av umerket alanin. Det var mulig å vurdere lengden av voksende polyalaninkjeder fra parallelle bestemmelser av radioaktiv alanin inkorporering og kjennskap til antall syntetiserte voksende kjeder. Lengden til voksende peptider som ble produsert var like uansett initierende tRNA (tabell 2). Det viktige trekket ved disse data er at mens tRNA^A-^a-(AAA) ikke er funksjonell for peptidforlengelse kan den bli bundet ved det ribosomale P setet for å muliggjøre ikke-enzynatisk-initiert peptidsyntese. Det er også å bemerke at polyalaninsyntesen ble inhibert av erythromycin uansett initierende acyl-tRNA (selv AcPhe-tRNA, data ikke vist).

Ac[<14>C]aminoacyl-tRNA ble anvendt i nærvær av ikke-radioaktiv alanin for å bestemme antall initierte voksende kjeder.

[<14>C]alanin ble anvendt for å måle pmol Ala inkorporert i polyalanin.. Gjennomsnittlig lengde av voksende polyalanin er gitt ved pmol Ala/pmol voksende kjeder som beskrevet i metodedelen.

Fluorescensegenskapene til et CPM residie påcx-amino gruppen til disse aminoacylerte alanin tRNA reflekterer det lokale miljøet rundt fluoroforen når tRNA enten er fritt i opp-løsning eller bundet til ribosomer. CPM-Ala-tRNAe<Ala>(AAA) bindes til 70S ribosomer med mange av de samme egenskapene som tidligere er blitt rapportert av W. D. Picking et al.

(1991) for CPM-Phe-tRNA og syntetisk CPM-Ser-tRNA<Ser>(AAA) diskutert ovenfor. For CPM-Ala-tRNAiAla(AAA) indikerer derimot fluorescensanisotrofi dataene at fluoroforen blir holdt mere fast enn elongator motparten når hver er fri i oppløsning. Fluoroforen på initiator tRNA analogen ser ut til å beveges mere fritt enn den samme proben på elongator tRNA når den er bundet til 70S ribosomene. Til tross for at hvert fluorescens tRNA blir bundet til det ribosomale "P setet" reagerer hver av disse forskjellig overfor den påfølgende erythromycin bindingen. Disse resultatene tyder samlet på at CPM proben og antagelig alanin som det er koblet til ikke er i identiske posisjoner når de to tRNA er i "P setet" vurdert ifølge funksjonen. Denne forskjellen i binding relativt til bindingssetet til erythromycin forhindrer ikke at antibiotikaet inhiberer polyalaninsyntesen om denne syntesen blir påbegynt ved forbinding av N-blokkert elongator Ala-tRNA,

Disse funksjonelle forskjellene kan reflektere forskjellene i strukturen til initiator og elongator tRNA. Det er mange regioner som er sterkt konserverte blant prokaryote initiator tRNA i forhold til elongator tRNA. B. L. Seong et al.

(1987), H. Wakao et al. (1989), og C. 0. Gualerzi et al.,

(1990) Biochem. 29:5881-5889. Disse trekkene innbefatter fravær av et V/atson-Crick basepar mellom residiene 1 og 72, tilstedeværelse av et purin 11-pyrimdin 24 basepar i dihydrouridinstammen (D-stammen) og tre påfølgende G.C basepar i antikodonstammen. B. L. Seong et al (1987). Sistnevnte trekk kan være involvert når det gjelder diskrimi-nering av initiator tRNA fra elongator tRNA og er nødvendig for P-sete spesifikk binding til ribosomer. B. L. Seong et al. (1987). Sete-spesifikke mutasjoner i denne delen av antikodonstammen er blitt vist å føre til et progressivt tap av initiatorfunksjon for tRNAf^<etm>Fremkomst av tre påfølg-ende G-C basepar har også vært antatt å gi antikodonet til initiator tRNA spesielle strukturelle og elektromagnetiske egenskaper. K. A. Sharp et al. (1990) Biochem. 29:340-346.

Fluroescens målinger av ekstens. i onen til nve voksende polypeptider

Først ble CPM-Phe-tRNA eller CPM-Ser-tRNA anvendt for å initiere poly(U)-avhengig syntese av polyfenylalanin, polycystein og polyserin. CPM merking av a-gruppen til gjær Phe-tRNA er beskrevet i 0. Odom et al. (1990). Ser-tRNA-<S>er(AAA) ble likeledes merket ved a-gruppen til seryl delen. Fluroescens tRNA analogene ble renset ved revers-fase HPLC på en Q>i kolonne på en måte som ligner den som er beskrevet for CPM-Phe-tRNA.

Lineære fluorescens målinger ble utført på et modell 8000 foton-tellende spektrofluormeter fra SLM-Aminco Instruments, Inc. (Urbana, IL) som tidligere beskrevet i W. Rychlik et al.

((1983) Biochemistry 22:85-93). Spektral data ble akkumulert ved 1-nm intervaller med en scanningsrate på 0,5 sek. pr. bølgelengde del. Alle målingene ble automatisk korrigert for bølgelengde avhengigheten til følsomheten av fotomulti-plikatoren. Fluorescensmålingene ble utført med en absorbanse på mindre enn 0,1 ved eksitasjonsbølgelengden i et volum på 0,5 ml og ved en temperatur på 20° C for med hensikt å redusere elongeringsraten. Lineær fluorescens anisotrofi målinger ble utført som beskrevet u 0. Odom ((1984) Biochemistry 23:5069-5076).

Fluorescens anisotrofien fra CPM proben på disse aminosyrene blir fulgt når de voksende peptidene ble dannet. Binding av CPM-Phe-tRNA til peptidyl transferase senteret av ribosomene resulterer i en økning i fluorescens anisotrofien fra 0,18 til omtrent 0,36. Denne høye fluorescens anisotrofien reflekterer rigiditeten som aminosyren til CPM-Phe-tRNA blir holdt i peptidyl transferase senteret. V/.D. Picking et al.

(1990). Syntese av de første peptidbindingene til polyfenylalanin resulterte i et fall i anisotrofien som deretter økte når det voksende peptidet ble utvidet. I kontrast resulterte poly(A)-avhengig polylysin syntesen i et hurtif fall i anisotrofien når den amino-terminale proben ble utvidet fra peptidyl transferase senteret uten påfølgende økning i anisotrofi.

Ved initiering av polycystein eller polyserin syntesen med CPM-Phe-tRNA falt anisotrofien drastisk på en måte som ligner det som tidligere fremkom med polylysin (fig. 3A). Til forskjell fra polylysin syntesen så flatet anisotrofien til disse voksende peptidene ut for korte perioder før de igjen falt (fig. 3A). Disse resultatene er ventet dersom amino-terminien til begge voksende peptider utførte ribosomene innenfor en lengde på noen få aminosyrer fra peptidyl tRNA senteret. Voksende serinpeptider er lengre enn de av cystein (tabell 1) som kan stå for den lavere slutt anisotrofien til førstnevnte. Basert på denne og tidligere resultater kan det tyde pet ci c poiycyiatfCiii p*o xjTo^ l a r± volvscuut; p>o 1 ^p>GpLider* utgår direkte inn i den omgivende oppløsningen i likhet med poly(A)-rettet voksende polylysin.

For å tilveiebringe ytterligere bevis for at resultatene beskrevet ovenfor ikke var et resultat av CPM-Phe-tRNA anvendt for å initiere translasjonen ble hvert voksende polypeptidart, inkludert polyfenylalanin, initiert med CPM-Ser-tRNA. Forandringer i fluorescensen som oppsto når peptidene ble elongert ble registrert som beskrevet ovenfor. Som tidligere oppdaget falt anisotrofien når de første peptidbindingene til polyfenylalanin ble dannet og økte deretter når peptidet ble utvidet (fig. 3B, W. D. Picking et al. (1990)). Anisotrofien til CPM-Ser proben ble også betraktelig redusert når de første peptidbindingene til polycystein og polyserinpeptidene ble dannet. I kontrast til resultatene for polyf enylalanin økte den ikke når polypeptidene ble utvidet. Reduksjon i anisotrofien stoppet i en kort periode etter at noen få aminosyrer (vurdert 3 eller 4) var blitt tilsatt til aminoterminal CPM-Ser (fig. 3B). Resultatene er like med de som ble oppnådd når peptidene ble initiert med CPM-Phe. Grunnlaget for dette resultatet er uklart. Det kan reflektere bestemmelsen av det korte voksende peptidet eller et spesielt strukturelt trekk ved ribosomene som proben møter når peptidet opprinnelig blir utvidet.

For vurdering av den gjennomsnittlige lengden til voksende polyalaninkjeder (gitt i tabell 2) var det nødvendig å eksperimentelt bestemme antall aktive ribosomer i poly(U)-avhengig polypeptidanalysen beskrevet ovenfor. For å gjøre dette ble 55 pmol Ac[<14>C]Phe-tRNA (100 Ci/mol), Ac[<14>C]Ala-tRNAe<Ala>(AAA) eller Ac[<14>C]La-tRNAiAla(AAA) (50 Ci/mol) på forhånd bundet til poly(U)-programmerte ribosomer (50 pmol) ved inkubasjon ved 37° C i 15 min før tilsetning av de andre komponentene nødvendige for proteinsyntese. Etter forbinding av Ac[<14>C]aminoacyl-tRNA ble polypeptidsyntesen utført som beskrevet ovenfor med unntagelse av at ikke-radioaktiv alanin ble anvendt slik at eneste radioaktivitet inkorporert inn i trikloreddiksyrepresipiterbart materiale var fra forbundede N-blokkerte aminosyrer. Dette tilveiebringer et mål på de ribosomene hvorpå aminosyren fra forbundet [<*4>C]-merket Ac-aa-tRNA deretter ble inkorporert inn i voksende polyalanin. Når total pmol alanin inkorporert i polyalanin (beskrevet ovenfor) blir målt kan verdien bli delt med antallet aktive ribosomer (som bestemt ved måling av antallet syntetiserte voksende kjeder) for å gi en vurdering på den gjennomsnittlige voksende polyalaninkjedelengden.

På ny ble et modell 8000 proton-tellende spektrofluorometer fra SLM-Aminco Instruments, Inc. (Urbana, IL) anvendt for likevekts-fluorescensmålinger som beskrevet ovenfor. Fluorescerende tRNA ble bundet til ribosomer som beskrevet ovenfor med unntagelse av at konsentrasjonen til disse tRNA ble redusert til omtrent 10$ av ribosom konsentrasjonen for å forsikre maksimal tRNA binding. Spektrene ble målt ved 1-nm emissjonsintervaller med en scanningrate på 0,5 sek pr bølgelengde økning med en eksitasjonsbølgelengde på 385 nm. Anisotrofien og relative intensitetsmålinger ble utført ved en emissjonsbølgelengde på 475 nm. Målingene ble automatisk korrigert for bølgelengdeavhengigheten til fotomultiplikator sensitiviteten. Fluorescensmålingene ble utført ved 20°C i et volum på 0,6 ml. Alle målingene ble utført med en enkel absorbanse på mindre enn 0,1 ved eksitasjonsbølgelengden og fluorescens anisotrofi målinger ble utført som tidligere beskrevet i W. L. Picking et al. (1991). Kvantumutbyttene av CPM-Ala-tRNAeAl<a>(AAA) og CPM-Ala-tRNAiAl<a>(AAA) ble bestemt ved sammenligning med qunin sulfat i 0,05 M H2SO4som hadde et kvantum utbytte på 0,508 ved 25° C (R. A. Velapold et al.

(1980) "A Fluorescence Standard Reference Manual: Quine Sulfate Dihydrate", National Bureau of Standards Special Publication 260-64, U.S. Government Printing Office, Washington, D. C).

Fluorescens anisotrofien og kvantumutbyttet var forskjellige for de to tRNA under granskningsbetingelsene. Anisotrofien til fritt CPM-Ala-tRNAe<Åla>(AAA) (0,185) var likt det som tidligere fremkom for naturlig elongator tRNA CPM-Phe-tRNA<Phe>(0,181) samt syntetisk elongator tRNA CPM-Ser-tRNA<Ser>(AAA)

(0,175). Ved binding til 70S ribosomene økte anisotrofien og kvantumutbyttet til CPM-Ala-tRNAe<Ala>(AAA) på samme måte som tidligere studerte tRNA (W.D. Picking et al. (1991), tabell 3). CPM-Ala-tRNAiAla(AAA) hadde en høyere anisotrofi når det var fritt i oppløsning (0,205) og en lavere anisotrofi når bundet ved ritosomalt P sete (0,310) i sammenligning med fritt (0,185) og P sete-bundet 80,346) CPM-Ala-tRNAe<Ala>(AAA)

(tabell 3). At P sete-bindingen til hvert tRNA var oppstått ble bekreftet ved tilsetning av puromycin. Dette resulterte i en stor økning i anisotrofien til bundet CPM-Ala-tRNAe^3—

(AAA) (til 0,175) og CPM-Ala-tRNAiA<la>(AAA) (til 0,183) når hvert CPM-Ala-puromycin produkt ble dannet og deretter frigjort fra ribosomet (data ikke vist).

Når deacylert tRNA<Phe>var forbundet til 70S ribosomene for å fremme A sete binding av CPM-Ala-tRNA<A->'-<a>(AAA), ble ingen forandring i kvantumutbyttet, anisotrofi eller emissjons-spektrum observert og dette tyder på at ingen binding hadde oppstått (tabell 3). Dette ble bekreftet ved eksperimenter som demonstrerer at etter for-binding av deacylert tENA<Phe>forble CPM-Ala-tRNAi<Ala>(AAA) ikke med ribosomfraksjonen når reaksjonskomponentene ble separert ved gelfiltrering på Sephacryl S-300 (data ikke vist). CPM-Ala-tRNAe<A>21<a>(AAA) ble bundet ved det ribosomale A setet som vist ved øket anisotrofi (0,312) og kvantumutbytte (0,472) (tabell 3). Mindre enn 10$ av dette A sete-bundede CPM-Ala-tRNAe<Ala>(AAA) var reaktiv med puromycin (data ikke vist).

Dataene tyder på at syntetisk initiator tRNA har beholdt bindingsegenskapene til naturlig tRNAf<Met_>Disse egenskapene er parallelle med fluorescenskaraktertrekkene som er forskjellige fra de til elongator Ala-tRNA.

CPM-Ala-tRNAeAl<a>(AAA) og CPM-Ala-tRNA1<Ala>(AAA) (25 pmol) blir også anvendt for å undersøke virkningen av IF-2 på tRNA bindingen til 30S og 70S ribosomene. Fluorescens anisotrofi og kvantumutbyttet ble målt i nærvær og fravær av renset IF-2 (105 pmol) etter sekvensiell tilsetning av 30S subenheter (195 pmol) og 50S subenheter (195 pmol). Målingene ble utført i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM Mg(0Ac)2, 50 mM NH4C1, 1 mM GTP, 5 mM dithioerythritol og 0,2 mg/ml (poly(U) i et sluttvolum på 600 pl. Når disse målingene var avsluttet ble Mg^<+>kcnsentrasjonen øket til 15 mM for iliko -enzymatisk lettet tRNA bindingen og anisotrofien og kvantumutbyttet ble på ny målt. Resultatene ser ut til å indikere at hverken methionin eller AUG kodonet unikt er nødvendig for peptid-initiering med IF-2. Initiator tRNA mutert for å gjenkjenne UUC og GUC kodonene og aminoacylert med fenylalanin og valin er blitt vist å initiere enzymatisk aktiv p<->galactosidase in vivo når mRNA inneholder det hensiktsmessige kodonet ved initiator kodon posisjonen R. Chattapadhyay et al. (1990) Biochem. 29:4263-4268. I en lignende studie kan initiering av aktiv kloramfenieol acetyltransferase oppstå fra et amber (UAG) kodon, sannsynligvis med glutamin, når et initiator tRNA endret for å gjenkjenne initiator amber kodonet er til stede. U. Varshney et al. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. 87:1586-1590.

IF-2 og/ei ler 3QS ribosomale subenheter ble inkubert med fluorescens tRNA o 15 min ved 37 °C med 6 mM Mg^<+>til stede før måling av fluorescensen. Etter hver påfølgende tilsetning ble reaksjonsblandingen inkubert 10 min ved 37° C og deretter 15 min ved 20°C (i kuvetten anvendt for fluorescensmålingene) før avlesning av fluorescensen. Alle reaksjonene ble utført i et sluttvolum på 600 pl som beskrevet i metodedelen. Etter tilsetning av ribosomene ble Mg^<+>konsentrasjonen øket 9 mM (for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 15 mM) for å muliggjøre ikke-enzymatisk binding av fluorescens tRNA. Anisotrofi og kvantumsutbytte ble deretter på ny målt for sammenligning.

Evnen som tRNA^<Ala>(AAA) har når det gjelder å virke ved enzymatisk peptid initiering ble testet ved anvendelse av renset E. coli initiator faktor 2 (IF-2) for binding av tRNA til 30S og 70S ribosomene (i 6 mM Mg<2+>). IF-2 letter bindingen av CPM-Ala-tRNA1<Ala>(AAA) til 30S subenhetene som vurdert ved øket anisotrofi og kvantumutbytte (tabell 4). Når 50S subenhetene deretter ble tilsatt til reaksjonsblandingen ble over 80$ av CPM-Ala-tRNA1Ala( AAA) bundet til 70S ribosomene i 6 mM Mg<2+>som indikert ved en øket fluorescens anisotrofi (tabell 4). Bare en mindre ytterligere økning i bindingen ble observert når Mg<2+>konsentrasjonen ble øket til 15 mM i reaksjonsblandingen for å formidle den ikke-enzymatiske bindingen av tRNA som diskutert ovenfor (tabell 4). Med poly(U) ved 6 mM Mg<2+>ble CPM-Ala-tRNAiAla(AAA) ikke bundet til 30S ribosomale subenheter i fravær av IF-2 og dårlig til 70S ribosomene (tabell 4). Etter økning av Mg<2+>til 15 mM ble initiator tRNA bundet til poly(U) programmerte ribisomer i fravær av IF-2 (tabell 4). Disse data indikerer at IF-2 spesifikt formidler bindingen av CPM-Ala-tRNA^<A->'-a<->

(AAA) til 30S ribosomale subenheter eller til 70S ribosomene i 6 mMMg2+.

CPM-Ala-tRNAe<Ala>(AAA) ble ikke bundet til 30S eller 70S ribosomer i 6 mM Mg<2+>i nærvær eller fravær av IF-2 (tabell 4), derimot ble det i hvert +11. felle hurtig butidet ved økning av Mg<2+>konsentrasjonen til 15 mM. Ved høy Mg<2+>konsentrasjonen ble fluorescens anisotrofien og kvantumutbyttet til CPM-Ala-tRNAe<Ala>(AAA) forøket til verdier tidligere observert for ribosombinding (se tabell 3).

Fluorescensen fra coumarin delen til CPM er meget følsom overfor hydrofobisitet, ladning og andre faktorer i nærheten av proben. Som med CPM-Ser-tRNA diskutert ovenfor ble denne omgivelsessensitiviteten anvendt for å sammenligne to CPM-Ala-tRNA under forskjellige betingelser. Fluorescens emissjonsspektrene til CPM-ALa-tRNAe<Ala>(AAA) og CPM-Ala-tRNAiA^a(AAA) ble målt når tRNA var frie i oppløsning, bundet poly(U)-programmerte ribosomer, bundet til ribosomer samtidig med erythromycin og bundet til ribosomer samtidig med sparsomycin og puromycin (fig. 4A og B). Sparsomycin er blitt vist i dette laboratoriet å blir bundet til 70S ribosomer og inhiberer puromycin reaktiviteten med P sete-bundet N-acyl-Phe-tRNA uten å forhindre bindingen av puromycin (Odom og Hardesty, manuskrpit under preparering.

Intensiteten til emissjonsspekteret til CPM-Ala-tRNAe<Ala>(AAA) er øket og er ledsaget av et betraktelig "blue shift" (6 nm) ved binding til ribosomene (fig. 4A, stiplet linje mot fast linje). Emissjonen av CPM-Ala-tRNA^A-'-a( AAA) gjennomgår en lignende, men noe mindre økning i fluorescensintensiteten ved binding til ribosomer (fig. 4 B, stiplet linje) ledsaget av et noe mindre "blue shift" (3 nm).

Når erythromycin ble bundet til ribosomer som allerede inneholder CPM-Ala-tRNAe<Ala>(AAA) ble en 15% økning i relativ fluorescens intensitet observert og ledsaget av et ytterligere 3 nm "blue shift" i emissjonsmaksimumet (fig. 4A, stiplet linje). Erythromycin resulterte i bare en 3% økning i relativ intensitet av bundet CPM-Ala-tRNA^A^a(AAA) ledsaget av et 2 nm "blue shift" i emissjonsspekteret (fig. 4B, stiplet linje). Disse observasjonene tyder på at CPM-Ala delen på initiator tRNA er i en noen annen posisjon på ribosomer relativt til erythromycin bindingssetet. For å utforske denne muligheten ble fluorescensen til hvert tRNA (etter binding til poly(U)-programmerte ribosomer) undersøkt etter den sekvensielle tilsetningen av sparsomycin og puromycin. Sparsomycin alene hadde liten virkning på emissjonsspekteret til hver fluorescens tRNA (data ikke vist). Antibiotikaet er en inhibitor av puromycinreaksjonen med akryl-tRNA bundet i det ribosomale P setet. Dette gjorde det mulig å undersøke virkningen av puromycinbindingen på fluroescensen til hvert tRNA (fig. 4A og B). Puromycinbindingen resulterte i en 26$ økning i i fluorescens intensiteten til bundet CPM-Ala-tRNAe<Ala>(AAA) ledsaget av et 4 nm "blue shift" i emissjonsmaksimum (fig. 4A, strek/prikk/- stiplet linje). Ingen forandring i anisotrofi ble observert. Dette resultatet bekrefter inhibisjonen av puromycin-reaktiviteten i nærvær av sparsomycin. Puromycin bindingen resulterte i bare en 6$ økning i fluorescensen til bundet CPIVI-Ala-tRNAiA-'-a( AAA) og er også ledsaget av et 4 nm "blue shift" (fig. 4B, strek/prikk/stiplet linje).

Resultatene med erythromycin og sparsomycin/puromycin understøtter konklusjonen om at CPM-Ala delen av initiator tRNA blir holdt i en annen posisjon på ribosomet enn samme del av elongator tRNA. Et interessant trekk ut fra disse resultatene er at polyalaninsyntesen initiert med enten AcAla-tRNA blir inhibert av erythromycin og hvert N-acyl tRNA er puromycin-reaktiv (i fravær av sparcomycin) når bundet i det ribosomale P setet. Dette tyder på at CPM-Ala delen av initiator tRNA blir holdt forskjellig med hensyn på bindings-setene til erytromycin og puromycin enn den samme delen av elongator tRNA uten noen tydelig virkning på funksjonen til antibiotikaene. Implikasjonene til denne forskjellen i CPM-Ala posisjonen er ikke klar, men reflekterer sannsynligvis forskjellene i tRNA strukturen og ikke funksjonen i peptidyl overføringen.

Syntetisk tRNA^^(AAA), noe dårlig aminoacylert, ble effektivt anvendt for poly( TJ )-rettet polycystein syntesen. Syntetisk tRNA<Ser>(AAA) var et mye bedre substrat for aminoacylering og ble også anvendt effektivt i det poly(TJ)-rettede translasjonssystemet. Et interessant trekk ved poly (TJ )-rettet syntese av polycystein og polyserin var at hvert var følsomt overfor inhibisjon av forbundet erythromycin om ikke-enzymatisk initiert med AcSer-tRNA eller AcPhe-tRNA. Dette er i direkte konstrast til polyfenylalanin syntesen som ikke blir påvirket av erythromycin med initiering med AcPhe-tRNA eller AcSer-tRNA. Disse data tyder på at erythromycin sensitiviteten er en funksjon av voksende peptid og ikke mRNA eller tRNA.

For å utvide disse dataene ble fluorescens egenskapene til en CPM probe koblet til et amino-terminalt fenylalanin eller serin registrert når polyfenylalanin, polycystein eller polyserin ble dannet. Ved initiering med CPM-fenylalanin eller CPM-serin oppførte polyfenylalanin seg i samsvar og ble bygget opp som en uoppløselig masse ved siden av peptidyl transferase senteret. Derimot så det ut som om voksende peptider som ble utvidet med cystein eller serin utgikk direkte fra peptidyltransferase senteret inn i den omgivende oppløsningen om de ble initiert med AcSer-tRNA eller AcPhe-tRNA. Dette resultatet er i samsvar med det som fremkom med polylysin.

Sammenligning av de to syntetiske alanin tRNA oppførte elongator tRNA (tRNAeala(AAA) og initiator tRNA (tRNA1<Ala->

(AAA) forskjellig i løpet av peptidsyntesen på ribosomer vurdert ifølge både in vitro translasjon og fluorescens-teknikkene. tRNAjAla(AAA) virket ikke for poly(U)-avhengig elongering av polyalaninpeptidene mens tilsvarende tRNAeA-^a-(AAA) effektivt ble anvendt for denne prosessen. Begge AcAla-tRNA hadde evne for ikke-enzymatisk binding til P setet av poly(U)-programmerte 70S ribosomer i nærvær av 15 mM Mg<2+>. På denne måten kunne hver bli anvendt for å begynne polyalanin syntesen med tRNAe<Ala>(AAA) til stede som elongator tRNA kilde. Bare initiator tRNA analogen var enzymatisk bundet til IF-2 og GTP ved 6 mM Mg<2+>. Resultatene indikerer at tRNAi<Ala->

(AAA) har beholdt initiator funksjonen, mens bare tRNAe<Ala->

(AAA) kan virke for peptidelongeringsfunksjonen.

Claims (12)

1. DNA som koder for et syntetisk tRNA,karakterisert vedat det omfatter en RNA polymerase promoter, et mutant E. coil tRNA gen, som inkluderer et AAA antikodon og spesifikke tRNA syntetasegjenkjenningsseter for en aminosyre som er en annen enn Phe; og minst to restriksjonseter.

2. DNA sekvens ifølge krav 1,karakterisertved at nevnte DNA sekvens innbefatter et HindiII sete, en T7 RNA polymerasepromoter, et BstNI sete og et BamHI sete.

3. DNA sekvens ifølge krav 2,karakterisertved at den videre omfatter el Fstl sete dannet ved å forandre basen A21 og T24 til C21 og C24 og et Spel sete ved tilsetning av en A mellom T42 og C43 i nevnte tRNA-gen.

4 . DNA sekvens ifølge krav 3,karakterisertved at den blir betegnet tRNA<Cvs>(AAA) genet, med en nukleinsyresekvens bestående av:

5 . Fremgangsmåte for fremstilling av tRNA<Cvs>(AAA) genet ifølge krav 4,karakterisert vedå danne 5'-3' og 3'-5' Hindll/Pstl oligomerene og 5'-3' og 3'-5' Pstl/BamHI oligomerene, sammensmeltning av nevnte 5'-3' og 3'-5' Hindlll/Pstl oligomerene og 5'-3' og 3'-5<*>Pstl/BamHI oligomerne, danne en ligeringsblanding av nevnte sammensmeltede oligomerer og et Hindlll/BamHI-spaltet pUC18 plasmid, inkubering av nevnte ligeringsblanding, transformering av E. coli med nevnte inkuberte ligeringsblanding , eksponerer nevnte transformerte E. coli for ampicillin og X-gal, screening av nevnte transformerte E. coli inneholdende plasmider med et innskudd for tilstedeværelse av hele tRNACvs(AAA) gener og sekvensering av begge trådene til nevnte innskudd.

6. DNA sekvens ifølge krav 2,karakterisertved at den videre omfatter et BstBI restriksjonssete innenfor T loop til nevnte tRNA-gen.

7. DNA sekvens ifølge krav 6,karakterisertved at den er betegnet tRNA^<er>(AAA) gen som har en nukleinsyresekvens bestående av:

8. Fremgangsmåte for fremstilling av tRNA<Ser>(AAA) genet ifølge krav 7,karakterisert vedå kopiere tRNA<Ser>(GGA) genet fra E. coli genomet, substituering av AA for GG i nevnte gen som danner et AAA antikodon, butt-gjøring av endene av endene til nevnte substituerte gen, spaltning av nevnte butt-endede gen med Hindlll og BamHI, ligering av nevnte spaltede gen inn i et pUC18 plasmid, transformering av E. coli med nevnte ligerte plasmid, screening av nevnte transformerte E. coli inneholdende plasmider med et innskudd for tilstedeværelse av hele tRNA<Ser>(AAA) gener og sekvensering av begge trådene av nevnte innskudd.

9. DNA sekvens ifølge krav 6,karakterisertved at den er betegnet tRNAeA-la( AAA) gen, med en nukleinsyresekvens bestående av:

10. Fremgangsmåte for fremstilling av tRNAeAla(AAA) genet ifølge krav 9,karakterisert vedå kopiere tRNA<Ala>(GGC) genet fra E. coli genomet, substituere AAA med GGC i nevnte gen som danner et AAA antikodon, butt-gjøre endene av nevnte substituerte gen, spalte nevnte butt-endede gen med Hindlll og BamHI, ligere nevnte spaltede gen inn i et pUC18 plasmid, transformere E. coli med nevnte ligerte plasmid, screene nevnte ti-ans f orme r te E. coli inneholdende plasmider med et innskudd for tilstedeværelse av helt tRNAeAla(AAA) gener og sekvensere begge trådene av nevnte innskudd.

11. DNA sekvens ifølge krav 6,karakterisertved at det er betegnet tRNA<iAla>(AAA) genet med en nukleinsyresekvens bestående av:

12. Fremgangsmåte for fremstilling av tRNA^<Ala>(AAA) genet ifølge krav 11,karakterisert vedå kopiere tRNAf<Met>(CAT) genet fra E. coli genomet, substituere A med basene C og T i antikodonet til nevnte gen som danner et AAA antikodon, substiutere G med basene 1C og 3C og T med basene 70G og 72A av nevnte substituerte gen, innsette A mellom basene 17C og 17aT til nevnte substituerte gen, butt-gjøre endene til nevnte substiuerte gen, spalte nevnte butt-endede gen med Hindlll og BamHI, ligere nevnte spaltede gen inn i et pUC18 plasmid, transformere E. coli med nevnte ligerte plasmid, screene nevnte transformerte E. coli inneholdende plasmider med et innskudd for tilstedeværelse av hel tRNA^<A>^-<a>(AAA) gener og sekvensere begge tråder av nevnte innskudd.