CN114317590A

CN114317590A - 一种将植物基因组中的碱基c突变为碱基t的方法

Info

Publication number: CN114317590A
Application number: CN202011060374.4A
Authority: CN
Inventors: 王飞鹏; 赵思; 刘亚; 宋金岭; 贺晓庆
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2040-09-30
Also published as: CN114317590B

Abstract

本发明公开了一种将植物基因组中的碱基C突变为碱基T的方法。本发明方法包括如下步骤：将SpRYn、胞嘧啶脱氨酶、sgRNA和UGI导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T。通过实验证明：本发明方法可对位于植物基因组上的PAM序列为NGN的靶点序列中的碱基C进行编辑，实现碱基C到碱基T的替换，在拓展可编辑的C的范围的同时，还提高了碱基替换效率。

Description

一种将植物基因组中的碱基C突变为碱基T的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种将植物基因组中的碱基C突变为碱基T的方法。

背景技术

CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9 protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。

2016年，David Liu和Akihiko Kondo两个实验室分别独立报道了两种不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，CBE)，分别使用了两种不同的胞苷脱氨酶rAPOBEC1(rat APOBEC1)和PmCDA1(activation-induced cytidine deaminase(AID)ortholog from sea lamprey)，原理都是通过使用胞苷脱氨酶直接实现对单个胞嘧啶(Cytosine，C)碱基进行编辑，而不再通过产生DSB和启动HDR修复，大大提高了C替换为胸腺嘧啶(Thymine，T)的碱基编辑效率。具体为dead Cas9(dCas9)或the Cas9 nickase(Cas9n)连带着rAPOBEC1或PmCDA1通过向导RNA定位到靶点，rAPOBEC1或PmCDA1催化非配对的单链DNA上的C发生胞嘧啶脱氨反应变成尿嘧啶(Uracil，U)，通过DNA的修复使得U与腺嘌呤(Adenine，A)配对，又通过DNA复制，最终使得T与A配对，从而实现了C到T的转换。在所测试的编辑器中，SpCas9n(D10A)&rAPOBEC1/PmCDA1&UGI碱基编辑系统(其含有尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂(uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI)的平均突变率较高，原因有二：一是UGI可以抑制尿嘧啶DNA糖化酶(uracil DNA glycosylase，UDG)催化清除DNA中U，二是SpCas9n(D10A)在非编辑链上产生切口，诱导真核错配修复机制或long-patch BER(base-excision repair)修复机制，促使U:G错配更多的偏好性修复成U:A。

目前，SpCas9n(D10A)&rAPOBEC1/PmCDA1&UGI碱基编辑系统已被广泛应用到水稻中，实现C到T的转换，但编辑的靶点主要局限在PAM(Protospacer Adjacent Motif)为NGG的序列，大大限制了可编辑的C的范围。SpCas9的变体SpCas9-NG能够识别NGN(N＝A，T，C或G)PAM靶点，被成功的开发成CBE(SpCas9-NG-CBE)，大大拓展了动物和植物基因组中可编辑的C的范围，但是相对于NGA，NGT和NGG PAM靶点，SpCas9-NG-CBE对NGC PAM靶点的编辑能力低。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法。

本发明提供的将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法为如下1)或2)或3)或4)：

所述1)包括如下步骤：将SpRYn、胞嘧啶脱氨酶、sgRNA和UGI导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；

所述2)包括如下步骤：将SpRYn、胞嘧啶脱氨酶和sgRNA导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；

所述3)包括如下步骤：将SpRYn的编码基因、胞嘧啶脱氨酶的编码基因、转录sgRNA的DNA分子和UGI的编码基因导入植物体内，使所述SpRYn、所述胞嘧啶脱氨酶、所述sgRNA和所述UGI均得到表达，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；

所述4)包括如下步骤：将SpRYn的编码基因、胞嘧啶脱氨酶的编码基因和转录sgRNA的DNA分子导入植物体内，使所述SpRYn、所述胞嘧啶脱氨酶和所述sgRNA均得到表达，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；

所述sgRNA靶向靶点序列；

所述靶点序列的PAM序列为NGN；N为A、T、C或G。

上述将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法中，所述sgRNA为tRNA-esgRNA；

所述tRNA-esgRNA如式I所示：tRNA-所述靶点序列转录的RNA-esgRNA骨架(式I)；

所述tRNA为m1)或m2)或m3)：

m1)将序列1第597-673位中的T替换为U得到的RNA分子；

m2)将m1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

m3)与m1)或m2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；

所述esgRNA骨架为n1)或n2)或n3)：

n1)将序列1第694-779位中的T替换为U得到的RNA分子；

n2)将n1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

n3)与n1)或n2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。

上述将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法中，所述SpRYn为A1)或A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

所述胞嘧啶脱氨酶可为human APOBEC3A、human AID、PmCDA1或rAPOBEC1等蛋白质。在本发明的具体实施例中，所述胞嘧啶脱氨酶为PmCDA1。

所述PmCDA1为C1)或C2)或C3)：

C1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

C2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

C3)在C1)或C2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

所述UGI为E1)或E2)或E3)：

E1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；

E2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

E3)在E1)或E2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)、C1)或E1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2或序列3或序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)、C2)或E2)中的蛋白质，为与序列2或序列3或序列4所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)、C2)或E2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)、C2)或E2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1的第3167-7267位、第7553-8176位或第8210-8458位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连接上表所示的标签的编码序列得到。序列1的第3167-7267位、第7553-8176位和第8210-8458位分别编码序列2、序列3和序列4所示的蛋白质。

所述SpRYn的编码基因为b1)或b2)或b3)：

b1)序列表中序列1第3167-7267位所示的cDNA分子或DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述SpRYn的cDNA分子或DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述SpRYn的cDNA分子或DNA分子；

所述PmCDA1的编码基因为d1)或d2)或d3)：

d1)序列表中序列1第7553-8176位所示的cDNA分子或DNA分子；

d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述PmCDA1的cDNA分子或DNA分子；

d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述PmCDA1的cDNA分子或DNA分子；

所述UGI的编码基因为f1)或f2)或f3)：

f1)序列表中序列1第8210-8458位所示的cDNA分子或DNA分子；

f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述UGI的cDNA分子或DNA分子；

f3)在严格条件下与f1)或f2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述UGI的cDNA分子或DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述SpRYn、所述PmCDA1或所述UGI的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的所述SpRYn、所述PmCDA1或所述UGI的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述SpRYn、所述PmCDA1或所述UGI且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2、3或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法中，所述转录tRNA-esgRNA的DNA分子转录后得到的所述tRNA-esgRNA为不成熟的RNA前体，该RNA前体中的tRNA会被两种酶(RNase P和RNase Z)切割掉后得到成熟的RNA。一个重组表达载体中有多少个靶点，就会得到多少个独立的成熟的RNA，每个成熟的RNA依次由所述靶点序列转录的RNA和所述esgRNA骨架组成，或依次由所述tRNA残留的个别碱基、所述靶点序列转录的RNA和所述esgRNA骨架组成。

上述将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法中，所述1)和3)中，所述UGI的个数可为一个或两个或多个。在本发明的具体实施例中，所述UGI的个数具体为两个。

上述将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法中，所述3)中，所述SpRYn的编码基因、所述转录sgRNA的DNA分子、所述胞嘧啶脱氨酶的编码基因和所述UGI的编码基因可通过一个或多个重组表达载体导入植物体内。在本发明的具体实施例中，所述SpRYn的编码基因、所述转录tRNA-esgRNA的DNA分子、所述PmCDA1的编码基因和所述UGI的编码基因通过一个重组表达载体导入植物体内。

进一步的，所述重组载体还包括筛选剂抗性蛋白的编码基因。

更进一步的，所述重组载体包括含有转录tRNA-esgRNA的DNA分子的表达盒和依次含有所述SpRYn的编码基因、所述PmCDA1的编码基因、所述UGI的编码基因、所述UGI的编码基因、所述自切割寡肽的编码基因和所述筛选剂抗性蛋白的编码基因的表达盒。

所述含有转录tRNA-esgRNA的DNA分子的表达盒的个数可为一个或两个或多个。具体可为一个或两个或三个。

所述自切割寡肽可为来源于病毒基因组的2A自切割寡肽，如口蹄疫病毒(FMDV)(F2A)肽、马A型鼻炎病毒(ERAV)(E2A)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)(T2A)肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)(P2A)肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。具体可为P2A肽。

所述筛选剂抗性蛋白具体可为潮霉素磷酸转移酶。

在本发明的具体实施例中，所述重组表达载体具体为SpRYn-CBE-1重组表达载体、SpRYn-CBE-2重组表达载体、SpRYn-CBE-3重组表达载体、SpRYn-CBE-4重组表达载体、SpRYn-CBE-5重组表达载体、SpRYn-CBE-6重组表达载体、SpRYn-CBE-7重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供上述将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法的新用途。

本发明提供了上述将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法在如下X1)-X3)任一种中的应用：

X1)植物基因组碱基替换或植物基因组碱基编辑；

X2)提高植物基因组碱基替换效率或植物基因组碱基编辑效率；

X3)制备植物突变体。

本发明还有一个目的是提供成套试剂的新用途；所述成套试剂包括上述SpRYn、上述胞嘧啶脱氨酶和上述sgRNA；

本发明提供了成套试剂在如下T1)-T11)任一种中的应用：

T1)将植物基因组靶点序列中的C突变为T；

T2)制备将植物基因组靶点序列中的C突变为T的产品；

T3)植物基因组碱基替换；

T4)制备植物基因组碱基替换的产品；

T5)植物基因组碱基编辑；

T6)制备植物基因组碱基编辑的产品；

T7)提高植物基因组碱基替换效率；

T8)制备提高植物基因组碱基替换效率的产品；

T9)提高植物基因组碱基编辑效率；

T10)制备提高植物基因组碱基编辑效率的产品；

T11)制备植物突变体；

所述靶点序列的PAM序列为NGN；N为A、T、C或G。

进一步的，所述成套试剂还包括上述UGI。

更进一步的，所述成套试剂由上述SpRYn、上述胞嘧啶脱氨酶、上述sgRNA、上述UGI、上述自切割寡肽和上述筛选剂抗性蛋白组成。

上述任一所述方法或应用中，所述PAM序列为与所述靶点序列3′端相连的一段DNA序列。所述PAM序列自5′端起第一个N与所述靶点序列3′端相连。所述靶点序列大小可为15-25bp，进一步可为18-22bp，更进一步可为20bp。

进一步的，所述NGN可为NGA、NGG、NGC或NGT。

更进一步的，所述NGA可为TGA、AGA或GGA。

所述NGG可为TGG、CGG或AGG。

所述NGC可为AGC或GGC。

所述NGT可为CGT或AGT。

上述任一所述方法或应用中，所述靶点序列可为一个或两个或多个。

上述任一所述方法或应用中，所述碱基替换或碱基编辑为将植物基因组靶点序列中的C突变为T。

所述碱基替换效率或所述碱基编辑效率为将位于植物基因组上的PAM为NGC的靶点序列中的C突变为T的碱基替换效率或所述碱基编辑效率。

所述C可为位于所述靶点序列中任意位置的碱基C。

上述任一所述方法或应用中，所述植物为S1)或S2)或S3)：

S1)单子叶植物或双子叶植物；

S2)禾本科植物；

S3)水稻(如日本晴)。

本发明提供了一种将植物基因组中的碱基C突变为碱基T的方法。本发明方法包括如下步骤：将SpRYn、胞嘧啶脱氨酶、sgRNA和UGI导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T。通过实验证明：本发明方法可对位于植物基因组上的PAM序列为NGN的靶点序列中的碱基C进行编辑，实现碱基C到碱基T的替换，在拓展可编辑的C的范围的同时，还提高了碱基替换效率。

附图说明

图1为SpRYn-CBE碱基编辑系统载体各元件结构示意图。其中，n为靶点个数，具体可为1、2或3，OsU6具体可为OsU6a、OsU6b或OsU6c，一个靶点时使用OsU6a，两个靶点时分别使用OsU6a和OsU6b，三个靶点时分别使用OsU6a，OsU6b和OsU6c。

图2为SpCas9n-NG-CBE碱基编辑系统载体各元件结构示意图。其中，n为靶点个数，具体可为2或3，OsU6具体可为OsU6a、OsU6b或OsU6c，两个靶点时分别使用OsU6a和OsU6b，三个靶点时分别使用OsU6a，OsU6b和OsU6c。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

引物对NGC-C1由引物NGC-C1-F：5’-GGAGCTGGATGAGGTGCT-3’和引物NGC-C1-R：5’-GGAAGAAGAAAAGTAGGGAGA-3’组成，用于扩增靶点NGC-C1。

引物对NGC-C2由引物NGC-C2-F：5’-TGTTCTGAGTTAGCATGGGCTG-3’和引物NGC-C2-R：5’-TTGAACACAAAATAAGGGCA-3’组成，用于扩增靶点NGC-C2。

引物对NGC-C3由引物NGC-C3-F：5’-GATTTTGTAGAGCGGCAGCCAA-3’和引物NGC-C3-R：5’-GTAGGTCGAGTCGACGATC-3’组成，用于扩增靶点NGC-C3。

引物对NGC-C4由引物NGC-C4-F：5’-ATCACAAATTGTGCCAATTCAC-3’和引物NGC-C4-R：5’-TACAGGAAATACTGCAACAAC-3’组成，用于扩增靶点NGC-C4。

引物对NGC-C5由引物NGC-C5-F：5’-GCCGCGACGGCCAAGACC-3’和引物NGC-C5-R：5’-AAGCCTCAATTTTCCCTGTC-3’组成，用于扩增靶点NGC-C5。

引物对NGA-C1由引物NGA-C1-F：5’-GCAGCAGCGGTCGGTGCAGCG-3’和引物NGA-C1-R：5’-GAATTAGTCTGATCATCATGGAT-3’组成，用于扩增靶点NGA-C1。

引物对NGA-C2由引物NGA-C2-F：5’-TCAATTAGTTGTACCCGGTGA-3’和引物NGA-C2-R：5’-CGCCCACCACTGATCGATCG-3’组成，用于扩增靶点NGA-C2。

引物对NGA-C3由引物NGA-C3-F：5’-TTTTGGTCGTTGCAGGGATGT-3’和引物NGA-C3-R：5’-GAACAACAAGATTAACCTAAGGCT-3’组成，用于扩增靶点NGA-C3。

引物对NGA-C4由引物NGA-C4-F：5’-TTTTGGTCGTTGCAGGGATGT-3’和引物NGA-C4-R：5’-GAACAACAAGATTAACCTAAGGCT-3’组成，用于扩增靶点NGA-C4。

引物对NGT-C1由引物NGT-C1-F：5’-CCTAGCAAGGACAAGTACATCA-3’和引物NGT-C1-R：5’-GCCATGATGAGATGAGCAAGC-3’组成，用于扩增靶点NGT-C1。

引物对NGT-C2由引物NGT-C2-F：5’-TTTTGGTCGTTGCAGGGATGT-3’和引物NGT-C2-R：5’-GAACAACAAGATTAACCTAAGGCT-3’组成，用于扩增靶点NGT-C2。

引物对NGG由引物NGG-F：5’-TGACGTGATGGAGGAGTTTCAC-3’和引物NGG-R：5’-TAGCTATAGCTTATGCGTGGAC-3’组成，用于扩增靶点NGG-C1、NGG-C2、NGG-C3和NGG-C4。

以下实施例中，C·T碱基替换是指靶点序列中任何位置的C突变为T。

C·T碱基替换效率＝发生C·T碱基替换的阳性T0苗数/分析的总阳性T0苗数×100％。

日本晴水稻：参考文献：梁卫红,王高华,杜京尧,等.硝普钠及其光解产物对日本晴水稻幼苗生长和5种激素标记基因表达的影响[J].河南师范大学学报(自然版),2017(2):48-52.；公众可以从北京市农林科学院获得。

恢复培养基：含有200mg/L特美汀的N6固体培养基。

筛选培养基：含有50mg/L潮霉素的N6固体培养基。

分化培养基：含有2mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。

生根培养基：含有0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。

实施例1、SpRYn-CBE碱基编辑系统可实现对水稻基因组中PAM序列为NGC的靶点进行碱基编辑

一、重组表达载体的构建

人工合成如下重组表达载体，SpRYn-CBE-1重组表达载体、SpRYn-CBE-2重组表达载体，SpCas9n-NG-CBE-1重组表达载体和SpCas9n-NG-CBE-2重组表达载体。SpRYn-CBE-1重组表达载体和SpRYn-CBE-2重组表达载体各元件结构示意图如图1所示。SpCas9n-NG-CBE-1重组表达载体和SpCas9n-NG-CBE-2重组表达载体各元件结构示意图如图2所示。各载体均为环状质粒，具体结构描述分别如下：

SpRYn-CBE-1重组表达载体的序列为序列表中的序列1。序列1的第131-596位为OsU6a启动子的核苷酸序列，第597-673位为tRNA的核苷酸序列，第674-693位为靶点NGC-C1的核苷酸序列，第694-779位为esgRNA骨架的核苷酸序列，第780-786位为PolyT序列；序列1的第787-1119位为OsU6b启动子的核苷酸序列，第1126-1202位为tRNA的核苷酸序列，第1203-1222位为靶点NGC-C4的核苷酸序列，第1223-1308位为esgRNA骨架的核苷酸序列，第1309-1320位为PolyT序列；序列1的第1327-3040位为OsUbq3启动子的核苷酸序列，第3167-7267位为SpRYn蛋白质的编码序列(不含有起始密码子和终止密码子)，编码序列2所示的SpRYn蛋白质；序列1的第7553-8176位为PmCDA1蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列3所示的PmCDA1蛋白质；序列1的第8210-8458位和第8471-8719位均为UGI蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列4所示的UGI蛋白质；序列1的第8762-8818位为P2A的编码序列，第8819-9844位为潮霉素磷酸转移酶的编码序列，第10184-10436位为Nos终止子的核苷酸序列。SpRYn-CBE-1重组表达载体含有的两个靶点NGC-C1和NGC-C4，序列见表1。

SpRYn-CBE-2重组表达载体的序列为将序列表中序列1的第131-1320位的序列替换为序列表中的序列5,且保持其他序列不变后得到的序列。序列5的第1-466位为OsU6a启动子的核苷酸序列，第467-543位为tRNA的核苷酸序列，第544-563位为靶点NGC-C2的核苷酸序列，第564-649位为esgRNA骨架的核苷酸序列，第650-656位为PolyT序列；序列5的第657-989位为OsU6b启动子的核苷酸序列，第996-1072位为tRNA的核苷酸序列，第1073-1092位为靶点NGC-C3的核苷酸序列，第1093-1178位为esgRNA骨架的核苷酸序列，第1179-1185位为PolyT序列；序列5的第1186-1927位为OsU6c启动子的核苷酸序列，第1934-2010位为tRNA的核苷酸序列，第2011-2030位为靶点NGC-C5的核苷酸序列，第2031-2116位为esgRNA骨架的核苷酸序列，第2117-2128位为PolyT序列。NGC-C2靶点序列、NGC-C3靶点序列和NGC-C5靶点序列见表1。

SpCas9n-NG-CBE-1重组表达载体的序列为将序列表中序列1的第3167-7267位的序列替换为序列表中的序列6，且保持其他序列不变后得到的序列。序列6为SpCas9n-NG蛋白质的编码序列(不含有起始密码子和终止密码子)。

SpCas9n-NG-CBE-2重组表达载体的序列为将SpRYn-CBE-2重组表达载体中所包含的序列1的第3167-7267位的序列替换为序列表中的序列6，且保持其他序列不变后得到的序列。

各载体的esgRNA的靶点核苷酸序列及相应的PAM序列如表1所示。

表1、各载体的esgRNA的靶点核苷酸序列及相应的PAM序列

二、水稻植株中对靶点进行碱基编辑

将步骤一获得的SpRYn-CBE-1重组表达载体、SpRYn-CBE-2重组表达载体，SpCas9n-NG-CBE-1重组表达载体和SpCas9n-NG-CBE-2重组表达载体分别按照如下步骤1-11进行操作：

1、将载体导入农杆菌EHA105(上海唯地生物技术有限公司的产品，CAT#:AC1010)，得到重组农杆菌。

2、采用培养基(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的YEP培养基)培养重组农杆菌，28℃，150rpm震荡培养至OD₆₀₀为1.0-2.0，室温条件下，10000rpm离心1min，用侵染液(将N6液体培养基中的糖替换为葡萄糖和蔗糖，葡萄糖和蔗糖在侵染液中的浓度分别为10g/L和20g/L)重悬菌体并稀释至OD₆₀₀为0.2，得到农杆菌侵染液。

3、水稻品种日本晴成熟种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(v/v)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于N6固体培养基上，28℃暗培养4-6周，得到水稻愈伤。

4、完成步骤3后，将水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液甲(农杆菌侵染液甲为向农杆菌侵染液中加入乙酰丁香酮得到的液体，乙酰丁香酮的添加量满足乙酰丁香酮与农杆菌侵染液的体积比为25μl：50ml)中浸泡10min，然后，放在铺有两层灭菌滤纸的培养皿(内含约200ml不含农杆菌的侵染液)上，21℃暗培养1天。

5、取步骤4得到的水稻愈伤放入恢复培养基上，25-28℃暗培养3天。

6、取步骤5得到的水稻愈伤，置于筛选培养基上，28℃暗培养2周。

7、取步骤6得到的水稻愈伤，再次置于筛选培养基上，28℃暗培养2周，得到水稻抗性愈伤。

8、取步骤7得到的水稻抗性愈伤放入分化培养基上，25℃光照培养1个月左右，将分化出来的小苗移至生根培养基上，25℃光照培养2周，获取水稻T0苗。

9、提取水稻T0苗的基因组DNA并以其作为模板，采用引物F(5’-ttattgccactagttcattctacttat-3’)和引物R(5’-ggggtacttctcgtggtagg-3’)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将该PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有约729bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗为水稻阳性T0苗；如果PCR扩增产物中不含有约729bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗不为水稻阳性T0苗。

10、各载体分别取步骤9所获得的水稻阳性T0苗的基因组DNA作为模板，对于NGC-C1靶点，采用引物对NGC-C1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于NGC-C2靶点，采用引物对NGC-C2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于NGC-C3靶点，采用引物对NGC-C3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于NGC-C4靶点，采用引物对NGC-C4进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于NGC-C5靶点，采用引物对NGC-C5进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

11、将步骤10得到的PCR扩增产物进行Sanger测序及分析。测序结果只针对各靶点区进行分析。分别统计各靶点发生C·T碱基替换的阳性T0苗数，计算得出C·T碱基替换效率，结果见表2。

结果表明，SpRYn-CBE碱基编辑系统对五个靶点均实现C·T碱基替换，SpCas9n-NG-CBE碱基编辑系统仅实现对NGC-C5靶点的编辑，且C·T碱基替换效率低至2.4％。说明对于NGC PAM靶点，SpRYn-CBE碱基编辑系统优于SpCas9n-NG-CBE碱基编辑系统，能够在水稻基因组中很好的实现C·T碱基替换。

表2、C·T碱基替换效率

靶点名称	CBE系统	总阳性T0苗数	发生C·T碱基替换的阳性T0苗数	C·T碱基替换效率(％)
					NGC-C1	SpRYn-CBE	36	7	19.4
	SpCas9n-NG-CBE	35	0	0
					NGC-C2	SpRYn-CBE	35	13	37.1
	SpCas9n-NG-CBE	29	0	0
					NGC-C3	SpRYn-CBE	40	4	10
	SpCas9n-NG-CBE	43	0	0
					NGC-C4	SpRYn-CBE	42	7	16.7
	SpCas9n-NG-CBE	29	0	0
					NGC-C5	SpRYn-CBE	38	2	5.3
	SpCas9n-NG-CBE	41	1	2.4

实施例2、SpRYn-CBE碱基编辑系统可实现对水稻基因组中PAM序列为NGA，NGT或NGG的靶点进行碱基编辑

一、重组表达载体的构建

人工合成如下重组表达载体：SpRYn-CBE-3重组表达载体，SpRYn-CBE-4重组表达载体，SpRYn-CBE-5重组表达载体，SpRYn-CBE-6重组表达载体和SpRYn-CBE-7重组表达载体。各载体均为环状质粒。

SpRYn-CBE-3重组表达载体的序列为将SpRYn-CBE-1重组表达载体序列中NGC-C1靶点序列替换为NGA-C1靶点序列，NGC-C4靶点序列替换为NGA-C2靶点序列，且保持其他序列不变后得到的序列。NGA-C1靶点序列和NGA-C2靶点序列见表3。

SpRYn-CBE-4重组表达载体的序列为将SpRYn-CBE-1重组表达载体序列中NGC-C1靶点序列替换为NGA-C3靶点序列，NGC-C4靶点序列替换为NGA-C4靶点序列，且保持其他序列不变后得到的序列。NGA-C3靶点序列和NGA-C4靶点序列见表3。

SpRYn-CBE-5重组表达载体的序列为将SpRYn-CBE-1重组表达载体序列中NGC-C1靶点序列替换为NGT-C1靶点序列，NGC-C4靶点序列替换为NGT-C2靶点序列，且保持其他序列不变后得到的序列。NGT-C1靶点序列和NGT-C2靶点序列见表3。

SpRYn-CBE-6重组表达载体的序列为将SpRYn-CBE-2重组表达载体序列中NGC-C2靶点序列替换为NGG-C1靶点序列，NGC-C3靶点序列替换为NGG-C2靶点序列，NGC-C5靶点序列替换为NGG-C3靶点序列，且保持其他序列不变后得到的序列。NGG-C1靶点序列、NGG-C2靶点序列和NGG-C3靶点序列见表3。

SpRYn-CBE-7重组表达载体的序列为将序列表中序列1的第131-1320位的序列替换为序列表中的序列7，且保持其他序列不变后得到的序列。序列7的第1-466位为OsU6a启动子的核苷酸序列，第467-543位为tRNA的核苷酸序列，第544-563位为靶点NGG-C4的核苷酸序列，第564-649位为esgRNA骨架的核苷酸序列，第650-661位为PolyT序列。NGG-C4靶点序列见表3。

各载体的esgRNA的靶点核苷酸序列及相应的PAM序列如表3所示。

表3、各载体的esgRNA的靶点核苷酸序列及相应的PAM序列

二、水稻植株中对靶点进行碱基编辑

1、将步骤一构建的SpRYn-CBE-3重组表达载体，SpRYn-CBE-4重组表达载体，SpRYn-CBE-5重组表达载体，SpRYn-CBE-6重组表达载体和SpRYn-CBE-7重组表达载体，分别按照实施例1步骤二的1-9进行操作，得到水稻阳性T0苗。

2、各载体分别取步骤1所获得的水稻阳性T0苗的基因组DNA作为模板，对于NGA-C1靶点，采用引物对NGA-C1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于NGA-C2靶点，采用引物对NGA-C2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于NGA-C3靶点，采用引物对NGA-C3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于NGA-C4靶点，采用引物对NGA-C4进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于NGT-C1靶点，采用引物对NGT-C1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于NGT-C2靶点，采用引物对NGT-C2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于NGG-C1、NGG-C2、NGG-C3和NGG-C4靶点，均采用引物对NGG进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行Sanger测序及分析。测序结果只针对各靶点区进行分析。分别统计各靶点发生C·T碱基替换的阳性T0苗数，计算得出C·T碱基替换效率，结果见表4。

结果表明，SpRYn-CBE碱基编辑系统对所有测试的靶点均能够有效编辑，得到C·T碱基替换的T0苗，碱基编辑效率为4.2％-40％。由此表明SpRYn-CBE碱基编辑系统可以对水稻基因组中PAM序列为NGA，NGT和NGG的靶点序列进行碱基编辑，实现C·T碱基替换。

表4、基因编辑效率分析结果

靶点名称	总阳性T0苗数	发生C·T碱基替换的阳性T0苗数	C·T碱基替换效率(％)
				NGA-C1	33	7	21.2
NGA-C2	39	4	10.3
				NGA-C3	37	2	5.4
NGA-C4	36	4	11.1
				NGT-C1	24	1	4.2
NGT-C2	48	2	4.2
				NGG-C1	34	2	5.9
NGG-C2	35	6	17.1
				NGG-C3	35	14	40
NGG-C4	24	9	37.5

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种将植物基因组中的碱基C突变为碱基T的方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16842

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacatg gcactagcct caccgtcttc gcagacgagg 60

ccgctaagtc gcagctacgc tctcaacggc actgactagg tagtttaaac gtgcacttaa 120

ttaaggtacc tggaatcggc agcaaaggat tttttcctgt agttttccca caaccatttt 180

ttaccatccg aatgatagga taggaaaaat atccaagtga acagtattcc tataaaattc 240

ccgtaaaaag cctgcaatcc gaatgagccc tgaagtctga actagccggt cacctgtaca 300

ggctatcgag atgccataca agagacggta gtaggaacta ggaagacgat ggttgattcg 360

tcaggcgaaa tcgtcgtcct gcagtcgcat ctatgggcct ggacggaata ggggaaaaag 420

ttggccggat aggagggaaa ggcccaggtg cttacgtgcg aggtaggcct gggctctcag 480

cacttcgatt cgttggcacc ggggtaggat gcaatagaga gcaacgttta gtaccacctc 540

gcttagctag agcaaactgg actgccttat atgcgcgggt gctggcttgg ctgccgaaca 600

aagcaccagt ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc gggttcgatt 660

cccggctggt gcagcaccac ggacatctgg agggtttcag agctatgctg gaaacagcat 720

agcaagttga aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 780

tttttttgca agaacgaact aagccggaca aaaaaaaaag gagcacatat acaaaccggt 840

tttattcatg aatggtcacg atggatgatg gggctcagac ttgagctacg aggccgcagg 900

cgagagaagc ctagtgtgct ctctgcttgt ttgggccgta acggaggata cggccgacga 960

gcgtgtacta ccgcgcggga tgccgctggg cgctgcgggg gccgttggat ggggatcggt 1020

gggtcgcggg agcgttgagg ggagacaggt ttagtaccac ctcgcctacc gaacaatgaa 1080

gaacccacct tataaccccg cgcgctgccg cttgtgttgg gatccaacaa agcaccagtg 1140

gtctagtggt agaatagtac cctgccacgg tacagacccg ggttcgattc ccggctggtg 1200

catcaggccg acgatgacgc acgtttcaga gctatgctgg aaacagcata gcaagttgaa 1260

ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt tttttttttt 1320

aagcttacaa attcgggtca aggcggaagc cagcgcgcca ccccacgtca gcaaatacgg 1380

aggcgcgggg ttgacggcgt cacccggtcc taacggcgac caacaaacca gccagaagaa 1440

attacagtaa aaaaaaagta aattgcactt tgatccacct tttattacct aagtctcaat 1500

ttggatcacc cttaaaccta tcttttcaat ttgggccggg ttgtggtttg gactaccatg 1560

aacaactttt cgtcatgtct aacttccctt tcagcaaaca tatgaaccat atatagagga 1620

gatcggccgt atactagagc tgatgtgttt aaggtcgttg attgcacgag aaaaaaaaat 1680

ccaaatcgca acaatagcaa atttatctgg ttcaaagtga aaagatatgt ttaaaggtag 1740

tccaaagtaa aacttataga taataaaatg tggtccaaag cgtaattcac tcaaaaaaaa 1800

tcaacgagac gtgtaccaaa cggagacaaa cggcatcttc tcgaaatttc ccaaccgctc 1860

gctcgcccgc ctcgtcttcc cggaaaccgc ggtggtttca gcgtggcgga ttctccaagc 1920

agacggagac gtcacggcac gggactcctc ccaccaccca accgccataa ataccagccc 1980

cctcatctcc tctcctcgca tcagctccac ccccgaaaaa tttctcccca atctcgcgag 2040

gctctcgtcg tcgaatcgaa tcctctcgcg tcctcaaggt acgctgcttc tcctctcctc 2100

gcttcgtttc gattcgattt cggacgggtg aggttgtttt gttgctagat ccgattggtg 2160

gttagggttg tcgatgtgat tatcgtgaga tgtttagggg ttgtagatct gatggttgtg 2220

atttgggcac ggttggttcg ataggtggaa tcgtggttag gttttgggat tggatgttgg 2280

ttctgatgat tggggggaat ttttacggtt agatgaattg ttggatgatt cgattgggga 2340

aatcggtgta gatctgttgg ggaattgtgg aactagtcat gcctgagtga ttggtgcgat 2400

ttgtagcgtg ttccatcttg taggccttgt tgcgagcatg ttcagatcta ctgttccgct 2460

cttgattgag ttattggtgc catgggttgg tgcaaacaca ggctttaata tgttatatct 2520

gttttgtgtt tgatgtagat ctgtagggta gttcttctta gacatggttc aattatgtag 2580

cttgtgcgtt tcgatttgat ttcatatgtt cacagattag ataatgatga actcttttaa 2640

ttaattgtca atggtaaata ggaagtcttg tcgctatatc tgtcataatg atctcatgtt 2700

actatctgcc agtaatttat gctaagaact atattagaat atcatgttac aatctgtagt 2760

aatatcatgt tacaatctgt agttcatcta tataatctat tgtggtaatt tctttttact 2820

atctgtgtga agattattgc cactagttca ttctacttat ttctgaagtt caggatacgt 2880

gtgctgttac tacctatctg aatacatgtg tgatgtgcct gttactatct ttttgaatac 2940

atgtatgttc tgttggaata tgtttgctgt ttgatccgtt gttgtgtcct taatcttgtg 3000

ctagttctta ccctatctgt ttggtgatta tttcttgcag tacgtaatgg actacaagga 3060

ccacgacggc gactacaagg atcatgacat cgactacaag gacgacgacg acaagatggc 3120

tcctaagaag aagcggaagg ttggtattca cggggtgcct gcggctgaca agaagtactc 3180

catcggcctc gccatcggca ccaacagcgt cggctgggcg gtgatcaccg acgagtacaa 3240

ggtcccgtcc aagaagttca aggtcctggg caacaccgac cgccactcca tcaagaagaa 3300

cctcatcggc gccctcctct tcgactccgg cgagacggcg gagcgcaccc gcctcaagcg 3360

caccgcccgc cgccgctaca cccgccgcaa gaaccgcatc tgctacctcc aggagatctt 3420

ctccaacgag atggcgaagg tcgacgactc cttcttccac cgcctcgagg agtccttcct 3480

cgtggaggag gacaagaagc acgagcgcca ccccatcttc ggcaacatcg tcgacgaggt 3540

cgcctaccac gagaagtacc ccactatcta ccaccttcgt aagaagcttg ttgactctac 3600

tgataaggct gatcttcgtc tcatctacct tgctctcgct cacatgatca agttccgtgg 3660

tcacttcctt atcgagggtg accttaaccc tgataactcc gacgtggaca agctcttcat 3720

ccagctcgtc cagacctaca accagctctt cgaggagaac cctatcaacg cttccggtgt 3780

cgacgctaag gcgatccttt ccgctaggct ctccaagtcc aggcgtctcg agaacctcat 3840

cgcccagctc cctggtgaga agaagaacgg tcttttcggt aacctcatcg ctctctccct 3900

cggtctgacc cctaacttca agtccaactt cgacctcgct gaggacgcta agcttcagct 3960

ctccaaggat acctacgacg atgatctcga caacctcctc gctcagattg gagatcagta 4020

cgctgatctc ttccttgctg ctaagaacct ctccgatgct atcctccttt cggatatcct 4080

tagggttaac actgagatca ctaaggctcc tctttctgct tccatgatca agcgctacga 4140

cgagcaccac caggacctca ccctcctcaa ggctcttgtt cgtcagcagc tccccgagaa 4200

gtacaaggag atcttcttcg accagtccaa gaacggctac gccggttaca ttgacggtgg 4260

agctagccag gaggagttct acaagttcat caagccaatc cttgagaaga tggatggtac 4320

tgaggagctt ctcgttaagc ttaaccgtga ggacctcctt aggaagcaga ggactttcga 4380

taacggctct atccctcacc agatccacct tggtgagctt cacgccatcc ttcgtaggca 4440

ggaggacttc taccctttcc tcaaggacaa ccgtgagaag atcgagaaga tccttacttt 4500

ccgtattcct tactacgttg gtcctcttgc tcgtggtaac tcccgtttcg cttggatgac 4560

taggaagtcc gaggagacta tcaccccttg gaacttcgag gaggttgttg acaagggtgc 4620

ttccgcccag tccttcatcg agcgcatgac caacttcgac aagaacctcc ccaacgagaa 4680

ggtcctcccc aagcactccc tcctctacga gtacttcacg gtctacaacg agctcaccaa 4740

ggtcaagtac gtcaccgagg gtatgcgcaa gcctgccttc ctctccggcg agcagaagaa 4800

ggctatcgtt gacctcctct tcaagaccaa ccgcaaggtc accgtcaagc agctcaagga 4860

ggactacttc aagaagatcg agtgcttcga ctccgtcgag atcagcggcg ttgaggaccg 4920

tttcaacgct tctctcggta cctaccacga tctcctcaag atcatcaagg acaaggactt 4980

cctcgacaac gaggagaacg aggacatcct cgaggacatc gtcctcactc ttactctctt 5040

cgaggatagg gagatgatcg aggagaggct caagacttac gctcatctct tcgatgacaa 5100

ggttatgaag cagctcaagc gtcgccgtta caccggttgg ggtaggctct cccgcaagct 5160

catcaacggt atcagggata agcagagcgg caagactatc ctcgacttcc tcaagtctga 5220

tggtttcgct aacaggaact tcatgcagct catccacgat gactctctta ccttcaagga 5280

ggatattcag aaggctcagg tgtccggtca gggcgactct ctccacgagc acattgctaa 5340

ccttgctggt tcccctgcta tcaagaaggg catccttcag actgttaagg ttgtcgatga 5400

gcttgtcaag gttatgggtc gtcacaagcc tgagaacatc gtcatcgaga tggctcgtga 5460

gaaccagact acccagaagg gtcagaagaa ctcgagggag cgcatgaaga ggattgagga 5520

gggtatcaag gagcttggtt ctcagatcct taaggagcac cctgtcgaga acacccagct 5580

ccagaacgag aagctctacc tctactacct ccagaacggt agggatatgt acgttgacca 5640

ggagctcgac atcaacaggc tttctgacta cgacgtcgac cacattgttc ctcagtcttt 5700

ccttaaggat gactccatcg acaacaaggt cctcacgagg tccgacaaga acaggggtaa 5760

gtcggacaac gtcccttccg aggaggttgt caagaagatg aagaactact ggaggcagct 5820

tctcaacgct aagctcatta cccagaggaa gttcgacaac ctcacgaagg ctgagagggg 5880

tggcctttcc gagcttgaca aggctggttt catcaagagg cagcttgttg agacgaggca 5940

gattaccaag cacgttgctc agatcctcga ttctaggatg aacaccaagt acgacgagaa 6000

cgacaagctc atccgcgagg tcaaggtgat caccctcaag tccaagctcg tctccgactt 6060

ccgcaaggac ttccagttct acaaggtccg cgagatcaac aactaccacc acgctcacga 6120

tgcttacctt aacgctgtcg ttggtaccgc tcttatcaag aagtacccta agcttgagtc 6180

cgagttcgtc tacggtgact acaaggtcta cgacgttcgt aagatgatcg ccaagtccga 6240

gcaggagatc ggcaaggcca ccgccaagta cttcttctac tccaacatca tgaacttctt 6300

caagaccgag atcaccctcg ccaacggcga gatccgcaag cgccctctta tcgagacgaa 6360

cggtgagact ggtgagatcg tttgggacaa gggtcgcgac ttcgctactg ttcgcaaggt 6420

cctttctatg cctcaggtta acatcgtcaa gaagaccgag gtccagaccg gtggcttctc 6480

caaggagtct atccgcccaa agagaaactc ggacaagctc atcgctagga agaaggattg 6540

ggaccctaag aagtacggtg gtttcctgtg gcctactgtc gcctactccg tcctcgtggt 6600

cgccaaggtg gagaagggta agtcgaagaa gctcaagtcc gtcaaggagc tcctcggcat 6660

caccatcatg gagcgctcct ccttcgagaa gaacccgatc gacttcctcg aggccaaggg 6720

ctacaaggag gtcaagaagg acctcatcat caagctcccc aagtactctc ttttcgagct 6780

cgagaacggt cgtaagagga tgctggcttc cgctaagcag ctccagaagg gtaacgagct 6840

tgctcttcct tccaagtacg tgaacttcct ctacctcgcc tcccactacg agaagctcaa 6900

gggttcccct gaggataacg agcagaagca gctcttcgtg gagcagcaca agcactacct 6960

cgacgagatc atcgagcaga tctccgagtt ctccaagcgc gtcatcctcg ctgacgctaa 7020

cctcgacaag gtcctctccg cctacaacaa gcaccgcgac aagcccatcc gcgagcaggc 7080

cgagaacatc atccacctct tcacgctcac gcgcctcggc gcccctcgcg ctttcaagta 7140

cttcgacacc accatcgacc ccaagcagta ccgctccacc aaggaggttc tcgacgctac 7200

tctcatccac cagtccatca ccggtcttta cgagactcgt atcgaccttt cccagcttgg 7260

tggtgatgga ggaggaggca cgggaggagg aggctccgcc gagtatgtgc gcgcgctctt 7320

cgacttcaac ggcaatgacg aggaggatct ccctttcaag aagggcgaca tcctccgcat 7380

ccgcgataag ccggaggagc agtggtggaa cgcagaggac tccgagggca agcggggcat 7440

gatcctggtg ccatacgtcg agaagtacag cggcgattac aaggaccacg atggcgacta 7500

caaggatcat gacatcgatt acaaggacga tgacgataag tccggcgtcg acatgacgga 7560

cgcggagtat gtgcgcatcc acgagaagct cgatatctac accttcaaga agcagttctt 7620

caacaataag aagtcggtgt cccatcggtg ctacgtcctc ttcgagctga agcgcagggg 7680

agagcgccgc gcctgcttct ggggctacgc ggtgaataag ccgcagtcag gcacagagcg 7740

cggcatccac gccgagatct tctcgatccg gaaggtcgag gagtacctcc gcgacaaccc 7800

aggccagttc acgatcaatt ggtactccag ctggtcccct tgcgcagatt gcgcagagaa 7860

gatcctcgag tggtacaacc aggagctgag gggcaatggc cataccctca agatctgggc 7920

ctgcaagctg tactacgaga agaacgcgag gaatcagatc ggcctctgga acctgcggga 7980

taatggcgtg ggcctcaacg tgatggtgtc cgagcactac cagtgctgcc gcaagatctt 8040

catccagtcc tcccacaatc agctgaacga gaataggtgg ctcgaaaaga ccctgaagcg 8100

cgccgagaag tggaggagcg agctgtctat catgatccag gtcaagatcc tgcacaccac 8160

aaagtcaccg gcggtgggcg gcggcggcag cgatgattcc ggcggcagca ccaacctctc 8220

cgacatcatc gagaaggaga caggcaagca gctcgtgatc caggagagca tcctcatgct 8280

cccggaggag gtggaggagg tcatcggcaa caagccggag tccgacatcc tcgtgcacac 8340

cgcctacgac gagtccaccg acgagaacgt gatgctcctc acctcagatg caccagagta 8400

caagccatgg gcactcgtga tccaggacag caacggcgag aacaagatca agatgctctc 8460

cggcggcagc accaacctct ccgacatcat cgagaaggag acaggcaagc agctcgtgat 8520

ccaggagagc atcctcatgc tcccggagga ggtggaggag gtcatcggca acaagccgga 8580

gtccgacatc ctcgtgcaca ccgcctacga cgagtccacc gacgagaacg tgatgctcct 8640

cacctcagat gcaccagagt acaagccatg ggcactcgtg atccaggaca gcaacggcga 8700

gaacaagatc aagatgctct ccggcggctc cccgaagaag aagaggaaag tgggatcagg 8760

agccaccaac ttctccctcc tcaagcaggc cggcgacgtg gaggagaacc cgggcccaat 8820

gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag 8880

cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt 8940

aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg 9000

ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg 9060

ggagtttagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt tcacagggtg tcacgttgca 9120

agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt tctacaaccg gtcgcggagg ctatggatgc 9180

gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat 9240

cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca 9300

ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc tcgatgagct 9360

gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcacgcgg atttcggctc 9420

caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat 9480

gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc tggaggccgt ggttggcttg 9540

tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag gatcgccacg 9600

actccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg 9660

caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc 9720

cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg 9780

tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtccga gggcaaagaa 9840

atagactagt tcagccagtt tggtggagct gccgatgtgc ctggtcgtcc cgagcctctg 9900

ttcgtcaagt atttgtggtg ctgatgtcta cttgtgtctg gtttaatgga ccatcgagtc 9960

cgtatgatat gttagtttta tgaaacagtt tcctgtggga cagcagtatg ctttatgaat 10020

aagttggatt tgaacctaaa tatgtgctca atttgctcat ttgcatctca ttcctgttga 10080

tgttttatct gagttgcaag tttgaaaatg ctgcatattc ttattaaatc gtcatttact 10140

tttatcttaa tgagctttgc aatggcctat gggatataaa agagatcgtt caaacatttg 10200

gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt 10260

tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag 10320

atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat 10380

atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatccctg 10440

caggacgcgt ttaattaagt gcacgcggcc gcctacttag tcaagagcct cgcacgcgac 10500

tgtcacgcgg ccaggatcgc ctcgtgagcc tcgcaatctg tacctagtgt ttaaactatc 10560

agtgtttgac aggatatatt ggcgggtaaa cctaagagaa aagagcgttt attagaataa 10620

cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg tgcatgccaa 10680

ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact ttgatccaac ccctccgctg ctatagtgca 10740

gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtct tctgaaaacg acatgtcgca caagtcctaa 10800

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cgcataaagt agaatacttg cgactagaac cggagacatt acgccatgaa caagagcgcc 10920

gccgctggcc tgctgggcta tgcccgcgtc agcaccgacg accaggactt gaccaaccaa 10980

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aggcgcgacc gcccggagct ggccaggatg cttgaccacc tacgccctgg cgacgttgtg 11100

acagtgacca ggctagaccg cctggcccgc agcacccgcg acctactgga cattgccgag 11160

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gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt accgaagaga 11640

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catcgcaacc catctagccc gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc tgttagtcga 12000

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cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct acccaggcac 12420

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gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac gcggtacgcc aaggcaagac cattaccgag 12720

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atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag gcaccgacgc 12840

cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg gctgggttgt 12900

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aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg gagaagttga 13020

aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc ggtgaatcgt 13080

ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca accgccggca gccggtgcgc 13140

cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt ccgatgctct 13200

atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc cgtctgtcga 13260

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tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac aagcccggcc 13440

gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc gatggcggaa 13500

agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac gttgccatgc 13560

agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt gaagccttga 13620

ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc gagatcgagc 13680

tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg ctgacggttc 13740

accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc ctggcacgcc 13800

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gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg tcaaatgacc 13920

tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta gtcatgcgct 13980

accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag cagatgctag 14040

ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg gatagcacgt 14100

acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg aacccaaagc 14160

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ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg ccactcgacc 14460

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gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 14880

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 14940

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 15000

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 15060

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 15120

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 15180

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 15240

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cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 15360

agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 15420

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 15480

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 15540

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 15600

ggattttggt catgcattct aggtactaaa acaattcatc cagtaaaata taatatttta 15660

ttttctccca atcaggcttg atccccagta agtcaaaaaa tagctcgaca tactgttctt 15720

ccccgatatc ctccctgatc gaccggacgc agaaggcaat gtcataccac ttgtccgccc 15780

tgccgcttct cccaagatca ataaagccac ttactttgcc atctttcaca aagatgttgc 15840

tgtctcccag gtcgccgtgg gaaaagacaa gttcctcttc gggcttttcc gtctttaaaa 15900

aatcatacag ctcgcgcgga tctttaaatg gagtgtcttc ttcccagttt tcgcaatcca 15960

catcggccag atcgttattc agtaagtaat ccaattcggc taagcggctg tctaagctat 16020

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tcagtttttt caattccggt gatattctca ttttagccat ttattatttc cttcctcttt 16440

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gttccttgca ttctaaaacc ttaaatacca gaaaacagct ttttcaaagt tgttttcaaa 16560

gttggcgtat aacatagtat cgacggagcc gattttgaaa ccgcggtgat cacaggcagc 16620

aacgctctgt catcgttaca atcaacatgc taccctccgc gagatcatcc gtgtttcaaa 16680

cccggcagct tagttgccgt tcttccgaat agcatcggta acatgagcaa agtctgccgc 16740

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<210> 2

<211> 1368

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Arg Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

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Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

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Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

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Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

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Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

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Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

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Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

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Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala

1010 1015 1020

Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe

1025 1030 1035

Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

1040 1045 1050

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu

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Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val

1070 1075 1080

Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

1085 1090 1095

Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Arg Pro Lys

1100 1105 1110

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

1115 1120 1125

Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Leu Trp Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

1130 1135 1140

Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

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Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

1160 1165 1170

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

1175 1180 1185

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

1190 1195 1200

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Lys

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Gln Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1220 1225 1230

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys

1250 1255 1260

His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys

1265 1270 1275

Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala

1280 1285 1290

Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn

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Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Arg Leu Gly Ala Pro Arg Ala

1310 1315 1320

Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Pro Lys Gln Tyr Arg Ser

1325 1330 1335

Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

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Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1355 1360 1365

<210> 3

<211> 208

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Thr Asp Ala Glu Tyr Val Arg Ile His Glu Lys Leu Asp Ile Tyr

1 5 10 15

Thr Phe Lys Lys Gln Phe Phe Asn Asn Lys Lys Ser Val Ser His Arg

20 25 30

Cys Tyr Val Leu Phe Glu Leu Lys Arg Arg Gly Glu Arg Arg Ala Cys

35 40 45

Phe Trp Gly Tyr Ala Val Asn Lys Pro Gln Ser Gly Thr Glu Arg Gly

50 55 60

Ile His Ala Glu Ile Phe Ser Ile Arg Lys Val Glu Glu Tyr Leu Arg

65 70 75 80

Asp Asn Pro Gly Gln Phe Thr Ile Asn Trp Tyr Ser Ser Trp Ser Pro

85 90 95

Cys Ala Asp Cys Ala Glu Lys Ile Leu Glu Trp Tyr Asn Gln Glu Leu

100 105 110

Arg Gly Asn Gly His Thr Leu Lys Ile Trp Ala Cys Lys Leu Tyr Tyr

115 120 125

Glu Lys Asn Ala Arg Asn Gln Ile Gly Leu Trp Asn Leu Arg Asp Asn

130 135 140

Gly Val Gly Leu Asn Val Met Val Ser Glu His Tyr Gln Cys Cys Arg

145 150 155 160

Lys Ile Phe Ile Gln Ser Ser His Asn Gln Leu Asn Glu Asn Arg Trp

165 170 175

Leu Glu Lys Thr Leu Lys Arg Ala Glu Lys Trp Arg Ser Glu Leu Ser

180 185 190

Ile Met Ile Gln Val Lys Ile Leu His Thr Thr Lys Ser Pro Ala Val

195 200 205

<210> 4

<211> 83

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu Val

1 5 10 15

Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val Ile

20 25 30

Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp Glu

35 40 45

Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr

50 55 60

Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile

65 70 75 80

Lys Met Leu

<210> 5

<211> 2128

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tggaatcggc agcaaaggat tttttcctgt agttttccca caaccatttt ttaccatccg 60

aatgatagga taggaaaaat atccaagtga acagtattcc tataaaattc ccgtaaaaag 120

cctgcaatcc gaatgagccc tgaagtctga actagccggt cacctgtaca ggctatcgag 180

atgccataca agagacggta gtaggaacta ggaagacgat ggttgattcg tcaggcgaaa 240

tcgtcgtcct gcagtcgcat ctatgggcct ggacggaata ggggaaaaag ttggccggat 300

aggagggaaa ggcccaggtg cttacgtgcg aggtaggcct gggctctcag cacttcgatt 360

cgttggcacc ggggtaggat gcaatagaga gcaacgttta gtaccacctc gcttagctag 420

agcaaactgg actgccttat atgcgcgggt gctggcttgg ctgccgaaca aagcaccagt 480

ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc gggttcgatt cccggctggt 540

gcagcccctg gacaggttct cgggtttcag agctatgctg gaaacagcat agcaagttga 600

aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct tttttttgca 660

agaacgaact aagccggaca aaaaaaaaag gagcacatat acaaaccggt tttattcatg 720

aatggtcacg atggatgatg gggctcagac ttgagctacg aggccgcagg cgagagaagc 780

ctagtgtgct ctctgcttgt ttgggccgta acggaggata cggccgacga gcgtgtacta 840

ccgcgcggga tgccgctggg cgctgcgggg gccgttggat ggggatcggt gggtcgcggg 900

agcgttgagg ggagacaggt ttagtaccac ctcgcctacc gaacaatgaa gaacccacct 960

tataaccccg cgcgctgccg cttgtgttgg gatccaacaa agcaccagtg gtctagtggt 1020

agaatagtac cctgccacgg tacagacccg ggttcgattc ccggctggtg caaccacatc 1080

tttatatatt gggtttcaga gctatgctgg aaacagcata gcaagttgaa ataaggctag 1140

tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt tttttctcat tagcggtatg 1200

catgttggta gaagtcggag atgtaaataa ttttcattat ataaaaaagg tacttcgaga 1260

aaaataaatg catacgaatt aattcttttt atgtttttta aaccaagtat atagaattta 1320

ttgatggtta aaatttcaaa aatatgacga gagaaaggtt aaacgtacgg catatacttc 1380

tgaacagaga gggaatatgg ggtttttgtt gctcccaaca attcttaagc acgtaaagga 1440

aaaaagcaca ttatccacat tgtacttcca gagatatgta cagcattacg taggtacgtt 1500

ttctttttct tcccggagag atgatacaat aatcatgtaa acccagaatt taaaaaatat 1560

tctttactat aaaaatttta attagggaac gtattatttt ttacatgaca ccttttgaga 1620

aagagggact tgtaatatgg gacaaatgaa caatttctaa gaaatgggca tatgactctc 1680

agtacaatgg accaaattcc ctccagtcgg cccagcaata caaagggaaa gaaatgaggg 1740

ggcccacagg ccacggccca cttttctccg tggtggggag atccagctag aggtccggcc 1800

cacaagtggc ccttgccccg tgggacggtg ggattgcaga gcgcgtgggc ggaaacaaca 1860

gtttagtacc acctcgctca cgcaacgacg cgaccacttg cttataagct gctgcgctga 1920

ggctcaggga tccaacaaag caccagtggt ctagtggtag aatagtaccc tgccacggta 1980

cagacccggg ttcgattccc ggctggtgca catcctcgtg gaggcgctgg gtttcagagc 2040

tatgctggaa acagcatagc aagttgaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 2100

ggcaccgagt cggtgctttt tttttttt 2128

<210> 6

<211> 4101

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gacaagaagt actccatcgg cctcgccatc ggcaccaaca gcgtcggctg ggcggtgatc 60

accgacgagt acaaggtccc gtccaagaag ttcaaggtcc tgggcaacac cgaccgccac 120

tccatcaaga agaacctcat cggcgccctc ctcttcgact ccggcgagac ggcggaggcg 180

acccgcctca agcgcaccgc ccgccgccgc tacacccgcc gcaagaaccg catctgctac 240

ctccaggaga tcttctccaa cgagatggcg aaggtcgacg actccttctt ccaccgcctc 300

gaggagtcct tcctcgtgga ggaggacaag aagcacgagc gccaccccat cttcggcaac 360

atcgtcgacg aggtcgccta ccacgagaag taccccacta tctaccacct tcgtaagaag 420

cttgttgact ctactgataa ggctgatctt cgtctcatct accttgctct cgctcacatg 480

atcaagttcc gtggtcactt ccttatcgag ggtgacctta accctgataa ctccgacgtg 540

gacaagctct tcatccagct cgtccagacc tacaaccagc tcttcgagga gaaccctatc 600

aacgcttccg gtgtcgacgc taaggcgatc ctttccgcta ggctctccaa gtccaggcgt 660

ctcgagaacc tcatcgccca gctccctggt gagaagaaga acggtctttt cggtaacctc 720

atcgctctct ccctcggtct gacccctaac ttcaagtcca acttcgacct cgctgaggac 780

gctaagcttc agctctccaa ggatacctac gacgatgatc tcgacaacct cctcgctcag 840

attggagatc agtacgctga tctcttcctt gctgctaaga acctctccga tgctatcctc 900

ctttcggata tccttagggt taacactgag atcactaagg ctcctctttc tgcttccatg 960

atcaagcgct acgacgagca ccaccaggac ctcaccctcc tcaaggctct tgttcgtcag 1020

cagctccccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccagt ccaagaacgg ctacgccggt 1080

tacattgacg gtggagctag ccaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc aatccttgag 1140

aagatggatg gtactgagga gcttctcgtt aagcttaacc gtgaggacct ccttaggaag 1200

cagaggactt tcgataacgg ctctatccct caccagatcc accttggtga gcttcacgcc 1260

atccttcgta ggcaggagga cttctaccct ttcctcaagg acaaccgtga gaagatcgag 1320

aagatcctta ctttccgtat tccttactac gttggtcctc ttgctcgtgg taactcccgt 1380

ttcgcttgga tgactaggaa gtccgaggag actatcaccc cttggaactt cgaggaggtt 1440

gttgacaagg gtgcttccgc ccagtccttc atcgagcgca tgaccaactt cgacaagaac 1500

ctccccaacg agaaggtcct ccccaagcac tccctcctct acgagtactt cacggtctac 1560

aacgagctca ccaaggtcaa gtacgtcacc gagggtatgc gcaagcctgc cttcctctcc 1620

ggcgagcaga agaaggctat cgttgacctc ctcttcaaga ccaaccgcaa ggtcaccgtc 1680

aagcagctca aggaggacta cttcaagaag atcgagtgct tcgactccgt cgagatcagc 1740

ggcgttgagg accgtttcaa cgcttctctc ggtacctacc acgatctcct caagatcatc 1800

aaggacaagg acttcctcga caacgaggag aacgaggaca tcctcgagga catcgtcctc 1860

actcttactc tcttcgagga tagggagatg atcgaggaga ggctcaagac ttacgctcat 1920

ctcttcgatg acaaggttat gaagcagctc aagcgtcgcc gttacaccgg ttggggtagg 1980

ctctcccgca agctcatcaa cggtatcagg gataagcaga gcggcaagac tatcctcgac 2040

ttcctcaagt ctgatggttt cgctaacagg aacttcatgc agctcatcca cgatgactct 2100

cttaccttca aggaggatat tcagaaggct caggtgtccg gtcagggcga ctctctccac 2160

gagcacattg ctaaccttgc tggttcccct gctatcaaga agggcatcct tcagactgtt 2220

aaggttgtcg atgagcttgt caaggttatg ggtcgtcaca agcctgagaa catcgtcatc 2280

gagatggctc gtgagaacca gactacccag aagggtcaga agaactcgag ggagcgcatg 2340

aagaggattg aggagggtat caaggagctt ggttctcaga tccttaagga gcaccctgtc 2400

gagaacaccc agctccagaa cgagaagctc tacctctact acctccagaa cggtagggat 2460

atgtacgttg accaggagct cgacatcaac aggctttctg actacgacgt cgaccacatt 2520

gttcctcagt ctttccttaa ggatgactcc atcgacaaca aggtcctcac gaggtccgac 2580

aagaacaggg gtaagtcgga caacgtccct tccgaggagg ttgtcaagaa gatgaagaac 2640

tactggaggc agcttctcaa cgctaagctc attacccaga ggaagttcga caacctcacg 2700

aaggctgaga ggggtggcct ttccgagctt gacaaggctg gtttcatcaa gaggcagctt 2760

gttgagacga ggcagattac caagcacgtt gctcagatcc tcgattctag gatgaacacc 2820

aagtacgacg agaacgacaa gctcatccgc gaggtcaagg tgatcaccct caagtccaag 2880

ctcgtctccg acttccgcaa ggacttccag ttctacaagg tccgcgagat caacaactac 2940

caccacgctc acgatgctta ccttaacgct gtcgttggta ccgctcttat caagaagtac 3000

cctaagcttg agtccgagtt cgtctacggt gactacaagg tctacgacgt tcgtaagatg 3060

atcgccaagt ccgagcagga gatcggcaag gccaccgcca agtacttctt ctactccaac 3120

atcatgaact tcttcaagac cgagatcacc ctcgccaacg gcgagatccg caagcgccct 3180

cttatcgaga cgaacggtga gactggtgag atcgtttggg acaagggtcg cgacttcgct 3240

actgttcgca aggtcctttc tatgcctcag gttaacatcg tcaagaagac cgaggtccag 3300

accggtggct tctccaagga gtctatccgc ccaaagagaa actcggacaa gctcatcgct 3360

aggaagaagg attgggaccc taagaagtac ggtggtttcg tgtcccctac tgtcgcctac 3420

tccgtcctcg tggtcgccaa ggtggagaag ggtaagtcga agaagctcaa gtccgtcaag 3480

gagctcctcg gcatcaccat catggagcgc tcctccttcg agaagaaccc gatcgacttc 3540

ctcgaggcca agggctacaa ggaggtcaag aaggacctca tcatcaagct ccccaagtac 3600

tctcttttcg agctcgagaa cggtcgtaag aggatgctgg cttccgctcg cttcctccag 3660

aagggtaacg agcttgctct tccttccaag tacgtgaact tcctctacct cgcctcccac 3720

tacgagaagc tcaagggttc ccctgaggat aacgagcaga agcagctctt cgtggagcag 3780

cacaagcact acctcgacga gatcatcgag cagatctccg agttctccaa gcgcgtcatc 3840

ctcgctgacg ctaacctcga caaggtcctc tccgcctaca acaagcaccg cgacaagccc 3900

atccgcgagc aggccgagaa catcatccac ctcttcacgc tcacgaacct cggcgcccct 3960

cgcgctttca agtacttcga caccaccatc gacaggaagg tgtaccgctc caccaaggag 4020

gttctcgacg ctactctcat ccaccagtcc atcaccggtc tttacgagac tcgtatcgac 4080

ctttcccagc ttggtggtga t 4101

<210> 7

<211> 661

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tggaatcggc agcaaaggat tttttcctgt agttttccca caaccatttt ttaccatccg 60

aatgatagga taggaaaaat atccaagtga acagtattcc tataaaattc ccgtaaaaag 120

cctgcaatcc gaatgagccc tgaagtctga actagccggt cacctgtaca ggctatcgag 180

atgccataca agagacggta gtaggaacta ggaagacgat ggttgattcg tcaggcgaaa 240

tcgtcgtcct gcagtcgcat ctatgggcct ggacggaata ggggaaaaag ttggccggat 300

aggagggaaa ggcccaggtg cttacgtgcg aggtaggcct gggctctcag cacttcgatt 360

cgttggcacc ggggtaggat gcaatagaga gcaacgttta gtaccacctc gcttagctag 420

agcaaactgg actgccttat atgcgcgggt gctggcttgg ctgccgaaca aagcaccagt 480

ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc gggttcgatt cccggctggt 540

gcacgcgtcc atggagatcc accgtttcag agctatgctg gaaacagcat agcaagttga 600

aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct tttttttttt 660

t 661

Claims

1.一种将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法，为如下1)或2)或3)或4)：

所述sgRNA靶向靶点序列；

所述靶点序列的PAM序列为NGN；N为A、T、C或G。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SpRYn为A1)或A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述胞嘧啶脱氨酶为PmCDA1；

所述PmCDA1为C1)或C2)或C3)：

C1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

C3)在C1)或C2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述UGI为E1)或E2)或E3)：

E1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；

E3)在E1)或E2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述sgRNA为tRNA-esgRNA；

所述tRNA为m1)或m2)或m3)：

m1)将序列1第597-673位中的T替换为U得到的RNA分子；

所述esgRNA骨架为n1)或n2)或n3)：

n1)将序列1第694-779位中的T替换为U得到的RNA分子；

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述SpRYn的编码基因为b1)或b2)或b3)：

b1)序列表中序列1第3167-7267位所示的cDNA分子或DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2中所述SpRYn的cDNA分子或DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2中所述SpRYn的cDNA分子或DNA分子；

所述PmCDA1的编码基因为d1)或d2)或d3)：

d1)序列表中序列1第7553-8176位所示的cDNA分子或DNA分子；

d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或3中所述PmCDA1的cDNA分子或DNA分子；

d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或3中所述PmCDA1的cDNA分子或DNA分子；

所述UGI的编码基因为f1)或f2)或f3)：

f1)序列表中序列1第8210-8458位所示的cDNA分子或DNA分子；

f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或4中所述UGI的cDNA分子或DNA分子；

f3)在严格条件下与f1)或f2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或4中所述UGI的cDNA分子或DNA分子。

7.权利要求1-6任一所述方法在如下X1)-X3)任一种中的应用：

X1)植物基因组碱基替换或植物基因组碱基编辑；

X3)制备植物突变体。

8.成套试剂在如下T1)-T11)任一种中的应用：

T1)将植物基因组靶点序列中的C突变为T；

T2)制备将植物基因组靶点序列中的C突变为T的产品；

T3)植物基因组碱基替换；

T4)制备植物基因组碱基替换的产品；

T5)植物基因组碱基编辑；

T6)制备植物基因组碱基编辑的产品；

T7)提高植物基因组碱基替换效率；

T8)制备提高植物基因组碱基替换效率的产品；

T9)提高植物基因组碱基编辑效率；

T10)制备提高植物基因组碱基编辑效率的产品；

T11)制备植物突变体；

所述成套试剂包括权利要求1-6中任一所述的SpRYn、权利要求1-6中任一所述的胞嘧啶脱氨酶和权利要求1-6中任一所述的sgRNA；

所述靶点序列的PAM序列为NGN；N为A、T、C或G。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述成套试剂还包括权利要求1-6中任一所述的UGI。

10.根据权利要求1-6任一所述的方法或权利要求7-9任一所述的应用，其特征在于：所述植物为S1)或S2)或S3)：

S1)单子叶植物或双子叶植物；

S2)禾本科植物；

S3)水稻。