KR20170072827A - 정제된 형광 메티오닌 및 진핵세포 번역 시스템을 이용한 목적 단백질의 고효율 형광 표지 방법 - Google Patents

정제된 형광 메티오닌 및 진핵세포 번역 시스템을 이용한 목적 단백질의 고효율 형광 표지 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 정제된 형광 메티오닌 및 진핵세포 번역 시스템을 이용한 목적 단백질의 고효율 형광 표지 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 정제된 형광 메티오닌을 사용하여 진핵세포 내에서 목적 단백질 합성에 사용하여 인 비트로에서 목적 단백질의 합성 효율과 형광 표지 효율을 개선하는 효과를 제공한다. 또한, 본 발명은 형광 표지된 단일 아미노산의 유도체화 없이 단일 아미노산의 정량 곡선을 통해 형광 표지된 단일 아미노산을 정량할 수 있다.

Description

정제된 형광 메티오닌 및 진핵세포 번역 시스템을 이용한 목적 단백질의 고효율 형광 표지 방법{Method for highly efficient fluorescent tagging of a single protein with a purified fluorescently labeled methionine in eukaryote translation systems}
본 발명은 정제된 형광 메티오닌 및 진핵세포 번역 시스템을 이용한 목적 단백질의 고효율 형광 표지 방법에 관한 것이다.
세포 내에 존재하는 수많은 생체물질 중에서 표적 단백질을 찾아내는 것을 간단하지 않지만 최근 살아있는 세포 내에서 비천연 아미노산이나 화학물질을 통한 단백질 표지화 기술에 대한 보고들이 있다(Marks KM et al., Nat Methods 3, 591-6 (2006); Ryu Y et al. Nat Methods 3, 263-5 (2006)). 이를 극복하기 위한 효과적인 방법 중 하나가 표적 단백질에 표시할 수 있는 형광 표지화 방법이다. 그러나 이 방법은 표적이 되는 분자(반응기)와 형광기(GFP protein)가 크기 때문에 표적 단백질과의 상호작용을 해치는 경우가 자주 발생하여 표적을 찾아내는 것이 곤란하고 보고된 선택적인 표시 지역의 시스테인과 라이신 등의 지역은 구조적, 형광 컨쥬게이션 반응으로 인한 형광 효율적 한계점을 가지고 있다. 그리고 보고된 천연 아미노산 분석법은 단일-결합으로 이루어져 일반적으로 가시광선영역의 흡광을 갖고 있지 않아 다양한 방법으로 유도체화 하여 크로마토그래피 분석법으로 복잡한 분석 및 분석시간, 유도체 시약비용과 노동력을 많이 요구하고 있다(Rutherfurd, S.M. and Gilani, G.S.(2009) Amino acid analysis. Current protocols in protein science / editorial board, John E. Coligan et al., Chapter 11, Unit 11 19). 천연 아미노산중 유일하게 메티오닌은 방사성동위원소 표지된 메티오닌으로 방사선 의약품으로 바이오마커로 대사질환과 암, 노화와 연관되어 연구보고 되어있다(Gomes, A.C.et al. Rna 22, 467-476(2016); Larance, M. et al. Nature methods 8, 849-851(2011); Hu, V. W. & Heikka, D. S. FASEB journal 14, 448-454(2000); Grandison, R. C., Piper, M. D. & Partridge, Nature 462(2009); Cavuoto, P. & Fenech, M. F. Cancer treatment reviews 38, 726-736(2012)). 또한 기존 연구에 대장균 유래 단백질 시스템에서 다량의 단백질 생산량이 필요하고 이미 보고된 N-말단 단백질은 대장균의 개시 tRNA와 서프레서 tRNA(suppressor tRNA)를 사용하여 비천연 아미노산을 포함한 인 비트로 전사를 통해 대장균 유래 형광 단백질을 제조과정이 보고되어 있다(Jun SY et al. J Microbiol Methods 73, 247-51 (2008); Masanori Miura et al. Bulletin of the Chemical Society of Japan 83, 546-553 (2010)). 이들 제조 과정은 N-말단 단백질이 목적 단백질의 발현을 모니터링하는 저효율의 형광 표지화 기술로 제조되거나, 2단계의 실험 단계를 거쳐 제조하는데, 복잡한 형광 분리 정제가 요구된다.
국내공개특허 제2009-0077243호 (2009. 07. 15) 국내공개특허 제2008-0036638호 (2008. 04. 28)
Marks KM et al., Nat Methods 3, 591-6 (2006) Ryu Y et al. Nat Methods 3, 263-5 (2006) Jun SY et al. J Microbiol Methods 73, 247-51 (2008) Masanori Miura et al. Bulletin of the Chemical Society of Japan 83, 546-553 (2010)
본 발명의 목적은 목적 단백질의 형광 표지를 위해 정제된 형광 메티오닌을 tRNA와 반응시켜 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.본 발명의 다른 목적은 상기 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체와 진핵세포 번역 시스템을 이용하여 목적 단백질의 메티오닌의 형광 표지 효율을 개선하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적 상기 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체와 진핵세포 번역 시스템을 이용하여 목적 단백질의 인 비트로 합성을 개선하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 단일 아미노산의 정량 곡선을 이용하여 형광 표지된 단일 아미노산의 정량 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 정제된 형광 메티오닌과 진핵세포 유래의 tRNA를 반응시켜 정제된 형광 메티오닌-tRNA 복합체를 제조하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 정제된 형광 메티오닌 또는 정제된 형광 메티오닌-진핵세포 유래의 tRNA 복합체 및 목적 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 및 상기 진핵세포의 인 비트로 세포배양을 통해 목적 단백질의 합성을 유도하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 메티오닌의 형광 표지 효율을 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 정제된 형광 메티오닌 또는 정제된 형광 메티오닌-진핵세포 유래의 tRNA 복합체 및 목적 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 및 상기 진핵세포의 인 비트로 세포배양을 통해 목적 단백질의 합성을 유도하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 인 비트로 합성을 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 형광 표지된 단일 아미노산을 정제하여 형광 강도를 측정하고, 형광이 없는 상기 단일 아미노산의 흡광도에 따라 작성된 표준 곡선에 적용하여 형광 표지된 단일 아미노산의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 형광 표지된 단일 아미노산의 정량 방법을 제공한다.
본 발명은 정제된 형광 메티오닌을 사용하여 세포배양을 통해 목적 단백질의 합성을 유도하여 인 비트로에서 목적 단백질 합성에 사용하므로, 목적 단백질의 합성 효율과 형광 표지 효율을 개선하는 효과를 제공한다.
또한, 본 발명은 단일 아미노산의 흡광도를 이용한 표준 곡선을 통해 형광 표지된 단일 아미노산의 유도체화 없이 형광 강도를 이용하여 형광 표지된 단일 아미노산의 정량이 가능하다.
도 1은 본 발명의 정제된 형광 메티오닌의 제조 및 정제된 형광 메티오닌-개시 tRNA 복합체를 이용한 목적 단백질의 N-말단 형광 표지화 기술의 도식도이다.
도 2a는 형광 표지된 메티오닌을 26.5분대에서 피크가 HPLC, UV(210nm) 및 형광 검출(여기파장 600nm, 방출파장 670nm)을 통해 정제한 후, Cy5 표지된 메티오닌(Cy5-Met)(670nm (파란선) 26.5분대에서 피크가, 210 nm에서 보여주는 표지되지 않은 메티오닌(붉은선) 2분대 피크가 시작하는 역-상 HPLC 및 질량 스펙트럼 데이터를 나타낸 것으로, Cy5 염료 단독은 검정선(210nm)으로 표시된다.
도 2b는 형광 표지된 메티오닌을 HPLC, UV(210nm) 및 형광 검출(여기파장 600nm, 방출파장 670nm)을 통해 형광메티오닌 정제 분석조건과 분석확인을 위해, 체류시간 질량스펙트럼 분석상 0-2분 미만에서(검정선;UV 검출) 어떠한 형광도 없는(파란선;FLD 검출기) 주요 피크를 보여주는 표지되지 않은 L-메티오닌(149.2 Da)의 HPLC 분석 및 질량 스펙트럼 데이터를 나타낸다.
도 3a는 도 2b와 동일한 목적으로 형광메티오닌 정제 분석조건과 분석확인을 위해 UPLC 조건에서, UV(210nm)를 이용한 LC-Mass(고해상도: 왼쪽 그래프, 저해상도: 오른쪽 그래프), 및 형광 검출(FLD)에 의한 정제된 형광 표지된 L-메티오닌의 피크를 분석 결과로, 각각의 반응물 L-메티오닌 단독(녹색) 및 Cy5 단독(파란색)으로부터 뚜렷한 분리를 반영하는 질량스펙트럼 분석상 9분에서 Cy5-Met(826.3 Da)의 특징적인 피크를 나타낸다.
도 3b는 도 3a 에서의 UPLC 같은 조건에서 정제된 형광메티오닌의 순수도를 확인하기 위해서 정제된 Cy5-Met(붉은색) 및 Cy5 염료 단독(대조군, 파란색)의 FLD를 이용하여 얻은 UPLC 프로파일을 분석을 나타낸 것이다. 하단 도면은 Cy5-Met(826.2 Da)의 질량에 기반한 L-메티오닌(149.2 Da)의 아민기와 Cy5 형광염료(792 Da)와 결합하면서 에스테르 화학 기(115 Da)가 제거되는 화학적 컨쥬게이션에 의한 아마이드 결합 형성을 보여주는 반응식이다.
도 4는 인 비트로 전사(In vitro transcription)를 이용하여 얻은 인간 개시 tRNA(A)(레인 1) 및 정제된 형광 메티오닌-인간 개시 tRNA 복합체(B)의 아가로즈 젤 확인 결과와, 인간 개시 tRNA(녹색) 및 Cy5-Met-표지된 개시 tRNA(파란색)의 MALDI-TOF/TOF MS 분석 결과(C)를 나타낸 것으로, 상기 (B)에서 레인 1은 Cy5 단독(검은색 화살표), 레인 2는 상기 정제된 형광 메티오닌-인간 개시 tRNA 복합체(붉은색 화살표), 레인 3은 인간 개시 tRNA(파란색 화살표: 음성 대조군)를 보여준다.
도 5는 표준 곡선 및 MTT 분석에 의한 정제된 형광 표지된 L-메티오닌의 정량화 결과(209nm)로, 아민 반응성 Cy5 단독 그래프와 L-메티오닌의 음성 대조군 피크는 각각 209nm에서 L-메티오닌(자주색)은 농도 의존적 증가 곡선인 반면에 209nm에서 Cy5 단독 그래프(파란색)은 형광농도 포화도에서도 일정한 약 0.5의 흡광도의 곡선을 일정하게 유지한다. 표준 곡선은 L-메티오닌 농도에 따른 평균 흡광도로부터 얻으며, 정제된 형광 표지된 L-메티오닌에서 L-메티오닌을 측정하기 위해 사용된다(상단 도면). MTT 분석을 통해 L-메티오닌의 농도에 따른 중간엽 세포 생존능에서 해당 흡광도를 측정하고, L-메티오닌 세포사멸 현상의 독성 결과는 매우 낮은 농도(4mM 미만)에서는 고려하지 않는다(하단 도면). 정제된 형광 표지된 L-메티오닌 정량화 실험 조건의 독성 확인을 위한 MTT 분석은 왼쪽의 L-메티오닌 표준곡선과 유사한 농도 의존적 조건에서 시행하였다.
도 6은 HeLa 세포에서 정제된 형광 메티오닌-인간 개시 tRNA 복합체를 이용한 EGFP mRNA(A) 및 단백질(B) 수준 분석 결과를 EGFP의 정량적 표지화 확인 결과로, (A)는 EGFP 발현의 형광 및 차등 간섭 조영 이미지이고, (B)는 EGFP 발현 세포의 FACS 분석 결과, (C)는 EGFP의 mRNA 수준을 보여주며, (B)에서 붉은색 그래프는 세포만을 의미하고, 파란색 그래프는 메티오닌이 첨가된 배지, 오렌지색 그래프는 메티오닌이 결핍된 배지에서 정제된 형광 메티오닌-개시 tRNA 복합체를 제공한 결과이며, (C)의 결과는 3회 독립적인 실험의 평균값을 보여주며, 표준 편차는 bar로 표시한다.
도 7은 역상 크로마토그래피에 의해 정제된 형광 메티오닌-인간 개시 tRNA 복합체의 HeLa 세포에서의 활성, HIV Tat 단백질의 합성 확인을 위한 SEC-UPLC 및 정량적 UPLC 분석 결과와, 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 단일분자 수준에서 Cy5 표지된 HIV Tat 단백질의 검출 결과를 나타낸 것으로, 쿼츠 슬라이드에 고정된 단일-분자 홀리데이 정션(양성 대조군, 왼쪽) 및 Cy5 표지된 Tat 단백질(샘플, 오른쪽)을 보여주며, Cy5 표지된 스팟(파란색 둥근 스팟, 오른쪽)은 표면에 고정된 Cy5 표지된 Tat 단백질의 TIRE 이미지로 유사한 원형 스팟의 군집수를 보여준다. 스캐일 바는 5㎛이다. 단일 Cy5 염료 블리칭 트레이스(빨간선)는 시간-형광 강도 TIRE 이미지에서 Cy5 표지된 Tat 단백질에서 관찰된다.
도 9는 역상 크로마토그래피에 의해 정제된 형광 메티오닌-인간 개시 tRNA 복합체의 HeLa 세포에서의 활성, HIV Tat 단백질의 합성 확인을 위한 UPLC 분석 결과 및 Tat 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 10은 분석 형광 스펙트럼에 의해 HeLa 세포에서 N-말단 형광 프로브 활성에 대한 Cy5 표지된 HIV Tat 단백질의 평가 결과를 나타낸 것으로, N-말단 형광 표지된 Tat 단백질의 검출은 뉴트라비딘 코팅된 96웰 플레이트에서 수행되며, C-말단 AVI-tag를 함유하는 Tat 단백질은 Ni-친화도 스핀 컬럼을 이용하여 HeLa 추출물로부터 회수된다. Cy5-표지된 비오틴이 결합된 Tat 단백질에 해당하는 형광 스펙트럼 파장은 형광 스펙트럼 측정(레드 레이저: 620-670nm)를 사용하여 분석한다.
도 11은 선행기술에 따른 Tat 단백질의 형광 표지화 결과를 보여주는 젤 사진도이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 정제된 형광 메티오닌과 진핵세포 유래의 tRNA를 반응시켜 정제된 형광 메티오닌-tRNA 복합체를 제조하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 정제된 형광 메티오닌 또는 정제된 형광 메티오닌-진핵세포 유래의 tRNA 복합체 및 목적 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 및 상기 진핵세포의 인 비트로 세포배양을 통해 목적 단백질의 합성을 유도하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 메티오닌의 형광 표지 효율을 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 정제된 형광 메티오닌 또는 정제된 형광 메티오닌-진핵세포 유래의 tRNA 복합체 및 목적 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 및 상기 진핵세포의 인 비트로 세포배양을 통해 목적 단백질의 합성을 유도하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 인 비트로 합성을 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명은 정제된 형광 메티오닌과 진핵세포 번역 시스템을 이용하여 목적 단백질의 형광 표지 효율을 개선한 기술로, 예시로, 형광 표지 메티오닌을 분리 정제한 후 개시 tRNA와 결합시켜 「형광물질-Met-tRNA 복합체」를 제조하고, 목적 단백질의 코딩 유전자를 탑재한 벡터와 상기 복합체를 인간세포에 형질전환시켜 N-말단이 형광 표지된 목적 단백질의 합성 효율과 형광 표지 효율을 개선하는 것을 특징으로 한다.
상기의 정제된 형광 메티오닌을 사용함에 따른 인간세포에서의 최적화된 조건에서 목적 단백질의 N-말단 표지화는 종래의 번역 후 과정(posttranslation)에 의한 변형으로 대장균 시스템에서는 인간 유래 단백질의 발현이 제한적인 단점을 극복한 것으로, 인간 유래 단백질을 인간세포에서 발현하여 N-말단을 100% 형광 효율로 표지화함으로써 기능적 구조적 제한 없이도 N-말단 형광 표지할 수 있는 것을 특징으로 한다. 종래의 형광 단백질 표지화 기술은 단백질을 정제한 후 형광을 선택한 영역에 형광 화학반응에 의한 목적 단백질의 구조적 제한과 목적 단백질 선택에 제한점이 있으나, 본 발명은 대부분 단백질을 정제하기 전에 세포 내에서 단백질의 번역 과정 동안 목적 단백질의 N-말단을 형광 표지한다는 점에서 N-말단 부분을 선택한 영역에만 형광 화학반응에 의한 목적 단백질의 구조적 제한과 목적 단백질의 선택의 제한이 없다. 따라서 인 비트로에서 종래 목적 단백질의 생산량과 저효율 형광 컨쥬게이션 문제를 극복하여 복잡한 형광 정제 없이 고순도의 N-말단이 형광 표지된 진핵생물의 천연 단백질을 세포내에서 생산하여서 최종적으로 인 비트로(in vitro)와 인 비보(in vivo)에서 단 분자와 나노 규모 수준에서 연구적 산업적으로 활용할 수 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 정제된 형광 메티오닌을 단독 사용하여 목적 단백질 내 연장 메티오닌의 형광 표지가 가능한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 메티오닌이 목적 단백질 서열 내에 개시 메티오닌으로만 존재하는 HIV Tat 단백질의 경우 목적 단백질의 N-말단의 형광 표지 효율이 개선될 뿐만 아니라 목적 단백질의 형광 표지가 가능하다는 점에서 목적 단백질의 합성 효율 역시 개선할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 「번역 시스템」은 천연 발생 아미노산을 합성하는데 필요한 성분을 지칭하는 것으로, 예컨대, 리보솜, tRNA, 합성효소, mRNA 등을 포함할 수 있다. 본 발명에서는 세포내 번역 시스템, 더 구체적으로 진핵세포 번역 시스템을 사용한다. 세포내 번역 시스템은 원하는 핵산 서열을 mRNA에 전사하고, mRNA를 번역할 수 있는 전세포 제제, 예컨대, 투과화된 세포 또는 세포 배양물을 포함한다.
본 명세서에서, 「진핵생물」은 진핵생물 계통 도메인에 속하는 유기체, 예컨대, 동물(포유동물, 곤충류, 양서류, 조류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 섬모충, 식물류(단자엽식물, 쌍자엽식물, 조류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 진균류, 효모, 편모충, 마포자충류, 원생생물 등을 지칭한다.
본 발명의 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체는 정제된 형광 메티오닌과 진핵세포 유래의 tRNA를 반응시켜 정제된 형광 메티오닌-tRNA 복합체를 제조할 수 있다.
상기 정제된 형광 메티오닌은 형광물질과 메티오닌을 반응시키고, 반응물에 대해 역상 크로마토그래피 및 크기 분리 크로마토그래피로 순차적으로 분리하여 정제한 것일 수 있다.
상기 형광물질은 5-카르복시플루오레세인(5-carboxyfluorescein), Dansyl, Fluorescein, Texas Red, Cascade Blue, Cascade Yellow, Erythrosin, Coumarin, NBD, Pacific Blue, PyMPO, Pyrene, Phycoerythrin, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7 또는 NBD-Phallacidin등일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 형광물질은 메티오닌과 결합하기 위한 화학반응의 구현에 적합한 유도체 형태일 수 있다. 예컨대, N-하이드록시석시니마이드 에스테르(NHS ester), 이소티오시아네이트(isothiocyanates), 카르복실산(carboxylic acids) 또는 술포닐 클로라이드(sulfonyl chlorides) 등에서 선택될 수 있다. 이러한 유도체는 합성을 통해 제조하거나, 상용화되어 있는 것을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 형광물질은 Cy5 NHS ester일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
바람직하게는, 상기 정제된 형광 메티오닌-tRNA 복합체는 Cy5 표지된 메티오닌-tRNA 복합체일 수 있다.
정제된 형광 메티오닌과 진핵세포 유래의 tRNA의 결합 반응은 축합반응, 아실화 반응, 에스테르화 반응, 또는 환원성 알킬화 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체에 따른 tRNA는 개시 tRNA 또는 메티오닐 tRNA 중 어느 하나일 수 있다. 따라서, 개시 tRNA일 경우 목적 단백질의 N-말단의 개시 메티오닌을 합성하는데 사용되고, 메티오닐 tRNA는 목적 단백질 내 연장 메티오닌 합성에 사용될 수 있다.
본 발명의 목적 단백질의 메티오닌의 형광 표지 효율을 개선하거나, 목적 단백질의 인 비트로 합성을 개선하는 방법은 도 1에 도시된 모식도를 참고하여 설명하면,
정제된 형광 메티오닌 또는 정제된 형광 메티오닌-진핵세포 유래의 tRNA 복합체 및 목적 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 및
상기 진핵세포의 인 비트로 세포배양을 통해 목적 단백질의 합성을 유도하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 진핵세포는 효모, 진균류, 포유동물, 곤충, 식물 등을 포함할 수 있다. 더 구체적으로, 진핵세포는 포유동물의 세포일 수 있다. 보다 구체적으로, 진핵세포는 인간세포일 수 있다.
상기 정제된 형광 메티오닌 또는 정제된 형광 메티오닌-진핵세포 유래의 tRNA 복합체 및 목적 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 벡터를 진핵세포에 도입하는 것은 통상의 형질전환 기법을 사용할 수 있다.
상기 벡터는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 또는 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
상기 진핵세포의 인 비트로 배양은 배지 내에 메티오닌이 결핍된 조건에서 수행될 수 있다.
상기 인 비트로 배양을 위한 배양배지, 배양조건, 배양장치 등은 진핵세포의 종류에 따라 당업자 수준에서 적절히 채택될 수 있다.
또한, 본 발명의 목적 단백질은 천연적으로 코딩된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 더 구체적으로, 종류가 제한되지 않은 인간 유래 단일 단백질일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 표지되는 메티오닌은 목적 단백질의 N-말단의 개시 메티오닌이거나, 목적 단백질 내에 존재하는 메티오닌일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, N-말단의 개시 메티오닌이 형광 표지된 목적 단백질은,
형광물질의 아미노기의 반응에 의해 형광 표지된 메티오닌을 제조하고,
인간 MetRs를 이용한 아미노아실화에 의해 상기 형광 표지된 메티오닌이 결합된 개시 tRNA를 제조하고,
진핵세포 번역 시스템에서 상기의 형광 메티오인-개시 tRNA 복합체를 이용하여 목적 단백질의 N-말단이 표지되어 합성될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 목적 단백질 내 N-말단을 제외한 메티오닌이 형광 표지된 목적 단백질은,
형광물질의 아미노기의 반응에 의해 형광 표지된 메티오닌을 제조하고,
상기 형광 표지된 메티오닌이 첨가된 세포배양배지에서 목적 단백질을 발현하는 형질전환된 진핵세포를 배양하여 연장 메티오닌이 형광 표지된 목적 단백질이 합성될 수 있다.
본 발명은 또한 형광 표지된 단일 아미노산을 정제하여 형광 강도를 측정하고, 형광이 없는 상기 단일 아미노산의 흡광도에 따라 작성된 표준 곡선에 적용하여 형광 표지된 단일 아미노산의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 형광 표지된 단일 아미노산의 정량 방법에 관한 것이다.
세포에서 아미노산의 표지화를 위해서는 형광 표지된 아미노산의 정량화가 요구된다. 아미노산이 단일-결합으로 이루어져 가시광선 영역의 흡광을 갖고 있지 않으므로 다양한 종래기술을 이용하여 아미노산을 유도체화하여 크로마토그래피 분석을 통한 복잡한 분석이 필요하고, 이에 따른 시간 소요, 유도체화를 위한 시약, 비용, 노동력 등이 필요하다. 또한, 형광 표지된 아미노산은 형광 신호를 기준으로 하여 정량하기는 불가능하다.
그러나, 본 발명은 형광 표지된 단일 아미노산의 분리 조건을 확립하고, 형광 표지 되지 않은 단일 아미노산의 파장의 분리 조건을 확립하여 형광 메티오닌을 정량할 수 있는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 메티오닌은 209 nm에서 0 내지 31.25 mM의 농도 범위에서 농도의존적인 정량곡선(직선의 기울기)을 보임을 확인하고, 이로부터 메티오닌의 농도별 흡광도의 함수를 설정하고, 이를 기준으로 하여, 형광 메티오닌의 209 nm에서의 형광 강도를 측정하여 상기 함수에 따른 정량 곡선(또는 표준 곡선)에 대입항 형광 메티오닌의 함량을 측정할 수 있다. 상기 정량 곡선의 농도 범위는 메티오닌의 포화값에 도달하기 전의 농도, 즉, 직선 기울기를 가지는 범위를 의미한다.
상기 정량 곡선은 단일 아미노산의 종류에 따라 달라질 수 있다. 즉, 단일 아미노산의 포화 농도 값과, 흡광도를 갖는 파장 범위가 단일 아미노산의 종류에 따라 달라질 수 있다.
또한, 본 발명의 형광 표지된 단일 아미노산의 정제 방법은 단일 아미노산의 종류에 따라 제한 없이 종래 알려진 기술을 채용할 수 있다. 예컨대, 형광 표지된 메티오닌의 경우 형광물질과 단일 아미노산을 반응시키고, 반응물에 대해 역상 크로마토그래피 및 크기 분리 크로마토그래피로 순차적으로 분리 정제하여 얻을 수 있다.
상기 형광물질은 상술한 바와 같고, 단일 아미노산의 종류에 따라 적절히 채용할 수 있어, 이에 제한하지는 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 정제된 형광 메티오닌-개시 tRNA 복합체의 제조
(클로닝)
정제된 형광(Cy5) 표지된 메티오닌-개시 tRNA 복합체의 활성을 확인하기 위한 모델 단백질로 enhanced green fluorescent protein(EGFP)를 이용하여 녹색형광단백질 발현 플라스미드와 HIV-1 Tat 유전자에 필요한 제한효소의 인식 서열 및 프라이머 서열을 설계하였다.
EGFP 플라스미드는 다음과 같이 구축하였다. EGFP 유전자는 플라스미드 pEGFP-N1(Clonetech)로부터 증폭하였고, 표준 제한 클로닝 방법을 이용하여 pcDNA3.1+(Invitrogen)에 삽입하였다. EGFP 유전자는 또한 KpnI 및 SalI 사이트를 이용하여 pGE-LysRS의 NdeI 및 KpnI 사이트에 연결된 HIV-1 Tat 유전자의 3'-말단에 삽입되어 플라스미드 pGE-Tat-EGFP를 생성하였다. pGEMEX-1(Promega)의 유도체인 플라스미드 pGE-LysRS를 이용하여 Tat의 발현을 위한 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드는 PCR을 위한 주형으로 이용하였다. PCR 후, 증폭은 다음의 서열을 포함하는 EcoRI Avitag Tat 프라이머를 이용하여 수행하였다:
정방향 프라이머: 5'-GGATCCATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAG-3';
역방향 프라이머: 5'-GAATTCTTATTCGTGCCATTCGATTTTCTGAGCCTCGAAGATGTCGTTCAGACCTTCCTTCGGGCCTGTCGG-3'
BamH1 및 EcoRI 제한효소 사이트는 표준 제한 클로닝 방법에 따라 형성되었고, 단편을 pcDNA3.1+(Invitrogen)에 삽입하였다.
(고순도 형광 메티오닌 정제)
시아닌5(Cy5) NHS 에스테르(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)와 L-메티오닌의 알파 아미노기의 결합을 통해 형광 메티오닌을 제조하였다. 간단히 말해, 1mg의 Cy5 NHS 에스테르를 62.5 mM 소듐 테트라보레이트 버퍼(pH8.5)에 녹였다. L-메티오닌을 첨가한 후, 혼합물을 4℃에서 오버나이트 동안 인큐베이션 하였다. 역상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography on a 1290 Infinity Ultra-High-Performance liquid chromatograpy system(Agilent) equipped with an EclipsePlus C18 column(RRHD, 1.8 ㎛; 2.1×50 mm) 및 UV 및 FLD 형광 검출 시스템을 통해 Cy5-결합된 메티오닌을 정제하였다. 용매 시스템은 용매 A[0.1% trifluoroacetic acid(99.5% 순도; Sigma) in water] 및 용매 B(0.1% TFA in acetonitrile)로 구성되고, 20-80% 솔벤트 B의 직선 구배를 통해 40분 동안 0.5 mL/min의 유속에서 수행하였다. Cy5-결합된 메티오닌을 포함하는 분획을 동결-건조로 건조하였다. 최종 분말에 최소량의 물(약 50㎕)을 첨가하여 재현탁하고, 이후 인간 개시 tRNA의 아미노아실화에 사용하였다. Cy5-결합된 메티오닌의 제조에서 결합되지 않은 메티오닌의 함량은 Acquity UPLC C18 column(BEH C18 2.1 × 100 mm, 1.8 μm, Waters, Milford, MA, U.S.A.)이 구비된 액체 크로마토그래피 질량 스펙트로메트리(LC-MS)(Ultimate 3000 RS UHPLC, Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, U.S.A.)에서 평가하였다. 용매 시스템은 용매 A[0.1% TFA (99.5% purity) in water] 및 용매 B[0.1% TFA in acetonitrile]로 구성되며, 0-100% 솔벤트 B의 직선 구배를 통해 22분 동안 0.40 mL/min의 유속에서 수행하였다. 질량 분석(Mass spectrometric analyses)은 ThermoFinnigan LCQ Deca XP plus ion trap mass spectrometer, with ESI interface(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, U.S.A.)에서 수행하였다.
(정제된 형광 메티오닌-인간 개시 tRNA 복합체의 제조)
정제된 형광(Cy5) 표지된 메티오닌-개시 tRNA 복합체를 생산하기 위한 인간 개시 tRNA를 생산하였다.
인간 개시 tRNA 유전 정보를 가진 PCR 산물을 생산하기 위한 프라이머를 제작하여 PCR을 시행하였다. 인 비트로 전사에서 주형으로 사용하고, T7 RNA polymerase(Promega) kit를 사용하여 인간 개시 tRNA 생산 시 전사 버퍼에 AMP(인간 개시 tRNA에 A 서열 첨가를 위함)를 첨가하여 생산하였다.
생산된 인간 개시 tRNA와 정제된 형광(Cy5) 표지된 메티오닌의 아미노아실화 반응을 위해 아미노아실화 버퍼(30 mM Hepes(pH 7.4), 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate 및 100 mM ATP)을 37℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 에탄올 침전 반응을 통해 상기 아미노아실 반응을 정지시켰다. 이를 위해, 아미노아실화 반응액에 대해 0.1 부피의 2.5 M NaOAc(pH 4.5) 첨가하고 페놀(10 mM NaOAc(pH 4.5)로 포화된 페놀)을 넣어 에탄올 침전 실험을 수행하여 최종 분리 정제된 형광(Cy5) 표지된 메티오닌을 개시 tRNA의 펠렛을 RNase-프리 워터에 녹여 생산하였다. 정제된 형광(Cy5) 메티오닌-개시 tRNA 복합체의 생산은 아가로즈 젤과 MALDI-TOF/TOF 5800(AB sciex) 시스템을 이용해서 확인하였다. 매트릭스 용액은 3-하이드록시피콜린산(50 g/L in H2O) 및 디암모늄 시트레이트(50 g/L in H2O)로 구성된다. 질량 정확도는 시나핀산 매트릭스에 녹인 소혈청알부민을 이용하여 외부 검량선 작성을 통해 이 크기의 tRNA에 대해 25 kDa의 약 ±0.2%가 되도록 평가하였다.
(정제된 형광 표지된 L-메티오닌의 정량화)
우선, X축의 L-메티오닌의 농도에 따른 표준 계산 그래프를 작성하였다. L-메티오닌의 농도는 31.25mM의 L-메티오닌을 희석한 농도로 하였다. Cy5 염료 단독의 수치가 그래프 내에 포함되어 있고, 형광-표지된 메티오닌의 L-메티오닌의 농도는 형광물질이 결합된 메티오닌과 표준물질의 기울기로 나누어 얻었다.
(MTT 분석에 의한 중간엽줄기세포주에서 L-메티오닌의 독성 실험 결과)
96-웰 플레이트에서, 중간엽줄기세포주의 배양된 세포를 L-메티오닌에 노출하였다. 웰의 첫 번째 열은 L-메티오닌에 노출하고, 이를 대조군으로 하였다. 웰의 두 번째 열은 2.6mM의 L-메티오닌을 노출하였다. 24시간 후, MTT 분석(EZ-Cytox Cell viability assay kit, DAEILL LAB Service Co., Seoul, Korea)을 수행하고, 450nm 파장에서 OD를 측정하였다.
(목적 단백질 합성을 위한 세포 확립)
목적 단백질 합성을 위한 인간세포로 HeLa 세포를 선택하고, 10% FBS(v/v) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(v/v)이 첨가된, 페놀 레드가 없는 MEM 배지(Welgene Inc.)에서 5% CO2에서, 37℃의 온도에서 배양하였다.
단백질 생산을 위한 트랜스펙션은 리포펙타민을 사용하여 500 ng의 플라스미드 당 2×106개의 세포 조건에서 시행하였다.
메티오닌이 제거된 배지 조성을 위해 HeLa 세포를 키운 배지를 2회 이상 세척하였다. 성장 배지로 1회 세척하고, 10×PBS(pH7.4)로 2회 세척한 후 PBS로만 1회 세척하였다. 세척 후 메티오닌이 없는 배지를 세포에 첨가하여 최소 6~12시간 5% CO2에서, 37℃의 온도에서 인큐베이션한 후, EGFP 또는 Tat 플라스미드와, 정제된 형광(Cy5) 메티오닌 단독 또는 정제된 형광(Cy5) 메티오닌-개시 tRNA(<100 pmol 당 2×106 cells) 및 L-메티오닌(Sigma catalog no. M9625)을 리포펙타민 2000을 이용하여 37℃에서 24시간 동안 트랜스펙션을 수행한 후, 5% CO2에서, 37℃의 온도에서 배양하였다.
(표지화 처리 동안 EGFP 및 HIV tat 발현의 정량 및 식별)
형광 라이브 세포에서 EGFP에 의한 녹색 형광 발현 세포를 형광현미경 하에서 관찰하였다. 형광현미경의 형광 필터 및 형광 세기 측정 조건은 다음과 같다:
EGFP의 과발현 분석은 인버티드 형광 현미경(Olympus IX71)을 이용한 레이저-유도 형광 또는 FACSVerse 플로우 사이토메트리를 이용하여 수행하였다. 형광 이미지는 같은 강도 범위로 표준화하였다. 녹색 형광(플루오레세인)을 위해서는 488-nm 레이저 라인을, 붉은색 형광을 위해서는 545-nm 라인을 이용하였다. 레이저는 20×오브젝티브를 이용하여 채널에 조준하였다; 형광 신호는 같은 렌즈에 의해 수집되고, 광학적으로 필터링되었다. 녹색 형광을 검출하기 위해, 녹색 필터 세트 EGFP 시프트 프리(BP460-495 BA510-550)를 사용하고, 붉은색 형광을 검출하기 위해, 붉은색 필터 시프트 프리(BP510-550 BA590)를 사용하였다.
정제된 형광(Cy5) 메티오닌-개시 tRNA 복합체의 활성 확인을 위해 메티오닌이 제거된 배지에서 녹색 형광 발현 HeLa 세포에 대한 EGFP 단백질 수준 분석을 위한 FACS 실험 및 mRNA 수준 분석을 위한 실시간 PCR을 수행하였다.
플로우 사이토메트리 분석은 BD FACSuite 및 Flow Jo software를 사용하여 수행하였다. 실시간 정량 PCR을 위해, RNeasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 HeLa 세포에서 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA(0.15 ㎍)은 Superscript III Reverse transcriptase(Invitrogen) 및 oligo dT 프라이밍 방법을 이용하여 한 가닥 cDNA로 전환하였다. 실시간 정량 PCR은 SYBR Green(LightCycler　 480 SYBR Green I Master, Roche) 및 LightCycler PCR 장비(Roche)를 사용하여 15 ng의 cDNA를 가지고 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 5분; 95℃에서 10초, 56℃에서 15초 및 72℃에서 20초로 40 사이클.
EGFP를 위한 올리고뉴클레오티드 정방향 프라이머: 5'-GGCACAAGCTGGAGTACAAC-3';
역방향 프라이머: 5'- ATGCCGTTCTTCTGCTTGTC-3'
모든 측정은 사람 하우스키핑유전자인 글리세알데히드-3-포스페이드 디하이드로게나아제(GAPDH)에 대해 표준화하였다.
(HeLa 세포 추출물에서 His-Tat 단백질의 정제)
메티오닌이 없는 배지를 세포에 첨가하여 공-트랜스펙션을 실시한 후 5% CO2에서, 37℃의 온도에서 24시간 동안 배양하고, 세포를 라이시스시켜 단백질을 추출하였다. 이때, 포유동물 세포 프로토콜을 위한 Tansey Lab 프로토콜의 기본 동결-융해 라이시스에 따라 600 mM KCl, 20 mM Tris-Cl(pH 7.8) 및 20% Glycerol glycerol을 각각 포함하는 FT 라이시스 버퍼를 사용하였다. 세포 용해물을 15,000 rpm에서 4℃의 온도로 15분 동안 원심분리하고, 단백질을 포함하는 맑은 상등액을 정제 분석에 사용하였다. 단백질을 포함하는 상등액을 취하고, HIV Tat 단백질을 정제하기 위해 상기 단백질의 C-말단에 His tag을 부가하여 니켈 어피니티 레진 실험을 수행하였다. 원심분리 후, 용해물의 용해성 분획을 HisPur™ Ni-NTA Spin Columns's modified protocol(Pierce Biotechnology, 88224)에 로딩하였다. 결합 및 용출을 위해 각각 pH 7.2 및 pH 5.8의 버퍼(50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride(PBS) without 10 mM imidazole)를 사용하였다.
정제된 형광(Cy5) 메티오닌을 개시 tRNA 복합체 제조를 통한 인 비트로 N-말단 고효율 형광 Tat 단백질의 합성을 확인하기 위해, 크기 분리 크로마토그래피(Size exclusion chromatography(SEC)-high performance liquid chromatography)을 수행하였다.
이를 위해, Yarra SEC-2000 column(300×7.8mm)(Phenomenex, USA)를 사용하여 Agilent HPLC 시스템에서 UPLC 및 크기 분리 크로마토그래피를 이용하여, HeLa 세포에서 N-말단 Cy5 표지된 정제된 His tag-HIV Tat 단백질을 분석하였다.
*용매 시스템은 1 mL/min의 유속에서 70분 이상 용매 B에 대해 직선 구배 없이 평형화된 용매 A[150 mM sodium chloride, 50 mM sodium]로 구성되었다.
순도(> 95%)는 크기 분리 크로마토그래피 SEC-HPLC에 의해 확인되었다. 인젝션 부피는 5-10 ㎕로 하였다.
N-말단 Cy5-표지된 단백질 발현을 위해, HeLa 세포를 3개의 6-cm 배양접시(2×104/dish, Nunc/Denmark)에 플레이팅하고, 용해시켰다.
(표지된 단백질의 질량 분석)
SDS-PAGE를 통해 N-말단 Cy5-표지된 Tat를 분리하고, 쿠마시 블루로 염색하여 식별하였으며, 젤 내 분해(in-gel digestion)를 수행하였다. LC-MS 분석은 LTQ OrbitrapVelos mass spectrometer(ThermoFinnigan, USA)으로 수행하였다. 데이터는 데이터-의존적 방식으로 전체-스캔 및 CID(collision-induced dissociation) 스펙트럼을 동시에 기록하여 얻고, Sequest(Bioworks; Thermo Electron, USA)를 이용하여 HIV-1 Tat의 서열을 비교하였다.
(N-말단 Cy5-표지된 발현된 단일 단백질 형광 검출)
단일-분자 형광 이미지는 electron multiplying charge-coupled device (EM-CCD) 카메라(iXon DV887ECS-BV, Andor Technology, South Windsor, CT, U.S.A.), 레드 레이저(Cy5, Exceisior-635-5c, Spectra Physics) 및 Visual C++program에서 기록된 프로그램(Microsoft, Seattle, WA)를 이용하여 prism type wide-field total-internal-reflection fluorescence microscope에서 얻었다. Molecular Probes®Carboxylate-modified FluoSpheres® beads(Diameter 0.2 ㎛, Invitrogen)를 통해 단일-분자 측정의 계산을 수행하였다. 비오틴이 결합된 폴리에틸렌 글리콜(biotin-PEG-SC;MW5000, Laysan Bio, Inc., Arab, AL, U.S.A.)이 코팅된 쿼츠 슬라이드를 제조하였다. DNA 표준물질(Holliday junction)은 IDTDNA (Coralville, IA)에서 구입하였다. 1mg/mL의 비오틴이 결합된 PEG(biotin-PEG-SC;MW5000, Laysan Bio, Inc.) 40mL, 0.2 mg/mL의 스트렙타비딘 (Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.) 40 mL 및 10 mM Tris:HCl(pH 7.5), 50 mM NaCl 및 50mM MgCl2(T50 버퍼)에 녹인 1050 pM의 비오틴이 결합된 홀리데이 정션 40 mL을 연속 첨가하여 홀리데이 정션 DNA를 표면에 부착하였다. T50 버퍼로 세척한 후, 스트렙타비딘과 프리 형광 백그라운드 분자가 서로 잘 분리되었는지를 확인하였다. 홀리데이 정션 및 Cy5 표지된 Tat 단백질 실험은 느린 광퇴색(photobleaching)을 위해 37℃에서 10 mM Tris:HCl(pH 7.5), 50 mM NaCl 및 산소 소거제 시스템(1mM Trolox, 1 mg/mL glucose oxidase, 0.04 mg/mL catalase, 0.4% [w/v] glucose [Sigma-Aldrich])과 더불어 20 mM Tris-HCl 이미징 버퍼(pH 8.0)에서 수행하였다. 단-분자 추적 시간, 또는 체류-시간을 얻기 위해, 300-ms 또는 1000-ms의 EM-CCM 노출 시간 중 어느 하나를 사용하였다. 단-분자 데이터 분석은 Matlab 및 IDL을 이용하여 수행하였다. Cy5-표지된 Tat 단백질을 검출하기 위해 Multi-mode Microplate reader FlexStation 3 system(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.)를 이용하였다. 단백질은 뉴트라비딘이 코팅된 고결합능의 96 웰 클리어 플레이트(Thermo Scientific)에서 스펙트럼 모드로 하여(350-750 nm) 순차적으로 희석하였다. 비오틴의 결합을 위해, HeLa 추출물에서 정제된 His tagged Tat 단백질을 0.5units의 BirAligase(AviTagTM(Avidity LLC), Aurora, CO, U.S.A.)과 함께 50 mM bicine, pH8.3, 10 mM ATP, 10 mM Mg(OAc)2, d-비오틴을 포함하는 버퍼에서 4℃에서 오버나이트동안 인큐베이션 하였다.
<실험예 1> 정제된 형광 메티오닌 및 재조합 사람 개시 tRNA의 분석
실시예 1에서 역상 크로마토그래피를 통해 정제된 형광 메티오닌(Cy5-메티오닌)과 크기 분리 크로마토그래피를 통해 정제된 형광 메티오닌에 대해 HPLC 분리 조건에 대한 고성능 질량분석기를 통해 분석을 수행하였다.
도 2a-b에 나타난 바와 같이, Cy5-표지된 메티오닌(826.2 Da)은 유리 메티오닌(Met, 149.21 Da; 210 nm)(도 2b) 및 Cy5 NHS Ester(Succinimidyl Ester) 염료 (792. Da)(도 2a)로부터 분리하였다. 특정 체류시간에서 표지되지 않은 메티오닌(적색 선), Cy5 NHS Ester dye 단독(검은 선) 및 Cy5 표지된 메티오닌(푸른색 선)(도 2a)을 보여주는 주요 피크들이 보였다. 26.5분에서 가장 높은 피크에 해당하는 Cy5 표지된 메티오닌을 수집하였다. 분석 역-상 UPLC를 이용하여 피크 분획을 추가로 분획하였다(도 3a-b). 판독 결과, 정제된 Cy5-표지된 L-메티오닌은 L-메티오닌 단독 및 Cy5 염료로부터 잘 분리되었다(도 2a-b 및 3a-b). L-메티오닌의 분자량은 0.82분에서 150 Da인 것으로 계산되었다. 분자량의 분석 결과, 0-2분에서의 피크는 정제된 Cy5-표지된 Met 및 L-메티오닌 단독의 것과는 뚜렷하게 달랐다. 0-2분에서 분자량의 차이는 Cy5-표지된 메티오닌의 형광 결합 효율로 인한 것으로 보인다. Cy5-표지된 메티오닌의 피크 분획은 825.2 Da(고-해상도 질량)의 분자량을 가지며, Cy5-표지된 메티오닌의 분자량은 826.2 Da(저-해상도 질량)이다.
상기 결과로부터, 메티오닌 단독(149.2 Da)의 질량값이 체류시간 0-2분 사이 값에서 확인되는 반면 정제된 Cy5-메티오닌 샘플 주입 후 체류시간 0-2분에서는 확인되지 않아 이는 정제된 Cy5-메티오닌의 메티오닌과 Cy5 컨쥬게이션 순도가 매우 높음을 의미하는 것이다. 따라서 HPLC 분리조건에 따른 정제된 Cy5-메티오닌의 메티오닌 질량값을 확인함으로써 고순도 정제된 Cy5-메티오닌임을 증명하였다.
인간 개시 tRNA는 인 비트로 전사를 통해 생산하고(도 4a), 인간 메티오닌 tRNA 합성효소(MetRs)를 이용하여 Cy5-메티오닌과 컨쥬게이션 시켰다(도 4b). 정제된 Cy5-표지된 Met-하전된 인간 개시 tRNA를 MALDI-TOF로 분석하고 메티오닌 결합 전에 인간 개시 tRNA와 비교하였다(도 4c). 분자량의 차이는 개시 tRNA의 3‘-말단에 첨가된 Cy5-표지된 메티오닌 모이어티를 반영한다.
<실험예 2> L-메티오닌의 계산 곡선
세포에서 표지화에 사용하기 위해서는 형광 메티오닌을 정량할 필요가 있다. 아미노산의 분석은 복잡하여 정량화에 대한 보고가 없고, 형광 메티오닌을 정량하기 위해서는 형광 신호를 기준으로 정량화는 불가능하다. Cy5 단독의 경우 매우 낮은 농도 또는 고농도 즉 농도 의존적인 포화값이 209nm에서 확인된다. 또한, 메티오닌 단독으로는 농도 의존적으로 209nm에서 증가하는 표준 곡선이 그려진다.
일반적으로, 세포 배지에는 아미노산들이 일정 농도 첨가된다. DMEM 배지의 경우 소량의 L-메티오닌(0.1 mM, 15 mg/L)이 존재한다. 따라서, 형광 메티오닌을 정량적으로 사용해야 하는 세포 배지에 첨가할 경우 정량된 형광 메티오닌이 필요하다. 그러나, 형광 신호로는 정량화가 안되나, Cy5가 농도 의존적인 포화값을 보이고, 메티오닌 단독 역시 농도 의존적인 정량 곡선이 가능하므로 이로부터 형광 메티오닌을 정량화할 수 있다. 즉, 메티오닌을 표준 물질로 한 표준 곡선을 계산하고, 형광 메티오닌의 209nm에서의 Y값을 읽으면 형광 메티오닌의 정량이 가능하다(도 5).
또한, 정제된 형광-결합된 L-메티오닌과 정제된 형광-결합되지 않은 L-메티오닌의 상기 정량 곡선과 유사한 농도에서 세포 독성 여부를 확인하기 위해 MTT 분석을 수행하였다.
중간엽줄기세포에서 L-메티오닌 단독에 해당하는 450nm 파장에서의 피크 흡광도가 보였다(도 5, 자주색 피크). 또한, L-메티오닌의 투여량(2.3 mM~75mM, 15g~30g/L)은 다른 살아있는 세포의 비율이 대조군과 L-메티오닌 처리군에서 유의적인 차이가 없었다. 즉, 정량 곡선과 유사한 고농도의 메티오닌은 세포에 대해 독성 효과가 미미하였다. 결과적으로, 정상 세포 배지에서 L-메티오닌의 훨씬 낮은 농도(0.1 mM, 15 mg/L)에서도 어떠한 독성을 보이지 않았다.
<실험예 3> 재조합 인간 개시 tRNA를 이용한 EGFP 단백질 발현의 분석
정제된 형광 메티오닌-개시 tRNA 복합체의 활성을 확인하기 위해, 포유동물 세포에서 테스트 단백질로 EGFP를 사용하였다. HeLa 세포에 Cy5-표지된 tRNA 및 EGFP 플라스미드를 함께 형질전환시킨 후, EGFP 양성 세포를 형광 현미경을 이용하여 모니터닝하였다(도 6a). 메티오닌이 없는 배지(met-) 및 메티오닌이 함유된 배지(met+)를 EGFP 발현을 위한 대조군으로 사용하였다. 만약에 있다손 치더라도, met-에서 EGFP는 약하게 발현되어 낮은-수준의 내재성 met-개시 tRNA에 의해 번역이 개시되었음을 반영한다. 반면, EGFP-발현 세포는 met+ 배지에서 크게 증가하였다(도 6a). met- 배지에 정제된 Cy5-met 개시 tRNA(Cy5-met+)가 첨가될 때, met+ 배지에서 관찰되는 것과 유사하게 EGFP 발현 세포가 뚜렷하게 관찰되었다.
다음으로, FACS 분석에 의한 EGFP 발현 세포, 및 qRT-PCR에 의한 그들의 mRNA 수준의 증가 확인 및 정량화하였다(도 6b 및 6c). FACS 데이터의 오버레이 결과, 외부에서 넣어준 정제된 Cy5-Met 개시 tRNA에 의해 EGFP 발현 세포는 met+ 대조군과 비교하여 필적할 만 하였다(도 6b). 더욱이, qRT-PCR을 통해 시험된 바와 같이 EGFP-특이 mRNA 수준은 met+ 대조군 및 정제된 Cy5-met+ 형질전환 간에 유사하였다(도 6c). 이 결과는 전사의 활성적 개시가 형질전환에 의해 도입된 외부의 형광 표지된 tRNA에 의해 영향을 받을 수 있음을 보여준다.
<실험예 4> Tat 단백질의 N-말단 표지화 분석
형광 표지된 Tat 단백질의 형광(Cy5: 600-670 nm)파장과 단백질(280 nm) 파장이 7.8분에서 형광과 단백질 피크가 다 겹치는 부분의 목적 단백질이 있는지 웨스턴 블랏 장비(The Simple Western™ system인 WES.(Protein Simple, San Jose, Ca)로 확인하고, LC-Mass(LTQ OrbitrapVelos(Thermo Fisher Scientific-SEQUEST 프로그램)를 사용하였다.
도 7은 IDL 스크립트로 가공하여 레드 서클군집수를 비교해서 각각의 불루 스팟의 Cy5 형광 강도 프로필을 인식하고 추출한 대표적인 형광 단일-분자 이미징을 보여준다. 아울러, 합성된 단백질의 웨스턴 블랏 결과를 보여준다.
단일분자 수준에서의 형광 표지된 Tat 단백질의 형광 이미지를 홀리데이 졍션 양성 대조군 형광 이미지와 전체적인 집단을 비교함으로써 단일분자 형광 이미지 확인에 대한 단일분자 수준의 형광 표지된 Tat 단백질이 N-말단에 표지됨을 확인하였다. 이 결과는 기존의 방법(홀리데이 정션: 화학적 합성을 이용한 DNA의 형광 표지화)과 비교한 형광 레드 서클군집수의 이미지를 비교해서 보여준다. 즉, 화학적 합성에 의한 형광 표지법에 의한 형광 이미지와 본 발명의 정제된 형광 메티오닌-인간 개시 tRNA를 이용하여 Tat 단백질에 형광 표지하여 얻은 이미지를 비교한 단분자 추적 결과인 것이다. 따라서 세포내에서 N-말단에 메티오닌에 의한 단백질 분해 조절기작에도 불구하고 단일분자 수준의 형광 표지된 Tat 단백질이 N-말단에 표지가 가능함을 증명하였다.
또한, Cy5 형광 스팟과 피크가 도 8에서 관찰된 Cy5 여기 스펙트럼으로부터 명확하게 관찰되었다.
<실험예 5> 재조합 인간 개시 tRNA 반응성
역상 크로마토그래피로 분리 정제된 형광 메티오닌-개시 tRNA 복합체의 인 비트로에서 목적 단백질의 N-말단 고효율 형광 표지화를 증명하기 위해, 서열 내에 개시 메티오닌만이 포함되어 있는 HIV Tat을 모델 단백질로 사용하여 확인하였다. 이를 위해, 정제된 형광 메티오닌 또는 정제된 형광 메티오닌-개시 tRNA 복합체를 사용하였다. 음성 대조군으로 형광 표지된 개시 tRNA(Cy5tRNA)를 사용하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, 정제된 형광 메티오닌을 사용한 경우에 비해 정제된 형광 메티오닌-개시 tRNA 복합체를 사용한 경우 형광 효율이 현저히 높았다.
역상 크로마토그래피로 분리 정제된 형광 메티오닌에 대해 크기 분리 크로마토그래피를 수행하고, 상기와 동일한 실험을 수행하였다.
좀 더 정확한 목적 단백질의 N-말단 고효율 형광 표지화 확인을 위하여 Avi tag과 His tag의 복합 Tag으로 구성된 HIV Tat 단백질의 C-말단이 포함된 플라스미드를 제작하고, 상기 플라스미드, 분리 정제된 메티오닌 또는 분리 정제된 형광 메티오닌-개시 tRNA 복합체를 HeLa 세포에 도입하였다. 아비텍과 스트렙타비딘(Avi tag-Streptavidin) 또는 아비텍과 뉴트라비딘(Avi tag-Neutravidin)의 강한 결합력을 통한 단일 단백질 수준의 형광 효율은 단분자 실험이 가능한 터프 현미경(TIRF microscopy-최소 100 pmole 농도 단백질 측정)과 뉴트라비딘이 코팅된 검정 96 플레이트(Thermo Scientific - 최소 15 pmole 농도 단백질 측정 가능; ELISA 분석 장치)를 사용하여 측정하였다. 이를 위해, 아비텍이 포함된 His Tag으로 정제된 Tat 단백질을 0.5 유닛의 BirA ligase(Avidity)를 이용하여 50 mM bicine, pH 8.3, 10 mM ATP, 10 mM Mg(OAc)2 및 d-biotin를 포함하는 버퍼에서 뉴트라비딘 코팅 여부에 따라 Avi tag-Neutravidin-정제된 형광(Cy5) Tat 단백질을 바이오티닐화 과정을 통해 96 플레이트 리더기 플렉스테이션 (Multi-mode Microplate reader FlexStation 3 system)(Molecular Devices)에서 형광 Cy5 스펙트럼 형광 검출(여기 파장: 620 nm, 방출 파장: 670 nm) 값으로 확인하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, Avi tag과 His tag의 복합 Tag으로 구성된 HIV Tat 단백질의 형광 표지를 확인하였다.
<비교예 1> 선행기술과의 비교
선행기술인 인트론사의 방법으로 HeLa 세포와 프로메가사의 토끼의 망상적혈구에서 진핵세포 시스템을 적용하여 메티오닌이 제거된 실험 조건에서 실험을 수행한 후 SDS-GEL을 통해 목적 단백질의 형광 효율을 비교하였다.
인트론사의 기술은 분리 정제되지 않은 메티오닌을 사용하여 목적 단백질을 형광 표지하는 것으로, 대조군인 HeLa 세포 단독에서도 목적 단백질인 Tat 단백질(15 kDa) 부위에 형광 밴드가 보이지만 목적 단백질 발현 부위의 형광 발현 단백질 밴드 형광이 발현된 부위를 LC-mass로 확인한 결과 목적 단백질 Tat 단백질이 발현되지는 않았다. 이는 주위의 내재한 비특이적 형광 발현 비율과 목적 단백질의 낮은 형광 표지 효율로 인해 소량의 진핵세포 번역 시스템에서의 적용으로 젤 상에서는 분석이 되지 않았다(도 11).
이러한 비교 실험을 통해 본 발명의 정제된 형광 메티오닌을 이용하여 목적 단백질을 형광 표지하는 경우 목적 단백질의 합성 효율뿐만 아니라 형광 표지 효율을 함께 개선함을 알 수 있었다.

Claims (19)

  1. 정제된 형광 메티오닌과 진핵세포 유래의 tRNA를 반응시켜 정제된 형광 메티오닌-tRNA 복합체를 제조하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    정제된 형광 메티오닌은 형광물질과 메티오닌을 반응시키고, 반응물에 대해 역상 크로마토그래피 및 크기 분리 크로마토그래피로 순차적으로 분리하여 정제한 것인, 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    형광물질은 5-카르복시플루오레세인(5-carboxyfluorescein), Dansyl, Fluorescein, Texas Red, Cascade Blue, Cascade Yellow, Erythrosin, Coumarin, NBD, Pacific Blue, PyMPO, Pyrene, Phycoerythrin, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7 및 NBD-Phallacidin로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체의 제조방법.
  4. 제2항에 있어서,
    형광물질은 N-하이드록시석시니마이드 에스테르(NHS ester), 이소티오시아네이트(isothiocyanates), 카르복실산(carboxylic acids) 및 술포닐 클로라이드(sulfonyl chlorides)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 반응성 유도체인, 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    정제된 형광 메티오닌-tRNA 복합체는 Cy5 표지된 메티오닌-tRNA 복합체인, 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    반응은 축합반응, 아실화 반응, 에스테르화 반응, 또는 환원성 알킬화 중 어느 하나인, 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    tRNA는 개시 tRNA 또는 메티오닐 tRNA 중 어느 하나인, 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체의 제조방법.
  8. 정제된 형광 메티오닌 또는 정제된 형광 메티오닌-진핵세포 유래의 tRNA 복합체 및 목적 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 및
    상기 진핵세포의 인 비트로 세포배양을 통해 목적 단백질의 합성을 유도하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 메티오닌의 형광 표지 효율을 개선하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    정제된 형광 메티오닌은 형광물질과 메티오닌을 반응시키고, 반응물에 대해 역상 크로마토그래피 및 크기 분리 크로마토그래피로 순차적으로 분리하여 정제한 것인, 목적 단백질의 메티오닌의 형광 표지 효율을 개선하는 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    진핵세포는 포유동물의 세포를 포함하는, 목적 단백질의 메티오닌의 형광 표지 효율을 개선하는 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    진핵세포의 배양은 메티오닌 결핍 조건에서 수행되는, 목적 단백질의 메티오닌의 형광 표지 효율을 개선하는 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    목적 단백질은 천연적으로 코딩된 아미노산 서열을 갖는 것인, 목적 단백질의 메티오닌의 형광 표지 효율을 개선하는 방법.
  13. 제8항에 있어서,
    메티오닌은 목적 단백질의 N-말단의 개시 메티오닌이거나, 목적 단백질 내에 존재하는 메티오닌인, 목적 단백질의 메티오닌의 형광 표지 효율을 개선하는 방법.
  14. 정제된 형광 메티오닌 또는 정제된 형광 메티오닌-진핵세포 유래의 tRNA 복합체 및 목적 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 및
    상기 진핵세포의 인 비트로 세포배양을 통해 목적 단백질의 합성을 유도하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 인 비트로 합성을 개선하는 방법.
  15. 형광 표지된 단일 아미노산을 정제하여 형광 강도를 측정하고, 형광이 없는 상기 단일 아미노산의 흡광도에 따라 작성된 표준 곡선에 적용하여 형광 표지된 단일 아미노산의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 형광 표지된 단일 아미노산의 정량 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    형광 표지된 단일 아미노산은 형광물질과 단일 아미노산을 반응시키고, 반응물에 대해 역상 크로마토그래피 및 크기 분리 크로마토그래피로 순차적으로 분리하여 정제하는, 형광 표지된 단일 아미노산의 정량 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    단일 아미노산은 메티오닌을 포함하는, 형광 표지된 단일 아미노산의 정량 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    형광물질은 5-카르복시플루오레세인(5-carboxyfluorescein), Dansyl, Fluorescein, Texas Red, Cascade Blue, Cascade Yellow, Erythrosin, Coumarin, NBD, Pacific Blue, PyMPO, Pyrene, Phycoerythrin, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7 및 NBD-Phallacidin로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, 형광 표지된 단일 아미노산의 정량 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    형광이 없는 메티오닌의 표준 곡선은 0 내지 31.25 mM의 농도 범위에서 측정된 209 nm에서의 흡광도의 함수를 갖는 것인, 형광 표지된 단일 아미노산의 정량 방법.
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