CN114315754B - 一种异羟肟酸类化合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药化学领域，具体涉及一种含取代2‑苯基噻唑‑5‑甲酰胺或2‑苯基咪唑‑5‑甲酰胺的异羟肟酸类化合物及其用途，该类化合物具有式(I)所示的结构，能够选择性作用于HDAC6，抑制癌细胞增殖和增强肿瘤免疫作用，具有高效的抗癌活性。因此，可用于制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂以及治疗和/或预防癌症的药物。
Description
技术领域
本发明属于医药化学领域，具体涉及一种异羟肟酸类化合物及其用途。
背景技术
恶性肿瘤是一类高度复杂的疾病，严重威胁着人类生命健康，其危害程度仅次于心脑血管类疾病，而恶性肿瘤的有效治疗仍然是药物化学家们关注的焦点。近些年来，大量的研究表明组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的调控失衡会导致肿瘤的发生，因此该靶点被认为是一个可有效治疗肿瘤的靶标。HDAC家族主要有四大类，11个亚型，不同的亚型具有不同的生物学意义。HDAC6作为一个重要的HDAC亚型，抑制HDAC6对肿瘤细胞具有较大的毒性，但对正常组织的毒性较低。同时，HDAC6可有效促进肿瘤免疫，增加免疫检查位点抑制剂比如PD-1/PD-L1抑制剂的抗癌活性。
虽然目前已经有大量的HDAC抑制剂上市或者进入临床研究阶段，但这些药物均缺乏HDAC的亚型选择性，导致在产生较好的抗癌活性的同时，也对正常组织细胞有着较大的毒副作用和易出现耐药性等问题。因此，寻找高效低毒、高选择性的靶向HDAC抑制剂是目前抗癌药物开发的主要方向之一。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种含取代2-苯基噻唑-5-甲酰胺或2-苯基咪唑-5-甲酰胺的异羟肟酸类化合物及其制备方法和用途，所述化合物可选择性作用于HDAC6，抑制癌细胞增殖和增强肿瘤免疫作用，具有高效的抗癌活性。
本发明的第一方面，提供式(I)或式(II)或式(III)所示化合物或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂合物或前药：
本发明的第二方面，提供一种药物组合物，包括所述式(I)所示化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂合物或前药，以及任选的药学上可接受的赋形剂或载体。
本发明所述化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂合物或前药，或者所述药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠。给药剂型可为片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、或冻干粉针剂。可以为普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。
通常本发明的药物组合物含有质量百分比为0.1～99.9％的所述化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂合物或前药。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还包括其它活性药物成分。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物的给药形式包括将所述化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂合物或前药与其他活性药物成分同时、分别或依次给药。
在本发明的一些实施方式中，所述其它活性药物成分为PD-L1抑制剂，优选NP19。
NP19的全称为2-((5-氯-2-((3-氰基苄基)氧基)-4-((2-甲基-[1,1'-联苯基]-3-基)甲氧基)苄基)氨基)-2-甲基丙酸，化学结构式为
在本发明的一些实施方式中，在所述其它活性药物成分为PD-L1抑制剂的情况下，所述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂合物或前药与PD-L1抑制剂的质量比为2～8：1，优选3～6：1，更优选4～6：1。
本发明的第三方面，提供上述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂合物或前药，或上述的药物组合物在制备HDAC抑制剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述HDAC包括HDAC1、HDAC3、HDAC6、HDAC8中的至少一种，优选HDAC6。
本发明的第四方面，提供上述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂合物或前药，或上述药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述治疗和/或预防癌症的药物为抑制肿瘤生长的药物。
在本发明的一些实施方式中，所述治疗和/或预防癌症的药物为增加病灶中肿瘤浸润淋巴细胞百分比的药物。
本发明的式(I)所示化合物，尤其是化合物2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)噻唑-5-甲酰胺，可以进一步降低PD-L1抑制剂引起的PD-L1蛋白表达量减少，并通过活化肿瘤细胞微环境，增强肿瘤组织中淋巴细胞浸润，从而增强PD-L1抑制剂的抗肿瘤活性。
在本发明的一些实施方式中，所述癌症为结肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病和黑色素瘤，优选黑色素瘤。
本发明的第五方面，提供上述式(II)所示化合物或式(III)所示化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂合物或前药作为中间体在制备式(I)所示化合物中的用途。
本发明的第六方面，提供上述式(II)所示化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂合物或前药的制备方法，所述式(II)所示化合物由化合物A与化合物B缩合得到：
在本发明的一些实施方式中，所述缩合在溶剂存在的条件下进行，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
在本发明的一些实施方式中，所述缩合在缩合剂以及有机碱存在的条件下进行。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和/或1-羟基苯并三唑，所述有机碱为三乙胺。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与1-羟基苯并三唑的摩尔比为0.8～1.2：0.8～1.2。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述化合物A：化合物B：缩合剂：有机碱的摩尔比为1：1～1.2：2～3：3～4。
在本发明的一些实施方式中，所述缩合的温度为20-30℃，缩合的时间为2-4h。
本发明的第七方面，提供所述式(III)所示化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂合物或前药的制备方法，所述式(III)所示化合物由式(II)所示化合物水解得到。
在本发明的一些实施方式中，所述式(III)所示化合物由式(II)所示化合物经氢氧化锂水解得到。
在本发明的一些实施方式中，所述式(II)所示化合物：氢氧化锂的摩尔比为1：1.2～2。
本发明的第八方面，提供所述式(I)所示化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂合物或前药的制备方法，包括以下步骤：
将式(III)所示化合物与羟胺或羟胺盐、缩合剂混合，反应即得。
在本发明的一些实施方式中，所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和/或1-羟基苯并三唑。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与1-羟基苯并三唑的摩尔比为0.8～1.2：0.8～1.2。
在本发明的一些实施方式中，所述反应中还包括加入有机碱混合，所述有机碱为三乙胺。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述式(III)所示化合物：羟胺或羟胺盐：缩合剂：有机碱的摩尔比为1：1～1.2：2～3：3～4。
在本发明的一些实施方式中，所述反应的温度为20-30℃，反应的时间为2-4h。
根据本发明实施方式的化合物，至少具备如下有益效果：
(1)本发明提供了一种含2-苯基噻唑-5-甲酰胺或2-苯基咪唑-5-甲酰胺的异羟肟酸类化合物，两种化合物对人结肠癌细胞HCT116、小鼠黑色素瘤B16-F10及人外周血白血病T细胞Jurkat-T细胞的增殖抑制效果显著，在小鼠体内可有效抑制小鼠黑色素瘤B16-F10的增殖，可用于制备抗肿瘤药物。进一步的抗癌机制发现该类化合物可有效抑制HDAC6的活性从而发挥抗癌作用。同时，该类化合物和PD-L1抑制剂联用可显示出比药物单用更好的抗癌活性，为后续的药物联用奠定了基础。
(2)本发明的式(I)所示化合物的制备方法具有产率高，后处理简便，经济性好的优点。
本申请中术语：“药学上可接受的盐”包括与药学上可以接受的无机酸或者有机酸、或者无机碱或有机碱形成的常规盐。
“药物组合物”包括含治疗有效量的本发明的化合物的产品，以及直接地或间接地由本申请化合物的组合产生的任何产品。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，其中：
图1为本发明式(I)所示化合物2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)噻唑-5-甲酰胺的核磁共振氢谱图。
图2为本发明式(I)所示化合物2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)噻唑-5-甲酰胺的核磁共振碳谱图。
图3为本发明式(I)所示化合物2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)噻唑-5-甲酰胺的质谱图。
图4为本发明式(I)所示化合物2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)噻唑-5-甲酰胺的液相图。
图5为本发明式(I)所示化合物2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)咪唑-5-甲酰胺的核磁共振氢谱图。
图6为本发明式(I)所示化合物2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)咪唑-5-甲酰胺的核磁共振碳谱图。
图7为本发明式(I)所示化合物2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)咪唑-5-甲酰胺的质谱图。
图8为本发明式(I)所示化合物2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)咪唑-5-甲酰胺的液相图。
图9为式(I)所示化合物的体内抗肿瘤活性评价，包括空白对照组(Control)、PD-L1抑制剂组(NP19)、阳性对照组(CAY10603)、式(I)所示化合物VIII组(VIII)、PD-L1抑制剂组+式(I)所示化合物VIII组(NP19+VIII)、PD-L1抑制剂+阳性对照组(NP19+CAY10603)小鼠的肿瘤组织图(A)，小鼠体重(B)、肿瘤重量(C)、以及肿瘤体积(D)。
图10为式(I)所示化合物VIII对肿瘤免疫活性的影响，A：空白对照组(Control)与PD-L1抑制剂组(NP19)小鼠肿瘤组织中的浸润淋巴细胞(CD3+CD4+,CD3+CD8+)的比例；B：式(I)所示化合物VIII组(VIII)与PD-L1抑制剂组+式(I)所示化合物VIII组(NP19+VIII)小鼠肿瘤组织中的浸润淋巴细胞(CD3+CD4+,CD3+CD8+)的比例。
图11为式(I)所示化合物VIII对黑色素瘤组织中PD-L1蛋白表达水平的影响，A：Western Blot检测式(I)所示化合物VIII对PD-L1蛋白表达水平的影响；B：式(I)所示化合物VIII影响PD-L1蛋白表达水平的定量化结果。与NP19组比较，##P<0.01；与空白对照组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例
中间体的制备
中间体：2-(2,4-二甲氧基苯基)噻唑-5-羧酸甲酯的制备
将0.2g 2-溴-5-甲酸酯噻唑溶于10mL甲苯中，加入0.2g 2,4-二甲氧基苯硼酸，再加入0.11g四三苯基膦钯和0.5g磷酸钾，在氮气环境下于90度反应10小时，薄层色谱板监测反应完全后，将反应液用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相用饱和食盐水(5mL×3)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用石油醚：乙酸乙酯进行柱层析得到白色固体粉末0.218g，产率为86％。对柱层析得到白色固体粉末采用薄层色谱法进行鉴定，结果显示该白色固体粉末为中间体2-(2,4-二甲氧基苯基)噻唑-5-羧酸甲酯。
中间体：2-(2,4-二甲氧基苯基)咪唑-5-羧酸甲酯的制备
将0.21g 2-溴-5-甲酸酯咪唑溶于10mL甲苯中，加入0.21g 2,4-二甲氧基苯硼酸，再加入0.12g四三苯基膦钯和0.5g磷酸钾，在氮气环境下于90度反应10小时，薄层色谱板监测反应完全后，将反应液用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相用饱和食盐水(5mL×3)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用石油醚：乙酸乙酯进行柱层析得到白色固体粉末0.162g，产率为59％。对柱层析得到白色固体粉末采用薄层色谱法进行鉴定，结果显示该白色固体粉末为中间体2-(2,4-二甲氧基苯基)咪唑-5-羧酸甲酯。
化合物A：2-(2,4-二甲氧基苯基)噻唑-5-羧酸的制备
取0.21g中间体2-(2,4-二甲氧基苯基)噻唑-5-羧酸甲酯加入15mL甲醇，使其溶解，后加入0.05g的氢氧化锂水溶液，待反应完全后，于真空下蒸干甲醇后，加入2mL盐酸，pH为酸性时，析出白色固体，即可用布氏漏斗抽滤，获取白色固体0.196g，产率为97％。对抽滤得到白色固体粉末采用薄层色谱法进行鉴定，结果显示该白色固体粉末为2-(2,4-二甲氧基苯基)噻唑-5-羧酸。
化合物A：2-(2,4-二甲氧基苯基)咪唑-5-羧酸的制备
取0.12g中间体2-(2,4-二甲氧基苯基)咪唑-5-羧酸甲酯加入15mL甲醇，使其溶解，后加入0.03g的氢氧化锂水溶液，待反应完全后，于真空下蒸干甲醇后，加入2mL盐酸，pH为酸性时，析出白色固体，即可用布氏漏斗抽滤，获取白色固体0.11g，产率为96％。对抽滤得到白色固体粉末采用薄层色谱法进行鉴定，结果显示该白色固体粉末为2-(2,4-二甲氧基苯基)咪唑-5-羧酸。
式II化合物：7-(2-(2,4-二甲氧基苯基)噻唑-5-甲酰胺基)庚酸甲酯的制备
取0.16g的2-(2,4-二甲氧基苯基)噻唑-5-羧酸加入3.0mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，使其溶解，后加入0.14g 7-氨基庚酸甲酯盐酸盐(化合物B)，再各加入0.14g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.1g 1-羟基苯并三唑，最后加入0.18g的三乙胺，于室温下反应2小时。待反应完全后，往反应液中加入5.0mL水，待析出白色固体，即可用布氏漏斗抽滤，获取白色固体0.213g，产率为89％。对抽滤得到的白色固体粉末采用薄层色谱法、核磁共振方法进行鉴定，结果显示该白色固体粉末为7-(2-(2,4-二甲氧基苯基)噻唑-5-甲酰胺基)庚酸甲酯。
式II化合物：7-(2-(2,4-二甲氧基苯基)咪唑-5-甲酰胺基)庚酸甲酯的制备
取0.15g的2-(2,4-二甲氧基苯基)咪唑-5-羧酸加入3.0mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，使其溶解，后加入0.15g 7-氨基庚酸甲酯盐酸盐(化合物B)，再各加入0.14g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.1g 1-羟基苯并三唑，最后加入0.18g的三乙胺，于室温下反应2小时。待反应完全后，往反应液中加入5.0mL水，待析出白色固体，即可用布氏漏斗抽滤，获取白色固体0.213g，产率为91％。对抽滤得到的白色固体粉末采用薄层色谱法、核磁共振方法进行鉴定，结果显示该白色固体粉末为7-(2-(2,4-二甲氧基苯基)咪唑-5-甲酰胺基)庚酸甲酯。
式III化合物：7-(2-(2,4-二甲氧基苯基)噻唑-5-甲酰胺基)庚酸的制备
向0.22g的7-(2-(2,4-二甲氧基苯基)噻唑-5-甲酰胺基)庚酸甲酯中加入10mL甲醇，使其溶解，后加入0.02g氢氧化锂水溶液，待反应完全后，于真空下蒸干甲醇后，加入2.0mL盐酸，pH为酸性时，析出白色固体，即可用布氏漏斗抽滤，取白色固体0.201g，产率为95％。对抽滤得到白色固体粉末采用薄层色谱法、核磁共振方法进行鉴定，结果显示该白色固体粉末为7-(2-(2,4-二甲氧基苯基)噻唑-5-甲酰胺基)庚酸。
式III化合物：7-(2-(2,4-二甲氧基苯基)咪唑-5-甲酰胺基)庚酸的制备
向0.39g的7-(2-(2,4-二甲氧基苯基)咪唑-5-甲酰胺基)庚酸甲酯中加入10mL甲醇，使其溶解，后加入0.04g氢氧化锂水溶液，待反应完全后，于真空下蒸干甲醇后，加入2.0mL盐酸，pH为酸性时，析出白色固体，即可用布氏漏斗抽滤，取白色固体0.356g，产率为95％。对抽滤得到白色固体粉末采用薄层色谱法、核磁共振方法进行鉴定，结果显示该白色固体粉末为7-(2-(2,4-二甲氧基苯基)咪唑-5-甲酰胺基)庚酸。
实施例1式I化合物(化合物VIII)：2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)噻唑-5-甲酰胺的制备
取0.25g的7-(2-(2,4-二甲氧基苯基)噻唑-5-甲酰胺基)庚酸加入5.0mL的N,N-二甲基甲酰胺，使其溶解，后加入0.06g盐酸羟胺，各再加入0.15g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.1g 1-羟基苯并三唑，最后加入0.2g的三乙胺，于室温下反应2小时。待反应完全后，往反应液中加入10.0mL水，待析出白色固体，即可用布氏漏斗抽滤，取白色固体0.029g，产率为11％。对抽滤得到白色固体粉末采用核磁共振方法进行鉴定，结果显示该白色固体粉末为化合物VIII。
将所得到的白色固体采用核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、高分辨质谱和高效液相色谱进行鉴定，结果分别如图1-4所示，具体鉴定结果为：1H-NMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.35(s,1H),8.66(s,1H),8.56(s,1H),8.38(s,1H),8.22(d,J＝8.7Hz,1H),6.78(s,1H),6.71(d,J＝8.7 Hz,1H),4.03(s,3H),3.85(s,3H),3.22(d,J＝5.8 Hz,2H),1.94(t,J＝7.1Hz,2H),1.50(d,J＝6.1 Hz,4H),1.28(s,4H)。13C-NMR(101 MHz,d6-DMSO)δ169.08,164.07,162.47,160.37,157.70,142.02,133.70,128.86,114.40,106.76,98.40,56.06,55.59,32.20,29.01,28.30,26.17,25.05。m.p:129.5℃-130.7℃。HRMS(ESI-Q-TOF)m/z:[M+H]+calculated for C19H26N3O5S:408.1515,found:408.1516。HPLC:tR 15.424 min,purity98.50％，高效液相峰表数据见表1。
表1峰表
| Peak# | Ret.Tim | Area | Height | Conc. | Area％ |
| 1 | 14.862 | 64065 | 9408 | 1.150 | 1.150 |
| 2 | 15.424 | 5488488 | 695175 | 98.494 | 98.494 |
| 3 | 15.858 | 19835 | 3988 | 0.356 | 0.356 |
| Total | 5572389 | 708570 | 100.000 |
由上述鉴定结果可知，所得白色固体为2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)噻唑-5-甲酰胺，其结构式为
实施例2式I化合物(化合物IX)：2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)咪唑-5-甲酰胺的制备
取0.2g的7-(2-(2,4-二甲氧基苯基)咪唑-5-甲酰胺基)庚酸加入5.0mL的N,N-二甲基甲酰胺，使其溶解，后加入0.05g盐酸羟胺，各再加入0.12g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.08g 1-羟基苯并三唑，最后加入0.16g的三乙胺，于室温下反应2小时。待反应完全后，往反应液中加入10.0mL水，待析出白色固体，即可用布氏漏斗抽滤，取白色固体0.015g，产率为7％。对抽滤得到白色固体粉末采用核磁共振方法进行鉴定，结果显示该白色固体粉末为化合物IX。
将所得到的白色固体采用核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、高分辨质谱和高效液相色谱进行鉴定，结果分别如图5-8所示，具体鉴定结果为：1H-NMR(400 MHz,d6-DMSO)δ13.14(s,1H),10.35(s,1H),8.96(s,1H),8.76(s,1H),8.24(s,1H),7.95(s,2H),6.78(s,1H),6.75(d,J＝4.0 Hz,1H),4.04(s,3H),3.87(s,3H),3.23(s,2H),1.94(s,2H),1.49(s,4H),1.27(s,4H)。13C-NMR(101 MHz,d6-DMSO)δ169.6,164.1,162.3,161.6,144.7,137.8,132.7,131.3,121.7,121.0,115.8,115.6,112.4,56.4,55.9,38.6,32.7,29.8,28.8,26.6,25.5。m.p:131.9℃-133.1℃。HRMS(ESI-Q-TOF)m/z:[M+H]+calculated for C19H27N4O5:391.1903,found:391.1905。HPLC:tR 14.391 min,purity 97.72％，高效液相峰表数据见表2。
表2峰表
| Peak# | Ret.Tim | Area | Height | Conc. | Area％ |
| 1 | 1.483 | 6041 | 811 | 0.239 | 0.239 |
| 2 | 2.011 | 8198 | 734 | 0.324 | 0.324 |
| 3 | 4.933 | 6984 | 597 | 0.276 | 0.276 |
| 4 | 14.391 | 2474396 | 351432 | 97.719 | 97.719 |
| 5 | 14.793 | 28697 | 5053 | 1.133 | 1.133 |
| 6 | 15.122 | 7844 | 1028 | 0.310 | 0.310 |
| Total | 2532160 | 359654 | 100.000 |
由上述鉴定结果可知，所得白色固体为2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)咪唑-5-甲酰胺，其结构式为
实施例3体外抗肿瘤活性研究
本发明所述化合物的体外抗肿瘤活性采用如下方法测试所证明。这些效果表明本发明化合物可用于治疗癌症。具体测试方法如下：
采用MTT法检测实施例1所制备的2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)噻唑-5-甲酰胺和实施例2所制备的2-(2,4-二甲氧基苯基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)咪唑-5-甲酰胺的体外抗肿瘤活性。肿瘤细胞系购自美国ATCC，采用标准MTT法测定待测化合物对人结直肠癌细胞系HCT-116、人非小细胞肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、黑色素瘤细胞B16-F10及耐HDAC抑制剂的胃癌细胞YCC细胞系的抗增殖活性进行测定，用CCK-8法对人淋巴瘤Jurkat-T细胞系的细胞毒性进行评价。所有癌细胞系均在添加10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。细胞以5000个细胞/孔的密度接种到96孔板中。去除培养基后，向每个孔中添加100μL含有不同浓度的化合物的0.1％二甲基亚砜的培养基，并在37℃下再培养48小时。添加MTT或CCK-8 10μL(5mg/mL PBS)并再培养4小时，小心弃去上清液，每孔加入DMSO100μL，在37℃下再培养15分钟使甲瓒充分溶解，然后用波长为570nM的微孔板读取器检测吸光度纳米。所有的实验至少在三个独立的实验中重复。IC50值用Prism-GraphPad软件进行非线性回归分析。按下列公式计算抑制率，抑制率＝(1-加药组OD值/对照组OD值)×100％。
所测活性结果如表3所示：
表3化合物VIII、IX的抗肿瘤活性
上述体外实验结果显示，化合物VIII、IX对人结肠癌细胞HCT-116、人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人T淋巴母细胞Jurkat和小鼠皮肤黑色素瘤细胞B16-F10五种肿瘤细胞具有较强的增殖抑制作用，效果均明显优于阳性对照品(CAY10603)的抑制活性。
实施例4体外抑制HDAC研究
本发明化合物VIII、IX的体外抗肿瘤活性采用如下方法测试所证明。这些效果表明本发明化合物VIII、IX可用于有效抑制HDAC6。具体测试方法如下：
采用荧光分析法测定化合物VIII、IX的酶抑制活性，其中HDAC1(#ab101661)和HDAC6(#ab42632)酶购自Abcam公司，HDAC3(#BML-SE515-0050)从恩佐公司购买，HDAC8(#H90-30H-05)从SignalChem购买。缓冲液中含有25mmol/L Tris(pH 8.0)、1mmol/L MgCl2、0.1mg/mL BSA、137mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl，其中HDAC(HDAC1，7.2ng/孔；HDAC3，3.4ng/孔；HDAC6，15ng/孔；HDAC8，22ng/孔)，总体积为40μL。将待测化合物(10个稀释浓度，依次为500μM，125μM,31.25μM,7.81μM,1.95μM,0.49μM,0.12μM,0.03μM,7.6nM,1.88nM。每个稀释浓度做3个复孔)稀释在10％二甲基亚砜中，添加5μL稀释液并预培养在添加底物前，加入纯化的重组HDAC在室温下放置5min。最后，添加酶底物(Ac-Leu-Gly-Lys(Ac)-AMC，底物浓度10μM用于HDAC1、3、6；Ac-Leu-Gly-Lys(Tfa)-AMC，底物浓度2μM用于HDAC8)，并在37℃下以50μL的终体积培养30min。在室温下用50μL HDAC分析显影剂(1mg/mL胰蛋白酶和2μmol/L TSA于分析缓冲液中)使反应猝灭30min。通过酶标仪后对混合物中的荧光产物量进行测定。然后在TECAN酶标仪读取350-360nm的激发和450-460nm的发射波长处的荧光强度。IC50值的计算采用非线性回归方法，并使用Prism-GraphPad软件进行归一化剂量-反应拟合，所有实验至少独立进行三次。
所测活性结果如表4所示：
表4化合物VIII、IX的抗HDAC活性
上述体外实验结果显示，化合物VIII对HDAC6具有较强的抑制作用(IC50＝0.031nmol/L)，其亚型选择性指数为338，和阳性对照品(CAY10603)的HDAC6抑制活性相当。化合物IX对HDAC6也具有较强的抑制作用(IC50＝0.048nmol/L)，其亚型选择性指数为303。
实施例5体内抗癌活性研究
本发明化合物VIII的体内抗肿瘤活性采用如下方法测试所证明。这些效果表明本发明化合物VIII可用于体内黑色素瘤的治疗。具体测试方法如下：
本实验采用6～8周龄的C57小鼠，购自广东省实验中心，实验经南方医科大学国家机构动物保护与伦理委员会批准，研究化合物VIII对黑色素瘤细胞皮下移植模型的抑制作用。将对数生长期的B16-F10细胞(2.5×105/mL)悬浮于PBS中，然后注入小鼠体内200μL，建立肿瘤模型。将小鼠随机分为六组(n＝8)，将需要测试的化合物溶解在二甲基亚砜：乙醇：聚氧乙烯蓖麻油：PEG300：生理盐水(1：2：2：2：13)溶液中以产生所需浓度。空白组小鼠通过腹腔注射等量的上述空白溶剂，其他组别腹腔注射给予200μL药物治疗，每天给药一次，持续14天，具体组别和药物用量见表5。
表5组别和药物组成用量
在整个实验期间监测小鼠体重以评估急性毒性，用游标卡尺测量肿瘤体积，并用公式a×b2×0.5计算肿瘤体积，其中a和b分别代表较大和较小的直径。实验开始后14天后，把实验小鼠解剖小鼠后取出肿瘤组织，对肿瘤进行称重、量取体积和拍照。肿瘤生长抑制值(TGI)的计算公式为：TGI(％)＝[1-Wt/Wv]×100％，其中Wt和Wv是治疗组和溶媒对照组的平均肿瘤重量。
所测活性结果如图9所示，通过阳性对照品(CAY10603)与化合物VIII比较可知，化合物VIII和阳性对照品CAY10603给药14天后可以使实验动物的肿瘤生长抑制率为63％和48％，化合物VIII展现出比阳性对照药物CAY10603更显著的抑制肿瘤生长的效应。为了验证新合成的HDAC6抑制剂是否促进肿瘤免疫从而增强抗肿瘤效果，实验进一步考察了化合物VIII与PD-1/PD-L1抑制剂NP19联合用药后对肿瘤生长的抑制效果。如图9所示，VIII+NP19组(TGI＝69％)展现出比NP-19(TGI＝52％)或者VIII(TGI＝63％)单独使用时更强的抑瘤效应，而CAY10603+NP19组(TGI＝58％)同样展现出比两个药单用更好的抑瘤活性。
实施例6增强肿瘤免疫活性研究
本发明化合物VIII的增强肿瘤免疫活性研究采用如下方法测试所证明。这些效果表明本发明化合物VIII可增强PD-L1抑制剂NP19的抗肿瘤活性，可为HDAC6和PD-L1抑制剂联合用药提供治疗基础。具体测试方法如下：
上述实验开始后14天后，把实验小鼠处死后，解剖小鼠后获得其肿瘤组织，置于培养皿中的200目不锈钢网上，用注射器针芯碾压研碎。PRMI 1640培养液冲洗不锈钢网，收集脾细胞悬液。PBS洗涤细胞1次(1500r/min，5min)。用3-5倍体积的红细胞裂解液裂解红细胞，室温反应2min，500g离心5min，去上清，细胞沉淀用PBS洗涤细胞2次(1500r/min，5min)。洗涤后重悬细胞，待测。在1000转离心5min收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。然后加入PBS重悬细胞，使细胞浓度为1.0×106个/mL。吸取100μL上述细胞悬液到另一离心管中：空白对照管中不加任何抗体；CD3单染管仅加1μL FITC-CD3抗体；CD4单染管仅加1μLPE-CD4抗体；CD8单染管仅加1μL APC-CD8抗体；样品管同时加入1μL FITC-CD3抗体、1μLPE-CD4抗体和1μL APC-CD8抗体，轻混匀后，室温(25℃)避光反应30min。然后，每管加入1mLPBS重悬细胞，1000转离心5min收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。最后，每管加入300μL PBS，上机进行流式分析。选择合适的通道(FL1通道检测FITC，FL3通道检测PE，FL4通道检测APC)，同时对肿瘤组织中的PD-L1蛋白表达量进行检测。
所测活性结果如图10、11所示。上述体外实验结果显示，化合物VIII可增强肿瘤组织中淋巴细胞浸润，另外也表明化合物VIII可通过活化肿瘤细胞微环境，有效增加PD-1/PD-L1抑制剂的抗肿瘤活性。同时，化合物VIII联用NP19后，联合用药组肿瘤组织中的PD-L1蛋白表达量比单用NP19组低，表明化合物VIII可以通过增强PD-L1抑制剂引起的PD-L1蛋白表达量减少，从而增强PD-L1抑制剂的抗肿瘤活性。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (16)
1.式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：
2.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐，以及任选的药学上可接受的赋形剂或载体。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括其它活性药物成分。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述其它活性药物成分为PD-L1抑制剂。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐与所述PD-L1抑制剂的质量比为2～8：1。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐与所述PD-L1抑制剂的质量比为3～6：1。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐与所述PD-L1抑制剂的质量比为4～6：1。
8.权利要求1所述的式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求2～7中任一项所述的药物组合物在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶选自组蛋白去乙酰化酶1、组蛋白去乙酰化酶3、组蛋白去乙酰化酶6、组蛋白去乙酰化酶8中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶为组蛋白去乙酰化酶6。
11.权利要求1所述的式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求2～7中任一项所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述癌症选自结肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病和黑色素瘤。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述癌症为黑色素瘤。
14.权利要求1所述的式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括以下步骤：
将式(III)所示化合物与羟胺或羟胺盐、缩合剂混合，反应即得；
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述式(III)所示化合物由式(II)所示化合物水解得到；
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述式(II)所示化合物由化合物A与化合物B缩合得到：
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