CN114269745A - 用于促进肝再生或减少或预防肝细胞死亡的杂芳基取代的吡唑并吡啶蛋白激酶抑制剂 - Google Patents

用于促进肝再生或减少或预防肝细胞死亡的杂芳基取代的吡唑并吡啶蛋白激酶抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及吡唑并吡啶化合物，其抑制促分裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)、以及特别是相对于蛋白激酶JNK1和MKK7选择性抑制MKK4。该化合物可用于促进肝再生或减少或预防肝细胞死亡。它们还可用于治疗骨关节炎或类风湿性关节炎或CNS相关疾病。

Description

用于促进肝再生或减少或预防肝细胞死亡的杂芳基取代的吡 唑并吡啶蛋白激酶抑制剂
技术领域
本发明涉及杂芳基取代的吡唑并吡啶蛋白激酶抑制剂，其抑制促分裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)，特别是相对于蛋白激酶JNK1和MKK7选择性抑制MKK4。
背景技术
肝脏疾病可由感染、损伤、暴露于毒性化合物如酒精或药物、自身免疫过程、遗传缺陷和其他因素引起。虽然肝脏具有显著的再生能力，然而，其在疾病状态下可能受损，因此可能不足以补偿肝细胞和器官功能的损失。
WO 2007/002433描述了作为蛋白激酶抑制剂的化合物，其可用于治疗与蛋白激酶的异常活性相关的疾病和病症。这些化合物是Raf蛋白激酶，特别是B-Raf和c-Raf及其突变的抑制剂，因此可用于癌症治疗。此外，据说它们抑制多种其他蛋白激酶，其中包括c-JunN-末端激酶(JNK)，特别是JNK1。WO 2007/002325具有类似的公开内容，WO 2012/109075和WO 2014/194127公开了具有Raf蛋白激酶抑制活性的经修饰的化合物。H.Vin等人将WO2007/002433的两种化合物称为B-Raf抑制剂，其通过JNK信号传导的脱靶抑制来抑制凋亡。WO 2010/111527描述了吡唑并[3,4-b]吡啶化合物，其是用于治疗Raf蛋白激酶介导的疾病或病症如癌症的蛋白激酶抑制剂。此外，据说它们抑制多种其他蛋白激酶，其中包括c-JunN-末端激酶(JNK)，特别是JNK1。WO 2012/136859公开了一些化合物，其被描述为促分裂原活化蛋白激酶4(MKK4)的抑制剂并且可用于治疗肝衰竭，用于保护肝细胞免于凋亡和用于肝细胞再生。Wuestefeld等人(Cell 153:389-401,2013)和Willebring等人(Cell 153:283-284)描述了鉴定基因靶标的功能遗传方法，其可用于增加肝细胞的再生能力。特别地，Wuetefeld等人鉴定了蛋白激酶MKK4为肝再生的关键调节物，并报道了MKK4抑制通过MKK7的补偿上调和JNK1依赖性的ATF2和ELK1的激活而增加的肝细胞再生。
基于现有技术的发现，已经得出结论，MKK4和JNK1抑制剂可用于治疗JNK1介导的疾病。然而，尽管认识到JNK1的抑制可有益于治疗肝脏疾病，但尚未进行临床研究WO 2018/134254公开了吡咯并吡啶化合物，其为用于促进肝再生或减少或预防肝细胞死亡的蛋白激酶抑制剂。
发明内容
本发明的根本问题是提供有用的MKK4抑制剂的化合物、特别是相对于MKK7和JNK1选择性抑制MKK4的MKK4抑制剂。另一个问题是提供作为MKK4抑制剂的化合物，该化合物相对于MKK7和JNK1选择性抑制MKK4，其可用于治疗肝脏疾病，特别是用于促进肝再生或减少或预防肝细胞死亡。
该问题通过提供式(I)的化合物来解决。
因此，本发明涉及以下实施方案：
1.一种式(I)化合物
Figure BDA0003514405000000021
及其药学上可接受的盐、前药、生物活性代谢物、溶剂合物和立体异构体，
其中式(I)中的变量具有如下含义：
R1为H或烷基
R4为H或烷基；
R5选自
a)嘧啶基，其被1或2个独立地选自环烷基、烷基、-COOR10、-OH、烷基硫烷基(alkylsulfanyl)、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、四唑基、CN、卤素、烷氧基、-(NR10＝)S(＝O)-烷基[S-烷基磺亚胺酰基(alkylsulfonimidoyl)]和
Figure BDA0003514405000000022
的取代基取代，和
b1)吡啶基，其被1或2个独立地选自烷基和卤素的取代基取代并且其任选地进一步被选自-OH、烷氧基、CN、-COOR10、CF3、-(NR10＝)S(＝O)-烷基和
Figure BDA0003514405000000023
的基团取代，以及
b2)吡啶基，其被-COOR10取代且进一步被-OH、CN或CF3取代；
R6为H或烷基；
Rw为-NR10SO2R12；
Rx为H、卤素或烷基；
Ry为H、卤素或烷基；
Rz为H、卤素或烷基；
其中Rx、Ry或Rz中的一个或两个或三个为卤素、且Rx、Ry或Rz中其余为H或烷基；
R10在每次出现时独立地为H或烷基；
R12为H、烷基或苯烷基；以及
n为1或2。
2.实施方案1的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R1为H。
3.实施方案1或2的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中Rx、Ry或Rz中的2个或3个为卤素。
4.实施方案1至3中任一项的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中Rx、Ry或Rz的一个或多个卤素原子独立地为F或Cl，特别是F。
5.前述实施方案中任一项的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R4和R6为H。
6.实施方案6的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被1或2个独立地选自环烷基、烷基、-COOR10、烷氧基、OH、烷基硫烷基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、卤素、CN和四唑基的取代基取代。
7.实施方案6的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被1或2个独立地选自环烷基、烷基、烷氧基、OH、烷基硫烷基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、卤素、CN和四唑基的取代基取代。
8.实施方案7的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被1或2个独立地选自环烷基、烷氧基、OH、烷基硫烷基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、卤素、CN和四唑基的取代基取代。
9.实施方案8的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被1或2个独立地选自环烷基、烷氧基、OH、烷基硫烷基、卤素、CN和四唑基的取代基取代。
10.实施方案9的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被1或2个独立地选自环烷基、烷氧基、-OH、卤素和烷基硫烷基的取代基取代。
11.实施方案1至5中任一项的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被选自环烷基、烷基、-COOR10、烷氧基、OH、烷基硫烷基、烷基亚磺酰基和烷基磺酰基的基团取代，并且进一步被选自卤素、CN、四唑基、-(NR10＝)S(＝O)-烷基和
Figure BDA0003514405000000041
的基团取代。
12.实施方案7的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被选自环烷基、烷基、烷氧基、-OH和烷基硫烷基的基团取代，并且进一步被选自烷基、烷氧基和烷基硫烷基的基团取代。
13.实施方案12的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被选自环烷基、烷氧基、-OH和烷基硫烷基的基团取代，并且进一步被选自烷基、烷氧基和烷基硫烷基的基团取代。
14.实施方案1至5中任一项的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被环烷基取代，并且其任选地进一步被选自环烷基、烷基、-COOR10、-OH、烷基硫烷基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、四唑基、CN、卤素、烷氧基、-(NR10＝)S(＝O)-烷基[S-烷基磺亚胺酰基]和
Figure BDA0003514405000000042
的基团取代。
15.实施方案14的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被环烷基取代，并且其任选地进一步被选自环烷基基团、烷基、-COOR10、-OH、烷基硫烷基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、四唑基、CN、卤素和烷氧基的基团取代。
16.实施方案15的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被环烷基基团取代，并且其任选地进一步被选自环烷基、烷基、-COOR10、-OH、烷基硫烷基、四唑基、CN、卤素和烷氧基的基团取代。
17.实施方案16的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被环烷基基团取代，并且其任选地进一步被选自烷基、-COOR10、-OH、烷基硫烷基、CN、卤素和烷氧基的基团取代。
18.前述实施方案中任一项的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为在2位被取代的嘧啶基。
19.实施方案1至5中任一项的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为在2位被-COOR10取代并且进一步被-OH、CN或CF3取代的吡啶-3-基(吡啶基基团在3位与吡唑并吡啶基基团键合)。
20.实施方案1至5中任一个的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为在3位被烷基或卤素取代的吡啶基-4-基(吡啶基基团在4位与吡唑并吡啶基基团键合)。
21.前述实施方案中任一项的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R10为H或烷基，特别是H。
22.前述实施方案中任一项的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R12为烷基或苯烷基。
23.实施方案22的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R12为C1-C3-烷基或苄基。
24.前述实施方案中任一项的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其具有式(Ia)
Figure BDA0003514405000000051
其中：
Rx为卤素；
Ry为卤素；以及
R1、R4、R5、R6和Rw如前述实施方案中任一项所定义。
25.实施方案1至23中任一项的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其具有式(Ib)
Figure BDA0003514405000000061
其中：
Rx为卤素；
Ry为卤素；以及
R1、R4、R5、R6和Rw如实施方案1至15中任一项所定义。
26.实施方案1至23中任一项的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其具有式(Ic)
Figure BDA0003514405000000062
其中：
Rx为卤素；
Ry为卤素；
Rz为卤素；以及
R1、R4、R5、R6和Rw如实施方案1至15中任一项所定义。
27.实施方案24至26中任一项的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中Rx、Ry和Rz(如果存在)为F或Cl，特别是F。
具体实施方式
在一个实施方案中，本发明涉及式I化合物及其药学上可接受的盐、前药、酯、溶剂合物和光学异构体，其中R1、R4至R6、Rw、Rx、Ry和Rz以任何组合如上所定义。
在另一个实施方案中，本发明涉及式(Ia)、(Ib)和(Ic)的化合物及其药学上可接受的盐、前药、酯、溶剂合物和光学异构体，其中各变量如上文实施方案中所定义。
在另一个实施方案中，Rx、Ry或Rz中的至少两个为卤素，且Rx、Ry和Rz中的另一个为H、卤素或烷基，特别是烷基或卤素。卤素优选为F或Cl，特别是F。
在另一个实施方案中，R1、R4和R6为H。
在另一个实施方案中，R12为甲基、乙基或丙基。
在一个实施方案中，本发明涉及式(I)和(Ia)至(Ic)的MKK4抑制剂及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，并且特别涉及相对于蛋白激酶JNK1和MKK7选择性抑制蛋白激酶MKK4的MKK4抑制剂。
此外，本发明还涉及用于抑制蛋白激酶MKK4、以及特别是用于相对于蛋白激酶JNK1和MKK7选择性抑制蛋白激酶MKK4的本发明化合物。
此外，本发明还涉及用于促进肝再生或减少或预防肝细胞死亡以及同时增加肝细胞增殖的所述化合物。
本发明还包括上述化合物的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐特别是与药学上可接受的酸或碱形成的酸或碱加成盐。合适的药学上可接受的有机酸和无机酸的实例为盐酸，氢溴酸，磷酸，硫酸，氨基磺酸，C1-C4-烷基磺酸如甲磺酸，脂环族磺酸如S-(+)-10-樟脑磺酸，芳族磺酸如苯磺酸和甲苯磺酸，具有2-10个碳原子的二羧酸和三羧酸和羟基羧酸如草酸、丙二酸、马来酸、富马酸、乳酸、酒石酸、柠檬酸、乙醇酸、己二酸和苯甲酸。其他可利用的酸描述于例如Fortschritte derArzneimittelforschung[药物研究进展]，第10卷，第224页(
Figure BDA0003514405000000071
Verlag、Basel和Stuttgart，1966)中。合适的药学上可接受的有机碱和无机碱的实例为碱金属氢氧化物如氢氧化钠或氢氧化钾，碱土金属氢氧化物如氢氧化钙或氢氧化镁，氢氧化铵，有机氮碱如二甲胺、三甲胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、胆碱、2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇、葡甲胺、普鲁卡因等、L-精氨酸、L-赖氨酸、乙二胺或羟乙基吡咯烷。
本发明还包括本发明化合物和盐的任何互变异构体、晶体和多晶型物及其混合物。
本发明还包括溶剂合物如水合物。
本发明的化合物可以含有一个或多个手性中心，并且以不同的光学活性形式如对映异构体和非对映异构体存在。
如本文所用，术语“前药(pro-drug)”是指在体内通过一些生理化学过程转化为母体药物的药剂。前药的非限制性实例是酯形式的本发明化合物。
前药具有许多有用的特性。例如，前药可以比最终药物更易溶于水，从而便于静脉内施用。前药还可以具有比最终药物更高水平的口服生物利用度。施用后，前药被酶促或化学裂解以在血液或组织中递送最终药物(ultimate drug)。示例性的前药包括但不限于具有羧酸取代基的化合物，其中游离氢被以下取代：(C1-C4)烷基、(C1-C12)烷酰氧基-甲基、(C4-C9)1-(烷酰氧基)乙基、具有5-10个碳原子的1-甲基-1-(烷酰氧基)-乙基、具有3-6个碳原子的烷氧基羰基氧基甲基、具有4-7个碳原子的1-(烷氧基羰基氧基)乙基、具有5-8个碳原子的1-甲基-1-(烷氧基羰基氧基)-乙基、具有3-9个碳原子的N-(烷氧羰基)氨基甲基、具有4-10个碳原子的1-(N-(烷氧羰基)氨基)乙基、3-酞基(3-phthalidyl)、4-巴豆酰内酯基(4-crotono-lactonyl)、γ-丁内酯-4-基、二-N,N-(C1-C2)烷基氨基(C2-C3)烷基(如-β二甲基氨基乙基)、氨基甲酰-(C1-C2)烷基、N,N-二(C1-C2)-烷基氨基甲酰-(C1-C2)烷基和哌啶基-、吡咯烷-或吗啉代(C2-C3)烷基。其他示例性的前药释放式(I)的醇，其中羟基取代基(例如，R基团含有羟基)的游离氢被以下取代：(C1-C6)烷酰氧基-甲基、1-((C1-C6)烷酰氧基)-乙基、1-甲基-1-((C1-C6)烷酰氧基)乙基、(C1-C12)烷氧基-羰基氧-甲基、N-(C1-C6)-烷氧基-羰基氨基甲基、琥珀酰、(C1-C6)烷酰基、α-氨基(C1-C4)烷酰基、芳基酰基(arylactyl)和α-氨酰基、或α-氨酰基-α-氨酰基，其中所述的α-氨酰基部分独立地为蛋白质中发现的任何天然存在的L-氨基酸、P(O)(OH)2、-P(O)(O(C1-C6)烷基)2或糖基(由碳水化合物半缩醛脱去羟基而得到的基团)
MKK4抑制剂的表达意味着MKK4的激酶活性被抑制，其中IC50<10μmol/l，优选<1μmol/l，特别是<0.5μmol/l。如本文所用的表述“相对于蛋白激酶JNK1和MKK7选择性抑制蛋白激酶MKK4(selectively inhibit protein kinase MKK4 over proteinkinases JNK1and MKK7)”是指如使用KINOMEscanTM测量的，MKK7抑制活性与MKK4抑制活性的比率或JNK1抑制活性与MKK4抑制活性的比率(表示为对照或Kd的百分比)为≥10。
本文所用的表述“促进肝再生或减少或防止肝细胞死亡(promotingliverregeneration or reducing or preventing hepatocyte death)”意指与治疗开始时增殖细胞的数量相比，增殖肝细胞的相对数量增加至少30％，优选至少50％。特别地，该表达意指与治疗开始时增殖细胞的数量相比增加≥100％。在上下文中，实验测定和定量将使用标准方法进行，例如定量与细胞增殖严格相关的蛋白质Ki67。为了定量组织载玻片中的增殖肝细胞，可使用几种免疫组织化学标准方法，其使用一级抗Ki67抗体，随后通过使用例如辣根过氧化物酶缀合的二级抗体使抗Ki67结合可视化。过氧化物酶活性的量(通过显色底物的酶促转化显现)与Ki67蛋白的量和增殖细胞的数量相关。
在下述实验中，使用来自Abcam的一级多克隆兔抗Ki67抗体(产品编号ab15580，Abcam，剑桥，美国)和来自Invitrogen的含有荧光团四甲基罗丹明的二级山羊多克隆抗体(产品编号16101，Invitrogen/ThermoFisher)通过Ki67染色定量肝细胞增殖。
基于从几种临床前小鼠模型获得的数据，发现在慢性CCl4(四氯化碳)介导的肝损伤小鼠模型中，shRNA(小发夹RNA)介导的MKK4的抑制将肝细胞增殖从13％增加至27％(与对照shRNA相比)，并且与肝损伤(转氨酶)减少和肝纤维化减少相关。根据前一章的定义，增殖细胞的相对增加为108％。在酒精诱导的脂肪性肝炎(ASH)模型中，shRNA介导的MKK4沉默导致肝细胞增殖率为4％，相比之下，当使用对照shRNA时为2％(相对增加：100％)。肝细胞增殖的重复与通过转氨酶测量的脂肪变性(脂肪沉积)减少和肝损伤减少有关。同样，在部分肝切除模型中(手术切除三分之二的肝脏后48小时)，shRNA介导的MKK4沉默将肝细胞增殖从16％(对照shRNA)增加至33％(相对增加：106％)。同样，肝细胞增殖增加与肝再生改善和肝质量更快恢复有关。总之，这些研究证实MKK4作为治疗急性和慢性肝脏疾病的治疗靶标。此外，WO 2018/134254公开了新的化合物，其相对于MKK7和JNK1选择性抑制MKK4。在肝再生的体外和体内实验模型中，这些化合物可有效预防由施用Jo2抗体诱导的急性肝衰竭，并诱导分离的原代小鼠肝细胞增殖
本申请中公开的新化合物是有效的MKK4抑制剂，其对MKK7和JNK1具有选择性，因此，类似于WO2018/134254中公开的化合物，可用于治疗肝脏疾病和用于促进肝再生或减少或预防肝细胞死亡。
在上述变量的定义中提及的有机部分——如术语卤素——是单独列出的各个基团成员的集合术语(collective term)。前缀Cn-Cm在每种情况下表示基团中可能的碳原子数。
术语卤素在每种情况下表示氟、溴、氯或碘，特别是氟或氯并且优选氟。
烷基是直链或支链烷基基团，优选C1-C6烷基基团，即具有1至6个碳原子的烷基基团，更优选C1-C4-烷基基团，特别是C1-C3-烷基基团。烷基基团的示例是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、2-丁基、异丁基、叔丁基、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基。
烷基的定义同样适用于包括烷基基团的任何基团，例如烷氧基、烷基亚磺酰基、苯烷基等。
卤代烷基是如上所定义的卤化烷基基团，其中至少一个例如1、2、3、4个或所有氢原子被1、2、3、4个或相应数量的相同或不同的卤原子替代，如三氟甲基、氯甲基、溴甲基、二氟甲基、氟甲基、二氟乙基等。具体实例包括如所定义的氟化C1-C4烷基，例如三氟甲基、二氟甲基、氟甲基或二氟乙基。
环烷基是脂环族自由基，优选为C3-C8-环烷基，即具有3-8个碳原子的环烷基基团。特别地，3-6个碳原子形成环状结构，如环丙基、环丁基、环戊基和环己基。环状结构可以是未取代的或可以带有1、2、3或4个C1-C4烷基自由基，优选带有一个或多个甲基自由基。
本发明的化合物可以如通过引用整体并入本文的WO 2010/111527中所公开的或根据类似的方法制备。通过将游离碱与相应的酸混合或通过将游离酸与所需的碱混合，以常规方式来制备酸或碱加成盐。任选地，反应在有机溶剂的溶液中进行，所述有机溶剂例如低级醇如甲醇、乙醇或丙醇，醚如甲基叔丁基醚或二异丙基醚，酮如丙酮或甲基乙基酮或酯如乙酸乙酯。
本发明的化合物可用于促进肝再生或减少或预防肝细胞死亡，同时增加肝细胞增殖。因此，该化合物可用于治疗、调节、改善或预防可能由感染、损伤、暴露于毒性化合物、血液中正常物质的异常积聚、自身免疫过程、遗传缺陷或未知原因引起的涉及对肝脏的急性或慢性损伤的疾病。
这些肝脏疾病包括其中增加肝再生和减少或预防肝细胞死亡可能有助于实现潜在治疗效果(即肝功能的部分或完全恢复)的所有疾病。这些疾病包括：
急性和慢性或慢加急性(acute on chronic)肝病，诸如：急性和慢性病毒性肝炎如乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎，由艾普斯登-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和其他病毒引起的肝炎，所有类型的自身免疫性肝炎，原发性硬化性肝炎(primary sclerosing hepatitis)，酒精性肝炎；
代谢性肝脏疾病，诸如：代谢综合征、脂肪肝如非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、酒精性脂肪肝炎(ASH)、威尔森氏症(Morbus Wilson)、血色素沉着症、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖原贮积病；
所有类型的肝硬化，诸如原发性胆汁性肝硬化、乙醇中毒性肝硬化(ethyl toxiclivercirrhosis)、隐源性肝硬化；
急性(暴发性)或慢性肝衰竭，诸如中毒性肝衰竭如对乙酰氨基酚(扑热息痛)诱导的肝衰竭，α-鹅膏蕈碱诱导的肝衰竭，例如由抗生素、非甾体类抗炎药、抗痉挛药引起的药物诱导性肝毒性和肝衰竭，由草药补充剂(卡瓦、麻黄、黄芩、薄荷等)诱导的急性肝衰竭，由诸如布-加综合征(Budd-Chiari syndrom)的血管疾病引起的肝脏疾病和肝衰竭，不明原因的急性肝衰竭，由右心衰竭引起的慢性肝脏疾病；
半乳糖血症、囊性纤维化、卟啉症、肝脏缺血灌注损伤、肝移植术后小肝综合征、原发性硬化性胆管炎或肝性脑病。
为了促进肝再生或减少或预防肝细胞死亡，本发明化合物以治疗有效量施用于有需要的患者。各种诊断方法可用于检测肝脏疾病的存在。已知高于临床上可接受的正常范围的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的血液水平指示了进行性(on-going)肝损伤。血液胆红素水平或其他肝酶可用作检测或诊断标准。对肝脏疾病患者的ALT和AST血液水平的常规监测用于测量医学治疗期间肝脏疾病的进展。将升高的ALT和AST水平降低至可接受的正常范围内被视为反映患者肝损伤严重程度降低的临床证据。商业检测如FibroTest/FibroSURE、
Figure BDA0003514405000000111
FibroMeter或Cirrhometer可评估用于检测肝脏脂肪变性、纤维变性和肝硬化的五种和更多种生物化学参数的综合结果。此外，非侵入性的创新的物理成像技术如磁共振成像、超声波检查，特别是弹性成像技术可用于检测和监测肝脏疾病的状态和进展。
还发现shRNA介导的MKK4抑制减弱了骨关节炎中TNF-α驱动的软骨基质降解(CellDeath and Disease(细胞死亡和疾病)(2017)8,e3140)因此，使用本发明的化合物抑制MKK4的活性还可用于治疗骨关节炎和类风湿性关节炎。
此外，MKK4抑制剂还可用于治疗神经退行性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病。Grueninger等人发现在人成神经细胞瘤细胞中，MKK4在促进Tau聚集的丝氨酸422处的Tau蛋白磷酸化中起着关键作用(Mol Cell Biochem(2011)357:199-207)。防止Tau聚集的Tau磷酸化抑制剂被认为可用于预防或治疗阿尔茨海默病。
最近，已经描述了在体外和体内具有有效神经保护作用的MKK4抑制剂。在海马培养物中，与MKK4抑制剂一起孵育防止谷氨酸诱导的细胞死亡和半胱天冬酶-3活化，并且还抑制SH-SY5Y细胞中N-甲基-4-苯基吡啶鎓碘化物和淀粉样蛋白β1-42诱导的细胞死亡。相同的化合物还减轻了1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导的小鼠黑质纹状体多巴胺能神经元变性(Biochemical Pharmacology(生化药理学)(2018)，第162卷，2019年4月，109-122；doi:https://doi.org/10.1016/j.bcp.2018.10.008)。
本发明化合物通常以药物组合物的形式施用，该药物组合物包含至少一种根据本发明的化合物，任选地连同惰性载体(例如药学上可接受的赋形剂(excipient))和(需要时)其他药物。这些组合物可以，例如，口服、直肠、经皮、皮下、腹膜内、静脉内、肌内或鼻内施用。
合适的药物组合物的实例是固体药物形式如粉末、颗粒、片剂，特别是薄膜片剂、锭剂、小药囊(sachet)、扁囊剂、糖衣片剂；胶囊如硬明胶胶囊和软明胶胶囊；或栓剂；半固体药物形式如软膏剂、乳膏剂、水凝胶、糊剂或硬膏剂(plaster)；以及液体药物形式如溶液剂、乳剂，特别是水包油乳剂；悬浮液如洗剂、注射制剂和输注制剂。此外，还可以使用脂质体或微球体。
当制备该组合物时，任选地将本发明的化合物与一种或多种载体(赋形剂)混合或由之稀释。载体(赋形剂)可以是用作活性化合物的媒介物(vehicle)、载体或介质的固体、半固体或液体材料。
合适的载体(赋形剂)列于专科医学专著中。此外，制剂可包含药学上可接受的辅助物质，如润湿剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂；抗氧化剂；抗刺激剂(antiirritant)；螯合剂；包衣助剂；乳化稳定剂；成膜剂；凝胶形成剂；气味掩蔽剂；味道矫正剂；树脂；亲水胶体；溶剂；增溶剂；中和剂；扩散促进剂；色素；季铵化合物；加脂剂(refattingagent)和富脂剂(overfatting agent)；软膏、乳膏或油剂的原料；硅酮衍生物；分散助剂；稳定剂；灭菌剂；栓剂基质；片剂助剂如粘合剂，填充剂、助流剂、崩解剂或包衣；推进剂；干燥剂；遮光剂；增稠剂；蜡；增塑剂和白色矿物油。这方面的制剂基于专业知识，例如，在Fiedler,H.P.,Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie,Kosmetik undangrenzende Gebiete[Encyclopedia of auxiliary substances for pharmacy,cosmetics andrelatedfields(药学、化妆品及相关领域的辅助物质百科全书)],4th edition(第4版),Aulendorf:ECV-Editio-Cantor-Verlag,1996所述。
本发明的化合物还可适于与其他治疗剂组合。因此，本发明还涉及包含本发明化合物与一种或多种其他治疗剂的组合，特别用于促进肝再生或减少或预防肝细胞死亡。本发明的联合疗法可以辅助施用。辅助施用(adjunctive administration)是指以单独的药物组合物或装置形式连续或叠加施用每种组分。这种两种或更多种治疗剂的治疗性施用方案通常被本领域技术人员在本文中称为辅助治疗性施用；它也被称为附加治疗施用(add-on therapeutic administration)。其中患者接受本发明化合物和至少一种其他治疗剂的单独但连续或叠加治疗性施用的任何和所有治疗方案均在本发明的范围内。在如本文所述的辅助治疗性施用的一个实施方案中，患者通常在治疗性施用一种或多种组分一段时间后稳定，然后接受另一种组分的施用。
本发明的联合疗法也可以同时施用。同时施用是指这样的治疗方案，即其中各个组分一起施用，或者以包含或含有两种组分的单一药物组合物或装置的形式，或作为单独的组合物或装置，各自包含组分之一，同时施用。用于同时组合的单独的各个组分的这种组合可以以试剂盒的形式提供。
与本发明的化合物组合使用的合适药剂包括例如：
ACC抑制剂，如TOFA(5-(十四烷氧基)-2-糠酸)、firsocostat(以前称为GS 0976)、PF-05221304和如WO 2016/112305中公开的ACC抑制剂；
血管紧张素II受体拮抗剂；
血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，如依那普利(enalapril)；
ASK1(细胞凋亡信号调节激酶1，MAP3K5)抑制剂，如selonsertib(以前称为GS-4997)或SRT-015；
半胱天冬酶抑制剂，如恩利卡生(emricasan)；
组织蛋白酶B抑制剂，如混合的组织蛋白酶B/丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制剂如VBY-376；
CCR2趋化因子拮抗剂，如混合的CCR2/CCR5趋化因子拮抗剂如赛尼克韦罗(cenicriviroc)；
CCR5趋化因子拮抗剂；
氯通道刺激剂，如cobiprostone；
胆固醇增溶剂；
铜胺氧化酶3(AOC3)抑制剂，如BI 1467335(以前称为PXS-4728A)；
二酰基甘油O-酰基转移酶1(DGAT1)抑制剂，如LCQ908或GSK-3008356；
二酰基甘油O-酰基转移酶2(DGAT2)抑制剂，如PF-06865571；
二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制剂，如利格列汀；
法尼醇X受体(FXR)激动剂，如INT-747(奥贝胆酸)、cliofexor(以前称为GS-9674或PX-102)、tropifexor(以前称为LJN452)、EDP-305或LMB-763；
成纤维细胞生长因子(FGF)及其类似物，如FGF19的长效类似物(例如aldafermin，以前称为NGM-282)或FGF21的长效类似物(例如TEV-47948，也命名为Bio89-100或ARK01或PF-05231023)；
FXR/TGR5双重激动剂，如INT-767；
半乳糖凝集素-3抑制剂，如GR-MD-02；
胰高血糖素样肽1(GLP1)激动剂，如利拉鲁肽(liraglutide)或艾塞那肽(exenatide)；
胰高血糖素样肽1(GLP1)/胰高血糖素双重激动剂，如cotadutide；
双重葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，如tirzepatide(以前称为LY3298176)；
谷胱甘肽前体；
丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制剂，如混合的组织蛋白酶B/丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制剂如VBY-376；
HMG CoA还原酶抑制剂，如他汀类如阿托伐他汀；
11β-羟基类固醇脱氢酶(11β-HSD1)抑制剂，如R05093151；
IL-1β拮抗剂；
IL-6拮抗剂，如混合的IL-6/IL-1β/TNFα配体抑制剂如BLX-1002；
IL-10激动剂，如聚乙二醇化的白细胞介素(peg-ilodecakin)；
抗IL-11抗体或IL-11拮抗剂；
IL-17拮抗剂，如KD-025；
回肠胆汁酸钠(ileal sodium bile acid)协同转运蛋白抑制剂，如volixibat(以前称为SHP-626)；
整联蛋白抑制剂，如选择性αvβ1-抑制剂(例如PLN-1474或Wilkinson等人，Eur.J.Pharmacol.,842,239-247(2019))综述的那些；
己酮糖激酶抑制剂，如PF-06835919；
瘦蛋白类似物，如美曲普汀；
5-脂氧合酶抑制剂，如混合的5-脂氧合酶/PDE3/PDE4/PLC抑制剂如泰鲁司特(tipelukast)；
LPL基因刺激物，如阿利泼金(alipogene tiparvovec)；
赖氨酰氧化酶同系物2(LOXL2)抑制剂，如抗LOXL2抗体如simtuzumab(以前称为GS-6624)，或小分子抑制剂，如WO2017/136870中公开的那些；
含NOD样受体家族脓素结构域的3(NLRP3)炎性体小分子抑制剂，如MCC950；
ω-3多不饱和脂肪酸及其衍生物，如icosabutate和US 8,735,436 B2中公开的实例；
氧甾醇硫酸盐(oxysterol sulfate)，如25-羟基胆固醇3-硫酸盐和25-羟基-胆固醇3,25-硫酸氢盐；
PDE4抑制剂，如ASP-9831；
PPARα激动剂，如混合的PPARαPA激动剂elafibranor(以前称为GFT-505)、混合的PPARα/γ/δ激动剂lanifibranor或混合的PPARα/γ激动剂saroglitazar)；
PPARγ激动剂，如吡格列酮；
PPARδ激动剂，如seladelpar；
Rho相关蛋白激酶2(ROCK2)抑制剂，如KD-025；
钠葡萄糖转运蛋白-2(SGLT2)抑制剂，如依碳酸瑞格列净；
钠葡萄糖转运蛋白-1/2(SGLT1/2)抑制剂，如利格列汀；
硬脂酰CoA去饱和酶-1抑制剂，如aramchol或CVT-12805；
甲状腺激素受体β激动剂，如MGL-3196或VK2809；
肿瘤坏死因子α(TNFα)配体抑制剂；
转谷氨酰胺酶抑制剂和转谷氨酰胺酶抑制剂前体，如巯基乙胺；
PTPlb抑制剂，如A119505、A220435、A321842、CPT633、ISIS-404173、JTT-551、MX-7014、MX-7091、MX-7102、NNC-521246、OTX-001、OTX-002或TTP814；和
Namacizumab，一种将大麻素1受体(CB1)稳定在非活性构象的抗体。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂选自乙酰水杨酸，阿利泼金(alipogenetiparvovec)、aramchol、阿托伐他汀、BLX-1002、赛尼克韦罗(cenicriviroc)、cobiprostone、考来维仑(colesevelam)、emncasan、依那普利、GFT-505、GR-MD-02、氢氯噻嗪、二十碳五烯酸乙酯(乙基二十碳五烯酸)、IMM-124E、KD-025、利格列汀(linagliptin)、利拉鲁肽、巯基乙胺、MGL-3196、奥贝胆酸(obeticholic acid)、奥利索西(olesoxime)、聚乙二醇化的白细胞介素(peg-ilodecakin)、吡格列酮、GS-9674、依碳酸瑞格列净(remogliflozin etabonate)、SHP-626、索利霉素(solithromycin)、tipelukast、TRX-318、熊去氧胆酸和VBY-376。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂之一选自乙酰水杨酸、阿利泼金(alipogene tiparvovec)、aramchol、阿托伐他汀、BLX-1002和赛尼克韦罗(cenicriviroc)。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其：
抑制蛋白激酶MKK4；
相对于蛋白激酶JNK1和MKK7选择性抑制蛋白激酶MKK4、促进肝再生或预防肝细胞死亡；
治疗急性、慢加急性或慢性肝脏疾病；
治疗急性和慢性或慢加急性肝病，诸如：急性和慢性病毒性肝炎如乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎，由艾普斯登-巴尔病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和其他病毒引起的肝炎，所有类型的自身免疫性肝炎，原发性硬化性肝炎，酒精性肝炎；
治疗代谢性肝脏疾病，诸如：代谢综合征、脂肪肝如非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、酒精性脂肪肝炎(ASH)、威尔森氏症、血色素沉着症、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖原贮积病；
治疗所有类型的肝硬化，诸如原发性胆汁性肝硬化、乙醇中毒性肝硬化、隐源性肝硬化；
治疗急性(暴发性)或慢性肝衰竭，诸如中毒性肝衰竭如对乙酰氨基酚(扑热息痛)诱导的肝衰竭，α-鹅膏蕈碱诱导的肝衰竭，例如由抗生素、非甾体类抗炎药、抗痉挛药引起的药物诱导性肝毒性和肝衰竭，由草药补充剂(卡瓦、麻黄、黄芩、薄荷等)诱导的急性肝衰竭，由诸如布-加综合征的血管疾病引起的肝脏疾病和肝衰竭，不明原因的急性肝衰竭，由右心衰竭引起的慢性肝脏疾病；
治疗半乳糖血症、囊性纤维化、卟啉症、肝脏缺血灌注损伤、肝移植术后小肝综合征、原发性硬化性胆管炎或肝性脑病；
治疗骨关节炎、类风湿性关节炎或CNS相关疾病如阿尔茨海默病和帕金森病；
其包括向有此需要的受试者施用有效量的如上定义的化合物或组合物。
在一个实施方案中，本发明的化合物以所治疗的受试者的0.2-15mg/kg或0.5-12mg/kg的剂量施用。该化合物可以每天施用一次或若干次。该化合物施用4-12周。
以下实施例说明本发明而不限制本发明。
实施例
缩写：
Boc2O 二叔丁氧基碳酸酯
CPME 环戊基甲基醚
DCM 二氯甲烷
4-DMAP 4-二甲基氨基吡啶
DME 二甲醚
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
EtOAc 乙酸乙酯
HPLC 高效液相色谱
KOH 氢氧化钾
LDA 二异丙基氨基锂
MeCN 乙腈
MeOH 甲醇
NaHCO3 碳酸氢钠
NH4Cl 氯化铵
Na2SO4 硫酸钠
O/N 过夜
PdCl2(PPh3)2 双(三苯基膦)二氯化钯(II)
Pd(dppf)Cl2 DCM 1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁二氯化钯(II)与DCM的络合物
Pd2(dba3) 三(二亚苄基丙酮)二钯(0)
pTSA 对甲苯磺酸
PE 石油醚
RT 室温
TEA 三乙胺
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱
Xantphos 4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨
实施例1：合成N-(3-(5-(2-环丙基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)-1-苯基甲磺酰胺
Figure BDA0003514405000000181
步骤1-1：5-溴-3-碘-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶(II)
在室温下向搅拌的5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶((I)，6.81g，34.4mmol)和氢氧化钾(KOH，6.75g，120.4mmol)在DMF(45mL)的混合物中一次性碘(9.60g，37.8mmol)。在短暂的诱导期后，开始放热反应。1h后，再加入1g碘，并将混合物在45℃下搅拌1h。将混合物倒入300mL Na2SO3稀溶液中并用2N HCl酸化。通过抽滤收集固体，用水洗涤并在110℃的烘箱中干燥。产量：10.92g，
分析数据：
HPLC纯度：95％，
1H NMR(200MHz,DMSO)δ14.29(s,1H),8.62(s,1H),8.17(s,1H)；13C NMR(50MHz,DMSO)δ150.53,150.17,131.86,120.58,112.43,91.95；
MS(ESI-):m/z 322.0/324.0[M-H]-.
步骤1-2：5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羧酸(III)
将5-溴-3-碘-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶((II)，10.44g，32.2mmol)与DMF、MeOH和三乙胺(TEA，各75mL)合并。将容器抽空并用氩气(4×)冲洗。加入XantPhos(1.12g，1.93mmol)和Pd(OAc)2(217mg，0.97mmol)，并将一氧化碳(由甲酸和硫酸产生)鼓泡通过溶液，同时加热至60℃。将混合物在一氧化碳(气囊)气氛下搅拌8h。每1.5h将一氧化碳鼓泡通过溶液5min。将混合物减压浓缩并将残余物用2NHCl研磨。将固体在约100mL 1N NaOH中在95℃下加热过夜(O/N)。冷却至室温后，将混合物用浓HCl酸化，通过抽滤收集沉淀并用水洗涤。将固体在110℃的烘箱中干燥至恒定质量。将固体在100mL甲苯中超声处理5min并搅拌30min。将产物过滤，用另外20mL甲苯洗涤并在110℃下干燥。产量：7.92g。
分析数据：
HPLC纯度：>99％,
1H NMR(200MHz,DMSO)δ8.64(d,J＝7.9Hz,2H),5.69(bs,1H)；13C NMR(50MHz,DMSO)δ163.27,150.97,149.67,136.69,132.65,115.73,113.6；
MS(ESI-):m/z 239.9/241.9[M-H]-.
步骤1-3：5-溴-N-甲氧基-N-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲酰胺(IV)
将5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羧酸((III)，7.91g，32.7mmol)和1,1'-羰基二咪唑(5.83g，35.9mmol)在200mL DMF中于60℃下搅拌45min。向所得悬浮液中加入N,O-二甲基羟胺盐酸盐(3.51g，35.9mmol)并将混合物在65℃搅拌4h。在真空下除去大部分溶剂，并使残余物半饱和。加入NaHCO3溶液。通过抽滤收集固体，用水洗涤并在110℃下干燥。产量：7.94g，
分析数据：
HPLC纯度：96％，
1H NMR(200MHz,DMSO)δ14.46(s,1H),8.62(d,J＝20.4Hz,2H),3.76(s,3H),3.44(s,3H),
MS(ESI-):m/z 283.0/285.0[M-H]-
步骤1-4：合成(3-氨基-2,6-二氟苯基)(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)甲酮(V)
将2,4-二氟苯胺(6.25g，48.4mmol)溶解于50mL无水THF中并在氩气氛围下冷却至-78℃。滴加2.5M己烷正丁基锂的己烷溶液(19.4mL，48.4mmol)。15min后，滴加15mL的1,2-双(氯二甲基甲硅烷基)乙烷(10.9g，49.5mmol)的无水THF溶液，并将混合物搅拌30min。滴加2.5M正丁基锂的己烷溶液(19.4mL，48.4mmol)，使混合物在1h内达到室温。冷却至-78℃后，滴加2.5M正丁基锂的己烷溶液(19.4mL，48.4mmol)，并在-78℃搅拌1h。(＝溶液A)。
将5-溴-N-甲氧基-N-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲酰胺((IV)，6.00g，21.1mmol)悬浮于50mL无水THF中并在氩气气氛下冷却至0℃。分批加入NaH(60％矿物油溶液，0.88g，22.1mmol)，并将溶液在室温搅拌1h。(＝溶液B)。
在-78℃下将溶液B滴加至溶液A中。加入完成后，将混合物在30min内温热至室温。小心地加入12ml浓HCl并将混合物搅拌30min。加入固体NaHCO3以中和溶液，滤出固体并用THF洗涤。蒸发滤液并将残余物用MeOH和水研磨并在110℃下干燥。产量：4.03g；
分析数据：
HPLC纯度：97％，
1H NMR(200MHz,DMSO-d6)δ14.91(s,1H),8.77(dd,J＝5.4,2.1Hz,2H),7.18–6.59(m,2H),5.25(s,2H)；13C NMR(50MHz,DMSO)δ183.95,151.04,150.79,150.27(dd,J＝161.0,6.8Hz),145.50(dd,J＝167.3,6.8Hz),141.34,133.35(dd,J＝12.8,2.6Hz),132.28,117.45(dd,J＝8.4,6.5Hz),116.24(dd,J＝22.7,19.1Hz),115.55,114.81,111.26(dd,J＝21.7,3.5Hz)；MS(ESI-):m/z 351.1/353.1[M-H]-.
步骤1-5：N-(3-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺(VI)
在加热下将(3-氨基-2,6-二氟苯基)-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)甲酮(579mg，1.64mmol)和4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP，0.401g，3.28mmol)溶解于吡啶(3.31mL，41.0mmol)中。冷却至-10℃后，向形成的悬浮液中加入苯基甲磺酰氯(406mg，2.13mmol)。将混合物在-10℃下搅拌10min，在室温下再搅拌10min，然后升温至50℃并搅拌30min。将混合物减压浓缩，在2N NaOH(2.46mL，4.92mmol)中重构并在室温下搅拌10min。将混合物用水稀释并在搅拌下缓慢加入到25mL 2N HCl中。10min后，通过抽滤收集形成的固体，用水洗涤并在75℃下干燥(0.590g，1.16mmol，收率71％)。
分析数据：
1H NMR(200MHz,CDCl3)δ14.22(s,1H),8.96(s,1H),8.79(d,J＝2.2Hz,1H),8.59(d,J＝2.1Hz,1H),7.52–7.25(m,6H),6.87(td,J＝9.1,1.6Hz,1H),4.32(s,2H)；
MS(ESI-):m/z 504.7[M-1]-.
步骤1-6：N-[3-[5-溴-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟苯基]-1-苯基甲磺酰胺(VII)
将N-[3-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基]-1-苯基甲磺酰胺(0.419g，0.826mmol)、对甲苯磺酸(p-TSA)一水合物(15.7mg，0.0826mmol)和二氢吡喃(0.0904mL，0.991mmol)溶解于4.13ml DCM中并回流1.5h。冷却后，将混合物用DCM稀释，用饱和NaHCO3溶液洗涤、干燥并过滤。加入正庚烷并除去DCM。在冰浴中冷却后，通过抽滤收集产物。(0.393g，0.6650mmol，收率80％)。
分析数据：
1H NMR(200MHz,CDCl3)δ8.88(d,J＝1.8Hz,1H),8.68(d,J＝1.8Hz,1H),7.62(td,J＝9.0,5.6Hz,1H),7.34(s,5H),6.96(t,J＝8.1Hz,1H),6.48(s,1H),6.14(dd,J＝9.8,2.0Hz,1H),4.39(s,2H),4.03(d,J＝11.1Hz,1H),3.90–3.56(m,1H),2.56–2.36(m,1H),2.09–1.46(m,5H)；
MS(ESI-):m/z 591.3/589.4[M-H]-.
步骤1-7：N-[2,4-二氟-3-[1-(噁烷-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]-1-苯基甲磺酰胺(VIII)
向容器中加入N-[3-[5-溴-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟苯基]-1-苯基甲磺酰胺(0.365g，0.617mmol)、双(频哪醇合)二硼(0.313g，1.23mmol)、乙酸钾(0.182g，1.85mmol)和DMF(3.09mL)。将混合物加热至90℃并将容器抽空并用氩气(3×)填充。加入双(三苯基膦)二氯化钯(II)(PdCl2(PPh)3)2,4.33mg,0.00617mmol)并将反应物在90℃搅拌4h。冷却后，反应物经浓缩，溶于(take up)EtOAc中，用水、半饱和盐水和盐水洗涤，干燥并过滤。向滤液中加入活性炭并将混合物回流15min。冷却后，将混合物经硅藻土过滤并除去溶剂。将残余物溶于少量DCM中，加入正庚烷，并减压除去DCM。通过抽滤收集固体，用正己烷洗涤，干燥呈灰白色固体状产物(0.298g，0.4670mmol，收率76％)，其无需进一步纯化即可使用。
分析数据：
1H NMR(200MHz,CDCl3)δ9.16(s,1H),8.97(s,1H),7.63(td,J＝9.1,5.7Hz,1H),7.34(s,5H),6.96(t,J＝8.6Hz,1H),6.45(s,1H),6.23(d,J＝8.8Hz,1H),4.39(s,2H),4.12–3.94(m,1H),3.80(t,J＝9.9Hz,1H),2.60–2.31(m,1H),2.09–1.55(m,5H),1.39(s,12H).
步骤1-8：N-(3-(5-(2-环丙基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)-1-苯基甲磺酰胺(IX)
向容器中加入N-[2,4-二氟-3-[1-(噁烷-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]-1-苯基甲磺酰胺(0.275g，0.431mmol)、5-溴-2-环丙基嘧啶(0.111g，0.560mmol)、PdCl2(PPh)3)2(3.02mg，0.00431mmol)和1,4-二氧六环(1.44mL)。将容器抽空并用氩气(3×)填充。加入脱气的3MK2CO3水溶液(0.431mL，1.29mmol)并将混合物在60℃搅拌1h。冷却后，将反应物用EtOAc稀释并用NH4Cl溶液中和。将有机相干燥，蒸发并通过快速色谱法(DCM/EtOAc，10至50％)分离主要产物。为了除去THP保护基，将分离的产物在2.5N HCl(3mL)中回流1h。
分析数据：
1H NMR(200MHz,DMSO-d6)δ15.01(s,1H),9.86(s,1H),9.12(s,2H),9.08(d,J＝2.0Hz,1H),8.90(d,J＝2.0Hz,1H),7.60–7.16(m,7H),4.54(s,2H),2.39–2.19(m,1H),1.27–1.04(m,4H).
MS(ESI-):m/z 545.5[M-H]-.
实施例2：合成N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)甲磺酰胺
Figure BDA0003514405000000231
步骤2-1：N-[3-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基]甲烷-磺酰胺
将(3-氨基-2,4-二氟苯基)(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)甲酮(1.29g，3.65mmol)溶于18ml THF和5.09ml TEA(36.5mmol，10当量)中。加热混合物以实现完全溶解。然后，将溶液冷却至0℃，随后加入0.99ml甲磺酰氯(mesylchloride)(12.8mmol，3.5当量)。10min后，将混合物温热至室温，加入12ml 2N KOH并将混合物搅拌10min。用3N HCl酸化后，减压除去THF，通过抽滤收集固体，用3N HCl/MeOH(1+1)洗涤并干燥(1.46g，93％)。
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.87(s,1H),9.75(s,1H),8.71(d,J＝13.9Hz,2H),7.85(d,J＝6.6Hz,1H),7.39(t,J＝8.5Hz,1H),3.12(s,3H).
MS(ESI-):m/z 431.1/429.1[M-H]-,411.1/409.1[M-H-HF]-.
步骤2-2：N-[3-[5-溴-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]甲磺酰胺
向二氢吡喃(0.614mL，6.73mmol)和N-[3-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基]甲磺酰胺(1.45g，3.36mmol)的16.8mL DCM混悬液中加入p-TSA一水合物(64.0mg，0.336mmol)并将混合物回流1h。将混合物用DCM稀释，用饱和NaHCO3溶液洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物溶于少量丙酮中，在搅拌下转移到二乙醚中。通过抽滤收集产物并用乙醚洗涤，得到呈白色粉末状产物(1.07g，2.08mmol，收率62％)。
分析数据：
1H NMR(200MHz,DMSO-d6)δ9.78(s,1H),8.80(dd,J＝13.4,1.6Hz,2H),7.88(dd,J＝14.6,7.8Hz,1H),7.43(t,J＝9.0Hz,1H),6.14(d,J＝8.6Hz,1H),3.94(d,J＝11.6Hz,1H),3.72(dd,J＝14.6,9.1Hz,1H),3.13(s,3H),2.46-2.19(m,1H),2.00-1.18(m,5H)；
MS(ESI-):m/z 515.2/513.2[M-H]-.
步骤2-3：N-[3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]甲磺酰胺
向容器中加入N-[3-[5-溴-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]甲磺酰胺(119mg，0.231mmol)、(4-氯苯基)硼酸(36.1mg，0.231mmol)、PdCl2(PPh)3)2(3.24mg，0.00462mmol)并用氩气吹扫。加入脱气的1,4-二氧六环(0.770mL)和脱气的氟化钾(95.7mg，0.693mmol)并将反应物在60℃搅拌15min。冷却后，加入EtOAc和NH4Cl溶液，并弃去水相。将有机相经Na2SO4干燥，浓缩并将残余物吸收于含2.5N HCl(3mL)的乙醇中并在60℃下搅拌过夜。加入30ml异丙醇，通过离心收集固体并弃去溶剂。将固体吸收在THF/NaHCO3溶液中并摇动。将有机相干燥，蒸发溶剂并将残余物用DCM研磨(产量：44.0mg，0.0941mmol，41％)。
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.82(s,1H),9.75(s,1H),9.00(d,J＝2.2Hz,1H),8.76(d,J＝2.2Hz,1H),7.90–7.81(m,3H),7.61–7.57(m,2H),7.40(t,J＝8.4Hz,1H),3.11(s,3H)；
计算的精确质量：462.04,MS(ESI-):m/z:461.0[M-1]-.
实施例3：合成N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)乙磺酰胺
类似于实施例2，制备N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)乙磺酰胺。
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.00(d,J＝2.2Hz,1H),8.76(d,J＝2.2Hz,1H),7.84(dd,J＝13.4,8.4Hz,3H),7.60(d,J＝8.6Hz,2H),7.38(t,J＝8.6Hz,1H),3.17(q,J＝7.3Hz,2H),1.32(t,J＝7.3Hz,3H)
计算的精确质量：476.05,MS(ESI-):m/z:474.9[M-1]-.
实施例4：合成4-(3-(2,4-二氟-3-(甲基磺酰氨基)苯甲酰基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)苯甲酸乙酯
Figure BDA0003514405000000251
步骤4-1：4-[3-[2,4-二氟-3-(甲磺酰氨基)苯甲酰基]-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基]苯甲酸
N-[3-[5-溴-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]甲磺酰胺((I)，355mg，0.689mmol)和4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲酸(188mg，0.758mmol)、XPhos Pd G3((2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯)]甲磺酸钯(II)，可从Aldrich商购；17.5mg，0.0207mmol)在脱气的1,4-二氧六环(2.30mL)和1.5M碳酸钾(2.07mL，3.10mmol)中合并。将反应物抽空并用氩气冲洗(3×)。加入XPhos Pd G3(17.5mg，0.0207mmol)并将反应物在60℃(油浴温度)搅拌3h。冷却后，将混合物用2N HCl酸化并用EtOAc萃取。萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠(Na2SO4)干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法(DCM+MeOH3％-25％)纯化并用正己烷研磨(276mg，0.4960mmol，收率72％)。
步骤4-2：5-(3-(2,4-二氟-3-(甲基磺酰氨基)苯甲酰基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)苯甲酸乙酯
将50mg(II)(0.09mmol)溶于300μl H2SO4和800μl乙醇的混合物中，并在75℃下搅拌16h。使混合物冷却至室温后，将其倒入NaHCO3水溶液中，通过离心收集沉淀物并用水和乙醚洗涤(22mg，46％，化学纯度(HPLC/UV)：95％)。
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ14.86(s,1H),9.76(s,1H),9.06(s,1H),8.83(s,1H),8.10(d,J＝7.8Hz,2H),8.04–7.94(m,2H),7.87(dd,J＝14.5,7.6Hz,1H),7.40(t,J＝8.8Hz,1H),4.35(q,J＝7.0Hz,2H),3.11(s,3H),1.35(t,J＝7.1Hz,3H)；
计算的精确质量：500.10,MS(ESI-):m/z:499.4[M-1]-.
实施例5：合成5-(3-(2,4-二氟-3-(甲基磺酰氨基)苯甲酰基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)吡啶甲酸甲酯
Figure BDA0003514405000000261
步骤5-1：N-[2,6-二氟-3-[1-(噁烷-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]甲磺酰胺
向容器中加入N-[3-[5-溴-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]甲磺酰胺((I)，0.630g，1.22mmol)、双(频哪醇合)二硼(341mg，1.34mmol)、无水乙酸钾(360mg，3.67mmol)和无水1,4-二氧六环(4.08mL)。将容器抽空并用氩气(3×)填充。加入1,1'-双(二苯基膦基)-二茂铁-二氯钯(与DCM的1:1复合物)(Pd(dppf)Cl2，17.9mg，0.0245mmol)并将反应物在80℃搅拌过夜。冷却后，加入EtOAc，将悬浮液搅拌30min，用硅藻土(Celite)过滤。将溶剂浓缩，加入正庚烷并通过抽滤收集固体，用己烷洗涤并干燥(0.690g，1.23mmol，收率100％)。
步骤5-2：5-(3-(2,4-二氟-3-(甲基磺酰氨基)苯甲酰基)-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)吡啶甲酸甲酯
向容器中加入N-[2,6-二氟-3-[1-(噁烷-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]甲磺酰胺((II)，116mg，0.206mmol)、5-溴吡啶-2-羧酸甲酯(49.0mg，0.227mmol)、氟化钾(36.0mg，0.619mmol)，Pd(dppf)Cl2DCM(8.42mg，0.0103mmol)和脱气的1,4-二氧六环/水(4+1)(0.6mL)，将容器抽空并用氩气(3×)填充。将混合物在50℃下搅拌过夜，然后用EtOAc稀释，用盐水洗涤并除去溶剂。通过快速色谱法(DCM+EtOAc 0％-20％)分离产物；81.0mg呈白色固体(0.1420mmol，收率69％)。
步骤5-3：5-(3-(2,4-二氟-3-(甲基磺酰氨基)苯甲酰基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)吡啶甲酸甲酯
向5-[3-[2,4-二氟-3-(甲磺酰氨基)苯甲酰基]-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基]吡啶-2-羧酸甲酯((III)，60.0mg，0.105mmol)的甲醇(0.525mL)溶液中加入甲磺酸(0.0273mL，0.420mmol)，并将混合物在65℃下搅拌1.5h。将混合物冷却至室温并缓慢加入乙醚(15mL)中。通过抽滤收集固体，用乙醚洗涤并真空干燥；36.0mg呈白色固体(0.0739mmol，收率70％)。
分析数据：
1H NMR(200MHz,CDCl3)δ14.90(s,1H),9.74(s,1H),9.16(dd,J＝12.4,1.9Hz,2H),8.93(d,J＝2.0Hz,1H),8.47(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H),8.19(d,J＝8.3Hz,1H),7.88(dd,J＝14.8,7.7Hz,1H),7.41(t,J＝8.7Hz,1H),3.93(s,3H),3.12(s,3H)；
计算的精确质量：487.08；MS(ESI+):m/z:510.4[M+Na+]+.
实施例6：合成N-(2,6-二氟-3-(5-(嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺
Figure BDA0003514405000000271
步骤6-1：N-[3-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺
在-10℃下向(3-氨基-2,4-二氟苯基)-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)甲酮((I)，65.0g，184mmol)和TEA(282mL，2020mmol)的THF(614mL)悬浮液中滴加1-丙基磺酰氯(68.4mL，607mmol)与DCM的1:1(v/v)混合物，保持温度低于-5℃。添加完成后，将混合物在0℃下搅拌1h。加入2N NaOH(736mL，1470mmol)并将混合物在室温下再搅拌30min。在45℃下减压蒸发从混合物中除去THF和TEA。将溶液冷却至20℃，并小心地用EtOAc(4×300mL)在涡旋(不摇动)下洗涤。减压除去残留的EtOAc，并在有效搅拌下将溶液缓慢加入到3N HCl(736mL，2210mmol)中。通过抽滤收集固体，用大量水洗涤并在100℃下干燥，得到呈灰白色固体状的N-[3-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺(73.9g，161mmol，收率87％)。
步骤6-2：N-[3-[5-溴-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺
向(II)(70.7g，154mmol)的DCM(440mL)悬浮液中加入p-TSA一水合物(2.93g，15.4mmol)和二氢吡喃(15.5mL，169mmol)并将混合物回流1h。冷却后，用200mL DCM稀释混合物，用饱和NaHCO3溶液和盐水洗涤，并经Na2SO4干燥并蒸发。将油状残余物溶于温热的(45℃)MeOH(150mL)中，加入来自先前合成的晶种并将混合物在室温搅拌。在观察到沉淀后，将混合物用冷MeOH稀释，将悬浮液冷却至-20℃持续2h，通过抽滤收集固体并且在-20℃下用50mL MeOH洗涤。在真空烘箱中在50℃下干燥产物，得到N-[3-[5-溴-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺(73.4g，135mmol，收率88％)。
步骤6-3：N-[2,6-二氟-3-[1-(噁烷-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]丙烷-1-磺酰胺
向容器中加入N-[3-[5-溴-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺((III)，4.74g，8.72mmol)、双(频哪醇合)二硼(4.65g，18.3mmol)和无水乙酸钾(2.57g，26.2mmol)。将容器抽空并用氩气(3×)填充。加入无水DMF(29.1mL)并将混合物加热至90℃。将容器抽空并再次用氩气(3×)填充。在氩气流下加入PdCl2(PPh3)2(30.6mg，0.0436mmol)，将容器密封并将反应物在90℃搅拌4h。冷却后，减压浓缩反应物，将残余物溶于约50ml EtOAc中，用水、半饱和NaCl溶液和盐水洗涤。干燥后，过滤萃取物，加入活性炭并将混合物加热至回流温度15min。冷却后，将混合物经硅藻土过滤，向滤液中加入正庚烷(50mL)并除去溶剂。将固体在正己烷(100mL)中搅拌30min，并通过抽滤收集产物。干燥后，得到呈无色固体状N-[2,6-二氟-3-[1-(噁烷-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]丙烷-1-磺酰胺(4.37g，7.4mmol，收率85％)。
步骤6-4：N-[2,6-二氟-3-(5-嘧啶-5-基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基]丙烷-1-磺酰胺
向容器中加入N-[2,6-二氟-3-[1-(噁烷-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]丙烷-1-磺酰胺((IV)，120mg，0.203mmol)、5-溴嘧啶(35.5mg，0.224mmol)、氟化钾(35.4mg，0.610mmol)、PdCl2(PPh3)2(3.32mg，0.00406mmol)和脱气的1,4-二氧六环/水(0.5mL，(4+1))。将容器抽空并用氩气(3×)填充并加热至60℃持续2h。反应物用浓HCl(0.3mL)酸化，用MeOH(0.2mL)稀释并加热至60℃过夜。加入另外的0.3mL浓HCl并继续搅拌4h。冷却后，将混合物用水稀释，用NaHCO3溶液中和并用THF萃取。将有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并蒸发。将残余物通过快速色谱法(DCM/甲醇，2％-8％)纯化，并用丙酮研磨，得到N-[2,6-二氟-3-(5-嘧啶-5-基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基]丙烷-1-磺酰胺(35.0mg，0.0741mmol，收率36％)。
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.87(s,1H),9.71(s,1H),9.28(d,J＝10.4Hz,3H),9.10(d,J＝2.2Hz,1H),8.94(d,J＝2.2Hz,1H),7.87(dd,J＝14.7,7.6Hz,1H),7.40(t,J＝8.6Hz,1H),3.20–3.07(m,2H),1.89–1.71(m,2H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H)；
C20H16F2N6O3S(分子量：458.44)的计算精确质量：458.10；
MS(ESI-):m/z:456.9[M-1]-.
实施例7：合成N-(2,6-二氟-3-(5-(2-甲基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺
Figure BDA0003514405000000291
向容器中加入N-[2,6-二氟-3-[1-(噁烷-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]丙烷-1-磺酰胺(120mg，0.203mmol)、5-溴-2-甲基嘧啶(38.7mg，0.224mmol)、氟化钾(35.4mg，0.610mmol)、Pd(dppf)Cl2·DCM(3.32mg，0.00406mmol)和脱气的1,4-二氧六环/水(0.5mL，(4+1))。将容器抽空并用氩气(3×)填充并加热至60℃持续2h。将混合物用浓HCl(0.3mL)酸化，用MeOH(0.2mL)稀释并加热至60℃过夜。加入另外的0.3mL浓HCl并继续搅拌3h。冷却后，将混合物用EtOAc和水稀释。蒸发有机相并通过快速色谱法纯化产物。
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.82(s,1H),9.66(s,1H),9.16(s,2H),9.06(d,J＝2.1Hz,1H),8.89(d,J＝2.2Hz,1H),7.86(dd,J＝14.6,7.6Hz,1H),7.40(t,J＝8.7Hz,1H),3.15(dd,J＝8.7,6.5Hz,2H),2.70(s,3H),1.81(dq,J＝14.9,7.4Hz,2H),0.99(t,J＝7.5Hz,3H)；
C21H18F2N6O3S(分子量：472.47)的计算精确质量：472.11；
MS(ESI-):m/z:471.0[M-1]-
实施例8：合成5-(3-(2,4-二氟-3-(丙基磺酰氨基)苯甲酰基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)嘧啶-2-羧酸
Figure BDA0003514405000000301
步骤8-1：5-(3-(2,4-二氟-3-(丙基磺酰氨基)苯甲酰基)-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)嘧啶-2-羧酸甲酯
向容器中加入N-[2,6-二氟-3-[1-(噁烷-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]丙烷-1-磺酰胺((I)，134mg，0.227mmol)、5-溴嘧啶-2-羧酸甲酯(54.2mg，0.250mmol)、氟化钾(39.6mg，0.681mmol)、Pd(dppf)Cl2 DCM(3.71mg，0.00454mmol)和脱气的1,4-二氧六环/水(0.5mL，(4+1))。将容器抽空并用氩气(3×)填充并加热至60℃持续2h。加入NH4Cl溶液和EtOAc，混合物经硅藻土蒸发。通过快速色谱法(DCM/EtOAc，30％-100％)分离产物；121mg固体(0.2010mmol，收率89％)。
步骤8-2：5-(3-(2,4-二氟-3-(丙基磺酰氨基)苯甲酰基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)嘧啶-2-羧酸
将5-[3-[2,4-二氟-3-(丙基磺酰基氨基)苯甲酰基]-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基]嘧啶-2-羧酸甲酯((II)，87.0mg，0.1640mmol，收率82％)溶于3mL 2.5M HCl的乙醚溶液中并回流1h。真空除去溶剂，将残余物溶于2mL MeOH和2mL 2N NaOH中，回流1h。冷却后，混合物用1N HCl酸化至pH3，加入盐水，混合物用THF和THF/EtOAc(1:1)萃取。萃取物用盐水(用一些1N HCl酸化)洗涤，经Na2SO4干燥并过滤。除去溶剂，得到5-[3-[2,4-二氟-3-(丙基磺酰基氨基)苯甲酰基]-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基]嘧啶-2-羧酸(87.0mg，0.1640mmol，收率82％)。
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.94(s,1H),9.68(d,J＝4.6Hz,1H),9.45(s,2H),9.16(d,J＝1.7Hz,1H),9.04(s,1H),7.88(dd,J＝14.5,7.9Hz,1H),7.41(t,J＝8.9Hz,1H),3.15(dd,J＝8.7,6.6Hz,3H),1.87–1.77(m,2H),1.00(t,J＝7.5Hz,3H)；
C21H16F2N6O5S(分子量：502.45)的计算精确质量：502.09；
MS(ESI-):m/z:501.0[M-1]-
实施例9：合成N-(3-(5-(2-氰基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
Figure BDA0003514405000000321
步骤9-1：N-[3-[5-(2-氰基嘧啶-5-基)-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺
向容器中加入N-[2,6-二氟-3-[1-(噁烷-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]丙烷-1-磺酰胺((I)，398mg，0.674mmol)、5-溴嘧啶-2-甲腈(136mg，0.741mmol)、氟化钾(117mg，2.02mmol)、PdCl2(PPh3)2(11.8mg，0.0169mmol)和脱气的二氧六环/水(4+1，2.5mL)。将容器抽空并用氩气(3×)填充并加热至60℃持续2h。冷却后，将反应混合物用NH4Cl溶液稀释并用EtOAc萃取。萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并蒸发。将残余物通过快速色谱法(DCM/EtOAc，5％-30％)纯化，得到N-[3-[5-(2-氰基嘧啶-5-基)-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺(270mg，0.4760mmol，收率71％)。
步骤9-2：N-[3-[5-(2-氰基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺
将N-[3-[5-(2-氰基嘧啶-5-基)-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺((II)，50.0mg，0.0881mmol)在1mL TFA中于室温下搅拌5h。将混合物浓缩，吸收在水中并使用1N NaOH将pH调节至4。将水相用EtOAc萃取，将萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并蒸发。将残余物用乙醚研磨，得到N-[3-[5-(2-氰基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺(27.0mg，0.0542mmol，收率61％)。
分析数据：
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.98(s,1H),9.68(s,1H),9.55(s,2H),9.31(s,1H),9.17(d,J＝2.2Hz,1H),9.08(d,J＝2.1Hz,1H),7.88(dd,J＝14.5,7.8Hz,1H),7.41(t,J＝8.8Hz,1H),3.19–3.10(m,2H),1.86–1.74(m,2H),1.00(t,J＝7.5Hz,3H)；
C21H15F2N7O3S(分子量：483.45)的计算精确质量：483.09；
MS(ESI-):m/z:482.0[M-1]-.
实施例10：合成N-(3-(5-(2-(1H-四唑-5-基)嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
Figure BDA0003514405000000331
修改自Vorona,S.等人(Synthesis-Stuttgart 46(6):781-786(2014))，N-[3-[5-(2-氰基嘧啶-5-基)-1-(噁烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺(75.0mg，0.132mmol)、溴化锌(29.8mg，0.132mmol)和叠氮化钠(9.45mg，0.145mmol)在1-丙醇(0.661mL)中加热至95℃持续2h。将反应物冷却，加入0.25N NaOH(2.64mL，0.661mmol)，减压除去正丙醇并将悬浮液在室温搅拌15min。过滤混合物并用0.25NNaOH(2.64mL，0.661mmol)洗涤过滤器。将滤液用2N HCl酸化并用EtOAc萃取。萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并蒸发。将残余物溶于2.5N HCl的EtOH溶液(2mL)中并加热至70℃持续2h。将反应物浓缩，用乙醚稀释，并通过抽滤收集固体，得到N-[2,6-二氟-3-[5-[2-(1H-四唑-5-基)嘧啶-5-基]-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]丙烷-1-磺酰胺盐酸盐(44.0mg，0.0782mmol，收率59％)。
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.96(s,1H),9.68(s,1H),9.57(s,2H),9.22(d,J＝2.1Hz,1H),9.08(d,J＝2.1Hz,1H),7.88(dd,J＝14.8,7.6Hz,1H),7.41(t,J＝8.5Hz,1H),3.21–3.09(m,2H),1.89–1.72(m,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H)；
C21H16F2N10O3S(分子量：526.48)的计算精确质量：526.11；
MS(ESI-):m/z:525.0[M-1]-.
实施例11：合成N-(3-(5-(2-环丙基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
Figure BDA0003514405000000341
向容器中加入N-[2,6-二氟-3-[1-(噁烷-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]丙烷-1-磺酰胺(176mg，0.298mmol)、5-溴-2-环丙基嘧啶(65.3mg，0.328mmol)、氟化钾(52.0mg，0.894mmol)、PdCl2(PPh3)2(4.18mg，0.00596mmol)和脱气的1,4-二氧六环/水(1mL，(4+1))。将容器抽空并用氩气(3×)填充并加热至60℃持续2h。冷却后，将混合物在饱和NH4Cl溶液和EtOAc之间分配，将有机相用Na2SO4干燥并蒸发。将主要产物通过快速色谱法(DCM/EtOAc，20％-80％)分离并溶于2mL的2.5N HCl的乙醇溶液中并回流2h。将反应混合物浓缩并将固体用EtOAc研磨，得到N-[3-[5-(2-环丙基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺盐酸盐(55.0mg，0.1030mmol，收率34％)。
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ14.90(s,1H),9.68(s,1H),9.11(s,2H),9.04(d,J＝2.2Hz,1H),8.87(d,J＝2.2Hz,1H),7.86(dd,J＝14.9,7.6Hz,1H),7.40(t,J＝8.5Hz,1H),3.20–3.10(m,2H),2.35–2.26(m,1H),1.86–1.74(m,2H),1.16–1.04(m,4H),0.99(t,J＝7.5Hz,3H)；
C23H20F2N6O3S(分子量：498.51)的计算精确质量：498.13；
MS(ESI-):m/z:497.0[M-1]-.
实施例12：合成N-(3-(5-(2-氯嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
Figure BDA0003514405000000342
向容器中加入N-[2,6-二氟-3-[1-(噁烷-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]丙烷-1-磺酰胺(120mg，0.203mmol)、5-溴-2-氯嘧啶(43.2mg，0.224mmol)、氟化钾(35.4mg，0.610mmol)、Pd(dppf)Cl2 DCM(3.32mg，0.00406mmol)和脱气的1,4-二氧六环/水(0.5mL，(4+1))。将容器抽空并用氩气(3×)填充并加热至60℃持续2h。冷却后，将混合物在饱和NH4Cl溶液和EtOAc之间分配，将有机相用Na2SO4干燥并蒸发。将残余物溶于1mL DCM和1mLTFA中并搅拌过夜。将混合物倒入水中，用EtOAc萃取，萃取物用NH4Cl溶液洗涤，经Na2SO4干燥并蒸发。将产物通过快速色谱法(溶剂:MeOH；使用20％-80％的DCM/EtOAc作为溶剂体系，产物未从色谱柱中洗脱)。将含有产物的级分蒸发至干燥并将残余物用甲苯和MeOH研磨。HPLC显示纯度仅87％。将固体用DCM、MeCN和乙醚洗涤并干燥(33.0mg，0.0596mmol，收率29％)。
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.92(s,1H),9.67(s,1H),9.28(s,2H),9.09(d,J＝2.1Hz,1H),8.98(d,J＝2.2Hz,1H),7.87(dd,J＝14.9,7.6Hz,1H),7.40(t,J＝8.7Hz,1H),3.22–3.10(m,2H),1.86–1.74(m,2H),1.00(t,J＝7.5Hz,3H)；
C20H15ClF2N6O3S(分子量：492.89)的计算精确质量：492.06；
MS(ESI-):m/z:490.9[M-1]-.
实施例13：合成N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,4,6-三氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
Figure BDA0003514405000000351
步骤13-1：(3-氨基-2,4,6-三氟苯基)-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)甲酮
将2,4,6-三氟苯胺(941mg，6.40mmol)和氯代三甲基硅烷(1.62mL，12.8mmol)的THF(5.82mL)溶液冷却至-78℃并滴加2M二异丙基氨基锂(6.40mL，12.8mmol)的THF/庚烷/乙苯溶液。将混合物温热至室温并搅拌30min。加入5-溴-N-甲氧基-N-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲酰胺(829mg，2.91mmol)并将混合物冷却至-30℃。滴加二异丙基氨基锂(4.65mL，9.30mmol)的THF/庚烷/乙苯溶液，并将混合物在-15℃搅拌20min。加入浓HCl(3mL)并将混合物在室温搅拌10min。用2N NaOH中和反应，将水相分离并用THF萃取。将合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过快速色谱法(DCM/EtOAc，0％-25％)纯化，并用少量DCM研磨，得到呈亮黄色固体状(3-氨基-2,4,6-三氟苯基)-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)甲酮(0.423g，1.14mmol，收率39％)。
分析数据：
1H-NMR(200MHz,CDCl3)δ14.96(s,1H),8.77(d,J＝2.8Hz,3H),7.21(t,J＝10Hz,2H),5.33(s,4H).
MS(ESI+):m/z＝370.8/368.8[M-H]-,350.8/348.8[M-H-HF]-.
步骤13-2：N-[3-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,4,6-三氟苯基]丙烷-1-磺酰胺
在-10℃向(3-氨基-2,4,6-三氟苯基)-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)甲酮(0.378g，1.02mmol)和TEA(1.56mL，11.2mmol)的THF(5.09mL)溶液中缓慢加入1-丙基磺酰氯(0.378mL，3.36mmol)的1mL THF溶液。将反应物在0℃下搅拌30min并加入2N NaOH(4.07mL，8.15mmol)。在室温下搅拌10min后，从混合物中蒸发THF并用EtOAc洗涤水溶液。将溶液用2N HCl酸化并用EtOAc萃取。将萃取物经Na2SO4干燥，蒸发并将残余物用正己烷研磨，得到N-[3-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,4,6-三氟苯基]丙烷-1-磺酰胺(0.344g，0.7210mmol，收率71％)。
分析数据：
1H NMR(200MHz,DMSO-d6)δ8.78(dd,J＝5.7,2.2Hz,2H),7.57(td,J＝9.8,2.0Hz,1H),3.18-3.05(m,3H),1.90–1.68(m,2H),0.98(t,J＝7.4Hz,3H)；
MS(ESI-):476.8/474.8[M-H]-,456.9/454.9[M-H-HF]-.
步骤13-3：N-[3-[5-(4-氯代苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,4,6-三氟苯基]丙烷-1-磺酰胺
向微波容器中加入N-[3-(5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,4,6-三氟苯基]丙烷-1-磺酰胺(78.0mg，0.163mmol)、(4-氯苯基)硼酸(26.8mg，0.172mmol)，并用氩气吹扫。加入脱气的1,4-二氧六环(0.545mL)和脱气的1.5M碳酸钾水溶液(0.327mL，0.490mmol)并将反应物在微波辐射下加热至110℃持续1h。将反应物在NH4Cl溶液和EtOAc之间分配，并蒸发有机相。将残余物通过快速色谱法(DCM/EtOAc 5％-35％)纯化，并用DCM和正己烷的混合物研磨，得到N-[3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,4,6-三氟苯基]丙烷-1-磺酰胺(44.0mg，0.0865mmol，收率53％)。
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.97(s,1H),9.66(s,1H),9.04(d,J＝2.2Hz,1H),8.77(d,J＝2.2Hz,1H),8.05–7.69(m,2H),7.71–7.44(m,3H),3.21–3.02(m,2H),1.92–1.62(m,2H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H)；
C22H16ClF3N4O3S(分子量：508.90)的计算精确质量：508.06；
MS(ESI-):m/z:507.0[M-1]-.
实施例14：合成N-(3-(5-(2-环丙基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)-1-苯基甲磺酰胺
类似于实施例11来合成实施例14。
Figure BDA0003514405000000371
分析数据：
1H NMR(400MHz,dmso)δ15.02–14.46(m,1H),9.77(s,1H),9.10(s,2H),9.05(d,J＝2.1Hz,1H),8.88(d,J＝2.1Hz,1H),7.86(dd,J＝14.3,7.5Hz,1H),7.46–7.34(m,6H),4.51(s,2H),2.35–2.24(m,1H),1.15–1.06(m,4H).
C27H20F2N6O3S(分子量：546.55)的计算精确质量：546.13
MS(ESI+):m/z 546.0[M+H]+.
实施例15：合成N-(2,6-二氟-3-(5-(2-甲氧基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例15。
Figure BDA0003514405000000381
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.87(s,1H),9.67(s,1H),9.09(s,2H),9.04(d,J＝1.7Hz,1H),8.86(d,J＝1.6Hz,1H),7.86(dd,J＝14.3,7.6Hz,1H),7.40(t,J＝8.8Hz,1H),4.00(s,3H),3.19–3.09(m,2H),1.81(td,J＝14.8,7.3Hz,2H),0.99(t,J＝7.3Hz,3H).
C21H18F2N6O4S(分子量：488.47)的计算精确质量：488.11
MS(ESI+):m/z 489.05[M+H]+.
实施例16：合成N-(2,6-二氟-3-(5-(2-羟基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例16。
Figure BDA0003514405000000382
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.78(s,1H),12.38(s,1H),9.66(s,1H),8.95(s,1H),8.77(s,1H),8.49(s,2H),7.85(dd,J＝14.7,7.7Hz,1H),7.39(t,J＝9.0Hz,1H),3.18–3.11(m,2H),1.81(td,J＝14.8,7.3Hz,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).
C20H16F2N6O4S(分子量：474.44)的计算精确质量：474.09
MS(ESI+):m/z 475.00[M+H]+.
实施例17：合成N-(3-(5-(3-氯吡啶-4-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例17。
Figure BDA0003514405000000391
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ15.05–14.58(m,1H),9.66(s,1H),8.83(s,2H),8.76(d,J＝1.6Hz,1H),8.68(d,J＝4.8Hz,1H),7.87(dd,J＝14.3,8.0Hz,1H),7.70(d,J＝4.9Hz,1H),7.40(t,J＝8.9Hz,1H),3.19–3.10(m,2H),1.81(dq,J＝14.8,7.3Hz,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).
C21H16ClF2N5O3S(分子量：491.90)的计算精确质量：491.06
MS(ESI+):m/z 491.95[M+H]+.
实施例18：合成N-(2,6-二氟-3-(5-(3-甲基吡啶-4-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例18。
Figure BDA0003514405000000392
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.82(s,1H),9.88–9.37(m,1H),8.75(d,J＝1.9Hz,1H),8.56(d,J＝1.6Hz,1H),8.55(d,J＝0.9Hz,1H),7.85(dd,J＝14.7,7.5Hz,1H),7.78(d,J＝7.6Hz,1H),7.39(dd,J＝10.8,5.9Hz,2H),3.17–3.11(m,2H),2.48(s,3H),1.81(dq,J＝14.9,7.4Hz,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).
C22H19F2N5O3S(分子量：471.48)的计算精确质量：471.12
MS(ESI+):m/z 471.9[M+H]+.
实施例19：合成N-(3-(5-(4-(叔丁基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例19。
Figure BDA0003514405000000401
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.78(s,1H),9.67(s,1H),9.00(d,J＝2.1Hz,1H),8.73(d,J＝2.1Hz,1H),7.86(dd,J＝14.7,7.6Hz,1H),7.75(d,J＝8.3Hz,2H),7.57(d,J＝8.4Hz,2H),7.40(t,J＝8.8Hz,1H),3.18–3.12(m,2H),1.81(td,J＝15.0,7.4Hz,2H),1.34(s,9H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).
C26H26F2N4O3S(分子量：512.56)的计算精确质量：512.17
MS(ESI+):m/z 513.0[M+H]+.
实施例20：合成N-(3-(5-(2-氯-4-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例20。
Figure BDA0003514405000000402
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.82(s,1H),9.66(s,1H),8.72(d,J＝1.8Hz,1H),8.57(d,J＝1.8Hz,1H),7.86(dd,J＝15.0,7.4Hz,1H),7.53(d,J＝8.6Hz,1H),7.39(t,J＝8.7Hz,1H),7.25(d,J＝2.3Hz,1H),7.10(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),3.86(s,3H),3.15(t,J＝7.6Hz,2H),1.81(dq,J＝15.0,7.5Hz,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).
C23H19ClF2N4O4S(分子量：520.94)的计算精确质量：520.08
MS(ESI+):m/z 521.0[M+H]+.
实施例21：合成N-(3-(5-(2-(叔丁基)嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例21。
Figure BDA0003514405000000411
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.88(s,1H),9.66(s,1H),9.22(s,2H),9.08(s,1H),8.91(s,1H),7.86(dd,J＝14.7,7.3Hz,1H),7.40(t,J＝8.7Hz,1H),3.18–3.11(m,2H),1.87–1.74(m,2H),1.43(s,9H),1.00(t,J＝7.2Hz,3H).
C24H24F2N6O3S(分子量：514.55)的计算精确质量：514.16
MS(ESI+):m/z 515.15[M+H]+.
实施例22：合成N-(2,6-二氟-3-(5-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例22。
Figure BDA0003514405000000412
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.87(s,1H),9.67(s,1H),9.13(s,2H),9.06(d,J＝1.9Hz,1H),8.90(d,J＝1.9Hz,1H),7.86(dd,J＝14.3,7.5Hz,1H),7.40(t,J＝8.8Hz,1H),3.19–3.12(m,2H),2.60(s,3H),1.87–1.75(m,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).
C21H18F2N6O3S2(分子量：504.53)的计算精确质量：504.08
MS(ESI+):m/z 505.05[M+H]+.
实施例23：合成N-(2,6-二氟-3-(5-(2-异丙基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例23。
Figure BDA0003514405000000413
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.87(s,1H),9.67(s,1H),9.13(s,2H),9.06(d,J＝1.9Hz,1H),8.90(d,J＝1.9Hz,1H),7.86(dd,J＝14.3,7.5Hz,1H),7.40(t,J＝8.8Hz,1H),3.19–3.12(m,2H),2.60(s,3H),1.87–1.75(m,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).
C23H22F2N6O3S(分子量：500.52)的计算精确质量：500.14
MS(ESI+):m/z 501.05[M+H]+.
实施例24：合成N-(2,6-二氟-3-(5-(4-氟-2-甲基苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例24。
Figure BDA0003514405000000421
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.82(s,1H),9.67(s,1H),8.68(d,J＝2.1Hz,1H),8.48(d,J＝2.1Hz,1H),7.86(dd,J＝14.8,7.6Hz,1H),7.42–7.36(m,2H),7.26(dd,J＝10.1,2.5Hz,1H),7.17(td,J＝8.5,2.6Hz,1H),3.18–3.11(m,2H),2.28(s,3H),1.81(dq,J＝15.0,7.4Hz,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).
C23H19F3N4O3S(分子量：488.49)的计算精确质量：488.11
MS(ESI+):m/z 489.05[M+H]+.
实施例25和26：合成N-(2,6-二氟-3-(5-(4-甲氧基-2-甲基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺(实施例25)和N-(2,6-二氟-3-(5-(4-羟基-2-甲基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺(实施例26)
步骤1：类似于实施例9，步骤9-1，进行N-(2,6-二氟-3-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺与5-溴-4-氯-2-甲基嘧啶的转化。
两种不同的脱保护方法得到实施例25或实施例26。
Figure BDA0003514405000000431
N-(2,6-二氟-3-(5-(4-甲氧基-2-甲基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺的分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.84(s,1H),9.66(s,1H),8.86(d,J＝2.0Hz,1H),8.75(d,J＝2.0Hz,1H),8.64(s,1H),7.85(dd,J＝15.4,7.4Hz,1H),7.39(t,J＝8.7Hz,1H),3.99(s,3H),3.18–3.10(m,2H),2.62(s,3H),1.81(td,J＝15.3,7.7Hz,2H),1.00(t,J＝7.5Hz,3H).
C22H20F2N6O4S(分子量：502.50)的计算精确质量：502.12
MS(ESI+):m/z 502.95[M+H]+.
N-(2,6-二氟-3-(5-(4-羟基-2-甲基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺的分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.84(s,1H),9.66(s,1H),8.86(d,J＝2.0Hz,1H),8.75(d,J＝2.0Hz,1H),8.64(s,1H),7.85(dd,J＝15.4,7.4Hz,1H),7.39(t,J＝8.7Hz,1H),3.99(s,3H),3.18–3.10(m,2H),2.62(s,3H),1.81(td,J＝15.3,7.7Hz,2H),1.00(t,J＝7.5Hz,3H).
C21H18F2N6O4S(分子量：488.47)的计算精确质量：488.11
MS(ESI+):m/z 489.15[M+H]+.
实施例27：合成N-(2,6-二氟-3-(5-(吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例11来合成实施例27。
Figure BDA0003514405000000441
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.86(s,1H),9.67(s,1H),9.05(dd,J＝10.7,2.0Hz,2H),8.83(d,J＝2.2Hz,1H),8.66(dd,J＝4.8,1.5Hz,1H),8.30–8.23(m,1H),7.87(dd,J＝14.9,7.5Hz,1H),7.57(dd,J＝7.5,4.8Hz,1H),7.40(t,J＝8.5Hz,1H),3.17–3.12(m,2H),1.86–1.75(m,2H),1.00(t,J＝7.5Hz,3H)；
C21H17F2N5O3S(分子量：457.46)的计算精确质量：457.10
MS(ESI-):m/z:455.9[M-1]-.
实施例28：合成5-(3-(2,4-二氟-3-(丙基磺酰氨基)苯甲酰基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)吡啶甲酸
类似于实施例11来合成实施例28。
Figure BDA0003514405000000442
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.92(s,1H),9.68(s,1H),9.15(dd,J＝16.8,2.0Hz,2H),8.93(d,J＝2.0Hz,1H),8.45(dd,J＝8.1,2.3Hz,1H),8.18(d,J＝8.1Hz,1H),7.88(dd,J＝14.5,7.7Hz,1H),7.41(t,J＝8.7Hz,1H),3.19–3.10(m,2H),1.86–1.75(m,2H),1.00(t,J＝7.5Hz,3H)；
C22H17F2N5O5S(分子量：501.46)的计算精确质量：501.09；
MS(ESI-):m/z:500.1[M-1]-
实施例29：合成N-[2,6-二氟-3-[5-(4-甲基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例29。
Figure BDA0003514405000000451
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.90(s,1H),9.66(s,1H),9.12(s,1H),8.80(d,J＝2.1Hz,1H),8.76(s,1H),8.68(d,J＝2.1Hz,1H),7.90–7.82(m,1H),7.43–7.36(m,1H),3.30(s,3H),3.19–3.11(m,3H),1.88–1.73(m,3H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).；
C21H18F2N6O3S(分子量：472.47)的计算精确质量：472.11；
MS(ESI+):m/z:473.55[M+H]+.
实施例30：合成N-[3-[5-(2,4-二甲基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例30。
Figure BDA0003514405000000452
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.88(s,1H),9.67(s,1H),8.77(d,J＝1.6Hz,1H),8.67–8.59(m,2H),7.86(dd,J＝14.6,7.5Hz,1H),7.40(t,J＝8.8Hz,1H),3.20–3.10(m,2H),2.66(s,3H),2.45(s,3H),1.87–1.74(m,2H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H).
C22H20F2N6O3S(分子量：486.49)的计算精确质量：486.13；
MS(ESI+):m/z:486.9[M+H]+.
实施例31：合成N-(3-(5-(2-环丙基-4-甲基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
Figure BDA0003514405000000461
步骤1：合成N-(3-(5-(2-环丙基-4-甲基嘧啶-5-基)-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺(C)
将N-(2,6-二氟-3-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺(300mg，0.51mmol)、化合物B(119mg，0.56mmol)和KF(144mg，1.53mmol)的1,4-二氧六环/H2O(10mL)溶液在室温下搅拌，然后用氩气吹扫5min。加入PdCl2(dppf).CH2Cl2(42mg，0.051mmol)并将混合物再次用氩气吹扫5min。然后将反应物加热回流8h。使用(20％EtOAc的己烷溶液v/v)通过TLC监控反应进程。完成后，将反应混合物逐渐冷却至室温并用乙酸乙酯(20mL)稀释，通过硅藻土垫过滤并减压浓缩，得到粗化合物。最后通过FCC纯化粗产物，得到135mg(45％)所需化合物C。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.69(s,1H),8.81(d,1H,J＝2.0Hz),8.64(d,1H,J＝2.0Hz),8.56(s,1H),7.93–7.85(m,1H),7.43(t,1H,J＝8.8Hz),6.21(d,1H,J＝9.6Hz),3.93–3.97(m,1H),3.71–3.80(m,1H),3.14(t,2H,J＝7.6Hz),2.43(br s,3H),2.21–2.27(m,1H),1.95–2.01(m,2H),1.67–1.75(m,3H),1.55–1.62(m,3H),1.10–1.20(m,4H),0.99(t,3H,J＝7.2Hz).
MS(ESI+):m/z 597.1(M+H+)
步骤-2：合成N-(3-(5-(2-环丙基-4-甲基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
在室温下向化合物C(135mg，0.22mmol)的MeOH(10mL)溶液中加入p-TSA(28mg，0.24mmol)，将反应混合物加热至50℃持续6h。使用(5％MeOH的DCM溶液v/v)通过TLC监控反应进程。反应完成后，真空蒸发溶剂，加入水(5mL)，将混合物用饱和的NaHCO3水溶液中和，并用EtOAc(3×20mL)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥并减压浓缩，得到粗化合物，将其研磨，得到55mg(48％)呈灰白色固体状所需化合物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.67(br s,1H),8.76(d,1H,J＝2.0Hz),8.61(d,1H,J＝2.0Hz),8.55(s,1H),7.82–7.88(m,1H),7.39(t,1H,J＝8.80Hz),3.14(t,2H,J＝7.60Hz),2.42(s,3H),2.20–2.28(m,1H),1.80(q,2H,J＝7.60Hz),1.05–1.11(m,4H),0.99(t,3H,J＝7.20Hz).
C24H22F2N6O3S(分子量：512.53)的计算精确质量：512.14；
MS(ESI+):m/z 513.60[M+H]+.
实施例32：合成N-(3-(5-(2-环丙基-4-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
A部分.合成5-溴-2-环丙基-4-(甲硫基)嘧啶(D)
Figure BDA0003514405000000471
步骤-1：5-溴-4-氯-2-(甲基磺酰基)嘧啶(B)
在室温下向5-溴-4-氯-2-(甲硫基)嘧啶(3g，12.6mol)的THF(25mL)搅拌溶液中加入溶解于水(15mL)中的单过硫酸氢钾(oxone)(1.16g，37.8mmol)。随后将混合物搅拌4h。如TLC所观察的，使用EtOAc/正己烷(30/70％v/v)作为溶剂完成反应后，将反应物用水(50mL)稀释并用EtOAc(3×25mL)萃取。将合并的分离的有机层用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并减压蒸发，得到3.2g(94％)呈灰白色固体状化合物B。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.38(s,1H),3.41(s,3H)
(ESI+):m/z 272.80[M+H]+
步骤-2：5-溴-4-氯-2-环丙基嘧啶(C)
在0℃下向化合物B(1.5g，5.55mmol)的无水THF(20mL)搅拌溶液中缓慢加入1M环丙基溴化镁(6.66mL，6.66mmol)。然后将混合物逐渐温热至室温并搅拌2h。如TLC所观察的，使用EtOAc/正己烷(20/80％v/v)作为溶剂完成反应后，加入NH4Cl水溶液猝灭反应，并用EtOAc(2×25mL)萃取。将分离的合并的有机层用盐水(15mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压蒸发，得到粗化合物。粗产物最后通过FCC纯化，得到600mg(52％)呈灰白色固体状所需化合物C。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.59(s,1H),2.05–2.25(m,1H),1.05–1.10(m,4H)
MS(ESI+):m/z 234.8[M+H]+.
步骤-3：5-溴-2-环丙基-4-(甲硫基)嘧啶(D)
在室温下，向化合物C(1.2g，5.17mmol)的DMF(10mL)搅拌溶液中加入NaSMe(544mg，7.75mol)，并将混合物在室温下搅拌16h。如TLC所观察的，使用EtOAc/正己烷(10/90％v/v)作为溶剂完成反应后，加入水(30mL)并用EtOAc(2×25mL)萃取，将分离的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压蒸发，得到800mg(80％)呈黄色液体状化合物D。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.25(s,1H),2.52(s,3H),4.10–4.23(m,1H),1.10–1.20(m,4H)
MS(ESI+):m/z 246.8[M+H]+.
B部分：合成N-(3-(5-(2-环丙基-4-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
Figure BDA0003514405000000481
步骤-1：N-(3-(5-(2-环丙基-4-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺(C)
向N-(2,6-二氟-3-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺(400mg，0.67mmol)和化合物D(182mg，0.74mmol)的5ml的1,4-二氧六环/H2O(75/25％v/v)搅拌溶液中加入溶解于1mL水中的118mg(2.03mmol)KF。将所得混合物用氩气吹扫5min，然后加入Pd(dppf)Cl2 DCM(0.1当量，55mg，0.067mmol)，并将混合物再次用氩气吹扫5min。然后将反应物在90℃下加热6h。反应完成后，加入水(10mL)并用1NHCl将pH调节至6。用EtOAc(3×15mL)萃取混合物，分离有机层，干燥并浓缩，得到粗残余物。通过反相制备型HPLC纯化粗物质，得到60mg(收率14％)化合物C。
MS(ESI+):m/z 629.20[M+H]+.
步骤2：N-(3-(5-(2-环丙基-4-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3羰基)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
在室温下向化合物C(90mg，0.143mmol)的MeOH(2mL)搅拌溶液中加入pTSA(74mg，0.42mmol)，并将反应混合物加热至65℃持续16h。使用EtOAc/正己烷(70/30％v/v)通过TLC监控反应进程。反应完成后，真空蒸发溶剂，加入水(5mL)，然后用NaHCO3水溶液中和(pH＝7)，并用EtOAc(3×5mL)萃取。将分离的有机层经无水Na2SO4干燥并减压浓缩，得到粗产物，将其通过SFC纯化，得到25mg(32％)所需化合物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.66(s,1H),8.72(s,1H),8.69(s,1H),8.37(s,1H),7.86(q,1H,J＝6.8Hz),7.39(t,1H,J＝8.8Hz),3.14(t,2H,J＝8.0Hz),2.20–2.30(m,1H),1.70–1.86(m,2H),1.10–1.15(br s,4H),0.99(t,3H,J＝7.2Hz).
C24H22F2N6O3S(分子量：512.53)的计算精确质量：512.14；
MS(ESI+):m/z 545.10[M+H]+.
实施例33：合成N-[2,6-二氟-3-[5-(4-甲基-2-甲磺酰基-嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]苯基]丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例33。
Figure BDA0003514405000000491
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.79(s,1H),9.73(s,1H),8.77(d,J＝2.0Hz,1H),8.65(d,J＝2.0Hz,1H),8.58(s,1H),7.86(dd,J＝14.6,7.8Hz,1H),7.39(t,J＝9.0Hz,1H),3.21–3.05(m,2H),2.57(s,3H),2.44(s,3H),1.91–1.68(m,2H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H).
C22H20F2N6O3S2(分子量：518.56)的计算精确质量：518.10；
MS(ESI-):m/z:517.5[M-1]-.
实施例34：合成N-[3-[5-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例34。
Figure BDA0003514405000000501
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.80(s,1H),9.66(s,1H),8.81(d,J＝2.1Hz,1H),8.69(d,J＝2.1Hz,1H),8.54(s,1H),7.84(dd,J＝14.5,7.7Hz,1H),7.38(t,J＝8.8Hz,1H),4.05–3.89(m,6H),3.18–3.09(m,2H),1.86–1.72(m,2H),0.98(t,J＝7.4Hz,3H).
C22H20F2N6O5S(分子量：518.49)的计算精确质量：518.12；
(ESI+):m/z 519.15[M+H]+
实施例35：合成N-(3-(5-(2-环丙基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,4,6-三氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
Figure BDA0003514405000000502
步骤-1：合成(3-氨基-2,4,6-三氟苯基)(5-溴-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)甲酮(B)
溶液A：在-10℃下向化合物A(4.22g，18.68mmol)的无水THF(24mL)溶液中滴加2M异丙基氯化镁(9.33mL，1当量，18.68mmol)的THF溶液，保持温度低于10℃。在25℃下搅拌20min后，将反应物冷却至0℃并缓慢加入三甲基氯硅烷(2.02g，1当量，18.68mmol)。将混合物温热至25℃并搅拌30min。将溶液再次冷却至-10℃并滴加2M异丙基氯化镁的THF溶液(9.33mL，1当量，18.68mmol)，保持温度低于10℃。在25℃下搅拌20min后，将反应物冷却至0℃并缓慢加入三甲基氯硅烷(2.02g，1当量，18.68mmol)。将混合物温热至25℃并搅拌30min。将反应物冷却至-10℃并滴加2M异丙基氯化镁的THF溶液(9.33mL，1当量，18.68mmol)。添加完成后，将混合物在0℃下搅拌20min。
溶液B：在第二个烧瓶中，在-10℃下，将2M异丙基氯化镁的THF溶液(9.33mL，1当量，18.68mmol)滴加到5-溴-N-甲氧基-N-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲酰胺(3g，8.12mmol)的THF(30mL)悬浮液中，保持温度低于0℃。添加完成后，将混合物在0℃下搅拌10min。
将溶液B加入到溶液A中并将反应物在25℃下搅拌2h。然后小心地加入4N HCl水溶液直至所有镁盐溶解。用30％NaOHaq将水溶液的pH调节至5，用NaCl饱和并分离各层。用THF和EtOAc的混合物萃取水层(需要加入EtOAc以分离各层)。蒸发萃取物，再溶解于THF中并与有机相合并。加入浓HClaq(5mL)，并在室温下将混合物搅拌10min。将混合物用固体NaHCO3中和，弃去下层水层，有机层经Na2SO4干燥。蒸发溶剂后，将残余物悬浮于乙醚(15mL)中，用DCM(20mL)研磨并通过抽滤收集固体。蒸发滤液，将残余物溶于乙醚(20mL)中，并通过抽滤收集固体。使用0-5％MeOH的DCM溶液通过FCC纯化合并的固体，得到900mg(38％)期望的呈灰白色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.86(d,1H,J＝2.0Hz),8.80(d,1H,J＝2.0Hz),7.25–7.35(m,1H),6.14(d,1H,J＝10Hz),5.36(br s,2H),3.90–3.95(m,1H),3.70–3.85(m,1H),2.25–2.33(m,1H),1.65–1.85(m,1H),1.50–1.62(m,2H),1.10–1.15(m,2H).
(ESI+):m/z 455.18[M+H]+
步骤2：合成N-(3-(5-溴-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,4,6-三氟苯基)丙烷-1-磺酰胺(C)
在-10℃向化合物B(900mg，1.98mmol)和三乙胺(13.7mL，10mmol)的THF(20mL)溶液中缓慢加入1-丙基磺酰氯(0.8mL，7mmol)的等体积THF溶液，并将反应物在-10℃搅拌30min。加入2N NaOH(3.75mL，12mmol)，在45℃减压蒸发THF。用EtOAc(2×20mL)和乙醚洗涤水溶液。蒸发残余的有机物，将溶液用2N HCl酸化并剧烈搅拌30min以破碎较大的团块。通过抽滤收集固体，用水洗涤并在100℃下干燥，得到呈灰白色固体状的化合物C(960mg，收率87％)。1H NMR显示了单磺酰胺和二磺酰胺的混合物，其原样用于下一步骤。
步骤3：合成N-(2,4,6-三氟-3-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)苯基)丙烷-1-磺酰胺(D)
向化合物C(900mg，1.60mmol)的1,4-二氧六环(15mL)搅拌溶液中加入双(频哪醇合)二硼(612mg，2.41mmol)和KF(278mg，4.8mmol),且所得混合物用氩气脱气10min。加入Pd(dppf)Cl2 DCM(65mg，0.08mmol)，将混合物进一步用氩气脱气5min并在85℃搅拌8h。使用EtOAc/正己烷(60/40％v/v)作为溶剂，通过TLC监控反应进程。完成后，将反应混合物冷却至室温，用EtOAc(20mL)稀释，通过硅藻土垫过滤并将有机层减压浓缩以得到粗化合物，将其通过FCC纯化以得到化合物D(960mg，87％)。
MS(ESI+):m/z 609.0[M+H]+.
步骤4：合成N-(3-(5-(2-环丙基嘧啶-5-基)-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,4,6-三氟苯基)丙烷-1-磺酰胺(F)
向化合物D(950mg，1.56mmol)和化合物E(342mg，1.71mmol)的1,4-二氧六环/H2O(10mL)搅拌溶液中加入KF(271mg，4.68mmol)，并将所得混合物用氩气脱气10min。加入Pd(dppf)Cl2 DCM(64mg，0.078mmol)，将反应混合物进一步用氩气脱气5min并在90℃搅拌8h。使用EtOAc/正己烷(40/60％v/v)作为溶剂，通过TLC监控反应进程。完成后，将反应混合物冷却至室温并用EtOAc(20mL)稀释，通过硅藻土垫过滤并将有机层减压浓缩，得到粗化合物，将其使用乙醚研磨，得到化合物F(650mg，61％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.10–9.15(m,3H),8.89(d,1H,J＝2.4Hz),7.80(t,1H,J＝8.8Hz),6.66(dd,1H,J＝2.4&10.4Hz),3.60–3.80(m,4H),2.22–2.38(m,3H),1.95–2.00(m,2H),1.72–1.93(m,3H),1.55–1.60(m,2H),1.06-1.09(m,2H),0.95–1.05(m,5H)
步骤5：合成N-(3-(5-(2-环丙基嘧啶-5-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基)-2,4,6-三氟苯基)丙烷-1-磺酰胺
在室温向化合物F(650mg，1.08mmol)中加入TFA(10mL)并将混合物搅拌过夜。如TLC所观察的，使用(MeOH/DCM 5/95％v/v)完成反应后，在室温使用N2流蒸发反应混合物，得到粗化合物。使用饱和NaHCO3水溶液将粗物质的pH中和至8，随后用DCM(2×20mL)萃取，将有机层分离并经无水Na2SO4干燥，蒸发溶剂得到粗物质。最后使用0-5％MeOH的DCM溶液(v/v)通过FCC纯化粗产物，得到175mg(32％)呈灰白色固体状所需化合物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):13.05(br s,1H),9.66(br s,1H),9.11(s,2H),9.07(s,1H),8.88(s,1H),7.59(t,1H,J＝8.0Hz),3.13(t,1H,J＝8.0Hz),2.25–3.35(m,1H),1.70–1.85(m,2H),1.05–1.15(m,4H),0.98(t,3H,J＝7.60Hz)
MS(ESI+):m/z 517.06[M+H]+.
实施例36：合成N-[3-[5-(3-乙基-4-吡啶基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例36。
Figure BDA0003514405000000531
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.90(s,1H),9.67(s,1H),8.72(d,J＝1.9Hz,1H),8.64(s,1H),8.59–8.50(m,2H),7.87(dd,J＝14.7,7.6Hz,1H),7.39(dd,J＝14.1,6.6Hz,2H),3.21–3.06(m,2H),2.66(q,J＝7.5Hz,2H),1.88–1.73(m,2H),1.06(t,J＝7.5Hz,3H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).
C23H21F2N5O3S(分子量：485.51)的计算精确质量：485.13；
MS(ESI-):m/z:484.2[M+H]-.
实施例37：合成N-[3-[5-(3-氰基-4-吡啶基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-羰基]-2,6-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺
类似于实施例7来合成实施例37。
Figure BDA0003514405000000541
分析数据：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.19(s,1H),9.04–8.91(m,3H),7.95–7.84(m,2H),7.41(t,J＝8.8Hz,1H),3.19–3.10(m,2H),1.81(dq,J＝15.0,7.5Hz,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).
C22H16F2N6O3S(分子量：482.47)的计算精确质量：482.10；
MS(ESI-):m/z:481.3[M+H]-.
实施例38：生物活性--功能酶测定中的抑制效力和选择性
使用由ProQinase GmbH(德国，弗莱堡)提供的
Figure BDA0003514405000000542
Assay Service来测量本发明化合物的激酶活性。在ProQinase网址(https://www.proqinase.com/ products-services-biochemical-assay-services/kinase-assays)上公开了测试条件详情。简言之，所有激酶测定在来自PerkinElmer(美国，马萨诸塞州，波斯顿)的96孔FlashPlatesTM中以50μl反应体积进行。按以下顺序分四个步骤来吸取反应混合物：
20μl测定缓冲液(标准缓冲液)
5μl ATP溶液(H2O溶液)
5μl测定化合物(10％DMSO溶液)
20μl酶/底物混合物
所有蛋白激酶的测定含有70mM HEPES-NaOH pH7.5,3mM MgCl2，3mM MnCl2，3μM原钒酸钠，1.2mM DTT，50μg/ml PEG20000，ATP(可变浓度，对应于各激酶的表观ATP-Km)，[γ-33P]-ATP(约8×1005cpm/孔)，蛋白激酶和底物。
将反应混合物在30℃下孵育60h。用50μl 2％(v/v)H3PO4终止反应，抽吸平板并用200μl 0.9％(w/v)NaCl洗涤两次。用微板闪烁计数器(Microbeta，Wallac)测定33Pi的掺入。
用BeckmanCoulter/SAGIANTM核心系统进行所有测定。
在单一浓度测定的情况下，测试化合物的效力表示为残余活性％。为了测定IC50值，测试最终浓度范围为100μM-3nM(10个浓度)的系列稀释液。IC50测定的拟合模型是“Sigmoidal反应(可变斜率)”，参数“顶部”固定在100％，且“底部”固定在0％。使用的拟合方法是最小二乘拟合(least-squares fit)。
MKK4效力：
对MKK4的抑制效力分类如下：
测定IC50值的试验：
Figure BDA0003514405000000551
通过IC50(脱靶)/IC50(MKK4)的比率计算测试化合物针对BRaf、JNK1和MKK7(统称为脱靶)的选择性，并分类如下：
Figure BDA0003514405000000552
表1：代表性实施例基于IC50值对MKK4的生物化学效力和对BRaf、MKK7和JNK1的选择性。
Figure BDA0003514405000000553
Figure BDA0003514405000000561

Claims (20)

1.一种式(I)化合物
Figure FDA0003514404990000011
及其药学上可接受的盐、前药、生物活性代谢物、溶剂合物和立体异构体，
其中式(I)中的变量具有如下含义：
R1为H或烷基；
R4为H或烷基；
R5选自
a)嘧啶基，其被1或2个独立地选自环烷基、烷基、-COOR10、-OH、烷基硫烷基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、四唑基、CN、卤素、烷氧基、-(NR10＝)S(＝O)-烷基[S-烷基磺亚胺酰基]和
Figure FDA0003514404990000012
的取代基取代，和
b1)吡啶基，其被1或2个独立地选自烷基和卤素的取代基取代并且其任选地进一步被-OH、烷氧基、CN、-COOR10、CF3、-(NR10＝)S(＝O)-烷基和
Figure FDA0003514404990000013
取代，以及
b2)吡啶基，其被-COOR10取代且进一步被-OH、CN或CF3取代；
R6为H或烷基；
Rw为-NR10SO2R12；
Rx为H、卤素或烷基；
Ry为H、卤素或烷基；
Rz为H、卤素或烷基；
其中Rx、Ry或Rz中的一个或两个或三个为卤素、且Rx、Ry或Rz中其余为H或烷基；
R10在每次出现时独立地为H或烷基；
R12为H、烷基或苯烷基；以及
n为1或2。
2.根据权利要求1所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R1为H。
3.根据前述权利要求中任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R4和R6为H。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被1或2个独立地选自环烷基、烷基、烷氧基、-OH、烷基硫烷基、卤素、CN和四唑基的取代基取代。
5.根据权利要求4所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被1或2个独立地选自环烷基、烷基、烷氧基、-OH、烷基硫烷基、卤素和CN的取代基取代。
6.根据权利要求5所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为嘧啶基，其被选自环烷基、烷基、烷氧基、-OH和烷基硫烷基的基团取代，并且进一步被选自烷基、烷氧基和烷基硫烷基的基团取代。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R5为在3位被烷基或卤素取代的吡啶基-4-基(在4位与吡唑并吡啶基键合)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R10为H或烷基，特别是H。
9.根据前述权利要求中任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R12为烷基或苯烷基。
10.根据权利要求9所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中R12为C1-C3-烷基或苄基。
11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其具有式(Ia)
Figure FDA0003514404990000031
其中：
Rx为卤素；
Ry为卤素；以及
R1、R4、R5、R6和Rw如前述权利要求中任一项所定义。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其具有式(Ib)
Figure FDA0003514404990000032
其中：
Rx为卤素；
Ry为卤素；以及
R1、R4、R5、R6和Rw如权利要求1至10中任一项所定义。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其具有式(Ic)
Figure FDA0003514404990000033
其中：
Rx为卤素；
Ry为卤素；
Rz为卤素；以及
R1、R4、R5、R6和Rw如权利要求1至10中任一项所定义。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体，其中Rx、Ry和Rz(如果存在)为F或Cl，特别是F。
15.一种根据权利要求1所述的化合物，其选自
Figure FDA0003514404990000041
Figure FDA0003514404990000051
及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体。
16.一种化合物，其选自
Figure FDA0003514404990000061
及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1至16中任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、前药、溶剂合物和光学异构体或根据权利要求17所述的组合物，其用于
抑制蛋白激酶MKK4、以及特别是用于相对于蛋白激酶JNK1和MKK7选择性抑制蛋白激酶MKK4；
促进肝再生或减少或预防肝细胞死亡；
治疗急性、慢加急性或慢性肝脏疾病；
治疗急性和慢性或慢加急性肝病，诸如：急性和慢性病毒性肝炎如乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎，由艾普斯登-巴尔病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和其他病毒引起的肝炎，所有类型的自身免疫性肝炎，原发性硬化性肝炎，酒精性肝炎；
治疗代谢性肝脏疾病，诸如：代谢综合征、脂肪肝如非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、酒精性脂肪肝炎(ASH)、威尔森氏症、血色素沉着症、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖原贮积病；
治疗所有类型的肝硬化，诸如：原发性胆汁性肝硬化、乙醇中毒性肝硬化、隐源性肝硬化；
治疗急性(暴发性)或慢性肝衰竭，诸如：中毒性肝衰竭如对乙酰氨基酚(扑热息痛)诱导的肝衰竭，α-鹅膏蕈碱诱导的肝衰竭，例如由抗生素、非甾体类抗炎药、抗痉挛药引起的药物诱导性肝毒性和肝衰竭，由草药补充剂(卡瓦、麻黄、黄芩、薄荷等)诱导的急性肝衰竭，由诸如布-加综合征的血管疾病引起的肝脏疾病和肝衰竭，不明原因的急性肝衰竭，由右心衰竭引起的慢性肝脏疾病；
治疗半乳糖血症、囊性纤维化、卟啉症、肝脏缺血灌注损伤、肝移植术后小肝综合征、原发性硬化性胆管炎或肝性脑病；
治疗骨关节炎或类风湿性关节炎，或CNS相关疾病如阿尔茨海默病和帕金森病。
19.根据权利要求18所述的用途的化合物及其药学上可接受的盐、溶剂合物和光学异构体，其中所述化合物以0.2-15mg/kg的待治疗受试者的剂量在1-12个月的周内施用。
20.一种方法，其：
抑制蛋白激酶MKK4；
相对于蛋白激酶JNK1和MKK7选择性抑制蛋白激酶MKK4；促进肝再生或预防肝细胞死亡；
治疗急性、慢加急性或慢性肝脏疾病；
治疗急性和慢性或慢加急性肝病，诸如：急性和慢性病毒性肝炎如乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎，由艾普斯登-巴尔病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和其他病毒引起的肝炎，所有类型的自身免疫性肝炎，原发性硬化性肝炎，酒精性肝炎；
治疗代谢性肝脏疾病，诸如：代谢综合征、脂肪肝如非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、酒精性脂肪肝炎(ASH)、威尔森氏症、血色素沉着症、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖原贮积病；
治疗所有类型的肝硬化，诸如：原发性胆汁性肝硬化、乙醇中毒性肝硬化、隐源性肝硬化；
治疗急性(暴发性)或慢性肝衰竭，诸如：中毒性肝衰竭如对乙酰氨基酚(扑热息痛)诱导的肝衰竭，α-鹅膏蕈碱诱导的肝衰竭，例如由抗生素、非甾体类抗炎药、抗痉挛药引起的药物诱导性肝毒性和肝衰竭，由草药补充剂(卡瓦、麻黄、黄芩、薄荷等)诱导的急性肝衰竭，由诸如布-加综合征的血管疾病引起的肝脏疾病和肝衰竭，不明原因的急性肝衰竭，由右心衰竭引起的慢性肝脏疾病；
治疗半乳糖血症、囊性纤维化、卟啉症、肝脏缺血灌注损伤、肝移植术后小肝综合征、原发性硬化性胆管炎或肝性脑病；
治疗骨关节炎或类风湿性关节炎，或CNS相关疾病如阿尔茨海默病和帕金森病，
其包括向有此需要的受试者施用有效量的如权利要求1至17中任一项所定义的化合物或组合物。
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