CN114262745A - 一种甘薯花青素相关snp分子标记、鉴定及其应用 - Google Patents
一种甘薯花青素相关snp分子标记、鉴定及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于甘薯育种领域，具体涉及一种甘薯花青素相关SNP分子标记、鉴定及其应用。本发明所述的甘薯花青素相关SNP分子标记为SNP位点（chr12.20497784），基因型为GG，GA，AA。本发明提供的鉴定方法，与常规群体株系全部重测序分析SNPs相比具有数据量小，花费少等优点。本发明提供的方法，在种子阶段或实生苗幼苗期取叶片就可以通过SNaPshot技术平台对SNP位点进行基因分型验证植株薯块中是否含有花青素，与常规的在结薯之后才能知道植株薯块是否含有花青素相比，节省了育种时间。
Description
技术领域
本发明属于甘薯育种领域，具体涉及一种甘薯花青素相关SNP分子标记、鉴定及其应用。
背景技术
花青素是一种天然水溶性的食用色素。甘薯（Ipomoea batatas(L.)Lam）种质资源中花青素的积累呈现丰富的多态性。甘薯中的花青素被广泛的应用于食品、药品等领域。单核苷酸多态性（SNP）作为最新一代遗传分子标记，目前被广泛的应用于生物各研究领域。目前，甘薯各生长位点花青素积累性状之间还没有系统的关联性分析。选育紫甘薯品种需要将有性杂交获得的种子先在苗床发苗，然后移栽到大田里，待结薯之后才能知道是否是紫薯，该育种过程时间长，且需要消耗大量的人力物力。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种甘薯花青素相关SNP分子标记。
本发明还提供了一种鉴定甘薯花青素的方法。
本发明还提供了一种甘薯花青素相关SNP分子标记在甘薯育种中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种甘薯花青素相关SNP分子标记，所述分子标记为SNP位点（chr12.20497784），基因型为GG，GA，AA。
进一步的，所述基因型为GG时，薯块不含有花青素；所述基因型为GA或者AA，薯块含有花青素。
进一步的，所述SNP位点基因分型检测中，涉及PCR扩增反应；PCR扩增反应中扩增引物P1、P2的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1 、SEQ ID NO.2所示；具体如下所示：
SEQ ID NO.1：TCGCCTACTCTGCTCCTCTG
SEQ ID NO.2：GGGTGCGTTGGTAGGTGTTT
进一步的，所述SNP位点检测中，涉及单碱基延伸反应；单碱基延伸反应中延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；具体序列如下所示：
SEQ ID NO.3：TTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTGGTGTTTTGATACGC
本发明还提供了一种利用上述SNP位点鉴定甘薯的薯块中是否含有花青素的方法，所述方法包括检测SNP位点chr12.20497784，以确定待检测甘薯该SNP位点处的基因型为GG，GA或AA；所述基因型为GG时，薯块不含有花青素；所述基因型为GA或者AA，薯块含有花青素。
本发明所提供的鉴定方法，具体包括以下步骤：
（1）将提取的DNA样品稀释至20ng/μl后作为PCR模板，进行单一扩增；
（2）将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，300V电压下12分钟，获取鉴定胶图，通过胶图确定目的条带大小，将PCR产物进行纯化；
（3）纯化好的单一PCR产物待用，单碱基延伸引物稀释到10μM，进行SNaPshot PCR；
（4）纯化好的混合PCR产物待用，单碱基延伸引物稀释到10μM，将各位点的等体积单碱基延伸引物混合，得到Pooled Primers，进行SNaPshot PCR，
（5）进行毛细管检测。
进一步的，步骤（1）中，所述扩增体系及各组分如下：
进一步的，步骤（3）中，所述PCR体系及各组分如下：
进一步的，步骤（4）中，所述PCR体系及各组分如下：
本发明还提供了一种上述甘薯花青素相关SNP分子标记在甘薯育种中的应用。
本发明对甘薯杂交群体中代表性个体（30个花青素株系+30个不含花青素株系）进行重测序分析；由于甘薯目前还没有可用于参考的基因组，目前甘薯的基因组重测序是基于其近缘种三浅裂野牵牛（Ipomoea trifida）的基因组序列（http://sweetpotato.uga.edu/gt4sp_download.shtml，Ipomoea trifida (NSP306) GenomeAssembly (v3)），其标记的位点信息是三浅裂野牵牛的基因组位点，实验发现三浅裂野牵牛的基因组序列可以用于甘薯基因型分析。
本发明对上述1个SNP位点在杂交群体其他株系中，通过SNaPshot技术平台对SNP位点进行基因分型，验证这个SNP位点在杂交群体中的可信度；对上述1个SNP位点在自然群体中，通过SNaPshot技术平台对SNP位点进行基因分型，验证这个SNP位点在自然群体中的可信度。
本发明所指出的GA/AA基因型的株系薯块中含有花青素，是指其概率大于90%。
本发明提供的鉴定方法，在种子阶段通过提取胚的基因组DNA或实生苗幼苗期通过提取叶片基因组DNA，就能够预测将来发育的薯块是否是紫薯。同样，该方法也可以用来开发甘薯其他重要农艺性状的分子标记，这个方法较常规方法相比节省了费用和数据分析的时间。
本发明的有益效果为：
（1）本发明提供的鉴定方法，与常规群体株系全部重测序分析SNPs相比 具有数据量小，花费少等优点。
（2）本发明提供的方法，在种子阶段或实生苗幼苗期取叶片就可以通过SNaPshot技术平台对SNP位点进行基因分型验证植株薯块中是否含有花青素，与常规的在结薯之后才能知道植株薯块是否含有花青素相比，节省了育种时间。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1
SNaPshot技术实验方法
1、DNA提取
使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒（通用型），具体步骤如下：
1.1 将Spin Column置于Collection Tube中，加入250μl Buffer BL，12000 rpm/min离心1 min活化硅胶膜；
1.2 取样本干燥组织（不大于20 mg），加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5 ml离心管中，加入400μl Buffer gP1，涡旋振荡1 min，65℃水浴10 ~ 30 min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；
1.3 加入150μl Buffer gP2，涡旋振荡1 min，冰浴5 min；
1.4 12000 rpm/min离心5 min，将上清转移至新的离心管中；
1.5 加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入Spin Column中，12,000 rpm/min离心30 s，弃废液；
1.6 向Spin Column中加入500μl Buffer PW（使用前已加入无水乙醇）， 12000rpm/min离心30 s，弃废液；
1.7 向Spin Column中加入500μl Wash Buffer（使用前已加入无水乙醇），12000rpm/min离心30 s，弃废液；
1.8 重复操作步骤4.1.7；
1.9 将Spin Column放回Collection Tube中，12,000 rpm/min离心2 min，开盖晾干1 min；
1.10 取出Spin Column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50 ~100μl TE Buffer（65℃预热TE Buffer），20 ~ 25℃放置2 min，12,000 rpm/min 离心2 min。
2、引物设计原则
2.1 外围引物设计原则
引物长度在15—30bp，其有效长度一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度，从而降低产物的特异性。GC含量应在40%一60%之间，最适Tm值在58—60℃。引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
2.2 单碱基延伸引物设计原则
引物长度在15—30bp，GC含量在40%一60%之间，最适Tm值在58—60℃。为了能够分辨不同SNP的不同基因型，可在引物的5'末端加上不同长度的PolyC或PolyT，使各条引物以长度区分。加尾后的引物最短设计为36bp，相邻两个SNP位点引物的长度一般相差4-6个核苷酸。
3、外围扩增
提取的DNA样品稀释至20ng/μl后作为PCR模板，以擎科1.1×T3 Super PCR Mix进行扩增，进行单一扩增，按以下扩增体系和程序进行扩增，扩增体系及各组分如表1所示。
表1
以上扩增体系按以下扩增程序扩增，扩增程序如表2所示。
表2
4、电泳检测
将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（2μl样品+6μl溴酚蓝），300V电压下12分钟，获取鉴定胶图，通过胶图确定目的条带大小。
5、PCR产物纯化
5.1 单一PCR产物纯化
5.1.1 PCR产物取10μl加入1.2mL 96孔平口板中，加入100μl的Buffer GL，盖上硅胶膜， 65℃水浴7min ；
5.1.2 揭开硅胶垫，用连续加液器每孔加入10μl已经混匀的磁珠，盖上硅胶垫，震荡1min，水平震荡仪800rpm震荡5min，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min；
5.1.3 弃废液，加入300μl W1，盖上硅胶垫，涡旋震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min；
5.1.4 弃废液，加入500μl W2，盖上硅胶垫，涡旋震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min；
5.1.5 弃废液，倒离心至500rpm，离心结束后取下磁力架，加入25μl的TE Buffer，盖上封口膜，水平振荡10s，65℃水浴5min，水平振荡2min；
5.1.6 水平振荡后取下离心至1000rpm 1min，即所得纯化后PCR产物。
5.2 混合PCR产物纯化
5.2.1 所有样品各位点PCR产物各取10μl加入1.2mL 96孔平口板中，加入混合PCR产物5倍体积的Buffer GL，盖上硅胶膜， 65℃水浴7min ；
5.2.2 揭开硅胶垫，用连续加液器每孔加入10μl已经混匀的磁珠，盖上硅胶垫，震荡1min，水平震荡仪800rpm震荡5min，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min；
5.2.3 弃废液，加入300μl W1，盖上硅胶垫，涡旋震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min；
5.2.4 弃废液，加入500μl W2，盖上硅胶垫，涡旋震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min；
5.2.5 弃废液，倒离心至500rpm，离心结束后取下磁力架，加入25μl的TE Buffer，盖上封口膜，水平振荡10s，65℃水浴5min，水平振荡2min；
5.2.6 水平振荡后取下离心至1000rpm 1min，即所得纯化后PCR产物。
6、SNP位点单碱基延伸
6.1 单一SNP位点单碱基延伸
纯化好的单一PCR产物待用，单碱基延伸引物稀释到10μM，进行SNaPshot PCR，PCR体系及各组分如表3所示。
表3
6.2 混合SNP位点单碱基延伸
纯化好的混合PCR产物待用，单碱基延伸引物稀释到10μM，将各位点的等体积单碱基延伸引物混合，得到Pooled Primers，进行SNaPshot PCR，PCR体系及各组分如表4所示。
表4
以上扩增体系均按以下扩增程序进行SNaPshot单碱基延伸反应，反应条件如表5所示。
表5
7、毛细管检测
7.1 将HiDi与GS120LIZ按100：1混合，配成mix。
7.2 用96孔PCR反应板分装mix，每个孔中加入10μl mix。
7.3 对应着在96孔板中加入1μl样品模板，离心到4000 rpm即停。
7.4 用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5分钟，拿出后立即放入-20℃。
7.5 冷却后拿出，4000 rpm离心，解冻、混匀。
7.6 上3730测序仪进行毛细管电泳。
效果实施例
（一）利用本发明提供的鉴定方法，对现有的甘薯品种进行检验，具体结果见表6。
表6
序列表
<110> 山东省农业科学院作物研究所
<120> 一种甘薯花青素相关SNP分子标记、鉴定及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<220>
Claims (10)
1.一种甘薯花青素相关SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记为SNP位点（chr12.20497784），基因型为GG，GA，AA。
2.根据权利要求1所述的甘薯花青素相关SNP分子标记，其特征在于，所述基因型为GG时，薯块不含有花青素；所述基因型为GA或者AA，薯块含有花青素。
3.根据权利要求1所述的甘薯花青素相关SNP分子标记，其特征在于，所述SNP位点基因分型检测中，涉及PCR扩增反应；PCR扩增反应中扩增引物P1、P2的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.1 、SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的甘薯花青素相关SNP分子标记，其特征在于，所述SNP位点检测中，涉及单碱基延伸反应；单碱基延伸反应中延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一种利用权利要求1-4任一项所述的SNP位点鉴定甘薯的薯块中是否含有花青素的方法，其特征在于，所述方法包括检测SNP位点chr12.20497784，以确定待检测甘薯该SNP位点处的基因型为GG，GA或AA；所述基因型为GG时，薯块不含有花青素；所述基因型为GA或者AA，薯块含有花青素。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）将提取的DNA样品稀释至20ng/μl后作为PCR模板，进行单一扩增；
（2）将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，300V电压下12分钟，获取鉴定胶图，通过胶图确定目的条带大小，将PCR产物进行纯化；
（3）纯化好的单一PCR产物待用，单碱基延伸引物稀释到10μM，进行SNaPshot PCR；
（4）纯化好的混合PCR产物待用，单碱基延伸引物稀释到10μM，将各位点的等体积单碱基延伸引物混合，得到Pooled Primers，进行SNaPshot PCR，
（5）进行毛细管检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述扩增体系及各组分如下：
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述PCR体系及各组分如下：
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述PCR体系及各组分如下：
10.一种如权利要求1-4任一项所述的甘薯花青素相关SNP分子标记在甘薯育种中的应用。
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