CN114317425B - 一种细胞支架及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞支架及其构建方法和应用。所述方法包括将基质胶和间充质细胞混合，得到细胞凝胶并进行培养，得到所述细胞支架。本发明提供了一种简单、快速、低成本的构建细胞支架的方法，所制备细胞支架具有网格状结构，孔径约为50～500μm，覆盖了人体多种腺体和脉管组织的解剖直径，可作为人体多种组织器官细胞如肾脏、前列腺、微/小血管或睾丸等的生长框架，以制备3D细胞培养模型，所构建的3D细胞培养模型可较好模拟体内生理结构。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种细胞支架及其构建方法和应用。
背景技术
现阶段科学研究大多使用细胞模型与动物模型，然而大量的实验研究发现上述两种模型存在一定的弊端。一方面细胞模型无法模拟机体内多种细胞复杂的相互作用，另一方面动物模型与人存在物种差异不能完全直观地反映人类机体变化，这在某种程度上限制了生物医学的发展。3D细胞培养模型的出现为弥补上述不足带来了可能，3D细胞微环境已被证明为细胞培养提供更完美的生理条件，能够更好地模拟内源性系统，并且能够在体外可持续培养。
近年来，3D细胞培养模型构建与培养技术突飞猛进，已经成功培养出大量具有部分关键生理结构和功能的类组织器官，比如：肾、肝、肺、肠、脑、前列腺、胰腺和视网膜等。人体许多组织器官，如肾脏、小肠、前列腺、血管和睾丸等均为中空的管网状结构，这类器官一般由上皮和其下间质组织组成，在构建这类模型时，往往需要使用3D打印或者致孔剂的细胞支架进行培养，如CN106085851A公开了一种基于3D打印的非接触式细胞共培养模型，包括用于培养不同细胞的两个培养体系，两个培养体系均由3D打印的中空纤维卷绕而成，中空纤维作为营养物质输送的通道；两个培养体系的至少一部分内外嵌套的卷绕在一起。但3D打印设备成本和维护费用仍比较昂贵且操作复杂，限制了该类方法的广泛应用。
综上所述，如何简单、快速地构建3D细胞管状细胞支架，且降低成本，是目前亟需解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种细胞支架及其构建方法和应用，所述细胞支架具有网格状结构，孔径约为50～500μm，覆盖了人体多种腺体和脉管组织的解剖直径，可作为人体多种组织器官细胞如肾脏、前列腺、微/小血管或睾丸等的生长框架，以制备3D细胞培养模型，且所述细胞支架的制备方法简单、周期短及成本低。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种构建细胞支架的方法，所述方法包括：
将基质胶和间充质细胞混合，得到细胞凝胶并进行培养，得到所述细胞支架。
本发明中，将基质胶和间充质细胞混合得到细胞凝胶，所述细胞凝胶中含有气泡，进行培养时，间充质细胞沿气泡边缘定植、生长、相互连接并进一步分泌细胞外基质，一段时间后基质胶被细胞吸收和分解，即可得到由间充质细胞组成的网格状细胞支架。
本发明中的构建细胞支架的方法所需原料(间充质细胞、基质胶和培养基等)和设备(培养箱、涡旋器)来源广泛、简单易得，制作过程无需高温加热，几乎所有生物实验室均可使用，操作简便且周期短，因此可广泛推广应用。
优选地，所述混合后还包括对基质胶和间充质细胞的混合物进行振荡和通气的步骤。
本发明中通过振荡和通气能够进一步增加细胞凝胶中气泡数量，使细胞支架结构更复杂化。
本发明中，市售常规基质胶均适用于本发明技术方案。
优选地，所述间充质细胞在所述细胞凝胶中的密度为1×106～1×109个/mL，包括但不限于1×107个/mL、1×108个/mL或1×109个/mL。
本发明中，常规能够培养哺乳动物细胞的培养基均适用于本发明技术方案。
优选地，所述培养的培养基包括DMEM培养基、D/F12培养基或EGM-2培养基。
优选地，所述DMEM培养基含有牛血清白蛋白。
优选地，所述培养的温度为35～38℃，包括但不限于36℃、37℃或38℃，所述培养的时间为4～9天，包括但不限于5天、6天、7天或8天。
作为优选的技术方案，所述构建细胞支架的方法包括：
将基质胶和间充质细胞混合，对基质胶和间充质细胞的混合物进行振荡和通气，得到细胞凝胶泡沫，并于35～38℃进行培养4～9天，得到所述细胞支架。
第二方面，本发明提供一种细胞支架，所述细胞支架由第一方面所述的构建细胞支架的方法制备得到。
本发明中，所述细胞支架具有网格状结构，孔径约为50～500μm，覆盖了人体多种腺体和脉管组织(肾小球：约50μm；甲状腺：约150μm；生精小管：约300μm；阴茎海绵体血管窦：约300μm等)的解剖直径，可作为人体多种组织器官细胞如肾脏、前列腺、微/小血管或睾丸等的生长框架。
第三方面，本发明提供如第二方面所述的细胞支架在制备构建3D细胞培养模型的产品中的应用。
第四方面，本发明提供如第二方面所述的细胞支架在构建3D细胞培养模型中的应用。
第五方面，本发明提供一种构建3D细胞培养模型的方法，所述方法包括使用第二方面所述的细胞支架培养器官的细胞。
优选地，所述器官包括肾脏、前列腺、微/小血管或睾丸。
本发明中以所述细胞支架为基础培养器官的细胞构建3D细胞培养模型，所构建的3D细胞培养模型可较好模拟体内生理结构。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的构建细胞支架的方法操作简单、周期短且成本低，能够快速制备网格状细胞支架，对于制备3D细胞培养模型领域具有重要意义；
(2)本发明的细胞支架具有网格状结构，孔径约为50～500μm，覆盖了人体多种腺体和脉管组织可作为人体多种组织器官细胞如肾脏、前列腺、微/小血管或睾丸等的生长框架，所构建的3D细胞培养模型可较好模拟体内生理结构。
附图说明
图1为细胞凝胶图；
图2为细胞凝胶在体视镜下成像图；
图3为细胞支架光镜图；
图4为共聚焦显微镜逐层扫描细胞支架成像图；
图5为共聚焦显微镜单层扫描细胞支架成像图；
图6为使用本发明的细胞支架进行内皮和平滑肌细胞培养后的共聚焦显微镜单层扫描成像图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
人阴茎海绵体组织是一种特殊的血管窦，是人体中天然存在的一种典型的网格化组织，本发明实施例以人阴茎海绵体组织来源的间充质细胞为例构建细胞支架。
实施例1
本实施例分离海绵体间充质细胞。
分离人海绵体组织，手术获取的海绵体组织，使用PBS漂洗3次去除血液，然后切割成2mm×2mm大小块状组织，使用消化酶(包括4mg/mL的IV型胶原酶、4mg/mL的I型胶原酶、3mg/mL的透明质酸酶和1.5mg/mL的胰酶)消化30min，然后使用组织滤网去除成块组织，离心保留细胞成分，得到间充质细胞。
实施例2
本实施例构建细胞支架并进行鉴定。
取实施例1分离的间充质细胞，使用10％胎牛血清的DMEM培养基重悬后进行培养，待细胞生长到100％密度时，消化细胞得到细胞悬液，使用PBS漂洗离心后放置于冰上预冷1min，然后使用基质胶(356231)重悬，重悬密度为1×108个/mL，吸取100μL细胞悬液转移到预冷的1.5mLEP管中，然后立即将细胞悬液进行涡旋，同时使用100mL移液枪反复吹打形成大量泡沫，每次吸取100mL左右泡沫放置于培养皿上(如图1所示)，在体视镜下成像观察泡沫，可见直径在50～500μm的微气泡(图2)，然后立即将培养皿颠倒放置于37℃培养箱中等待基质胶凝固，30min后使用细胞刮子小心铲起凝固的基质胶泡沫，放置于流式管(玻璃材质，避免基质胶和细胞贴附在管壁上)中，使用含10％FBS的DMEM培养基进行培养，期间每天半量换液1次，7天后即可得到细胞支架。
使用光镜观察细胞支架，如图3所示，可发现间充质细胞在3维空间上呈空心的类球型排列，在2维横切面上呈空心的网格状排列，进一步，使用鬼笔环肽标记细胞骨架成分，使用共聚焦显微镜拍照观察，可见间充质细胞可形成中空的窦腔(图4)，可发现细胞形成网格状排列的立体支架，网格孔径约为50～500μm(图5)，表明本发明成功构建网格状细胞支架。
实施例3
本实施例利用实施例2制备的细胞支架培养海绵体内皮细胞。
手术获取新鲜海绵体组织，使用消化酶(4mg/mL的IV型胶原酶、4mg/mL的I型胶原酶、3mg/mL的透明质酸酶和1.5mg/mL的胰酶)消化30min，然后使用组织滤网去除成块组织，离心保留细胞成分，使用内皮细胞培养基(Lonza，EGM-2)重悬后进行培养，7天后在显微镜下根据细胞形态确定内皮细胞和平滑肌细胞集落，分别消化后形成细胞悬液，加入实例2中的细胞支架进行共培养，2天后观察支架中内皮细胞与平滑肌定植与生长情况，以SAM标记平滑肌细胞，CD31标记内皮细胞，对DNA染色标记所有细胞核，进行单独观察及整合观察(MERGE)，结果如图6所示，可见内皮细胞与平滑肌细胞可定植于本发明网格状细胞支架，表明本发明的细胞支架能够为细胞提供生长环境，可有效应用于制备3D细胞培养模型。
综上所述，本发明提供了一种简单、快速、低成本的构建细胞支架的方法，所制备的细胞支架具有网格状结构，孔径约为50～500μm，覆盖了人体多种腺体和脉管组织的解剖直径，可作为人体多种组织器官细胞如肾脏、小肠、前列腺、血管或睾丸等的生长框架，以制备3D细胞培养模型，所构建的3D细胞培养模型可较好模拟体内生理结构。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (4)
1.一种构建孔径为50~500μm的细胞支架的方法，其特征在于，所述方法包括：
将基质胶和间充质细胞混合，得到细胞凝胶并进行培养，得到所述细胞支架；
所述间充质细胞来源为人阴茎海绵体组织；
所述混合后还包括对基质胶和间充质细胞的混合物进行振荡和通气的步骤；
所述间充质细胞在所述细胞凝胶中的密度为1×106~1×109个/mL；
所述培养的培养基包括DMEM培养基、D/F12培养基或EGM-2培养基；
所述培养的温度为35~38℃，所述培养的时间为4~9天。
2.一种细胞支架，其特征在于，所述细胞支架由权利要求1所述的构建孔径为50~500μm的细胞支架的方法制备得到。
3.权利要求2所述的细胞支架在制备构建3D细胞培养模型的产品中的应用。
4.一种构建3D细胞培养模型的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求2所述的细胞支架培养人阴茎海绵体组织的细胞。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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