CN106093172A - 一种人血中抗生素含量的电化学检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人血中抗生素含量的电化学检测方法，包括如下步骤：将未进行前处理的人血用电解质溶液稀释后作为检测溶液，所述检测溶液中抗生素的浓度为0.1～15ppm，以垂直有序介孔二氧化硅孔道‑胶束复合膜修饰的电极为工作电极，采用电化学方法，对人血中的抗生素含量进行检测。本发明采用垂直有序介孔二氧化硅孔道‑胶束复合膜修饰的电极，通过疏水作用，生物样本中疏水、电中性的抗生素被萃取\富集到胶束微腔中，以抗生素的还原峰电位为检测信号，实现人血中抗生素的原位检测，检测灵敏度高、响应时间短、检测限低、抗干扰稳定性好，对临床评估抗生素疗效具有重要的参考价值。

Description

一种人血中抗生素含量的电化学检测方法

技术领域

本发明属于电化学传感领域，尤其涉及一种人血中抗生素含量的检测方法。

背景技术

血液成分存在着多样性、复杂性，并且涉及到生物体的生理过程，因此血液中成分的准确、快速、低成本检测具有一定的难度。但由于其在生命科学以及人类生活中所呈现出来的重要作用，目前世界范围内生命科学家、分析学家、医学专家都在积极探索血液成分检测的高效途径。

抗生素又称抗菌素，是由一些微生物合成的、能抑制或杀灭某些病原体的化学物质。抗生素对人类健康水平的提高和生命安全的保障起到了极其重要的作用，因此该类药物被广泛地应用于临床、兽药、农业等方面。现有抗生素的种类已达几千种，常按以下方式分类：β-内酰胺类、四环素类、氨基糖甙类、大环内脂类、氟喹诺酮类、氯霉素类等。然而随着人类对抗生素药物所引起的耐药性以及长时间摄入含有抗生素的动物源性食品对人体的危害问题的持续关注，抗生素药物滥用的问题已经引起了研究人员的浓厚兴趣，研究者们开始致力于开发分析测定方法来检测人血中抗生素的含量。

目前，研究测定人血中抗生素的方法有微生物法、色谱分析法、分光光度法、化学发光分析法、免疫分析法、共振瑞利散射法等，这些方法都需要对人血样品进行复杂的前处理过程，如过滤、离心、萃取等，这些复杂的预处理过程使得测定结果极易受干扰。除此之外，耗时长、大型仪器昂贵、专门的仪器操作人员等特点，已难以满足当前分析要求和发展趋势，限制了这些方法在实际生活中的应用。电化学方法由于其操作简单，价格低廉、响应速度快、灵敏度高、选择性好和不受生物样品的混浊度干扰等优点，可以实现对人血中抗生素含量的快速、实时、在线监测。

介孔二氧化硅是一类孔径在2～50nm、孔道取向垂直于基底的新型多孔材料，该类材料因其具有独特的孔径结构、大的比表面积和介孔孔容、超强的吸附能力等，在吸附、催化、污水处理、生物传感等领域表现出了诱人的应用前景。

近年来，科研工作者们采用溶液生长法(Angew.Chem.Int.Ed.,2012,51,2173-2177)和电化学辅助自组装法(Nat.Mater.,2007,6,602-608)等方法，诱导了表面活性剂模板分子自助装和有机硅烷分子水解/缩聚的协同反应，在固体表面(金、铂、玻碳、导电玻璃、石墨电极、丝网印刷电极等)制备了孔径为2～3nm且垂直有序的介孔二氧化硅孔道和胶束的复合膜，简称为孔道-胶束复合物膜。孔道取向垂直于基底的二氧化硅，使得溶液中的分析物能够进入孔道并在电极表面发生有效的电子转移，为电化学分析提供了可能。

发明内容

本发明提供一种基于垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜的电化学检测人血中抗生素含量的方法，该方法检测灵敏度高，抗生物污染的能力强，检测限低的不需要复杂的预处理过程。

本发明所提供的人血中抗生素的电化学检测方法的具体步骤如下：

将未进行前处理(过滤、提纯等操作)的人血用电解质溶液稀释后作为检测溶液，以垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的电极为工作电极，采用电化学方法，对人血中的抗生素含量进行检测。

本发明采用电化学方法，以垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的电极为工作电极，铂丝电极和银/氯化银分别为对电极和参比电极，对人血中抗生素进行快速电化学检测。

作为优选，所述电解质溶液为氯化钠水溶液、氯化钾水溶液、硫酸钠水溶液、硝酸钠水溶液、硝酸钾水溶液、磷酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲溶液或tris-盐酸缓冲溶液中的一种；进一步优选氯化钠水溶液。所述电解质溶液浓度为0.02～0.5mol/L，进一步优选为0.1～0.2mol/L；所述电解质溶液的pH值为6～8，进一步优选为6～7。作为优选，人血样品用电解质溶液稀释，稀释倍数为1～100倍，进一步优选为10倍。

作为优选，所述工作电极为垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的如下电极：氧化铟锡(ITO)电极、氟掺杂氧化锡电极、金电极、铂电极、玻碳电极、石墨电极或丝网印刷电极中的一种，进一步优选为ITO电极。作为优选，所述工作电极为垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的ITO电极。

作为优选，所述工作电极为垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的电极。所述工作电极可采用现有的制备方法，如溶液生长法或电化学辅助自组装法，进一步优选为溶液生长法。

作为优选，所述胶束为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或双子表面活性剂中的一种组成，进一步优选为CTAB。

作为进一步优选，所述工作电极为垂直有序介孔二氧化硅孔道-十六烷基三甲基溴化铵胶束复合膜修饰的ITO电极。垂直有序介孔二氧化硅阵列的孔径为2～3nm。对所述工作电极进行分析，从上至下分别垂直介孔二氧化硅孔道-胶束复合物膜层、ITO层和玻璃层所述工作电极中垂直有序介孔二氧化硅孔道-十六烷基三甲基溴化铵胶束复合膜的厚度为110～115nm。

如图7所示，本发明以垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的电极为工作电极，脂溶性抗生素可以通过疏水作用被萃取/富集到由胶束组成的疏水空腔中，以脂溶性抗生素还原峰电流为检测信号。此外，这种修饰电极由于垂直介孔二氧化硅(孔径2～3nm)存在，可以防止血液中蛋白、血细胞等大尺寸物质对电极表面的污染。因此，该电极可以实现人血中(蛋白、血细胞存在下)的复杂背景下抗生素含量的测定。胶束由十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等的表面活性剂自组装而成，带电的极性基团朝外，与介孔硅孔道上的硅羟基静电作用，而非极性的长烷链则通过疏水作用堆积，在介孔硅内部形成了一个疏水空腔。通过疏水作用，水溶液中的脂溶性分析物能够被萃取/富集到有胶束组成的疏水空腔中，并在胶束/电极界面上发生电化学氧化还原反应。本发明构建的传感器，不需要复杂的预处理过程，灵敏度高，检测限低，响应快，操作简单，在药物检测领域具有较大的应用潜力。

作为优选，所述电化学检测方法为循环伏安法、差示脉冲伏安法、方波伏安法、方波溶出伏安法、线性扫描溶出伏安法中的一种，进一步优选为差示脉冲伏安法。

作为进一步优选，检测得到电流密度后，可通过如下公式直接得到待检测体系中抗生素的含量：

$x=\left\{\begin{array}{cc}-k_{1}y-b_1& y\&GreaterEqual;-4.22{\mathrm{\&mu;Acm}}^{-2}\\ -k_{2}y-b_2& y<-4.22{\mathrm{\&mu;Acm}}^{-2}\end{array}\right.$

其中x为待检测体系中抗生素的含量，单位是ppm，y为电流密度值，单位是μA cm^-2，k₁＝0.9-1(μA cm^-2)^-1ppm；k₂＝1.8～1.9(μA cm^-2)^-1ppm；b₁＝0.14～0.16ppm；b₂＝3.9～4.1ppm。作为进一步优选，k₁＝0.962(μA cm^-2)^-1ppm；k₂＝1.852(μA cm^-2)^-1ppm；b₁＝0.154ppm；b₂＝3.917ppm；

采用该方法，能够在0.1～15.0ppm的浓度范围内精确检测，更适于血液环境的检测。

作为优选，所述富集方法为搅拌富集，搅拌时间为0～30min，优选为30s。

作为优选，所述抗生素为脂溶性抗生素，所述脂溶性抗生素为氯霉素或呋喃妥因中的一种，进一步优选为氯霉素。作为进一步优选，所述检测溶液中氯霉素的浓度为0.1～15ppm。

相对于现有技术，本发明的有益效果具体体现在：

1、本发明采用的垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的电极，可以实现对人血中脂溶性抗生素的检测。

2、垂直有序介孔二氧化硅阵列的孔径为2～3nm，具有尺寸选择性，可以排阻人血中的蛋白、血细胞等尺寸大于二氧化硅孔径的物质到达电极表面。

3、由胶束组成的疏水空腔，具有电荷/亲疏水选择性，只有脂溶性的中性分子能够被萃取/富集疏水空腔中，进而在胶束/电极表面发生电化学氧化还原反应。而这种萃取/富集作用能够提高电极响应的分析性能(如高灵敏度、低检测限等)。

4、该方法检测快速，简单，价格低廉，电极可以大批量生产。

5、该方法无需对人血进行复杂的预处理过程，电极抗生物污染能力好，灵敏度高，检测限低，远远低于裸ITO电极的检测限，检测周期短，稳定性高，比同等条件下的裸ITO电极的化学信号衰减程度大大降低。

6、本发明的检测方法可以拓展到其他复杂实际样品，如食品，污水，以及人血清中的电活性物质的原位或临床检测。

7、本发明的检测方法可以拓展到其他疏水的中性小分子的检测，如爆炸物、有机磷农药、抗氧化剂等。

总之，本发明采用垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的电极，通过疏水作用，生物样本中疏水、电中性的抗生素被萃取\富集到胶束微腔中，以抗生素的还原峰电位为检测信号，实现人血中抗生素的原位检测，检测灵敏度高、响应时间短、检测限低、抗干扰稳定性好，对临床评估抗生素疗效具有重要的参考价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中人血稀释后的待检测溶液。

图2为本发明实施例1中垂直介孔二氧化硅阵列的透射电镜图(a)和扫描电镜图(b)。

图3为本发明实施例1中裸ITO电极(a)及垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束修饰的ITO电极(b)在含有1ppm氯霉素的人血中的差示脉冲伏安曲线。

图4(a)为本发明实施例1中垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的ITO电极在人血中未加和加有不同浓度的氯霉素的差示脉冲伏安曲线以及(b)氯霉素还原峰电流与浓度的线性关系图。

图5(a)为本发明实施例1裸ITO电极在人血中未加和加有不同浓度的氯霉素的差示脉冲伏安曲线以及(b)氯霉素还原峰电流与浓度的线性关系图。

图6为本发明实施例1中裸ITO电极及垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束修饰的ITO电极在含有10ppm氯霉素的人血中还原峰电流下降比率随时间的变化图。

图7为本发明利用垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的ITO电极检测原理图。

具体实施方式

实施例1

使用垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的ITO电极，检测人血中氯霉素的电化学过程：

(1)垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的ITO电极的制备方法为溶液生长法，具体步骤为：将0.16g CTAB、70mL水、30mL无水乙醇、100μL质量分数为2.5％的氨水和80μL四乙氧基硅烷混合后，将干净的ITO电极置于该溶液内。在60℃下反应24小时后，用水彻底清洗并在100℃烘箱中老化过夜。

(2)用0.15mol/L、pH值为7的氯化钠溶液将人血稀释10倍，作为待检测溶液，如图1所示。在测试之前，将惰性气体(氮气或氩气)通入该待测溶液中20min，以除去溶液中氧气的干扰。电化学测试过程中，采用传统的三电极系统，垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的ITO电极、铂丝电极及银/氯化银电极分别作为工作电极、对电极和参比电极，整个电极系统置于惰性气体氛围中，防止空气中氧气影响电化学测定。

(3)将氯霉素溶于乙醇中配置成储备液，在待测溶液中加入不同体积氯霉素储备液得到一系列待测溶液(氯霉素的浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、10.0、15.0ppm)，进行差示脉冲伏安测试。

图2(a)为垂直有序介孔二氧化硅阵列的透射电镜图，白色亮点即为孔，也就是圆柱形胶束所处位置，黑色部分即为二氧化硅。从图中可以看出介孔二氧化硅的孔径为2～3nm，且孔隙率为4×10^-12cm^-2；图2(b)为垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的ITO电极的截面扫描电镜图，从图中可以清晰地看到三层，从上至下分别垂直介孔二氧化硅孔道-胶束复合物膜层、ITO层和玻璃层，且垂直介孔二氧化硅阵列层的厚度为111.0nm。

图3为裸ITO电极(a)及垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合物膜修饰的ITO电极(b)在含有1ppm氯霉素的人血中的差示脉冲伏安曲线，从中可以看出，氯霉素在复合物膜修饰的ITO电极上的还原峰电流是其在裸ITO上的3倍。

图4中(a)为垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的ITO电极在人血中未加和加有不同浓度的氯霉素中的差示脉冲伏安曲线。可以看出，随着人为加入的氯霉素浓度的提高，在0.75V处的还原峰电流增加。图4中(b)为该复合物膜修饰电极上抗生素的还原峰电流和浓度的线性响应曲线。由图4中(b)可知，在3.7ppm线性关系发生变化，检测精度更高。

图5中(a)为裸ITO电极在人血中未加和加有不同浓度的氯霉素中的差示脉冲伏安曲线。可以看出，随着人为加入的氯霉素浓度的提高，在0.75V处的还原峰电流增加，但是峰型变宽。图5中(b)为裸ITO电极上抗生素的还原峰电流和浓度的线性响应曲线，由图5中(b)可知，裸ITO电极对人血中氯霉素进行检测时，检测精度较低。

表1归纳了裸ITO电极和垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合物膜修饰的ITO电极在人血中电化学检测氯霉素的分析结果，包括灵敏度、检测范围和检测限。从中可以看出，相对于裸ITO电极，垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合物膜修饰的ITO电极显示出优越的分析性能，包括高灵敏度、宽响应范围、低检测限。

表1

图6为裸ITO电极及垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束修饰的ITO电极在含有10ppm氯霉素的人血中还原峰电流比率(电流/0min时刻的电流)随时间的变化图。从中可以看出，在测试时间范围内(45min)，氯霉素在两种电极的电化学信号都有了不同程度的下降，但是氯霉素在复合膜修饰的ITO电极上峰电流的衰减程度(～21.0％)远小于其在裸ITO电极上的峰电流衰减程度(～75.5％)。由此证明了，复合物膜修饰的ITO电极具有较好的抗生物污染的能力，可以用于复杂生物样本的长时间在线分析。

以上分析结果证明了垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的电极可以成功地用于人血中抗生素含量的检测。

Claims (10)

1.一种人血中抗生素含量的电化学检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

将未进行前处理的人血用电解质溶液稀释后作为检测溶液，所述检测溶液中抗生素的浓度为0.1～15ppm，以垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的电极为工作电极，采用电化学方法，对人血中的抗生素含量进行检测。

2.根据权利要求1所述的人血中抗生素含量的电化学检测方法，其特征在于，所述胶束为十六烷基三甲基溴化铵或双子表面活性剂中的一种组成。

3.根据权利要求2所述的人血中抗生素含量的电化学检测方法，其特征在于，所述胶束为十六烷基三甲基溴化铵，其中垂直有序介孔二氧化硅阵列的孔径为2～3nm；所述工作电极中垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜的厚度为110～115nm。

4.根据权利要求1所述的人血中抗生素含量的电化学检测方法，其特征在于，所述抗生素为氯霉素或呋喃妥因中的一种。

5.根据权利要求1所述的人血中抗生素含量的电化学检测方法，其特征在于，所述电解质溶液为氯化钠水溶液、氯化钾水溶液、硫酸钠水溶液、硝酸钠水溶液、硝酸钾水溶液、磷酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲溶液或tris-盐酸缓冲溶液中的一种；所述电解质溶液浓度为0.02～0.5mol/L，所述电解质溶液的pH值为6～8。

6.根据权利要求1所述的人血中抗生素含量的电化学检测方法，其特征在于，所述工作电极为垂直有序介孔二氧化硅孔道-胶束复合膜修饰的下列电极之一：氧化铟锡电极、氟掺杂氧化锡电极、金电极、玻碳电极、铂电极、石墨电极或丝网印刷电极中的一种。

7.根据权利要求1所述的人血中抗生素含量的电化学检测方法，其特征在于，检测之前，向电解质溶液中通入惰性气体，排除电解质溶液中的氧气。

8.根据权利要求1所述的人血中抗生素含量的电化学检测方法，其特征在于，检测前可进行富集，富集方法为搅拌富集，搅拌时间30～60s。

9.根据权利要求1所述的人血中抗生素含量的电化学检测方法，其特征在于，所述工作电极采用如下的方法制备得到：溶液生长法或电化学辅助自组装法。

10.根据权利要求1所述的人血中抗生素含量的电化学检测方法，其特征在于，所述电化学检测方法为循环伏安法、差示脉冲伏安法、方波伏安法、方波溶出伏安法、线性扫描溶出伏安法中的一种。