CN114324523A - 一种体外药物代谢实时检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外药物代谢实时检测方法，包括如下步骤：将未经前处理的含大黄素的代谢体系溶液稀释后作为检测溶液，以亲脂胶束‑纳米均孔膜修饰的ITO电极作为工作电极，铂电极和银/氯化银电极分别作为对电极和参比电极，采用电化学方法，将待测溶液搅拌富集后，实现对代谢体系中的大黄素的快速、灵敏检测。本发明使用的亲脂胶束‑纳米均孔膜修饰电极集选择性富集和电化学检测功能于一体，检测的灵敏度高，检测限低；同时工作电极制备简单，无需对样品进行复杂的前处理，通过二氧化硅纳米孔道的尺寸选择性，即可实现代谢体系中其他成分存在下对大黄素的快速筛分和定量检测。

Description

一种体外药物代谢实时检测方法

技术领域

本发明涉及一种电化学实时检测方法，尤其涉及一种体外药物代谢实时检测方法。

背景技术

大黄素（Emodin）是一种天然的蒽醌类化合物，具有泻下、抗炎、抗菌、降血压及保护肝脏等多种药理活性。大黄素是大黄、何首乌、番泻叶等中药中的主要有效成分及毒性成分。该类中药材被广泛应用于保健和减肥食品中。但是近年来有关服用此类产品引起肝肾损伤的报道逐渐增多。大量研究表明大黄素使用剂量过高或长时间服用而导致体内蓄积，是其产生肝肾毒性的主要原因。药物代谢通常分为Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢，脂溶性的大黄素主要通过Ⅱ相代谢中的葡萄糖醛酸化途径，产生极性增强的代谢物，从而易于排出体外。因此，葡萄糖醛酸化在大黄素代谢解毒中发挥重要作用。研究大黄素的葡萄糖醛酸化通路对于大黄素代谢机理及解毒途径的解析具有重要意义。

肝微粒体体外代谢模型是研究药物代谢最常见的模型，也是药物代谢体外研究的经典方法之一。目前研究大黄素葡萄糖醛酸化通路常见的方法是检测肝微粒体葡萄糖醛酸化体外代谢模型中大黄素的代谢情况，主要检测指标是大黄素的代谢剩余量或代谢产物的增加量，由于缺乏相应代谢产物的标准品，所以文献报道的常见方法是检测大黄素的代谢剩余量。常用的检测技术有高效液相色谱-紫外法（HPLC-UV）、液相色谱-质谱法（LC-MS）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）。

上述方法均需要对代谢样品进行复杂的前处理，需要在将代谢反应终止后，经过离心、过滤、氮气下吹干、复溶等操作，方可进行检测。操作繁琐、耗时长，可能会严重影响检测结果的重复性。而在考察大黄素代谢随时间的变化时，由于需要终止代谢反应，这些方法均无法实现对同一代谢体系不同时间点的实时检测。

此外，肝微粒体代谢模型简单，对应的检测技术却需要复杂昂贵、操作要求高的大型仪器设备，这些均不利于大黄素葡萄糖醛酸化代谢研究的进行。

发明内容

发明目的：本发明旨在提供一种操作简便快速、成本低、灵敏度高的体外药物代谢实时检测方法。

技术方案：本发明所述的一种体外药物代谢实时检测方法，包括如下步骤：将未经前处理的含大黄素的代谢体系溶液稀释后作为检测溶液，以亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极作为工作电极，铂电极和银/氯化银电极分别作为对电极和参比电极，采用电化学方法，将待测溶液搅拌富集后，实现对代谢体系中的大黄素的快速、灵敏检测。

优选地，所述亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极由Stöber溶液生长法制备得到。所述亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极的制备方法具体包括：将十六烷基三甲基溴化铵溶解于水中，依次加入乙醇，氨水和四乙氧基硅烷，搅拌至澄清，将洗净的ITO电极浸入上述溶液中，密封，于水浴中静置生长；反应结束后用大量的纯水冲洗电极表面，氮气吹干，过夜老化，得到亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极。

优选地，所述纳米均孔膜的孔径为2~3 nm。二氧化硅纳米孔道的孔径为2~3 nm，具有尺寸选择性，可以排阻代谢体系中尺寸大于孔径的物质（如肝微粒体、丙甲菌素）进入胶束，而选择性富集大黄素。因此，该电极不需要进行复杂的前处理，就可实现复杂背景下（代谢体系中其他成分存在时）低浓度大黄素的定量检测。

优选地，所述电化学方法为差示脉冲伏安法。

优选地，所述电化学方法测试时的电解质溶液为0.02~0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为6~8。

优选地，所述富集方法为机械搅拌富集1~4 min。

本方法的检测原理是：电化学方法具有操作简单、成本低、灵敏度高等优点。而电极经过纳米材料修饰，可以提高对待测分子的富集能力，改善检测性能。通过Stöber溶液生长法在电极表面合成的垂直二氧化硅纳米孔道排列有序，孔径在2~3 nm，孔道内由表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）形成的圆柱形亲脂性胶束均匀填充。CTAB的长烷基链通过疏水作用聚集在一起形成疏水腔，通过疏水作用可以萃取、富集水溶液中的脂溶性小分子，提高检测灵敏度。

本发明采用的亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极中，亲脂胶束通过其疏水作用，在机械搅拌的辅助下，代谢体系中的脂溶性大黄素分子被富集到胶束中，并在电极表面发生电化学还原，以大黄素还原峰电流作为检测信号，根据用已知浓度的大黄素检测信号所作的标准曲线，可以计算出代谢体系中剩余大黄素的浓度。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：（1）灵敏度高，亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极集选择性富集和电化学检测于一体，检测的灵敏度高，检测限低。本发明以亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极作为工作电极，通过疏水胶束的富集作用，可以实现对肝微粒体葡萄糖醛酸化体外代谢体系中大黄素的灵敏检测，最低检测限0.46 nM。本发明的检测方法还可以拓展到其他脂溶性小分子药物的葡萄糖醛酸化代谢研究，如其他蒽醌类化合物、菲醌类化合物；（2）操作简便快速，成本低，工作电极制备简单，样品检测成本远低于目前常用的大型仪器，并且无需对样品进行复杂的前处理，通过二氧化硅纳米孔道的尺寸选择性，可以实现代谢体系中其他成分存在下对大黄素的快速筛分和定量检测。

附图说明

图1（a）为实施例1亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极在加有不同浓度大黄素的电解质溶液中的差示脉冲伏安曲线；图1（b）为大黄素的还原峰电流和浓度的标准曲线；

图2为实施例1大黄素在代谢体系中代谢不同时间后（0 min，15 min，30 min，60min，90 min，120 min），使用亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极检测得到的差示脉冲伏安曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

（1）亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极的合成

a. ITO电极的清洗：将ITO电极切割成2.5 cm×5 cm大小，在1 M NaOH的乙醇溶液中浸泡过夜，然后依次在丙酮、乙醇、水中各超声15 min，氮气吹干，备用。

b. 电极的修饰：修饰电极是通过Stöber溶液生长法制备得到，具体步骤如下：称取0.16 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），用70 mL水溶解，依次加入30 mL乙醇，10 μL氨水，80 μL四乙氧基硅烷（TEOS），搅拌至澄清，将干净的ITO电极浸入上述溶液中，密封，60 °C水浴中静置生长24 h。

c. 修饰电极的老化：反应结束后用大量的纯水冲洗电极表面，氮气吹干，100 ℃过夜老化，得到亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极，纳米均孔膜的孔径为2~3 nm。

（2）使用亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极，检测纯电解质溶液中大黄素的电化学过程：

以10 mL，0.1 mol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液作为电解质溶液。采用三电极体系：亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极、铂电极和银/氯化银电极分别作为工作电极、对电极和参比电极。

将大黄素溶于甲醇中配制成储备液，并用甲醇稀释为一系列浓度的标准溶液添加至电解质溶液中作为待测溶液（大黄素的浓度分别为1 nM、5nM、10 nM、50 nM、100 nM、200nM、300 nM），搅拌富集3 min后进行差示脉冲伏安检测。

图1（a）为亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极在加有不同浓度大黄素的电解质溶液中的差示脉冲伏安曲线。从图1（a）中可以看出，加入大黄素后，在-0.6 V处出现还原峰；随着加入大黄素浓度的提高，-0.6 V处的还原峰电流增加，说明该电位处的还原峰是大黄素的特征峰。图1（b）为大黄素的还原峰电流和浓度的标准曲线。曲线回归方程为Y = -0.25916 X + 0.12707，R²=0.99579，线性范围为1 nM~300 nM，检测限为0.46 nM。

（3）使用亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极，检测代谢体系中大黄素的电化学过程：

大黄素肝微粒体葡萄糖醛酸化体外代谢过程：

代谢体系：50 mM Tris-HCl（pH 7.4），50 mM MgCl₂，12.5 μg/mL大鼠肝微粒体，25μg/mL丙甲菌素，1 mM尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），不同浓度大黄素。

操作步骤：将除UDPGA之外所有溶液混匀，37 ℃水浴预孵育5 min后加入UDPGA，启动代谢反应，混匀，37 ℃水浴孵育。取一定体积孵育不同时间点的代谢溶液进行电化学检测。

图2为大黄素在代谢体系中代谢不同时间后（0 min，15 min，30 min，60 min，90min，120 min），使用亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极检测得到的差示脉冲伏安曲线。从图2中可以看出，0 min时，只有-0.6 V处的大黄素还原峰。随着代谢时间的延长，大黄素还原峰电流逐渐减弱，-0.47 V处出现还原峰并逐渐增强，表明此峰为大黄素葡萄糖醛酸化代谢物的还原峰。随着代谢时间的延长，大黄素还原峰电流逐渐减弱，代谢物还原峰电流逐渐增强。大黄素与其葡萄糖醛酸化代谢物的还原峰位置不同，代谢物信号不会显著干扰大黄素的检测。

实施例2

（1）亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极的合成

a. ITO电极的清洗：将ITO电极切割成2.5 cm×5 cm大小，在1 M NaOH的乙醇溶液中浸泡过夜，然后依次在丙酮、乙醇、水中各超声15 min，氮气吹干，备用。

b. 电极的修饰：修饰电极是通过Stöber溶液生长法制备得到，具体步骤如下：称取0.16 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），用70 mL水溶解，依次加入30 mL乙醇，10 μL氨水，80 μL四乙氧基硅烷（TEOS），搅拌至澄清，将干净的ITO电极浸入上述溶液中，密封，60 ℃水浴中静置生长24 h。

c. 修饰电极的老化：反应结束后用大量的纯水冲洗电极表面，氮气吹干，100 ℃过夜老化，得到亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极，纳米均孔膜的孔径为2~3 nm。

（2）使用亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极，检测纯电解质溶液中大黄素的电化学过程：

以10 mL，0.02 mol/L，pH值为6的磷酸盐缓冲溶液作为电解质溶液。采用三电极体系：亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极、铂电极和银/氯化银电极分别作为工作电极、对电极和参比电极。

将大黄素溶于甲醇中配制成储备液，并用甲醇稀释为一系列浓度的标准溶液添加至电解质溶液中作为待测溶液，搅拌富集4min后进行差示脉冲伏安检测。

（3）使用亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极，检测代谢体系中大黄素的电化学过程同实施例1。

实施例3

（1）亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极的合成

a. ITO电极的清洗：将ITO电极切割成2.5 cm×5 cm大小，在1 M NaOH的乙醇溶液中浸泡过夜，然后依次在丙酮、乙醇、水中各超声15 min，氮气吹干，备用。

b. 电极的修饰：修饰电极是通过Stöber溶液生长法制备得到，具体步骤如下：称取0.16 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），用70 mL水溶解，依次加入30 mL乙醇，10 μL氨水，80 μL四乙氧基硅烷（TEOS），搅拌至澄清，将干净的ITO电极浸入上述溶液中，密封，60 ℃水浴中静置生长24 h。

c. 修饰电极的老化：反应结束后用大量的纯水冲洗电极表面，氮气吹干，100 ℃过夜老化，得到亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极，纳米均孔膜的孔径为2~3 nm。

（2）使用亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极，检测纯电解质溶液中大黄素的电化学过程：

以10 mL，0.5 mol/L，pH值为8的磷酸盐缓冲溶液作为电解质溶液。采用三电极体系：亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极、铂电极和银/氯化银电极分别作为工作电极、对电极和参比电极。

将大黄素溶于甲醇中配制成储备液，并用甲醇稀释为一系列浓度的标准溶液添加至电解质溶液中作为待测溶液，搅拌富集4min后进行差示脉冲伏安检测。

（3）使用亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极，检测代谢体系中大黄素的电化学过程同实施例1。

Claims (7)

1.一种体外药物代谢实时检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将未经前处理的含大黄素的代谢体系溶液稀释后作为检测溶液，以亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极作为工作电极，铂电极和银/氯化银电极分别作为对电极和参比电极，采用电化学方法，将待测溶液搅拌富集后，实现对代谢体系中的大黄素的快速、灵敏检测。

2.根据权利要求1所述的体外药物代谢实时检测方法，其特征在于，所述亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极由Stöber溶液生长法制备得到。

3.根据权利要求1或2所述的体外药物代谢实时检测方法，其特征在于，所述亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极的制备方法具体包括：将十六烷基三甲基溴化铵溶解于水中，依次加入乙醇，氨水和四乙氧基硅烷，搅拌至澄清，将洗净的ITO电极浸入上述溶液中，密封，于水浴中静置生长；反应结束后用大量的纯水冲洗电极表面，氮气吹干，过夜老化，得到亲脂胶束-纳米均孔膜修饰的ITO电极。

4.根据权利要求1所述的体外药物代谢实时检测方法，其特征在于，所述纳米均孔膜的孔径为2~3 nm。

5.根据权利要求1所述的体外药物代谢实时检测方法，其特征在于，所述电化学方法为差示脉冲伏安法。

6.根据权利要求1所述的体外药物代谢实时检测方法，其特征在于，所述电化学方法测试时的电解质溶液为0.02~0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为6~8。

7. 根据权利要求1所述的体外药物代谢实时检测方法，其特征在于，所述富集方法为机械搅拌富集1~4 min。

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