KR20090077243A - 시험관 전사법으로 준비된 ｔＲＮＡ로부터 제조된 표지자를이용한 시험관 번역법으로 생산되는 단백질의 선택적표지방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시험관 번역법으로 생산되는 단백질을 방사성동위원소를 사용하지 않고 표지하는 비방사성 단백질 표지 방법에 있어서, 시험관 번역법에서 생산되는 단백질을 형광물질이나 바이오틴으로 선택적으로 표지하는데 이용될 수 있는 표지자의 제조 방법, 이에 의해 제조된 표지자를 이용한 단백질 표지 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은, 시험관 번역법의 반응액 안에 이미 존재하는 단백질은 표지하지 않으면서 실험자가 반응액에 첨가해 준 유전자로부터 생산되는 목적단백질만을 선택적으로 표지하는데 이용될 수 있는 단백질 표지자를 “전체 tRNA 혼합체” 대신 시험관 전사법을 통하여 제조된 한 종류의 tRNA만을 사용하여 제조하는 방법을 제공하고, 또한 상기 공정에 의해 제조된 단백질 표지자를 이용하여 시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질을 표지하는 방법을 제공한다. 본 발명을 따르면, “전체 tRNA 혼합체”를 tRNA 재료로 사용하여 단백질 표지자를 제조하고 이를 단백질 표지에 이용하던 종래방법에 비해 단백질 표지자의 제조도 훨씬 용이해지고 또한 이를 이용하여 표지된 단백질이 훨씬 개선된 시그널을 갖는다.

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Description

시험관 전사법으로 준비된 ｔＲＮＡ로부터 제조된 표지자를 이용한 시험관 번역법으로 생산되는 단백질의 선택적 표지방법{Selective Labeling of Cell-free Synthesized Proteins Using the Labeling Agent Derived from In Vitro Transcribed tRNA}

본 발명은 시험관 번역법(in vitro translation; cell-free protein synthesis)에서 생산되는 단백질을 선택적으로 표지(labeling)하는 데 사용될 수 있는 소재(material; agent)의 제조, 및 이를 이용한 단백질 표지 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 시험관 번역법으로 생산되는 단백질을 방사성동위원소(radioisotope)에 기반한 방법으로 표지할 때 수반되던 위험성을 회피하기 위해 개발된 비방사성 표지법(non-radioactive labeling)에 있어, tRNA 재료로서 “전체 tRNA 혼합체(total tRNA mixture)”를 사용하던 종래 방법 대신에 “시험관 전사법(in vitro transcription)으로 제조된 한 종류의 tRNA”만을 사용하여 단백질 표지자(labeling material; labeling agent)를 제조하는 방법, 및 이렇게 제조된 단백질 표지자를 이용하여 시험관 번역법을 통해 생산되는 단백질을 선택적으로 표지하는 방법에 관한 것이다.

시험관 번역법은 세포 배양(cell culture)을 통하지 않고 단백질(protein)을 신속하게 반응용기(reactor)에서 생산할 수 있는 방법이다. 초기의 시험관 번역법에서는 낮은 단백질 생산성(productivity)이 심각한 단점이었으나, 여러 연구 그룹들에 의한 반응 조건의 최적화(optimization)와 신규 반응기의 설계 등으로 이제는 매우 효율적인 단백질 생산 방법이 되었다(Eur. J. Biochem. 239: 881-886, 1996; FEBS Lett. 442: 15-19, 1999).

시험관 번역법의 활용성(availability)을 높이기 위해서는 상기의 단백질의 생산성 개선 외에도 생성 단백질의 간편한 확인 방법(detection method)의 개발 또한 필요하다. 시험관 번역법에서 생산되는 단백질을 쉽게 확인하려면, 생산하고자 하는 단백질의 정보를 가지고 있는 DNA 주형(template)으로부터 번역(translation)되어 새롭게 생산되는 목적단백질(target protein)만을 선택적으로 표지할 수 있는 방법이 필요하다. 왜냐하면, 시험관 번역법의 반응액(reaction mixture)에는 단백질 생산 자체에 필요한 효소를 포함한 매우 많은 수의 단백질들이 이미 존재하고 있기 때문이다. 생성되는 단백질의 선택적 표지법으로 가장 널리 활용된 것이 생성되는 단백질만을 방사성동위원소로 표지하는 방법이었다. 이 방법에서는 방사성동위원소로 표지된 아미노산(amino acid)을 단백질 생산 반응액에 첨가하여, 이 첨가된 아미노산이 생성되는 단백질에 삽입(introduction; insertion)되게 하여 결국 생성된 단백질이 방사성동위원소로 표지되게 한다. 이 때 단백질 생산 반응액에 이미 존재하던 단백질은 새로 만들어지는 단백질이 아니므로 방사성동위원소로 표지 된 아미노산이 삽입될 수 없다. 이 방사성동위원소를 이용한 방법은 생성되는 단백질을 간단하게 표지하고 확인할 수 있지만, 실험자가 방사능에 노출될 수 있는 위험성을 가지고 있다. 이에 더하여 방사성 물질의 취급 및 파생되는 방사성 폐기물의 처리 등에서 엄격한 관리가 요구되는 불편함이 있다.

방사성동위원소의 사용에 따른 이러한 단점과 불편함을 해결하면서 간단한 방식으로 신속하게 생산 단백질을 표지 및 확인하기 위해 방사성동위원소의 사용 대신에 형광물질(fluorophore; fluorescent dye)이나 바이오틴(biotin) 등을 이용하는 비방사성 표지법이 개발되었다. 시험관 번역법으로 생산되는 단백질의 선택적 표지를 위해 가장 널리 활용되고 있는 비방사성 표지법은 존슨 등에 의해서 개발된 방법(Biochemistry 15: 569-575, 1976)이다. 존슨 등에 의해 개발된 종래의 방법에서는 단백질 표지에 이용할 아미노산 하나를 미리 정하고 그 정해진 아미노산에 이것과 결합할 수 있도록 짝이 맞는 tRNA를 아미노아실-tRNA 합성 효소(aminoacyl-tRNA synthetases)를 이용하여 결합시킨다. 이러한 아미노산과 tRNA의 결합 반응을 아미노아실화 반응(aminoacylation)이라 한다. 정해진 아미노산을 tRNA에 결합시킨 후, tRNA에 결합된 아미노산의 곁사슬(side chain)이나 N-말단(N-terminus)에 존재하는 작용기(functional group)에 단백질 표지에 이용할 형광물질이나 바이오틴 등의 물질을 결합시켜 최종 단백질 표지에 사용할 물질을 제조한다. 결과적으로 이러한 과정을 거쳐 만들어진 단백질 표지용 물질은 tRNA에 결합되어 있는 아미노산의 곁사슬이나 N-말단을 통하여 형광물질이나 바이오틴이 결합되어 있는 형태이고 그 것의 개략적 모식도가 도 1에 제시되어 있다. 시험관 번역법에서 생산되는 단백질을 표지하기 위해 사용하는, tRNA에 결합된 아미노산을 통하여 형광물질이나 바이오틴을 결합시킨 복합체를 본 명세서에서는 “표지용 tRNA 복합체”로 지칭한다.

아미노산을 tRNA에 결합시킬 때 사용하는 아미노아실-tRNA 합성 효소는 높은 기질 특이성(이 효소들은 주로 천연에 존재하는 20 가지의 아미노산만을 기질로 받아들이고 다른 비천연의 아미노산은 극히 일부를 제외하고는 받아들이지 않는다)을 가지고 있다. 이런 이유로, 미리 형광물질이나 바이오틴을 아미노산에 부가한 후 이를 tRNA에 결합시키려고 하면 상기의 기질 특이성 때문에 결합이 달성되지 않는다. 따라서 아미노산을 tRNA에 먼저 결합시킨 후 나중에 형광물질이나 바이오틴을 결합시켜야만 한다.

시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질을 상기처럼 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 이용하여 표지하려면, “표지용 tRNA 복합체”를 시험관 번역법에 의한 단백질 생산 반응액에 첨가해 주면 된다. 그러면 유전자로부터 단백질이 생성될 때 이 생성되는 폴리펩타이드(polypeptide)에 형광물질이나 바이오틴으로 표지된 아미노산이 삽입되게 되고 결국 생성된 단백질은 형광물질이나 바이오틴으로 표지되게 된다.

이 존슨 등에 의해 개발된 종래방법에서는 시험관 번역법으로 생산되는 단백질의 선택적 표지를 위한 “표지용 tRNA 복합체”의 제조에 있어서 tRNA 재료로 “전체 tRNA 혼합체”를 사용하였다. “전체 tRNA 혼합체”는 여러 종류의 tRNA들이 섞여있는 tRNA의 혼합 형태를 지칭한다. 이런 “전체 tRNA 혼합체”를 tRNA 재료로 사용하면 다음과 같은 몇 가지 문제가 있었다. “전체 tRNA 혼합체”를 tRNA 재료로 사용할 경우, 모든 종류의 tRNA가 반응에 제공되지만 실제로 “표지용 tRNA 복합체” 제조에 사용되어지는 tRNA는 “전체 tRNA 혼합체”를 구성하는 여러 tRNA 중 단 한 종류뿐이다. 즉, “표지용 tRNA 복합체”를 제조하려는 자가 선정한 아미노산에만 상응하는 tRNA만이 사용된다. 그 밖의 tRNA는 전혀 이용되지 않는다. 사용되는 tRNA 보다 사용되지 않은 tRNA가 훨씬 많게 된다. 이들 사용되어지지 않은 tRNA들은 “표지용 tRNA 복합체” 제조동안 계속 따라 다니고 최종 “표지용 tRNA 복합체”에도 포함되게 된다. 이들 선정된 아미노산과 짝이 맞지 않는 tRNA들은 선정된 아미노산과의 결합이 형성될 수 없어 tRNA와 아미노산의 결합반응 후 연달아 이어지는 아미노산의 곁사슬이나 N-말단을 통한 형광물질이나 바이오틴과의 결합도 달성되지 않는다. 따라서 이들은 단백질 표지에 이용될 수 없다.

이렇게 어쩔 수 없이 포함되게 되는 짝이 맞지 않는 tRNA들을 불순물로 가진 “표지용 tRNA 복합체”를 시험관 번역법에 의해 생산되는 단백질 표지에 그대로 사용하면 결과적으로 단백질 표지의 효율성이 떨어진다. 또 최종 표지된 단백질의 시그널도 좋지 않게 만든다. 즉, 표지 단백질의 신호(signal-to-noise ratio)가 낮아지게 된다. 이는 형광물질이나 바이오틴이 이들 짝이 맞지 않는 tRNA의 기본 골격(backbone)에 비특이적으로 결합하여 최종 표지 단백질의 분석 때에 이로부터 백그라운드(background) 형광이 발생되기 때문이다.

또한 이들 tRNA 자체에 형광물질이나 바이오틴이 직접 결합된 것들은 단백질 표지에서의 유효성분인 “표지용 tRNA 복합체”의 용해도를 침해하여 최종적으로 “표지용 tRNA 복합체”를 고농도로 만들 수 없게 한다. 따라서 충분한 표지 단백질의 시그널을 얻기 위해서는 다량의 “표지용 tRNA 복합체”를 사용해야 되는데, 이럴 경우 다른 불필요한 tRNA 성분들의 첨가량도 동시에 늘어나게 되어 결과적으로 더욱 심한 백그라운드 발생을 초래하게 된다.

이런 이유로 종래의 방법에서는 “표지용 tRNA 복합체”를 제조한 후 이로부터 “표지용 tRNA 복합체”만을 순수하게 분리하여 사용하였는데, 이를 위해서 주로 크로마토그래피가 이용되었다. 그런데, 이 “표지용 tRNA 복합체”의 순수 분리는 복잡하고 또한 매우 많은 시간이 소요된다.

본 발명자들은 이러한 분리 정제가 필요 없는 “표지용 tRNA 복합체”의 새로운 제조방법이 개발된다면 매우 유용하게 활용되어질 수 있겠다고 확신하였고, 이는 “표지용 tRNA 복합체” 제조에서 tRNA 재료로“전체 tRNA 혼합체”대신 처음부터 정해진 아미노산에 상응하는 한 종류의 tRNA만을 사용하면 실현 가능할 것으로 확신하였다.

이러한 한 종류의 tRNA만을 “표지용 tRNA 복합체” 제조를 위한 tRNA 재료로 사용하기 위해서는 사용할 한 종류의 특정 tRNA를 아미노아실화 반응 전에 “전체 tRNA 혼합체”로부터 분리해서 사용할 수도 있다. 그렇지만 이것은 이론적일 뿐 실제에서는 tRNA 끼리의 비슷한 물리적 성질로 인하여 한 가지 tRNA만을 여러 tRNA가 섞여있는 혼합물에서부터 분리하여 사용하는 것은 어렵고 현실적이지 못하다. 이는 “표지용 tRNA 복합체”를 제조한 다음에, 최종적으로 얻어진 제조액으로부터 실제 단백질 표지에 유효한 “표지용 tRNA 복합체”만을 순수 분리하여 사용하는 방법에 비하여 오히려 더 어렵고 비효율적이라고도 할 수 있다.

이에 비해 좀 더 합리적인 방법으로 생각할 수 있는 것은, 특정 tRNA의 유전정보를 가진 유전자를 세포(cell)에 도입시킨 다음, 이 tRNA 유전자가 도입된 세포를 배양하여 특정 tRNA를 세포 내에 과발현시킨 후 그 세포를 회수하여 파쇄한 다음 얻어진 세포파쇄물(cell lysate)로부터 특정 tRNA를 분리하여 이용하는 방법일 것이다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 334-338, 1987). 그러나 이 방법에서도 세포 내부에 일정 수준으로 항상 존재하는 여러 가지의 tRNA들로 인하여 여러 종류의 tRNA의 오염이 일정한 정도 따를 수밖에 없다. 비록 이 경우 특정 tRNA의 비율이 상기의 “전체 tRNA 혼합체”를 사용하는 경우에 비하여 상대적으로 높을 수는 있지만 종래 방법에서 “전체 tRNA 혼합체”를 사용할 때와 크게 다르지는 않으며 여전히 분리 정제 과정이 필요하게 된다.

본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.

이에, 본 발명자들은 “표지용 tRNA 복합체” 제조에 있어서 tRNA 재료로 “전체 tRNA 혼합체”를 사용하는 대신에, 시험관 전사법으로 제조된 한 종류의 tRNA를 사용함으로써 종래방법에 있어 반드시 필요하던 “표지용 tRNA 복합체”의 순수 분리 단계의 필요성을 제거하였다. 또한 복잡한 크로마토그래피를 통한 분리 정제 없이 얻어진 “표지용 tRNA 복합체”를 그대로 사용하더라도 종래 방법으로 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 사용할 때에 비하여 훨씬 개선된 시그널을 가진 표지 단백질을 얻을 수 있었다.

따라서 본 발명의 목적은 제조가 용이하고 이를 이용한 단백질 표지에서 훨씬 개선된 품질의 시그널을 제공해 줄 수 있는 “표지용 tRNA 복합체”의 새로운 제조 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따라 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 이용하여 시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질을 선택적으로 표지하는 방법을 제공하는 것이다.

즉, 본 발명은 시험관 번역법으로 생산되는 단백질을 비방사성 표지 방법으 로 표지하고자 할 때 사용하는 “표지용 tRNA 복합체”를 제조함에 있어서, 종래의 방법에서 “전체 tRNA 혼합체”를 tRNA 재료로 사용함에 따라 발생하는 분리 정제의 필요성을 제거하고 여기에 더하여 종래 방법으로 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 사용할 때 보다 개선된 시그널을 제공해 줄 수 있는 “표지용 tRNA 복합체”의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 이를 위해 노력한 결과, “표지용 tRNA 복합체”의 제조에 있어, 단백질 표지에 이용하고자 하는 아미노산(즉, 선정된 아미노산을 지칭)의 DNA 상의 코돈(codon)에 상응하는 한 가지의 tRNA(본 명세서에서는 이를 “특정 tRNA"로 지칭함)만을 시험관 전사법으로 제조하여 이를 tRNA 재료로 사용하여 “표지용 tRNA 복합체”를 제조하는 방법을 고안하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명은, 번거롭고 많은 시간을 요하는 “표지용 tRNA 복합체”의 순수 분리 과정 없이도 종래 방법에 의해 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 이용하는 경우에 비교하여 더 개선된 시그널을 제공해 줄 수 있는 “표지용 tRNA 복합체”를 제조할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명은

1) 단백질 표지에 이용하고자 하는 아미노산의 DNA 상의 코돈에 상응하는 한 가지 tRNA(특정 tRNA)만을 시험관 전사법을 통해 제조하는 단계;

2) 단계 1에서 제조된 특정 tRNA에 상응하는 특정 아미노산을 아미노아실화 반응시켜 단계 1의 특정 tRNA에 결합시키는 단계; 및

3) 단계 2에서 제조된 특정 tRNA에 결합된 특정 아미노산의 곁사슬이나 N-말단에 존재하는 알파-아미노 그룹에 형광물질이나 바이오틴을 결합시켜 “표지용 tRNA 복합체”를 제조하는 단계;

를 포함하는, 시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질의 선택적 표지에 사용될 수 있는 “표지용 tRNA 복합체”의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 이용하여 시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질을 표지 및 확인하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 포함하는 단백질 발현 확인용 시약을 제공한다.

단백질의 아미노산 서열에 대한 유전 정보는 상기 DNA의 코돈이라는 것에 들어 있다. DNA 코돈은 3 개의 염기쌍으로 이루어져 있는데, A(adenine), T(thymine), G(guanine), C(cytosine)의 네 가지 염기(base) 중 하나를 가진 뉴클레오티드(nucleotide)의 조합(combination)으로 구성되어 있다. 예컨대, GGG는 글라이신에 해당하는 코돈이고, GCC는 알라닌에 해당하는 코돈이고, ATG는 메티오닌에 해당하는 코돈이다. 또한, 이 코돈에는 그에 상응하는 특정 tRNA가 존재한다. 모든 천연의 아미노산에 상응하는 DNA 코돈은 정지코돈(stop codon) 3 개를 제외하 고 총 61 개가 존재하고 이에 짝이 되는 tRNA도 그 수만큼 존재한다. 물론, 엄격하게 말하면 tRNA는 DNA로부터 전사된 mRNA에 상응한다고 해야 하지만 본 명세서에서는 이를 반영하지 않아도 당업자의 이해에는 문제가 없을 것이다.

시험관 전사법을 이용하면 특정 tRNA만을 고순도 및 고수율로 얻을 수 있다. 비록, 존슨 등의 방법과 비슷하다고 생각되는(물론 완전히 다른 방법임) 난센스 억제법(nonsense suppression)이라는 비천연성 아미노산을 단백질에 도입하는 방법에서는 억제-tRNA(suppressor-tRNA)라는 tRNA를 시험관 전사법으로 제조한 다음 이용하는 것이 일반적이지만(Chem. Biol. 3: 685-691, 1997; Nucleic Acids Res. 18: 83-88, 1990), 통상 시험관 번역법에서 생산되는 단백질의 표지방법으로 이용되고 있는 “표지용 tRNA 복합체”의 제조방법인 존슨 등에 의해 개발된 방법에서는 시험관 전사법으로 제조된 tRNA가 “표지용 tRNA 복합체” 제조를 위한 tRNA 재료로 이용된 예가 지금까지는 없었다. 비록 형광물질이 표지된 비천연성 아미노산을 포함한 많은 비천연성 아미노산이 난센스 억제법으로 단백질에 성공적으로 도입되었지만(Science 244: 182-188, 1989; Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 809-815, 2002), 이 방법은 발현할 단백질의 유전정보를 가지고 있는 DNA나 mRNA의 주형에 난센스 코돈(nonsense codon)을 미리 도입시켜야 하고 또한 이에 상보적인(complementary) 억제-tRNA를 필요로 하기 때문에, 시험관 번역법에서 생산된 단백질의 일반적인 표지방법(general labeling method)으로 이용하기에는 부적당하다. 즉, 아주 특수한 경우에 한하여 특별하게 준비된 재료를 이용하여 실시할 수 있는 방법이 난센스 억제법이라 할 수 있다.

실험자는 시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질을 선택적으로 표지하기 위해 상기 방법에 따라 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 시험관 번역법에 따른 단백질 생산 반응액에 첨가만 해 주면 된다. 즉, “표지용 tRNA 복합체”를 단백질 생산 반응액에 첨가해 주면 특정 유전자로부터 단백질이 생성될 때 형광물질이나 바이오틴이 결합된 아미노산이 이 생성되는 단백질에 삽입되게 되어 결국 생성된 단백질만을 선택적으로 형광물질이나 바이오틴으로 표지될 수 있게 된다. 이렇게 표지된 단백질을 포함한 단백질 생산 반응액은 그 생산 반응액 자체를 일반적인 방법에 따라 전기영동한 다음 그 전기영동하여 확보된 젤(gel)을 분석함으로써 생산 및 표지된 단백질을 확인할 수 있다. 이러한 젤의 분석에서는, 만약 단백질이 형광물질로 표지되었다면 그 젤을 형광 분석 장치(자외선 조사장치와 영상 분석장치가 있는 장치)를 이용하여 분석할 수 있고 만약 생산된 단백질이 바이오틴으로 표지되어 있다면 아비딘(avidin)-바이오틴 효소 복합체 검출법을 통하여 확인할 수 있다. 이 검출법을 본 명세서에서는 정확한 표현은 아니지만 편의상 웨스턴 블랏팅(western blotting)으로 지칭한다. 이들 분석 방법은 당분야에서는 널리 행하여지는 방법이기 때문에 당업자에게는 매우 일반적인 것이라 할 수 있으므로 이에 대한 자세한 설명은 생략하겠다.

시험관 전사로 제조된 한 종류의 특정 tRNA를 이용한 “표지용 tRNA 복합체”의 제조를 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다. 먼저 특정 tRNA의 시험관 전사에 서 주형으로 사용할 특정 tRNA에 대한 유전정보를 가진 플라스미드를 제작하고, 이 제작된 플라스미드를 충분한 양으로 준비한 다음 이를 제한효소 처리로 선형화한다. 이렇게 선형화된 플라스미드를 주형으로 이용하여 시험관 전사를 실시하여 특정 tRNA만을 고순도 및 고수율로 얻는다. 시험관 전사로 tRNA를 준비한 다음, 이 특정 tRNA에 짝이 맞는 특정 아미노산을 tRNA에 결합시킨다. 이렇게 아미노산이 tRNA에 결합된 복합체를 준비한 다음, 이 복합체의 아미노산의 곁사슬에 존재하는 작용기나 N-말단에 존재하는 알파-아미노 그룹을 이용하여 형광물질이나 바이오틴을 최종적으로 결합시킴으로써 “표지용 tRNA 복합체”를 제조할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 이용 가능한 아미노산의 한 예로 메티오닌을 선정하여 적용하였고 형광물질이나 바이오틴의 결합에 이용한 작용기로는 메티오닌의 아미노 그룹을 이용하였다. 특히 메티오닌 중에서 단백질의 N-말단에 존재하는 개시 메티오닌(initiator methionine)을 이용하였다. 그러나, 본 발명의 적용 가능 아미노산을 메티오닌에만 국한시킬 필요는 없으며, 본 발명은 천연에서 발견되는 20 가지 아미노산 어느 것이라도 적용 가능하다. 각 아미노산이 가지고 있는 작용기가 각기 다르기 때문에 이를 고려하여 선택하여 적용할 수 있다. 아미노산의 구조를 보여주는 그림이 도 2에 제시되어 있다. 도 2에서 “표지용 tRNA 복합체” 제조에 있어 형광물질이나 바이오틴의 결합에 이용될 수 있는 작용기 부분이 아미노산의 곁사슬 부분과 N-말단에 존재하는 알파-아미노 그룹이다. N-말단에 존재하는 알파-아미노 그룹이 활용될 수 있는 경우는 개시 메티오닌의 경우뿐이다. 통상 천연에 존재하는 아미노산은 루이신, 글라이신 등 20 가지이다. 본 발명을 적용할 때는 가장 먼저 이용할 아미노산을 정해야 된다. 그 다음 그 정해진 아미노산에 대한 몇 가지 상응하는 DNA 상의 코돈 중 본 발명을 적용할 하나의 코돈을 정해야 한다. 보통은 한 가지 아미노산에 대해 몇 가지의 코돈이 존재한다. 예를 들어, 히스티딘은 그것의 해당 코돈으로 CAT, CAC가 있고, 프롤린은 CCT, CCC, CCA, CCG가 있다. 일단 이용할 DNA 상의 코돈까지 정해지면 이용할 특정 tRNA도 정하여 지게 된다. 즉, 이용할 DNA 상의 코돈에 따라 상응하는 tRNA 짝만 바꾸어 본 발명을 적용하면 된다. 각 코돈에 상응하는 tRNA의 유전정보는 이미 다 밝혀져 있고, 또한 쉽게 구할 수 있으므로 특별히 제시하지는 않겠다. 즉, 어떠한 코돈에 상응하는 tRNA의 정보도 이미 공지되어 있으며 당업자라면 어렵지 않게 파악 및 확보할 수 있다.

선정된 특정 tRNA를 천연에 존재하는 tRNA와 똑같은 구조로 시험관 전사법을 통해 준비하기 위해서는 시험관 전사법에서 제조되는 특정 tRNA가 자연에 존재하는 tRNA의 구성염기 외에 추가의 염기 부가 없이 정확히 설계된 대로 전사가 되어야 한다. 이를 위해서는 시험관 전사가 tRNA의 전체 구성염기에 해당하는 DNA 부분에서만 정확히 일어나야 한다. 이는 시험관 전사의 주형이 되는 플라스미드를 환형(circular)으로 그대로 사용하지 않고 특정 tRNA의 전체 염기에 상응하는 부분이 끝나는 지점에서 절단시켜 사용함으로써 달성될 수 있다. 즉, 물리적으로 그 부분에서 전사를 멈추게 하는 것이다. 플라스미드에서 tRNA의 전체 염기에 해당하는 부분이 끝나는 자리 다음에서 플라스미드를 자르기 위해서는 이 부분에 플라스미드의 선형화에 사용할 제한효소의 인식서열이 미리 삽입되어 있어야 한다. 본 발명의 실시예에서는, 이들 플라스미드의 선형화를 위한 제한효소로 Fok I을 사용하였는데, 이외에도 다양한 효소들이 본 발명에 적용될 수 있음은 물론이다. 단, 한 가지 고려해야 할 점은 사용할 제한효소가 평활말단(blunt end)으로 플라스미드를 절단할 수 있어야 된다는 것이다. 즉, 돌출(overhang)이 형성되지 않게 플라스미드를 절단할 수 있는 제한효소의 이용이 바람직하다. 이렇게 평활말단으로 플라스미드를 자를 수 있는 제한효소로는 Sma I, Hinc II, EcoR V, EcoICR I, Alu I 등을 포함하여 매우 다양하게 존재한다. 참고로, 만약 다른 제한효소를 이용하고자 하는 경우에는 플라스미드에 해당하는 제한효소에 맞는 제한효소 인식서열이 삽입되어 있어야 한다. 이러한 제한효소의 선별이 불편하다면 단순히 본 발명의 실시예를 따라 Fok I을 사용해도 전혀 문제가 없다.

또한, 본 발명에서는 아미노산에 결합시키는 형광물질의 예로 5-카르복시플루오레세인 [5-carboxyfluorescein; 5-FAM]을 포함하여 3 종류가 제시되어 있는데, Dansyl, Fluorescein, Texas Red, Cascade Blue, Cascade Yellow, Erythrosin, Coumarin, NBD, Pacific Blue, PyMPO, Pyrene, Phycoerythrin, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, NBD-Phallacidin(이상, 상표명) 등 다양한 형광물질을 사용해도 무방하다.

형광물질이나 바이오틴을 tRNA에 결합되어 있는 아미노산에 결합시키기 위해 이용 가능한 화학반응으로는 다양한 화학반응이 가능하다. 예로, 축합반 응(condensation), 아실화 반응(acylation), 에스테르화 반응(esterification), 리덕티브 알킬레이션(reductive alkylation) 등이 있다. 본 발명에서는 축합반응을 예시적으로 이용하였으나 이에 국한되지 않음은 당연하다. 화학반응의 선택 시에는 선정한 아미노산의 작용기를 고려하여 실현 가능한 화학반응을 선정해야 한다. 이는 당분야에 익숙한 당업자는 쉽게 실시 가능하므로 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.

선정된 화학반응을 통하여 tRNA에 결합되어 있는 아미노산에 형광물질이나 바이오틴을 부가시키기 위해서는 형광물질이나 바이오틴이 선택되어진 화학반응의 구현에 적합한 유도체 형태로 준비되어야 한다. 통상의 형광물질 자체나 바이오틴 자체는 화학반응에 이용할 만한 충분한 반응성을 가지고 있지 않기 때문에 이러한 유도체 형태의 준비가 필요한 것이다. 이러한 유도체의 예로 석씨니미딜 에스테르(succinimidyl esters), 이소티오시아네이트(isothiocyanates), 카르복실산(carboxylic acids), 술포닐 클로라이드(sulfonyl chlorides) 등이 있다. 이러한 유도체는 실험자가 직접 유기합성법으로 제조하여 사용해도 되고 유기합성에 익숙하지 않거나 좀더 쉽게 유도체를 확보하길 원한다면 상용화되어 있는 것을 구입하여 사용해도 된다. 이미 많은 종류들이 다양한 유도체 형태로 상용화되어 있다. 본 발명에서는 형광물질이나 바이오틴의 석씨니미딜 에스테르 형태의 유도체를 이용하였으나 본 발명의 범위가 석씨니미딜 에스테르 형태의 유도체에만 한정되지 않음은 당연하다.

본 발명의 방법에 의해 표지될 수 있는 단백질들은 그 종류에 있어 특별한 제한은 따르지 않으며 시험관 번역법을 통하여 생산될 수 있는 단백질이라면 종류에 상관없이 본 발명을 적용할 수 있다. 아직 그 단백질의 생물학적 기능이 규명되어 있지 않거나 이미 공지되어 있거나 상관없이 본 발명을 적용할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 시험관 번역법으로 생산되는 단백질의 비방사성 표지에 사용되는 “표지용 tRNA 복합체”를 복잡한 분리 정제 없이도 제조할 수 있다. 즉, 시험관 전사법으로 제조된 tRNA를 “전체 tRNA 혼합체” 대신 tRNA 재료로 사용함으로써 종래 방법에 비하여 훨씬 용이하게 분리 정제 없이 고순도의 “표지용 tRNA 복합체”를 제조할 수 있게 된다. 또한 본 발명에 따라 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 사용하여 시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질을 표지하면 최종 생산 단백질의 확인에서 훨씬 개선된 표지된 단백질의 시그널을 제공해 준다. 즉, 종래 방법에 비하여 백그라운드 발생을 획기적으로 감소시켜 개선된 시그널을 제공해 준다. 또한 좀더 안전하고 편리하면서도 짧은 시간 내에 여러 유전자로부터 목적단백질의 생산 여부 확인이 가능하고, 특히 방대한 양의 유전자를 단시간 내에 발현 및 확인을 하는데 이용될 수 있어 초고속 유용 유전자 탐색에도 활용 가능하다. 그 밖에, 유효 약물 탐색이나 신약개발을 위한 연구 등에서 다량의 유전자의 기능 분석 또는 단백질 시료의 준비 및 확인에 유용하게 활용될 수 있다.

따라서 본 발명은 유전자의 발현 연구, 단백질의 확인, 단백질의 기능 및 구조 관련 연구 등을 포함하여 최근에 많은 주목을 받고 있는 다양한 프로테오믹스(proteomics) 연구에 활용될 수 있다. 또한 본 발명은 의약용, 산업용 및 연구용 단백질의 생산을 위한 기초실험에서 단백질 생산의 확인을 위해 사용될 수 있다. 이에 더하여 본 발명은 최근 새롭게 밝혀진 많은 유전자의 기능 규명을 위한 연구에서 목적단백질의 발현 확인에서 효과적으로 활용될 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 더욱 구체적인 내용으로서, 시험관 전사에서 주형으로 사용될 특정 tRNA의 유전정보를 가진 플라스미드의 제조는 실시예 1에 예시적으로 설명되어 있고, 평활말단으로 자르는 제한효소를 이용한 실시예 1에서 제작된 플라스미드의 선형화는 실시예 2에 예시적으로 설명되어 있고, 실시예 2에서 준비된 선형화된 플라스미드를 이용한 시험관 전사는 실시예 3에 예시적으로 설명되어 있고, 시험관 번역법에서의 단백질 생산을 위해 필수적인 세포 내 성분들을 포함한 세포추출물의 제조는 실시예 4에 예시적으로 설명되어 있고, 실시예 4에서 제조된 세포추출물로부터 실시예 3에서 준비된 tRNA에 아미노산을 결합시킬 때 사용하는 효소(즉, 아미노아실-tRNA 합성 효소)의 분리는 실시예 5에 예시적으로 설명되어 있고, 실시예 5 에서 분리한 아미노아실-tRNA 합성 효소를 이용한 실시예 3에서 준비된 tRNA와 아미노산의 결합반응은 실시예 6에 예시적으로 설명되어 있고, 실시예 6에서 준비된 아미노산이 결합된 tRNA와 형광물질의 결합반응은 실시예 7에 예시적으로 설명되어 있고, 실시예 6에서 준비된 아미노산이 결합된 tRNA와 바이오틴의 결합반응은 실시예 8에 예시적으로 설명되어 있고, 형광물질까지 결합된 “표지용 tRNA 복합체”를 이용한 시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질의 표지 및 표지된 단백질의 확인은 실시예 9에 예시적으로 설명되어 있고, 형광물질 대신 바이오틴까지 결합된 “표지용 tRNA 복합체”를 이용한 시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질의 표지 및 표지된 단백질의 확인은 실시예 10에 예시적으로 설명되어 있다. 실시예 9에서의 형광물질이 결합된 “표지용 tRNA 복합체”의 유효성 조사에서는 모델 단백질로 클로람페니콜 아세틸 전이효소(chloramphenicol acetyltransferase; CAT)가 이용되었고, 이에 더하여 여러 단백질들에의 응용 가능성의 조사를 위하여 에리쓰로포이에틴(erythropoietin; EPO) 및 디히드로포레이트 환원효소(dihydrofolate reductase; DHFR)를 추가로 선정하여 본 발명을 적용해 보았다. 실시예 10에서는 바이오틴이 결합된 “표지용 tRNA 복합체”의 유효성을 EPO를 이용하여 확인해 보았다.

이하에서는, 실시예에 의거하여, 시험관 번역법에서 생산 및 표지되는 단백질의 구체적인 예로서 CAT을 비롯한 몇 가지의 단백질을 본 발명에서 개시된 방법을 이용하여 생산 및 표지하는 것에 대하여 상세히 설명한다. 하지만, 이들 단백질은 단지 적용 가능한 단백질의 실례로서 제시된 것에 불과하며, 본 발명이 이들 단백질 종류에만 한정되는 것은 아니다. 원칙적으로 시험관 번역법으로 생산될 수 있는 모든 단백질이 본 발명에 적용될 수 있다. 그 단백질의 특성이 밝혀졌건 밝혀지지 않았건 본 발명의 적용에는 어떠한 제한도 따르지 않는다. 또한, 실시예에서는 석씨니미딜 에스테르 유도체의 이용에 대해서만 제시하고 있지만, 이는 여러 종류의 이용 가능한 다양한 유도체를 대표하는 것일 뿐 본 발명이 그것에만 한정되지 않음은 당연하다. 또한, 실시예에서는 이용하는 아미노산으로 메티오닌을 선정했는데, 이는 여러 가지 아미노산 중 적용예로 선정된 것으로 이에만 국한되지 않음은 당연하다.

실시예 1: 특정 tRNA 에 대한 유전정보를 가진 플라스미드의 제조

특정 tRNA에 대한 유전정보를 가진 플라스미드를 제조하기 위하여 본 실시예에서는 특정 tRNA의 유전자 서열, 클로닝 및 플라스미드의 선형화에 필요한 제한효소의 인식 서열, 및 시험관 전사에 필요한 프로모터 서열을 모두 가진 DNA 조각을 올리고뉴클레오타이드 결합법(oligonucleotide annealing)으로 먼저 준비하였다.

이렇게 DNA 조각을 제작하기 위해서는 먼저 제작할 DNA 조각의 전체 염기서열을 설계(design)해야 되는데, 이 설계를 위해 선택된 서열로는 다음과 같은 것들이 있다. 먼저 본 실시예에서는 이용할 아미노산으로 개시 메티오닌을 선택했으므로 이 개시 메티오닌에 상응하는 tRNA의 염기서열을 채택했고, 플라스미드의 선형화에 제한효소 Fok I을 이용하고자 하므로 Fok I의 인식서열을 채택했고, 플라스미드 제작 시 클로닝에 사용할 제한효소로 EcoR I과 Pst I을 이용하고자 이들의 인식 서열들을 채택하였고, 시험관 전사를 위한 프로모터로 T7 프로모터를 이용하고자 T7 프로모터 서열을 채택하여 DNA 조각의 전체 유전자 서열을 디자인하였다. 최종 설계된 DNA 조각은 다음의 올리고뉴클레오타이드의 유전자 서열로부터 알 수 있다.

참고로, 시험관 전사에 이용하는 프로모터의 채택에 있어 어떠한 제한도 없으며, SP6 프로모터 등도 채택 가능하다. 따라서 실험자가 원하는 프로모터를 채택하여 적용하면 된다. DNA 조각 설계에 필요한 tRNA 서열, 제한효소의 인식서열, 프로모터 서열은 실험자가 다양하게 채택할 수 있으며, 이들의 서열 정보는 이미 공지되어 있고 이러한 공지서열을 이용한 DNA 조각의 염기서열 설계는 당업자에게는 일반적인 것이므로 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.

설계된 DNA 조각의 제작을 위하여 두 가닥의 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 준비하였다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 전문적으로 제조해 주는 회사에 의뢰하면 쉽게 제조할 수 있다.

정방향 올리고뉴클레오타이드(sense oligonucleotide)는 5'-AATTCTAATACGACTCACTATACGCGGGGTGGAGCAGCCTGGTAGCTCGTCGGGCTCATAACCCGAAGGTCGTCGGTTCAAATCCGGCCCCCGCAACCACAGGATCCGCATCCTTCTGCA-3'(서열번호 1)이었고, 역방향 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)는 5'-GAAGGATGCGGATCCTGTGGTTGCGGGGGCCGGATTTGAACCGACGACCTTCGGGTTATGAGCCCGACGAGCTACCAGGCTGCTCCACCCCGCGTATAGTGAGTCGTATTAG-3'(서열번호 2)이었다. 앞의 두 가지 올리고뉴클레오타이드에서 밑줄로 표시한 부분(서열번호 3)은 본 실시예에서 선정한 개시 메티오닌에 상응하는 tRNA의 염기서열에 해당한다. 만약 다른 아미노산을 이용 하고자 하는 경우에는 이 부분을 그 다른 아미노산에 짝이 맞는 tRNA의 염기서열로 대체하면 된다. 합성하여 준비된 각 올리고뉴클레오타이드는 분자생물학 실험용 수준의 물에 녹이고 각각을 같은 몰농도가 되게 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)용 튜브에 섞었다. 이를 써멀 사이클러(thermal cycler)를 이용하여 다음의 조건으로 두 올리고뉴클레오타이드의 어닐링(annealing)을 실시하였다: (1) 95℃에서 2 분간 가열,(2) 65℃에서 5 분간 유지,(3) 37℃에서 30 분간 유지. 어닐링이 완료되었을 때, 벡터(vector)로의 클로닝을 위하여 어닐링으로 준비된 DNA 조각을 EcoR I과 Pst I으로 절단하여 클로닝에 이용될 부위가 노출되게 한 다음 이를 회수하였다. 한편 클로닝에 사용될 벡터인 pUC19도 EcoR I과 Pst I으로 절단하여 DNA 조각의 클로닝에 이용할 수 있는 형태로 변형시킨 다음 이를 회수하였다. 그 다음 회수된 DNA 조각과 회수된 pUC19 조각을 DNA 연결효소를 이용하는 통상의 라이게이션(ligation)법을 통하여 연결하였다. 이렇게 하여 최종적인 플라스미드를 제작하였다. 참고로, 본 실시예에서는 pUC19를 플라스미드 제작을 위한 벡터로 사용하였는데, 상용화되어 있건 실험자가 자체 제작하였든 상관없이 모든 클로닝 벡터가 본 발명에 제한 없이 사용 가능하다.

본 실시예에서는 전사 효율을 높이기 위하여 개시 메티오닌에 상응하는 tRNA의 염기서열에서의 첫번째 염기에 해당하는 C를 통상의 위치-특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis)을 통하여 G로 변경시켰다. 이는 이러한 돌연변이가 전사 효율을 증가시킨다는 보고가 있었기 때문이었다(Nat. Biotechnol. 20: 723-728, 2002). 이러한 돌연변이의 적용은 단지 전사 효율을 증가시키기 위한 방편으 로 적용한 것일 뿐이므로 꼭 적용해야만 되는 사항은 아니다.

이렇게 제작한 플라스미드를 이용하여 대장균을 형질전환시키고, 이 형질전환체로부터 통상의 방법에 따라 플라스미드를 대량으로 회수하였고 이를 다음의 선형화에 이용하였다.

실시예 2: 제한효소를 이용한 플라스미드의 선형화

실시예 1에서 얻어진 플라스미드를 시험관 전사에서 주형으로 사용하기 전에 평활말단으로 자를 수 있는 제한효소를 이용하여 선형화하였다. 본 실시예에 사용된 제한효소는 Fok I이었다. Fok I 제한효소 반응은 100 ㎕ 규모로 37℃에서 16 시간 동안 다음과 같은 조건으로 실시하였다. 제한효소 반응 조건은 실험자에 따라 얼마든지 변경하여 실시할 수 있으며 제한효소의 판매자가 권하는 방법에 따라 실시하는 것이 가장 용이하다. 1× 제한효소 완충액(restriction enzyme buffer; 인트론바이오테크놀로지; 10 mM 트리스-염산(Tris-HCl)(pH7.5), 10 mM 염화마그네슘(MgCl2), 1 mM 디띠오뜨레이톨(dithiothreitol; DTT), 50 mM 염화나트륨(NaCl)), 20 ㎍의 플라스미드, 50 유니트의 Fok I(인트론바이오테크놀로지), 0.01%의 소혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA). 상기 제한효소 반응에서는 완벽하게 플라스미드를 잘라주는 것이 좋으며 제한효소 반응에 첨가된 플라스미드의 양이 지나치게 많거나 제한효소 양이 너무 적으면 불완전하게 절단될 수 있다. 따라서 효과적으로 플라스미드를 절단해 주기 위해서는 첨가되는 플라스미드 양과 제한효소의 양의 비를 잘 정하는 것이 중요하다. 본 발명자들이 확인한 바에 따르면, 플라스미드는 0.2 ㎍/㎕의 농도가 되게, 제한효소는 0.5 U/㎕ 이상의 농도가 되게 첨가해 주는 것이 바람직하다. 대략 첨가된 플라스미드 1 ㎍ 당 제한효소를 2.5 유니트 이상을 첨가해주면 대부분의 플라스미드가 절단된다. 참고로 BSA를 첨가해 주는 것이 제한효소의 효율을 다소 증가시켰다.

실시예 3: 선형화된 플라스미드를 이용한 시험관 전사

Fok I 절단을 통해 선형화된 플라스미드를 포함하고 있는 용액 그 자체를 시험관 전사의 주형으로 사용하였다. 분리 정제 없이 선형화된 플라스미드를 포함하고 있는 용액 자체를 시험관 전사의 주형으로 사용하는 것이 전사 효율에 나쁜 영향을 미치지는 않았다. 전사 효율을 높이기 위해 각 성분을 최적화하긴 했지만 시험관 전사의 전반적 방법은 통상의 방법을 따라 실시했다. 시험관 전사 반응에 사용된 각 반응 성분들의 최종 농도는 다음과 같다: 80 mM HEPES-KOH(pH 7.5), 24 mM 염화마그네슘(MgCl2), 2 mM 스퍼미딘(spermidine), 40 mM DTT, 1 U/㎕ RNase 저해제, 3 mM rNTPs, 3.75 U/㎕ T7 RNA 중합효소, 0.005%(w/v) BSA, 35%(v/v)의 Fok I 절단을 통해 선형화된 플라스미드를 포함하고 있는 용액. 본 실시예에서 사용한 플라스미드는 T7 프로모터의 서열이 포함되어 있게 제작되었기 때문에 시험관 전사 반응을 위해서 T7 RNA 중합효소를 첨가해 주었다. 만약 다른 프로모터를 사용하게끔 플라스미드가 제작된 경우라면 그 프로모터에 적합한 RNA 중합효소를 첨가해 주면 될 것이다. 선형화된 플라스미드와 시험관 전사 반응에 첨가되는 한 성분인 스퍼미딘은 낮은 온도에서 서로 결합하여 침전을 형성할 수 있으므로 이의 발생을 막 기 위하여, 미리 다른 성분들을 혼합한 다음 이를 37℃에서 5 분간 데워준 다음에 선형화된 플라스미드를 포함한 용액을 마지막으로 첨가해 주었다. 시험관 전사 반응은 37℃에서 2 시간 동안 진행하였으며 시험관 전사 반응의 효율은 전사 반응산물을 2% 한천 젤을 이용한 전기영동을 통하여 분석하여 확인하였다. 결과로서, 본 발명자들은 전사 반응의 완충액으로는 트리스(Tris) 기반의 완충액보다 HEPES 기반의 완충액이 바람직하다는 사실과 Fok I으로 절단한 선형화된 플라스미드를 포함하고 있는 용액의 첨가량이 최종 얻어지는 전사 반응 산물의 수율에 크게 영향을 미친다는 사실을 확인할 수 있었다. Fok I으로 절단한 선형화된 플라스미드를 포함하고 있는 용액을 실시예 2처럼 준비한 경우에는 시험관 전사 반응에 대한 부피비로 35% 이상 첨가해 주는 것이 바람직하였다. 이보다 더 많은 부피를 첨가해 주는 것은 시험관 전사 반응 산물의 수율을 증가시키는데 도움이 되지 않았다. 실시예 1에서는 일차적으로 제작한 플라스미드와 이를 추가로 돌연변이 시킨 것을 포함하여 두 가지 플라스미드가 제작되었었다. 이 두 가지 플라스미드 중 돌연변이를 가한 플라스미드를 사용하는 경우가 그 다른 경우에 비하여 예상했듯이 시험관 전사 반응 산물의 수율이 약 2 배가량 높았다. 그러나 돌연변이를 시키지 않은 것을 시험관 전사 반응의 주형으로 사용하더라도 충분한 수준의 수율이 확보되었다. 따라서 두 가지 플라스미드 어느 것도 본 발명을 실현하는 데는 문제가 없었다.

실시예 4: 시험관 번역법에 사용하는 세포추출물의 제조

본 실시예 4에서 세포추출물 제조에 이용된 미생물은 대장균 BL21(DE3)이었 다. 이 대장균으로부터 시험관 번역법에 의한 단백질 생산에 필수적인 리보좀(ribosome) 및 개시인자(initiation factor) 등 단백질생산 관련 기구(protein synthesis machinery)가 포함된 세포추출물을 제조하였다. 이를 상세히 설명하면 다음과 같다. 대장균 BL21(DE3)을 5 ml의 LB 배지(트립톤, 10 g/L; 효모 추출물, 5 g/L; 염화나트륨, 10 g/L)를 이용해 37℃에서 7-8시간 동안 전배양(preincubation) 하였다. 이를 100 ml의 새 LB 배지로 옮겨 접종한 후 하룻밤 더 배양하였다. 하룻밤 배양 후 이 100 ml의 배양액을 2 L의 2× TY(박토-트립톤, 16 g/l; 효모 추출물, 10 g/l; 염화나트륨, 5 g/l) 배지가 첨가되어 있는 배양기에 접종하였다. 배양기를 이용한 대장균 세포 배양에서의 배양온도는 37℃이었고 산소 공급과 배지 성분의 혼합을 위하여 배양액을 860 rpm으로 계속 혼합해 주었다. 배양 개시 후, 600 nm에서 흡광도가 0.6 정도로 세포가 자랐을 때 T7 RNA 중합효소의 발현을 유도하기 위하여 최종농도가 1 mM이 되게 이소프로필티오-β-D-갈락토시드(IPTG)를 배지에 첨가해 주었다. 발현 유도 후, 600 nm에서 흡광도가 4-5 정도가 될 때까지 계속 배양한 후, 4,500 rpm으로 4℃에서 12 분간 원심분리하여 배양된 세포를 회수하였다. 얻어진 세포 침전물을 세척완충액(10 mM 트리스초산염, 14 mM 초산마그네슘, 60 mM 초산칼륨, 10 mM 2-머켑토에탄올, pH 8.2)을 이용하여 재부유시키고 다시 앞과 같은 조건으로 원심분리하여 세포를 회수하였다. 이를 3회 반복하면서 세포를 세척해 주었다. 이 때 마지막 원심분리 후, 최종 세포 침전물에 30 ml의 부유완충액(10 mM 트리스초산염, 14 mM 초산마그네슘, 60 mM 초산칼륨, 6 mM 2-머켑토에탄올, pH 8.2)을 가하여 세포를 부유완충액에 재부유시켰다. 이를 12,000× g로 4℃에서 30 분간 원심분리하여 세포를 다시 회수하였고 침전된 세포 1 g 당 1.27 ml의 비로 침전된 세포에 S30완충액(10 mM 트리스초산염, 14 mM 초산마그네슘, 60 mM 초산칼륨, 10 mM 2-머켑토에탄올, pH 8.2)을 가하여 재부유시켰다. 이 세포 재부유액을 프렌치프레서를 이용해 770 psi의 압력을 가하여 재부유액 속에 있는 세포를 파쇄하여 세포내 성분이 세포 밖으로 유리되게 하였다. 이렇게 제조된 세포파쇄물을 30,000× g로 4℃에서 30 분간 원심분리하여 상등액을 얻었으며, 이 얻어진 상등액을 다시 한번 같은 조건으로 원심분리를 실시하여 더 깨끗한 상등액을 얻었다. 최종적으로 상등액을 얻을 때에는 상등액의 윗부분에 존재하는 지질층 바로 밑 부분만을 조심스럽게 회수하였다. 이 회수된 상등액 10 ml 당 3 ml의 전배양혼합액(293 mM 트리스초산염, 2 mM 초산마그네슘, 10.5 mM ATP, 84 mM 크레아틴 포스페이트, 44 mM 2-머켑토에탄올, 0.04 mM 각 아미노산, 7 유니트/ml 크레아틴 키나아제, pH 8.2)을 첨가한 후, 항온조에서 37℃로 80 분간 전배양을 실시하여 세포추출물 속에 존재하던 mRNA를 분해시켰다. 전배양 후 S30 완충액 500 ml에 대하여 4℃에서 45 분간씩 4 회의 투석(dialysis)을 수행함으로써, 작은 분자량을 가진 불필요하거나 단백질 합성을 저해하는 성분들을 제거하였다. 투석이 완료된 후, 투석액을 회수하여 4,000× g로 4℃에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 회수하였고, 회수된 상등액을 냉동보관 용기에 분주한 후 액체질소에 보관하였다. 이를 향후 시험관 번역법에 의한 단백질 생산 반응에 있어서 세포추출물로 사용하였다. 상기의 세포추출물은 직접 제조하지 않고 수득해서 사용해도 무방하다. 또한 본 실시예에서 제조된 세포추출물은 다음의 실시예 5에서 아미노산을 tRNA에 결합시킬 때 필요한 아미노아실-tRNA 합성 효소의 분리를 위한 재료로도 이용되었다.

실시예 5: 아미노산을 tRNA 에 결합시키기 위해 사용하는 효소( 아미노아실 - tRNA 합성 효소)의 분리법

실시예 4에서 제조된 세포추출물 3 ml를 베크만(BECKMAN)사의 초원심분리기(ultracentrifuge)로 50.4 Ti 로터를 이용하여 150,000× g로 4℃에서 2 시간 동안 초원심분리하였다. 초원심분리 후, 상등액을 회수하여 -70℃에 보관하였다. 이를 향후 아미노산을 tRNA에 결합시키는 아미노아실화 반응(aminoacylation)에 있어 아미노아실-tRNA 합성 효소를 포함한 효소액으로 사용하였다. 물론 이들 아미노아실-tRNA 합성 효소는 직접 제조하지 않고 상용화되어 있는 것을 구입하여 사용할 수도 있다. 현재 판매되고 있는 대부분의 아미노아실-tRNA 합성 효소 제품은 본 실시예에서 제조되는 효소액보다 순도면에서 더 우수하다. 따라서 이러한 상용 효소를 사용하는 것이 더욱 바람직할 수도 있다. 물론 직접 만들어 사용하는 것과 구입하여 사용하는 것에는 그 얻어지는 결과에 있어 큰 차이가 없다.

실시예 6: 아미노산과 tRNA 와의 결합

부피비로 40%가 되는 양의 시험관 전사 반응 용액과 실시예 5에서 제조된 아미노아실-tRNA 합성 효소액이 충분한 양으로 포함되어 있는 하기 조성의 아미노아실화 반응액을 37℃에서 45 분간 반응시켜 아미노산과 tRNA의 결합을 유도하였다. 이 아미노아실화 반응에 사용하는 시험관 전사 용액은 어떠한 분리, 정제도 실시하지 않고 그대로 사용하였으며, 이것 때문에 발생되는 문제는 없었다. 아미노아실화 반응액의 조성은 20 mM의 이미다졸-염산 완충액(imidazole-HCl buffer, pH 7.5), 150 mM의 염화나트륨(NaCl), 12.5 mM의 염화마그네슘(MgCl2), 2 mM의 ATP, 68 μM의 폴리닉 산(folinic acid), 4 mM의 메티오닌, 부피비 15%의 실시예 5에서 준비된 아미노아실-tRNA 합성 효소액이었다. 여기에 제시된 값은 최적화를 통하여 얻어진 값이다. 상기 성분 중 폴리닉 산은 첨가해 주지 않아도 발생되는 문제가 없었다. 이 때 대조 실험으로, 260 nm에서 흡광도가 10 정도 되는 양(15 nmole에 해당)의 “전체 tRNA 혼합체”를 tRNA 재료로 이용한 반응도 실시하였다. 이때도 같은 조성과 같은 반응 조건에서 실시하였다. 45 분간의 아미노아실화 반응 후, 3 M 초산나트륨 용액(sodium acetate, pH 5.0)을 전체 아미노아실화 반응액의 1/10의 부피비로 첨가하여 반응액을 중화시킴으로써 아미노아실화 반응을 종결시켰다. 반응액을 중화하여 종결시킨 후, 클로로포름과 산성 페놀의 혼합액(부피비 1:1, pH 5.0)을 동부피 가하여 아미노아실화된 tRNA를 수용액 층으로 추출하였다. 수용액층을 조심스럽게 회수한 후, 회수된 수용액층에 2.5배 부피의 차가운 에탄올을 가하여 잘 섞어준 후 -70℃에서 1 시간 방치하여 tRNA의 침전을 유도하였다. 1 시간 방치 후, 4℃에서 20 분간 14,000 rpm으로 원심분리하여 tRNA만을 회수하였다. 얻어진 tRNA 침전물은 40 ㎕의 62.5 mM의 소듐 비카르보네이트 완충액(sodium bicarbonate, pH 8.5)을 사용하여 녹였으며 이를 실시예 7에서는 형광물질과의 결합반응에, 실시예 8에서는 바이오틴과의 결합반응에 아미노산이 결합된 tRNA로 사 용하였다.

실시예 7: tRNA 에 결합된 아미노산과 형광물질의 결합반응

실시예 6에서 준비된 아미노산과 tRNA의 결합체(본 명세서에서는 이를 “메티오닌-tRNA 결합체”라 지칭함)에 형광물질을 부가하는 반응은, 기본적으로 기테 등의 방법(Anal. Biochem. 279: 218-225, 2000)을 기반으로 하여 약간의 변형을 가한 후 실시하였다. 형광물질의 결합은 “메티오닌-tRNA 결합체”의 메티오닌의 N-말단에 존재하는 알파-아미노기를 이용하여 실시하였다. 본 실시예에 이용된 형광물질로는 5-카르복시플루오레세인 [5-carboxyfluorescein; 5-FAM]의 석씨니미딜 에스테르(하기 화학식 1 참조), 플루오레세인과 석씨니미딜 에스테르 구조 사이에 유동성을 부여하기 위해 첨가된 스페이서 그룹(spacer group)을 가진 플루오레세인-5-EX [Fluorescein-5-EX]의 석씨니미딜 에스테르(하기 화학식 2 참조), 및 6-((4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3에이,4에이-디아자-에스-인다센-3-프로피오닐) 아미노) 헥사노익 산 [6-((4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionyl) amino) hexanoic acid; BODIPY]의 석씨니미딜 에스테르(하기 화학식 3 참조)를 사용하였다. BODIPY는 시험관 번역법에서 단백질 표지에 널리 활용되고 있는 형광물질이다.

구체적으로는, 실시예 6에서 준비된 “메티오닌-tRNA 결합체”가 녹아 있는 용액 40 ㎕에 30 mM의 농도로 형광물질이 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 녹아 있는 형광물질 용액 10 ㎕를 가하였다. 이 혼합액을 0℃의 얼음 속에서 40 분 동안 방치하여 형광물질이 “메티오닌-tRNA 결합체”에 결합하게 하였 다. 40 분방치 후, 2 M 초산나트륨 용액(sodium acetate, pH 5.0)을 전체 반응액의 1/10의 부피비로 첨가하여 반응액을 중화시켜 형광물질의 부가반응을 종결시켰다. 반응을 종결시킨 후, 클로로포름과 산성 페놀의 혼합액(부피비 1:1, pH 5.0)을 동부피 가하여 형광물질이 부가된 “메티오닌-tRNA 결합체”를 수용액 층으로 추출하였다. 추출 과정을 2 회 반복 수행한 후, 추출액에 2.5 배 부피의 차가운 에탄올을 가한 다음 -70℃에 1 시간 방치하였다. 1 시간 방치 후, 4℃에서 20 분간 14,000 rpm으로 원심분리하여 형광물질이 부가된 “메티오닌-tRNA 결합체”의 침전물을 얻었다. 이 침전물을 50 ㎕가 되게 디에틸 피로카르보내이트(diethyl pyrocarbonate; DEPC)로 처리한 RNAse가 없는 순수한 물을 사용하여 녹인 후 2 M 초산나트륨 용액(sodium acetate, pH 5.0)을 전체액의 1/10의 부피비로 첨가한 다음, 2.5 배 부피의 차가운 에탄올을 추가로 첨가하여 에탄올 침전을 한번 더 실시하였다. 최종적으로 4℃에서 20 분간 14,000 rpm으로 원심분리하여 침전물을 얻은 후, 이 침전물을 80%(v/v) 에탄올 용액을 사용하여 한번 세척해 주었다. 세척 후 충분히 건조시킨 침전물은 DEPC로 처리한 RNAse가 없는 순수한 물 5 ㎕를 사용하여 녹였다. 이를 향후 시험관 번역법에 의한 단백질 생산 반응에서 생산되는 단백질의 표지를 위하여 사용하였다. 이렇게 제조된 형광물질이 부가된 “메티오닌-tRNA 결합체”(즉, “표지용 tRNA 복합체”)를 2% 한천 젤을 이용한 전기영동으로 분석해 보았다. 그 결과, 비록 최초 재료로 사용한 tRNA가 시험관 전사를 통해 인공적으로 만들어졌음에도 불구하고 형광물질이 결합된 “표지용 tRNA 복합체”가 소망한대로 제조되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 8: tRNA에 결합된 아미노산과 바이오틴의 결합반응

본 실시예에서는 바이오틴이 결합된 “표지용 tRNA 복합체”를 제조했는데, 형광물질 대신에 바이오틴을 사용한 점만 빼고는 모든 방법과 과정이 실시예 7과 동일하였다. 이때 사용한 바이오틴 유도체는 바이오틴의 석씨니미딜 에스테르(하기 화학식 4 참조)였다.

이렇게 제조된 바이오틴이 결합된 “메티오닌-tRNA 결합체”(즉, “표지용 tRNA 복합체”)를 2% 한천 젤을 이용한 전기영동으로 분석해 보았다. 그 결과, 비록 최초 재료로 사용한 tRNA가 시험관 전사를 통해 인공적으로 만들어졌음에도 불구하고 바이오틴이 결합된 “표지용 tRNA 복합체”가 소망한대로 제조되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 9: 형광물질이 결합된 “표지용 tRNA 복합체”를 이용한 생산 단백질의 표지 및 표지된 단백질의 확인

시험관 번역법에 의한 단백질 생산 반응은 기본적으로 김 등(Eur. J. Biochem. 239:881-886, 1996)의 방법을 따랐으며, 약간의 변형을 가하였다. 시험관 번역법을 따른 단백질 생산 반응액의 조성은 다음과 같다: 57 mM Hepes-KOH(pH 8.2), 1.2 mM ATP, 각 0.85 mM의 GTP, UTP와 CTP, 1.7 mM DTT, 150 mM 칼륨글루타메이트, 80 mM 초산암모늄, 16 mM 초산마그네슘, 0.17 mg/ml 대장균 tRNA 혼합물, 64 μM 폴리닉산, 0.3 U/ml 크레아틴 키나아제(creatine kinase), 각 0.5 mM의 20 가지 아미노산 혼합액, 28 mM 크레아틴 포스페이트(creatine phosphate), 0.6 mM cAMP, 생산하고자 하는 단백질의 유전정보를 가지고 있는 6.7 ㎍/ml 환형의 플라스미드, 및 33%(v/v) 세포추출물. 이상의 혼합액에 실시예 7에서 준비한 형광물질이 부가되어 있는 “표지용 tRNA 복합체”를 포함한 용액을 전체 단백질 생산 반응액 15 ㎕당 1 ㎕의 비율로 첨가해 주었다. 상기 반응액을 잘 혼합한 다음 37℃에서 1 시간 동안 단백질 생산 반응을 실시하였다. 단백질 생산 반응 종료 후, 단백질 생산 반응액 중 5 ㎕를 취하여 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동(SDS-PAGE)을 실시하였다. SDS-PAGE 후, 레이저 조사 장치를 이용하여 표지된 단백질을 확인하였다. 본 실시예에서는 CAT을 주모델 단백질로 사용하였으며, 이와 더불어 여러 단백질에 대한 본 발명의 유효성을 확인하고자할 때는 CAT을 포함하여 EPO, DHFR을 모델 단백질로 추가로 선택하였다. CAT을 모델 단백질로 한 실험에서, “시험관 전사로 제조된 tRNA”를 이용하여 제조한 “표지용 tRNA 복합체”와 “전체 tRNA 혼합체”를 이용하여 제조한 “표지용 tRNA 복합체”를 각각 이용하여 생성되는 단백질을 표지한 다음 레이저 조사로 가시화한 결과가 도 3에 제시되어 있다. 그 결과에서 알 수 있듯이, 시험관 전사로 제조된 tRNA를 이용하여 제조한 “표지용 tRNA 복합 체”가 비록 인공적으로 만들어진 tRNA로부터 제조되었음에도 불구하고, 시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질을 선택적으로 표지할 수 있었다. 또한, 시험관 전사로 만들어진 tRNA를 이용하여 제조한 “표지용 tRNA 복합체”로 표지한 단백질이 “전체 tRNA 혼합체”를 이용하여 제조한 “표지용 tRNA 복합체”로 표지한 단백질에 비하여 백그라운드 형광(background fluorescence)이 훨씬 작아 개선된 시그널을 제공해 주었다. 특히,“전체 tRNA 혼합체”를 이용하는 기존 방법에서는 15-25 kDa에 해당하는 크기를 가진 단백질이 나타나는 위치 부분에서 나타나는 백그라운드 형광이 매우 심하였지만 본 발명에 의한 방법은 상대적으로 매우 적어 이 위치에 해당하는 분자량을 가진 단백질의 확인에서 특히 본 발명이 효과적일 수 있음을 알 수 있었다.

도 4에는 여러 가지 형광물질이 부가된 “표지용 tRNA 복합체”를 이용하여 상기와 같은 방법에 따라 1 시간 반응으로 생산 및 표지된 CAT을 SDS-PAGE에 의해 분리한 후, 레이저 조사로 가시화한 사진이 개시되어 있다. 그 결과에서 알 수 있듯이, 본 실시예에서 사용된 모든 형광물질이 원활히 작동함을 알 수 있었다. 이상으로 통상의 단백질 표지에 사용되던 여러 종류의 형광물질들도 본 발명에 활용될 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 유효성을 여러 모델 단백질에 대하여 알아보았다. 이를 위하여 본 발명에서 개시한 방법을 이용하여 CAT, EPO, DHFR를 표지하였다. 도 5에는 상기와 같은 방법에 따라 1 시간의 반응으로 생산 및 표지된 여러 모델 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리한 후, 레이저 조사로 가시화한 사진이 개시되어 있다. 그 결과에서 알 수 있듯이, 단백질의 종류에 따라 그 시그널의 정도 차이는 있으나 레이저 조사로 모든 단백질이 각기 분자량에 해당하는 위치에서 형광을 가진 밴드로 가시화되었다. 이는 시험관 번역법을 통하여 생산되는 모든 단백질에 본 발명이 적용 가능함을 보여 준다할 수 있다. 본 실험에서는 형광물질로서 5-FAM의 석씨니미딜 에스테르를 사용하였다.

실시예 10: 바이오틴이 부가된 “표지용 tRNA 복합체”를 이용한 생산 단백질의 표지 및 표지된 단백질의 확인

바이오틴이 결합된 실시예 8에서 제조한 “표지용 tRNA 복합체”를 이용한 단백질의 표지 및 확인을 다음과 같이 실시하였다. 시험관 번역법에 의한 단백질 생산 반응은 실시예 9와 동일하게 실시하였다. 단, 생성되는 단백질 표지를 위하여, 형광물질이 부가된 “표지용 tRNA 복합체”를 포함한 용액 대신에 바이오틴이 부가된 “표지용 tRNA 복합체”를 포함한 용액을 단백질 생산 반응액에 첨가해 주었다. 단백질 생산 반응 종료 후, 반응액 중 5 ㎕를 취하여 SDS-PAGE를 실시하였다. 전기영동 후, 전기영동한 젤을 사용하여 표준방법에 따라 아비딘을 이용한 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 바이오틴으로 표지된 단백질에 대한 아비딘을 이용한 웨스턴 블랏팅 방법은 매우 잘 알려져 있어 본 명세서에서는 이를 특별히 설명하지는 않겠다. 본 실시예에서의 모델 단백질은 EPO이었다. 도 6에는 생산 및 표지된 EPO를 SDS-PAGE에 의해 분리한 후 웨스턴 블랏팅을 통하여 바이오틴으로 표지된 단백질을 가시화한 사진이 개시되어 있다. 그 결과에서 알 수 있듯이, 시험관 전사 로 제조한 tRNA를 이용하여 제조한 “표지용 tRNA 복합체”가 비록 인공적으로 만들어졌음에도 불구하고, 시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질을 선택적으로 표지할 수 있었다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 “표지용 tRNA 복합체”의 일반적 구조를 모식적으로 보여주는 그림이다. 도 1에서 알 수 있듯이 “표지용 tRNA 복합체”는 tRNA-아미노산-형광물질 또는 tRNA-아미노산-바이오틴의 순서로 일렬로 결합된 복합체이다.

도 2는 아미노산의 구조를 보여주는 그림이다.

도 3은 “전체 tRNA 혼합체” 또는 시험관 전사로 제조된 한 종류의 tRNA을 각각 tRNA 재료로 사용하여 제조한 두 종류의 “표지용 tRNA 복합체”를 각기 이용하여 시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질을 표지한 다음 이를 비교한 사진이다. 1 시간의 시험관 번역법 반응으로 생산 및 표지된 CAT을 SDS-PAGE에 의해 분리한 후 레이저 조사로 가시화한 사진이다. M 레인은 분자량 표시물질이고, 1번 레인은 시험관 전사로 제조한 특정 tRNA를 이용하여 제조한 “표지용 tRNA 복합체”를 첨가한 반응에 CAT 유전자를 넣어 주지 않고 실시한 음성 기준 반응이고, 2번 레인은 시험관 전사로 제조한 특정 tRNA를 이용하여 제조한 “표지용 tRNA 복합체”를 첨가한 반응에서 CAT 유전자를 넣어 주고 실시한 반응이고, 3번 레인은 “전체 tRNA 혼합체”를 이용하여 제조한 “표지용 tRNA 복합체”를 첨가한 반응에서 CAT 유전자를 넣어 주지 않고 실시한 음성 기준 반응이고, 4번 레인은 “전체 tRNA 혼합체”를 이용하여 제조한 “표지용 tRNA 복합체”를 첨가한 반응에서 CAT 유전자를 넣어 주고 실시한 반응이다. 도면에서 P는 형광물질로 표지된 생산된 단백질인 CAT을 나타내고, R은 백그라운드 형광을 나타낸다.

도 4는 서로 다른 형광물질이 부가된 3 종류의 “표지용 tRNA 복합체”를 이 용하여 단백질을 표지 및 분석한 결과 사진이다. M 레인은 분자량 표시물질이고, 1번 레인은 형광물질로 5-FAM의 석씨니미딜 에스테르를 사용하여 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 첨가한 반응에서 CAT 유전자를 넣어 주지 않고 실시한 음성 기준 반응이고, 2번 레인은 형광물질로 5-FAM의 석씨니미딜 에스테르를 사용하여 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 첨가한 반응에서 CAT 유전자를 넣어 주고 실시한 반응이고, 3번 레인은 형광물질로 fluorescein-5-EX의 석씨니미딜 에스테르를 사용하여 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 첨가한 반응에서 CAT 유전자를 넣어 주지 않고 실시한 음성 기준 반응이고, 4번 레인은 형광물질로 fluorescein-5-EX의 석씨니미딜 에스테르를 사용하여 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 첨가한 반응에서 CAT 유전자를 넣어 주고 실시한 반응이고, 5번 레인은 형광물질로 BODIPY-FL의 석씨니미딜 에스테르를 사용하여 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 첨가한 반응에서 CAT 유전자를 넣어 주지 않고 실시한 음성 기준 반응이고, 6번 레인은 형광물질로 BODIPY-FL의 석씨니미딜 에스테르를 사용하여 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 첨가한 반응에서 CAT 유전자를 넣어 주고 실시한 반응이다. 도면에서 P는 형광물질로 표지된 생산된 단백질인 CAT을 나타낸다.

도 5는 CAT 이외에 추가로 2 가지 다른 단백질에 형광물질로서 5-FAM의 석씨니미딜 에스테르를 사용하여 본 발명을 적용해 본 결과를 보여주는 사진이다. M 레인은 분자량 표시물질이고, 1번 레인은 유전정보가 포함된 플라스미드를 전혀 첨가해 주지 않은 음성 기준 반응의 결과이고, 2번 레인은 CAT 단백질을 생산 및 표지한 결과이고, 3번 레인은 EPO 단백질을 생산 및 표지한 결과이고, 4번 레인은 DHFR 단백질을 생산 및 표지한 결과이다.

도 6은 바이오틴이 부가된 “표지용 tRNA 복합체”를 이용하여 본 발명을 적용한 결과로서, 생산된 EPO를 SDS-PAGE에 의해 분리한 후 웨스턴 블랏팅으로 가시화한 사진이다. 1번 레인은 시험관 전사로 준비한 특정 한 종류의 tRNA를 이용하여 제조한 “표지용 tRNA 복합체”를 첨가한 반응에서 EPO 유전자를 넣어 주지 않고 실시한 음성 기준 반응이고, 2번 레인은 시험관 전사로 준비한 특정 한 종류의 tRNA를 이용하여 제조한 “표지용 tRNA 복합체”를 첨가한 반응에서 EPO 유전자를 넣어 주고 실시한 반응이다.

<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Selective Labeling of Cell-free Synthesized Proteins Using the Labeling Agent Derived from In Vitro Transcribed tRNA <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense oligonucleotide <400> 1 aattctaata cgactcacta tacgcggggt ggagcagcct ggtagctcgt cgggctcata 60 acccgaaggt cgtcggttca aatccggccc ccgcaaccac aggatccgca tccttctgca 120 120 <210> 2 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 2 gaaggatgcg gatcctgtgg ttgcgggggc cggatttgaa ccgacgacct tcgggttatg 60 agcccgacga gctaccaggc tgctccaccc cgcgtatagt gagtcgtatt ag 112 <210> 3 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> initiation methionine tRNA <400> 3 cgcggggtgg agcagcctgg tagctcgtcg ggctcataac ccgaaggtcg tcggttcaaa 60 tccggccccc gcaacca 77

Claims (5)

1) 단백질 표지에 이용하고자 하는 아미노산의 DNA 상의 코돈에 상응하는 한가지 tRNA(특정 tRNA)만을 시험관 전사법을 통해 제조하는 단계;

2) 단계 1에서 제조된 특정 tRNA에 상응하는 특정 아미노산을 아미노아실화 반응시켜 단계 1의 특정 tRNA에 결합시키는 단계; 및

3) 단계 2에서 제조된 특정 tRNA에 결합된 특정 아미노산의 곁사슬이나 N-말단에 존재하는 알파-아미노 그룹에 형광물질이나 바이오틴을 결합시켜 “표지용 tRNA 복합체”를 제조하는 단계;

를 포함하는, 시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질의 선택적 표지에 사용될 수 있는 “표지용 tRNA 복합체”의 제조 방법.

제 1 항에 있어서, 상기 단계 1의 특정 tRNA의 제조는, 특정 tRNA에 대한 유전정보를 가진 플라스미드를 제작하고, 이 플라스미드를 제한효소 처리로 선형화한 다음, 이 선형화된 플라스미드를 주형으로 시험관 전사를 실시하여 특정 tRNA만을 얻는 것을 특징으로 하는 제조 방법.

제 2 항에 있어서, 상기 제한효소 처리는 평활말단(blunt end)으로 플라스미 드를 절단하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.

제 1 항에 의해 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 이용하여 시험관 번역법을 통하여 생산되는 단백질을 표지 및 확인하는 방법.

제 1 항에 의해 제조된 “표지용 tRNA 복합체”를 포함하는 단백질 발현 확인용 시약.

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