CN115010658B - 一种化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种化合物及其制备方法与应用，其结构为

Description

一种化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于制药领域，具体涉及一种化合物及其制备方法与应用。
背景技术
癌症严重威胁人类的生命健康，是造成人类死亡的第二大病因，针对癌症的有效治疗方案成为了科学家们关注的焦点。近十年来，已有大量分子靶向药物上市用于癌症治疗，但由于癌症是一类多基因相关、高度复杂性疾病，往往单靶点药物在治疗癌症时存在疗效有限、只对部分病人有效等缺陷。针对上述问题，临床上常采用联合用药的方案，虽然不同作用机制的药物联用在一定程度上弥补了单靶点药物的不足，但也产生了一系列问题，如毒副作用叠加、PK/PD性质不可预测等。
自2006年全球首个PD-1单抗进入临床试验起，PD-1/PD-L1抑制剂的研究迅速发展，它对多种癌症疗效确切，但其单药治疗应答率低(～20％)。因此，临床上常将PD-L1抑制剂与其他抗癌药物联用以提高应答率，但毒性大等问题限制了它的进一步应用。而合理设计PD-L1抑制剂和其他抗癌药物的双靶点药物，不仅具有简单的PK/PD性质，而且通过双重抗癌机制，发挥不同靶点间协同作用，在提高抗癌药效、降低毒性方面具有明显优势。组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)作为一个重要的组蛋白去乙酰化酶家族成员，它存在着对肿瘤细胞毒性较大但对正常组织毒性较弱的优势，已获得大量研究者的关注。同时，近期研究表明靶向HDAC6的抑制剂具有增强抗肿瘤免疫的潜力，具有和免疫检查位点抑制剂(如PD-L1抑制剂)制备成双靶点抑制剂的前景。目前，未见HDAC6与PD-L1的双靶点抑制剂的报道，因此，设计能作用于PD-L1和HDAC6的双重抑制剂，用于癌症治疗具有重要意义。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种化合物；本发明的目的之二在于提供这种化合物的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种药物组合物；本发明的目的之四在于提供这种化合物的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一方面提供一种化合物，所述化合物的结构如式(Ⅰ)所示；
Figure BDA0003638419250000011
式(Ⅰ)中，R1选自C1-C12的亚烷基。
优选的，所述式(Ⅰ)中，R1选自C1-C6的亚烷基。
优选的，所述化合物包括以下所示的结构；
Figure BDA0003638419250000021
优选的，所述化合物为HDAC6/PD-L1双靶点抑制剂。
本发明第二方面提供根据本发明第一方面所述化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)将式(Ⅱ)所示的化合物与式(Ⅲ)所示的化合物混合，反应，得到式(Ⅳ)所示的化合物；
Figure BDA0003638419250000022
式(Ⅲ)中，R1选自C1-C12的亚烷基，R2选自C1-C4的烷基；
2)将式(Ⅳ)所示的化合物水解，得到式(Ⅴ)所示的化合物；
Figure BDA0003638419250000023
3)将式(Ⅴ)所示的化合物与盐酸羟胺混合，反应，得到所述的化合物。
优选的，所述步骤1)中，式(Ⅱ)所示的化合物与式(Ⅲ)所示的化合物摩尔比为1：(2-4)；进一步优选的，所述步骤1)中，式(Ⅱ)所示的化合物与式(Ⅲ)所示的化合物摩尔比为1：(2.5-3.5)。
优选的，所述步骤3)中，式(Ⅴ)所示的化合物与盐酸羟胺摩尔比为1：(5-40)；进一步优选的，所述步骤3)中，式(Ⅴ)所示的化合物与盐酸羟胺摩尔比为1：(10-30)。
本发明第三发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的化合物或其立体异构体、溶剂化物、前药、代谢产物、药学上可接受的盐或共晶。
本发明第四方面提供根据本发明第一方面所述化合物或其立体异构体、溶剂化物、前药、代谢产物、药学上可接受的盐或共晶在制备治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗癌症药物中的应用。
优选的，所述的癌症包括黑色素瘤、白血病。
优选的，所述的癌症药物包括HDAC6抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
本发明的有益效果是：
本发明公开的化合物结构新颖，能够选择性作用于HDAC6和PD-L1，表现出良好的HDAC6酶和PD-L1蛋白抑制活性；该化合物的制备方法工艺成熟、安全无污染，具有可工业推广的优势；该化合物可广泛应用于制备HDAC6抑制剂和/或PD-L1抑制剂，以及制备治疗和/或预防癌症的药物。
附图说明
图1为实施例1制备化合物HP1的核磁共振氢谱。
图2为实施例1制备化合物HP1的核磁共振碳谱。
图3为实施例2制备化合物HP2的核磁共振氢谱。
图4为实施例2制备化合物HP2的核磁共振碳谱。
图5为实施例3制备化合物HP3的核磁共振氢谱。
图6为实施例3制备化合物HP3的核磁共振碳谱。
图7为实施例4制备化合物HP4的核磁共振氢谱。
图8为实施例4制备化合物HP4的核磁共振碳谱。
图9为实施例5制备化合物HP5的核磁共振氢谱。
图10为实施例5制备化合物HP5的核磁共振碳谱。
图11为实施例6制备化合物HP6的核磁共振氢谱。
图12为实施例6制备化合物HP6的核磁共振碳谱。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器末注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
本实施例化合物的制备反应路线如下，
Figure BDA0003638419250000041
根据上述反应路线，化合物的制备包括以下步骤；
1)将2-溴-6-碘甲苯(A)溶于甲苯和水的混合溶液中，按2-溴-6-碘甲苯的摩尔量加入1.2摩尔倍的苯硼酸(B)，按2-溴-6-碘甲苯(A)的摩尔量加入0.1摩尔倍的四三苯基膦钯和2.5摩尔倍的磷酸钾，在氮气环境下于90度反应10小时，薄层色谱板监测反应完全后，将反应液用乙酸乙酯进行萃取，取有机相用饱和食盐水和无水硫酸钠干燥，脱溶，柱层析分离提纯出，得到中间体3-溴-2-甲基-1,1'-联苯(C)；具体反应式如下；
Figure BDA0003638419250000042
2)取步骤1)得到的3-溴-2-甲基-1,1'-联苯(C)溶解于DMSO中，按3-溴-2-甲基-1,1'-联苯的摩尔量加入1.2摩尔倍的联硼酸频那醇酯，按3-溴-2-甲基-1,1'-联苯(C)的摩尔量加入0.1摩尔倍的二氯[1,1'-双(二叔丁基膦)二茂铁钯(II)和2.5摩尔倍的乙酸钾，在氮气环境下于80度反应12小时，薄层色谱板监测反应完全后，将反应液用乙酸乙酯进行萃取，取有机相用饱和食盐水和无水硫酸钠干燥，脱溶，柱层析分离提纯出，得到中间体D；具体反应式如下；
Figure BDA0003638419250000043
3)取步骤2)得到的中间体D加入适量甲苯/水(V/V＝2/1)作为溶剂，后按中间体D的摩尔量加入1.1摩尔倍的6-氯-2-甲氧基-吡啶-3-甲醛(E)，按中间体D的摩尔量加入0.1摩尔倍的四三苯基膦钯和2.5摩尔倍的磷酸钾，在氮气环境下于90度反应10小时，薄层色谱板监测反应完全后，将反应液用乙酸乙酯进行萃取，取有机相用饱和食盐水和无水硫酸钠干燥，脱溶，柱层析分离提纯出，得到中间体F。具体反应式如下；
Figure BDA0003638419250000051
4)取步骤3)得到的中间体F，氨基甲酯盐酸盐衍生物(G)和甲醇加入到100mL茄形瓶内，室温反应2h。经TLC检测原料反应完全后，往反应体系内加入NaBH3CN和4滴冰醋酸，室温反应约24h，经TLC检测原料反应完毕后，减压蒸馏除去溶剂，得到的白色固体用20mL乙酸乙酯分散，抽滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，经柱层析得无色透明油状产物H。具体反应式如下；
Figure BDA0003638419250000052
5)将盐酸羟胺分散到甲醇溶液中，冰浴条件下缓慢滴加氢氧化钾的甲醇溶液，再加入反应20min后，迅速抽滤，滤液备用。取步骤4)得到的中间体H溶解于甲醇中，冰浴条件下缓慢滴加上述羟胺备用液，滴加完毕后，室温反应1h，经TLC检测反应完毕后，停止反应。将反应液减压蒸馏除去溶剂，得到粗品。将粗品中加入水后，在冰浴条件下用稀盐酸调节pH至中性。分离有机层和水层，有机层依次用水、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂得到白色固体产物(I)。具体反应式如下；
Figure BDA0003638419250000053
实施例1
本例化合物的具体制备步骤如下：
1)合成中间体3-溴-2-甲基-1,1'-联苯：将1.0g的1-溴-3-碘-2-甲基苯(A)(3.37mmol)溶于30mL的甲苯/水(V/V＝2/1)中，加入0.493g的苯硼酸(B)(4.04mmol)，再加入0.195g的四三苯基膦钯(0.169mmol)和1.79g的磷酸钾(8.42mmol)，在氮气环境下于90度反应10小时，薄层色谱板监测反应完全后，将反应液用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，静置分液，有机相依次用水(5mL×1)、饱和食盐水(5mL×3)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得固体，将固体用石油醚：乙酸乙酯进行柱层析得到无色液体0.731g，产率为87.7％。对柱层析得到无色液体采用核磁共振方法进行鉴定，结果显示该无色液体为3-溴-2-甲基-1,1'-联苯(C)，其结构式为；
Figure BDA0003638419250000061
2)合成中间体4,4,5,5-四甲基-2-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)-1,3,2-二氧硼烷：取0.73g的3-溴-2-甲基-1,1'-联苯(C)于反应瓶中，依次加入0.900g的联硼酸频那醇酯(3.54mmol)、0.096mg的1,1′-双(二-叔丁基膦基)二茂铁二氯化钯(0.147mmol)、0.869g的乙酸钾(8.86mmol)和15mL的DMSO溶液，在氮气环境下于80度反应12小时，薄层色谱板监测反应完全后，将反应液用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，静置分液，有机相依次用水(5mL×2)、饱和食盐水(5mL×5)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得固体，将固体用石油醚：乙酸乙酯进行柱层析得到无色液体0.562g，产率为64.7％。对柱层析得到无色液体采用核磁共振方法进行鉴定，结果显示该无色液体为4,4,5,5-四甲基-2-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)-1,3,2-二氧硼烷(D)，其结构式为；
Figure BDA0003638419250000062
3)合成中间体2-甲氧基-6-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)烟醛：取0.562g的4,4,5,5-四甲基-2-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)-1,3,2-二氧硼烷(D)(1.93mmol)中加入0.276g的6-氯-2-甲氧基烟醛(E)(1.61mmol)、0.092g的四三苯基膦钯(0.080mmol)、0.853g的磷酸钾(4.02mmol)和30mL甲苯/水(V/V＝2/1)溶液，在氮气环境下于90度反应10小时，薄层色谱板监测反应完全后，将反应液用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，静置分液，有机相依次用水(5mL×1)、饱和食盐水(5mL×3)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得固体，将固体用石油醚：乙酸乙酯进行柱层析得到白色固体0.321g，产率为65.8％。对柱层析得到白色固体采用核磁共振方法进行鉴定，结果显示该白色固体为2-甲氧基-6-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)烟醛(F)，其结构式为；
Figure BDA0003638419250000071
4)合成中间体((2-甲氧基-6-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)吡啶-3-基)甲基)甘氨酸甲酯：取0.321g的2-甲氧基-6-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)烟醛(F)(1.06mmol)于反应瓶中，依次加入0.398g的甘氨酸甲酯盐酸盐(G)(3.17mmol)，后加入10mL的甲醇，室温反应2h。经TLC检测原料反应完全后，往反应体系内加入0.200g的氰基硼氢化钠(3.17mmol)和4滴冰醋酸，室温反应约24h，经TLC检测原料反应完毕后，减压蒸馏除去溶剂，得到的白色固体用20mL乙酸乙酯分散，抽滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，经柱层析得无色透明油状产物0.256g(64.3％)。结果显示该无色液体粉末为((2-甲氧基-6-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)吡啶-3-基)甲基)甘氨酸甲酯，其结构式为：
Figure BDA0003638419250000072
5)将0.945g的盐酸羟胺(13.60mmol)分散到15mL的甲醇溶液中，于冰浴条件下缓慢滴加1.03g的氢氧化钾(18.36mmol)甲醇溶液，再反应20min后，迅速抽滤，滤液备用。取步骤4)得到的0.256g的中间体((2-甲氧基-6-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)吡啶-3-基)甲基)甘氨酸甲酯(0.680mmol)溶解于10mL甲醇中，冰浴条件下缓慢滴加上述羟胺备用液，滴加完毕后，室温反应1h，经TLC检测反应完毕后，停止反应。将反应液减压蒸馏除去溶剂，得到粗品。将粗品中加入水后，在冰浴条件下用稀盐酸调节pH至中性。分离有机层和水层，有机层依次用水、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂得到白色固体产物N-羟基-2-((((2-甲氧基-6-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)吡啶-3-基)甲基)氨基)乙酰胺0.040g(产率15.7％)，记为化合物HP1。其结构式为：
Figure BDA0003638419250000073
化合物HP1的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱如下：1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.73(s,1H),8.88(s,1H),7.98(d,J＝7.2Hz,1H),7.46–7.37(m,2H),7.37–7.29(m,4H),7.21(dd,J＝13.4,7.2Hz,2H),4.12(s,2H),3.91(s,3H),3.13(s,2H),2.14(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ166.54,161.01,158.47,143.10,141.95,141.49,140.75,133.29,130.31,129.64,129.24,128.73,127.51,126.13,117.70,113.11,54.14,45.02,43.60,40.61,40.40,40.19,39.98,39.77,39.56,39.35,28.64,18.84.MS(ESI)m/z(M+H)+:calculatedfor C22H24N3O3:378.2,found:378.3。图1为实施例1制备化合物HP1的核磁共振氢谱。图2为实施例1制备化合物HP1的核磁共振碳谱。
实施例2
本例化合物的制备中，步骤4)化合物(G)采用2-氨基异丁酸甲酯盐酸盐，其余步骤与实施例1相同，得到本例化合物N-羟基-2-((((2-甲氧基-6-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)吡啶-3-基)甲基)氨基)-2-甲基丙酰胺，白色固体产物(0.051g，产率16.9％)，结构为
Figure BDA0003638419250000081
记为化合物HP2。
化合物HP2的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱如下：1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.46(t,J＝6.8Hz,3H),7.36(q,J＝7.3Hz,5H),7.23(d,J＝7.2Hz,1H),7.11(d,J＝7.4Hz,1H),4.43(s,2H),3.91(s,3H),2.16(s,3H),1.78(s,6H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ169.64,160.58,155.78,142.99,142.05,141.12,136.60,133.26,129.97,129.64,129.25,128.72,127.46,126.05,118.08,117.65,53.76,48.51,45.03,40.55,40.50,40.34,40.30,40.13,40.09,39.88,39.67,39.46,39.25,32.42,23.19,21.43.MS(ESI)m/z(M+H)+:calculatedfor C24H28N3O3:406.2,found:406.1。图3为实施例2制备化合物HP2的核磁共振氢谱。图4为实施例2制备化合物HP2的核磁共振碳谱。
实施例3
本例化合物的制备中，步骤4)化合物(G)采用4-氨基丁酸甲酯盐酸盐，其余步骤与实施例1相同，得到本例化合物N-羟基-4-(((2-甲氧基-6-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)吡啶-3-基)甲基)氨基)丁酰胺，白色固体产物(0.030g，产率12.5％)，结构为
Figure BDA0003638419250000082
记为化合物HP3。
化合物HP3的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱如下：1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.56(s,1H),9.24(s,1H),8.81(s,1H),8.00(d,J＝7.5Hz,1H),7.47(t,J＝7.3Hz,2H),7.43–7.32(m,5H),7.26(dd,J＝13.1,7.0Hz,2H),4.14(s,2H),3.95(s,3H),3.04–2.91(m,2H),2.18(s,3H),2.11(t,J＝7.0Hz,2H),1.96–1.82(m,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ168.67,143.11,141.43,140.75,133.28,130.34,129.64,129.23,128.74,127.52,126.13,117.69,113.29,54.13,47.09,44.93,40.61,40.40,40.19,39.98,39.77,39.56,39.36,29.77,22.00,18.83.MS(ESI)m/z(M+H)+:calculated for C25H30N3O3:420.2,found:420.2。图5为实施例3制备化合物HP3的核磁共振氢谱。图6为实施例3制备化合物HP3的核磁共振碳谱。
实施例4
本例化合物的制备中，步骤4)化合物(G)采用5-氨基戊酸甲酯盐酸盐，其余步骤与实施例1相同，得到本例化合物N-羟基-5-((((2-甲氧基-6-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)吡啶-3-基)甲基)氨基)戊酰胺，白色固体产物(0.019g，产率10.1％)，记为化合物HP4，结构为
Figure BDA0003638419250000091
化合物HP4的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱如下：1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.48–7.43(m,3H),7.37(t,J＝6.9Hz,4H),7.23(d,J＝7.2Hz,1H),7.10(d,J＝7.4Hz,1H),4.43(s,2H),3.90(s,3H),3.30(s,2H),2.32(s,2H),2.16(s,3H),1.78(s,4H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ169.65,160.57,155.79,142.98,142.04,141.11,136.61,133.25,129.96,129.62,129.23,128.70,127.44,126.04,118.06,117.63,53.74,48.49,45.01,40.53,40.48,40.28,40.07,39.86,39.65,39.44,39.23,32.40,23.17,21.41,18.80.MS(ESI)m/z(M+H)+:calculated for C22H24N3O3:378.2,found:378.3。图7为实施例4制备化合物HP4的核磁共振氢谱。图8为实施例4制备化合物HP4的核磁共振碳谱。
实施例5
本例化合物的制备中，步骤4)化合物(G)采用6-氨基己酸甲酯盐酸盐，其余步骤与实施例1相同，得到本例化合物N-羟基-6-((((2-甲氧基-6-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)吡啶-3-基)甲基)氨基)己酰胺，白色固体产物(0.021g，产率10.7％)，记为化合物HP5，结构为
Figure BDA0003638419250000092
化合物HP5的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱如下：1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.53(d,J＝7.5Hz,1H),7.46(t,J＝7.3Hz,2H),7.41–7.31(m,5H),7.24(dd,J＝7.4,1.5Hz,1H),7.11(d,J＝7.4Hz,1H),4.46(s,2H),3.91(s,3H),3.44(s,2H),2.54–2.52(m,2H),2.17(s,3H),1.76–1.46(m,6H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ175.68,160.54,155.87,143.00,142.06,141.13,137.41,133.25,129.97,129.63,129.24,128.72,127.46,126.04,118.85,117.57,53.72,49.76,46.31,40.57,40.52,40.36,40.31,40.15,40.10,39.94,39.89,39.68,39.48,39.27,36.87,29.70,28.41,23.49,18.82.MS(ESI)m/z(M+H)+:calculatedfor C26H32N3O3:434.2,found:434.2。图9为实施例5制备化合物HP5的核磁共振氢谱。图10为实施例5制备化合物HP5的核磁共振碳谱。
实施例6
本例化合物的制备中，步骤4)化合物(G)采用7-氨基庚酸甲酯盐酸盐，其余步骤与实施例1相同，得到本例化合物N-羟基-7-((((2-甲氧基-6-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)吡啶-3-基)甲基)氨基)庚酰胺，白色固体产物(0.027g，产率11.6％)，记为化合物HP6，结构为
Figure BDA0003638419250000101
化合物HP6的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱如下：1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.37(s,1H),8.67(s,1H),7.95(d,J＝7.1Hz,1H),7.42(dd,J＝33.7,6.9Hz,7H),7.24(dd,J＝18.6,6.8Hz,3H),4.06(s,2H),3.94(s,3H),2.88(s,2H),2.18(s,4H),1.94(d,J＝6.6Hz,2H),1.62(s,2H),1.49(s,2H),1.32–1.20(m,5H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ169.53,160.85,157.41,143.06,141.98,140.92,140.13,133.26,130.16,129.62,129.22,128.71,127.48,126.08,117.64,116.29,53.95,48.24,45.91,40.58,40.37,40.16,39.95,39.74,39.54,39.33,32.62,28.71,27.19,26.44,25.42,18.84.MS(ESI)m/z(M+H)+:calculatedfor C27H34N3O3:448.2,found:448.3。图11为实施例6制备化合物HP6的核磁共振氢谱。图12为实施例6制备化合物HP6的核磁共振碳谱。
性能测试
1.体外抗肿瘤活性测试
采用荧光分析法测定化合物的酶抑制活性，其中HDAC1(#ab101661)和HDAC6(#ab42632)酶购自Abcam公司，HDAC3(#BML-SE515-0050)从恩佐公司购买，HDAC8(#H90-30H-05)从SignalChem购买。缓冲液中含有25mmol/L Tris(pH 8.0)、1mmol/L MgCl2、0.1mg/mLBSA、137mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl，其中HDAC(HDAC1，7.2ng/孔；HDAC3，3.4ng/孔；HDAC6，15ng/孔；HDAC8，22ng/孔)，总体积为40μL。将待测化合物(3倍稀释度，10浓度)稀释在10％二甲基亚砜中，添加5μL稀释液并预培养在添加底物前，加入纯化的重组HDAC在室温下放置5min。最后，添加酶底物(Ac-Leu-Gly-Lys(Ac)-AMC，底物浓度10μmol/L用于HDAC1、3、6；Ac-Leu-Gly-Lys(Tfa)-AMC，底物浓度2μmol/L用于HDAC8)，并在37℃下以50μL的终体积培养30min。在室温下用50μL HDAC分析显影剂(1mg/mL胰蛋白酶和2μmol/L TSA于分析缓冲液中)使反应猝灭30min。通过酶标仪后对混合物中的荧光产物量进行测定。然后在TECAN酶标仪读取350-360nm的激发和450-460nm的发射波长处的荧光强度。IC50值的计算采用非线性回归方法，并使用Prism-GraphPad软件进行归一化剂量-反应拟合，所有实验至少独立进行三次。表1为化合物HP1-HP6的抗组蛋白去乙酰化酶活性测试结果。
表1化合物HP1-HP6的抗组蛋白去乙酰化酶活性测试结果
Figure BDA0003638419250000111
其中，阳性对照品和对照品(SAHA和BMS-202)分别与样品HP1-6比较。表1的体外实验结果显示，含3-(2-吡啶)联苯的异羟肟酸类化合物(HP1-6)对HDAC6具有较强的抑制作用，其活性与SAHA相当，而BMS-202对HDAC6无抑制作用。
2.化合物对PD-1/PD-L1抑制活性测试
本测试部分所述化合物的体内抗肿瘤活性测试采用均相时间分辨荧光法(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)，均相时间分辨荧光法是一种用来检测纯液相体系中待测物的技术。
Figure BDA0003638419250000112
PD-1/PD-L1 binding assay kit(Cat#64ICP01PEG)购自Cisbio公司，Plate Format-96well(Cat#66PL96025)购自Greiner公司。具体测试方法如下：
实验过程如下：
1)化合物的稀释和测试液的配制：
(1)化合物母液的稀释：为了精确测量各个化合物对PD-1/PD-L1结合能力的抑制作用，我们先需要将各个化合物稀释为20mmol/L的化合物母液。根据公式C＝n/V＝m/M/V，即可算出稀释各个化合物所需的DMSO用量。配好化合物母液后，按照梯度稀释的方法，将母液用diluent试剂依次稀释为10μmol/L，3.333μmol/L，1.111μmol/L，0.370μmol/L，0.123μmol/L，0.041μmol/L，0.013μmol/L，0.004μmol/L的稀释液，混匀备用。
(2)PD-L1蛋白混合液的稀释：取试剂盒中7mL PD-L1蛋白，加入510mL diluent稀释剂将其稀释，混匀备用。
(3)PD-1蛋白混合液的稀释：取试剂盒中5mL PD-1蛋白，加入550mL diluent稀释剂将其稀释，混匀备用。
(4)混合测试液的配制：分别取试剂盒中5μL Anti-Tag-Eu3+和20μL Anti-Tag-XL665将其混合，然后加入975μL Detection Buffer将其稀释，混匀备用。
2)测试实验步骤：
(1)向96孔计数板中每孔加入2μL的化合物稀释液，每个化合物按照浓度从大到小的浓度依次从上到下加入，每个化合物测试8个浓度，每个浓度三个副孔。
(2)离心机1000转/分钟离心1分钟。
(3)向每孔加入4μL PD-L1蛋白混合液。
(4)离心机1000转/分钟离心1分钟，室温孵育15分钟。
(5)除Low Control组之外，每孔加入4μL PD-1蛋白混合液。Low Control组加入等量diluent试剂。
(6)离心机1000转/分钟离心1分钟。
(7)每孔加入10μL测试混合液。
(8)离心机1000转/分钟离心1分钟。
(9)室温孵育120分钟。
(10)使用多功能微孔板检测仪读取荧光值(激发波长320nm，发射波长620和665nm)。
3)实验数据处理：
(1)计算出每孔中发射波长下和吸收波长下信号值的比率(Ratio)。其中，Ratio＝(665nm信号下读数/629nm信号下读数)*104；
(2)计算出每个化合物每个浓度的抑制率(CV)。其中，CV(％)＝(标准偏差/平均比率)*100；
(3)根据每个化合物在不同浓度下的平均抑制率，绘制标准S型曲线，再得出各个化合物的半数抑制浓度(IC50)。
表2为化合物HP1-HP6 PD-1/PD-L1相互作用竞争性抑制活性测试结果。
表2化合物HP1-HP6 PD-1/PD-L1相互作用竞争性抑制活性测试结果
Figure BDA0003638419250000121
Figure BDA0003638419250000131
阳性对照品和对照品(BMS-202和SAHA)分别与样品HP1-6比较。表2的体外实验结果显示，含3-(2-吡啶)联苯的异羟肟酸类化合物(HP1-6)对PD-1/PD-L1具有较强的抑制作用，其活性与BMS-202相当，而SAHA对PD-1/PD-L1无抑制作用。

Claims (10)

1.一种化合物，其特征在于：所述化合物的结构如式（Ⅰ）所示；
Figure QLYQS_1
（Ⅰ）；
式（Ⅰ）中，R1选自C1-C12的亚烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述式（Ⅰ）中，R1选自C1-C6的亚烷基。
3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于：所述化合物选自以下所示的结构；
Figure QLYQS_2
。
4.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将式（Ⅱ）所示的化合物与式（Ⅲ）所示的化合物混合，反应，得到式（Ⅳ）所示的化合物；
Figure QLYQS_3
（Ⅱ）；/>
Figure QLYQS_4
（Ⅲ）；/>
Figure QLYQS_5
（Ⅳ）；
式（Ⅲ）中，R1选自C1-C12的亚烷基，R2选自C1-C4的烷基；
2）将式（Ⅳ）所示的化合物水解，得到式（Ⅴ）所示的化合物；
Figure QLYQS_6
（Ⅴ）；
3）将式（Ⅴ）所示的化合物与盐酸羟胺混合，反应，得到式（Ⅰ）所示的化合物。
5.根据权利要求4所述化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，式（Ⅱ）所示的化合物与式（Ⅲ）所示的化合物摩尔比为1：(2-4)。
6.根据权利要求4所述化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中，式（Ⅴ）所示的化合物与盐酸羟胺摩尔比为1：(5-40)。
7.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括权利要求1-3任一项所述化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐。
8.权利要求1-3任一项所述化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐或在制备治疗和/或辅助治疗癌症药物中的应用；
其中，所述癌症为具有HDAC6表达靶点或PD-L1表达靶点的癌症。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的癌症选自黑色素瘤、白血病中的一种。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的癌症药物选自HDAC6抑制剂、PD-L1抑制剂中的一种。
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