CN114262678A - 一种发酵乳杆菌Pm007及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵乳杆菌及其应用。本发明分离得到发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)Pm007,保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、保藏编号为CCTCC NO:M 2021930。发酵乳杆菌Pm007可以抑制肠道有害菌生长,改善肠道菌群,对肠道疾病,例如炎症性肠病,特别是溃疡性结肠炎或克罗恩病,具有优异的抵抗力,且无毒副作用,具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,具体涉及一种发酵乳杆菌Pm007及其应用,特别是在预防和/或治疗炎症性肠病中的应用。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)为累及回肠、直肠、结肠的一种特发性肠道炎症性疾病。溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)与克罗恩病(CD)是IBD的两种主要类型。目前公认的IBD发病机制假说是遗传、环境因素和宿主免疫系统之间的复杂相互作用导致免疫反应异常和慢性肠道炎症。人类肠道中有一个复杂而丰富的微生物聚集区,统称为肠道微生物区系。肠道微生物区系具有与营养、免疫系统和宿主防御相关的生理功能。新一代测序技术的最新进展已经确定了IBD肠道微生物区系组成和功能的改变,这被称为生态失调。临床和实验数据提示,生态失调可能在IBD的发病机制中起着关键作用(Nishida,A.et al.Gut microbiota in the pathogenesis of inflammatory boweldisease.Clinical Journal of Gastroenterology 11,1-10(2017);Franzosa,E.A.etal.Gut microbiome structure and metabolic activity in inflammatory boweldisease.Nat Microbiol 4,293-305(2019))。
尽管生物制剂和免疫抑制剂为IBD患者带来了新的希望,但是前者的昂贵费用及后者的不良反应仍是当前IBD治疗的软肋。微生态治疗有望成为治疗IBD的绿色手段,其中益生菌和粪便菌群抑制(fecal microbiota transplantation,FMT)为主要的两种手段。FMT是指将健康人粪便中的功能菌群移植到患者胃肠道内以重建其肠道菌群并治疗疾病的一种治疗措施。部分临床研究证明FMT治疗IBD安全、有效,但其在机制方面、适应症和安全性方面存在一定的局限性。益生菌可加强肠屏障功能及粘膜免疫调节等而发挥作用,但传统的益生菌的治疗作用有限(付一鸣,戴世学,沙卫红.益生菌治疗炎症性肠病的机制研究进展[J].中华消化杂志,2019:210-213.)。
发明内容
为克服现有技术的不足,本发明提供一种发酵乳杆菌及其在预防和/或治疗炎症性肠病中的应用。
在本发明第一方面,提供一种发酵乳杆菌Pm007,该菌株已于2021年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:中国武汉,武汉大学),保藏编号为CCTCC NO:M2021930。
在本发明第二方面,提供一种组合物,其包含发酵乳杆菌Pm007、其培养物、其菌悬液或其裂解物,以及一种或多种辅料。
特别是,该组合物包含发酵乳杆菌Pm007以及一种或多种辅料。
具体地,在该组合物中,发酵乳杆菌Pm007为活菌或非活菌,特别是活菌。
具体地,该组合物还可以含有其他益生菌和/或益生元,例如,其他对调节肠道菌群稳态,预防和治疗炎症性肠病等肠道疾病的发生有益的微生物和/或益生元。
根据组合物的用途,该组合物可以为药物组合物、食品组合物、膳食补充剂组合物、饲料添加剂组合物或饲料组合物等产品形式。
具体地,上述药物组合物包含发酵乳杆菌Pm007、其培养物、其菌悬液或其裂解物(特别是发酵乳杆菌Pm007活菌),以及一种或多种药学上可接受的辅料。
具体地,该药学上可接受的辅料可以为,例如,但不限于,填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂、包衣剂、酸度调节剂、防腐剂、稀释剂、悬浮液稳定剂等中的一种或多种。
具体地,该药物组合物可以为任何合适的剂型,特别是口服剂型,例如,液体制剂(如混悬剂、乳剂、糖浆剂等)、固体制剂(如粉剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂等),等。
在本发明的一些实施例中,该药物组合物为液体制剂,其中发酵乳杆菌Pm007为活菌,其有效活菌数≥1×109CFU/mL,例如,1×109至10×109CFU/mL,5×109CFU/mL。
具体地,上述食品组合物为人类日常摄取的食品,其可以为直接添加发酵乳杆菌Pm007、其培养物、其菌悬液或其裂解物(特别是发酵乳杆菌Pm007活菌)的食品组合物,也可以为添加发酵乳杆菌Pm007后经过发酵生产的食品组合物。
具体地,该食品组合物可以为乳制品(如发酵乳、酸奶、炼乳、奶油、干酪、风味乳制品等)、豆制品(如豆浆、豆腐乳、豆豉、豆酱、酸豆浆等)、果蔬制品(如果蔬饮料、腌制产品(如泡菜、酸菜))、肉制品、调味品等。
具体地,该食品组合物的形式可以采用任意的形式,如,糖果(如压片糖果、凝胶糖果、胶基糖果等)、固体饮料(如粉末、颗粒等)、液体饮料等。
具体地,上述膳食补充剂组合物能调节人体的机能,但不以治疗疾病为目的,其包含发酵乳杆菌Pm007、其培养物、其菌悬液或其裂解物(特别是发酵乳杆菌Pm007活菌),以及一种或多种膳食补充剂辅料。
具体地,该膳食补充剂辅料可以为,例如,但不限于,填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂、包衣剂、酸度调节剂、防腐剂、稀释剂、悬浮液稳定剂等中的一种或多种。
具体地,该膳食补充剂组合物的形式可以采用任意的形式,如,片剂、丸剂、胶囊剂、糖果(如压片糖果、凝胶糖果、胶基糖果等)、固体饮料(如粉剂、颗粒剂等)、液体饮料等。
具体地,上述饲料添加剂组合物为在饲料(如家畜饲料、家畜饮用水、宠物日粮、宠物零食、宠物饮用水等)生产加工、使用过程中以少量或微量添加的物质,其包含发酵乳杆菌Pm007、其培养物、其菌悬液或其裂解物(特别是发酵乳杆菌Pm007活菌),以及一种或多种添加剂辅料。
具体地,该添加剂辅料可以为,例如,但不限于,填充剂、粘合剂、润湿剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、崩解剂、着色剂、包衣剂、酸度调节剂、稀释剂、悬浮液稳定剂、防腐剂等中的一种或多种。
具体地,该饲料添加剂组合物的形式可以采用任意的形式,如,片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、液体剂等。
具体地,上述饲料组合物为人类日常喂饲动物(例如宠物、家畜)的饲料,例如,家畜饲料、宠物日粮、宠物零食等,其可以为直接添加发酵乳杆菌Pm007、其培养物、其菌悬液或其裂解物(特别是发酵乳杆菌Pm007活菌)的饲料组合物,也可以为添加发酵乳杆菌Pm007后经过发酵生产的饲料组合物。
在本发明第三方面,提供发酵乳杆菌Pm007、其培养物、其菌悬液或其裂解物在制备预防和/或治疗肠道疾病的药物中的应用。
具体地,该肠道疾病可以选自十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠或直肠疾病,特别是累及回肠、直肠、结肠的肠道疾病。
在本发明一个实施方案中,该肠道疾病为肠道肿瘤,例如,但不限于,结肠癌、直肠癌。
在本发明另一个实施方案中,该肠道疾病为炎症性肠病,例如,但不限于,溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD);具体地,该炎症性肠病可以为慢性炎症性肠病或急性炎症性肠病,特别是急性炎症性肠病,例如急性溃疡性结肠炎。
具体地,该肠道疾病的症状选自:腹痛、腹泻、便血、呕吐、里急后重、隐窝脓肿,以及体重减轻、发热、贫血、低蛋白血症、电解质异常、息肉、肠穿孔等中的一种或多种。
具体地,治疗作用可以为,改善上述肠道疾病症状中的一种或多种,降低肠道疾病的复发率,甚至完全治愈该肠道疾病。
具体地,预防作用可以为,降低肠道疾病的发生率,甚至完全避免患该肠道疾病。
在本发明第四方面,提供一种预防和/或治疗肠道疾病的方法,其包括向有此需求的受试者施用发酵乳杆菌Pm007、其培养物、其菌悬液或其裂解物(特别是发酵乳杆菌Pm007活菌),或本发明第二方面所述药物组合物的步骤。
具体地,肠道疾病、治疗作用、预防作用具有本发明第三方面中所述定义。
具体地,该受试者可以为哺乳动物,特别是人类。
在本发明第五方面,提供一种调节肠道菌群稳态的方法,其包括向有此需求的受试者施用发酵乳杆菌Pm007、其培养物、其菌悬液或其裂解物(特别是发酵乳杆菌Pm007活菌),或本发明第二方面所述食品组合物、膳食补充剂组合物或饲料添加剂组合物、饲料组合物的步骤。
具体地,该调节肠道菌群稳态的方法为非疾病预防或治疗目的。
具体地,该受试者可以为哺乳动物,例如,人类、家畜(如猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼等)、宠物(如狗、猫、兔、鼠(如豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠等))、实验动物(如猴、狗、兔、猫、鼠(如小鼠、大鼠)等)等,特别是人类。
本发明分离得到发酵乳杆菌Pm007,其可以抑制肠道有害菌生长,改善肠道菌群,对肠道疾病,例如炎症性肠病,特别是溃疡性结肠炎或克罗恩病,具有优异的抵抗力,且无毒副作用,具有重要的应用价值。
本发明中所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)Pm007已于2021年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:中国武汉,武汉大学),保藏编号:CCTCC NO:M2021930。
附图说明
图1所示为生理盐水-DSS对照组、发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠在DSS诱导肠炎期间体重变化曲线。
图2所示为生理盐水-DSS对照组、发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠在DSS诱导肠炎期间粪便评分曲线。
图3所示为生理盐水-DSS对照组、发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠第11天小鼠结肠的长度。
图4所示为生理盐水-DSS对照组、发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠远端结肠H&E染色显示肠道上皮破坏情况。
具体实施方式
除非另有定义,本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
如本发明中所用,术语“培养物”是指一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物,特别是指经人工接种和培养后,生长有微生物(发酵乳杆菌Pm007)群体的液体或固体培养基。
如本发明中所用,术语“菌悬液”是指含有微生物(发酵乳杆菌Pm007)细胞的悬浮液。
如本发明中所用,术语“裂解物”是指微生物(发酵乳杆菌Pm007)细胞裂解后所得产物。
如本发明中所用,术语“治疗”包括在疾病发作之后,根除、移除、逆转、缓解、改变或控制疾病。
如本发明中所用,术语“预防”指在疾病发作之前,通过治疗以避免、最小化或令疾病或状况难于发作或发展的能力。
如本发明中所用,术语“患者”或“受试者”等等在本文中可交换使用,是指根据本文所述的方法处理的任何动物或其细胞,不论是体外或原位。具体地,前述动物包括哺乳动物,例如,人类、家养动物(即由人类饲养驯化,且可以人为控制其繁殖的动物,用于例如食用、劳役、毛皮、宠物、实验等功能,例如经济动物、宠物、实验动物等),特别是人类。
本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书,其公开内容通过引用整体并入本文。
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1:发酵乳杆菌Pm007可以减轻小鼠DSS诱导肠炎表型
(1)准备WT小鼠
从上海灵畅公司购买30只8周龄的野生型BL/C57小鼠,饲养于SPF屏障系统内,适应一周后将小鼠随机分成3组,分别为生理盐水-DSS对照组(阴性对照组)、发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组(阳性对照组)。
(2)发酵乳杆菌Pm007肠道定植
将发酵乳杆菌Pm007和鼠李糖乳杆菌LGG接种于液态MRS培养基中,于37℃条件下厌氧、静置培养20-22h,然后8000rpm离心5min收集菌体,用生理盐水洗涤两次后,再将细菌重悬于生理盐水中,终浓度约5×109CFU/mL。按照每只小鼠200μL菌的剂量灌胃处理WT小鼠,隔天重复处理,持续2周,同时生理盐水-DSS对照组仅进行生理盐水灌胃处理。2周的灌胃处理结束后,小鼠即可进行诱导肠炎实验,诱导肠炎期间仍隔天灌胃相同菌量。
(3)建立小鼠DSS诱导肠炎模型
将生理盐水-DSS对照组、发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠饮水换成3%(质量%)葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液,处理9天后换成正常饮水至实验结束。即,DSS诱导肠炎的第1-9天,生理盐水-DSS对照组和发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠饮用3%DSS水溶液,第10-12天饮用普通饮用水。
诱导肠炎的第1-12天记录小鼠体重变化、粪便干稀度、便血情况。粪便评分:0,固态大便;1,固态大便,易变形;2,不成形大便;3,液体状大便。小鼠的体重变化的对比如图1所示,粪便评分的对比如图2所示。
根据该图可得知生理盐水-DSS对照组、发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠饮用DSS后均出现体重减轻,说明DSS肠炎诱导是成功的。进一步比较,发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠体重减轻幅度显著小于生理盐水-DSS组,发酵乳杆菌Pm007-DSS组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠体重减轻幅度差异不显著;同时发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠粪便评分显著低于生理盐水-DSS组,发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠粪便评分差异不显著,说明发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠肠炎症状较生理盐水-DSS组有显著改善。
DSS处理第12天,颈椎脱臼法处死小鼠,取出小鼠结肠部分,测量其长度,所得结果如图3所示。取远端结肠组织1cm左右肠断进行福尔马林固定,并后续进行HE染色和组织形态徐分析,所得结果如图4所示。
根据图3,可得知:DSS诱导肠炎模型中,发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠肠道长度分别为(6.62±0.19cm)和(6.52±0.53cm),显著长于生理盐水-DSS组小鼠(5.2±0.35cm);根据图4,可得知:发酵乳杆菌Pm007-DSS处理组和鼠李糖乳杆菌LGG-DSS对照组小鼠肠道上皮细胞仍可以看到较完整的隐窝结构,而生理盐水-DSS对照组小鼠肠道上皮则完全被破坏,无完整的隐窝结构。此图从形态学上反映出发酵乳杆菌Pm007-DSS组小鼠肠炎发病显著降低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换等,均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。
Claims (10)
1.一种发酵乳杆菌Pm007,其保藏编号为CCTCC NO:M 2021930。
2.一种组合物,其包含权利要求1所述的发酵乳杆菌Pm007、其培养物、其菌悬液或其裂解物,以及一种或多种辅料。
3.如权利要求2所述的组合物,其特征在于,所述组合物选自:药物组合物、食品组合物、膳食补充剂组合物、饲料添加剂组合物、饲料组合物。
4.如权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述药物组合物包含发酵乳杆菌Pm007活菌,以及一种或多种药学上可接受的辅料;
优选地,所述药学上可接受的辅料选自:填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂、包衣剂、酸度调节剂、防腐剂、稀释剂、悬浮液稳定剂中的一种或多种;
更优选地,所述药物组合物为口服剂型,所述药物组合物为液体制剂或固体制剂;
更优选地,所述药物组合物为液体制剂,其中发酵乳杆菌Pm007的有效活菌数≥1×109CFU/mL。
5.如权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述食品组合物为直接添加发酵乳杆菌Pm007的食品组合物,或添加发酵乳杆菌Pm007后经过发酵生产的食品组合物;
更优选地,所述食品组合物为乳制品(如发酵乳、酸奶、奶油、干酪等)、豆制品(如豆乳、豆腐乳、豆豉、豆酱等)、果蔬制品(如果蔬饮料、腌制产品(如泡菜、酸菜))、肉制品、调味品;
更优选地,所述食品组合物为糖果、固体饮料或液体饮料。
6.如权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述膳食补充剂组合物包含发酵乳杆菌Pm007活菌,以及一种或多种膳食补充剂辅料;
优选地,所述膳食补充剂辅料选自:填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂、包衣剂、酸度调节剂、防腐剂、稀释剂、悬浮液稳定剂中的一种或多种;
更优选地,所述膳食补充剂组合物为片剂、丸剂、胶囊剂、糖果、固体饮料、液体饮料。
7.权利要求1所述的发酵乳杆菌Pm007、其培养物、其菌悬液或其裂解物在制备预防和/或治疗肠道疾病的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述肠道疾病为炎症性肠病或肠道肿瘤。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。
10.一种调节肠道菌群稳态的方法,其包括向有此需求的受试者施用权利要求1所述的发酵乳杆菌Pm007、其培养物、其菌悬液或其裂解物,或权利要求5-6任一项所述的组合物的步骤。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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