CN114259458A

CN114259458A - 一种具有抗衰功效的超氧化物岐化酶可溶性微针贴片

Info

Publication number: CN114259458A
Application number: CN202210001753.9A
Authority: CN
Inventors: 董亮; 陈永丽; 张山; 张艳艳; 甘淼
Original assignee: Shanghai Chenyang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Chenyang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-01-04
Filing date: 2022-01-04
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2042-01-04
Also published as: CN114259458B

Abstract

本发明公开了一种具有抗衰功效的超氧化物岐化酶可溶性微针贴片，属于生物技术领域。所述具有抗衰功效的超氧化物岐化酶可溶性微针贴片，包括背衬层和针尖层；所述针尖层由阵列排布于背衬层上的可溶性微针组成，可溶性微针内装载SOD。可直接突破角质层生理屏障进入皮下组织，提高经皮制剂储存和运输的稳定性，并使SOD的经皮输送更高效和便捷。与其它可溶性微针制作工艺相比，本发明利用冷冻干燥技术可以保证SOD在制作过程中不失活。

Description

一种具有抗衰功效的超氧化物岐化酶可溶性微针贴片

技术领域

本发明涉及一种具有抗衰功效的超氧化物岐化酶可溶性微针贴片，属于生物技术领域。

背景技术

已有研究表明，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是一种金属酶，是机体抗氧化防御系统的重要成员之一，可以特异性催化超氧阴离子(O₂ ^-)自由基歧化生成O₂和H₂O₂，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。H₂O₂在过氧化物酶的催化下生成O₂和H₂O的抗氧化性可以抑制过氧化氢的形成，清除自由基的产生。故SOD具有超强的抗氧化性能，微量即可清除超氧阴离子自由基，羟自由基清除效果较好，因而具有较好的抗衰老、抗炎等效果。

SOD在人体中主要有三种存在形式，SOD1或CuZn-SOD，是第一个被鉴定的SOD酶，为一种含铜和锌的同源二聚体，几乎只在细胞胞浆间隙(细胞质)中发现；SOD2或Mn-SOD，以四聚体形式存在，最初合成时含有一个前导肽，前导肽选择性的使这种含锰SOD酶导向线粒体空间，成熟的Mn-SOD存在于线粒体中。与Cu/Zn-SOD基因相比，Mn-SOD基因更易被诱导表达，能够迅速响应外界氧化应激表达Mn-SOD酶，是机体抗氧化防御的主要组员，对于机体维护自身氧化还原平衡，防御病原体感染中至关重要。

鉴于SOD的上述特性，SOD目前被广泛应用于美白、抗衰除皱等美容护肤领域。然而，SOD的分子量大，水溶性强，因此经皮效率十分有限。已有研究报道人的表皮细胞中的角质层细胞、成纤维细胞均能表达SOD的转运体，可以吸收和积累SOD，但仍然受到分子自身的限制达不到较高的经皮效率，因此极大地限制了其在美容护肤领域的应用。因此，亟须开发一种SOD的新剂型，提高其在制剂中的稳定性和经皮效率。

随着微加工技术的迅速发展，可溶性微针应运而生，并受到广泛的关注。可溶性微针是一种新型的物理促透技术，由多个微米级的细小微针以阵列的方式连接在基座上形成的。微针的基材可以是体内可溶可降解的多种生物医用高分子材料。微针的长度(25μm-1000μm)、大小和形状可根据治疗的需求进行个体化设计。作为一种新型透皮给药方式，可溶性微针给药集皮下注射给药方式和透皮贴给药的优点于一体，其制备材料和制备方法多种多样，具有良好的生物相容性、无痛微创、高效吸收、安全性高、药物释放灵活可控、方便安全、患者依从性好等优势，是目前研究最为广泛且最具应用前景的一类微针。可溶性微针透皮给药应用广泛，可用于小分子、生物制剂、疫苗、细胞内DNA/RNA等药物的透皮递送，囊括了美容、医药、医疗器械等多个疾病领域。

可溶性微针凭借其多样的形体结构和给药特点具有其它经皮方式不可替代的优势，在美容护肤等领域的应用和市场发展空间巨大。但是，SOD作为一种酶来说，具有有机溶剂耐受性差、表面活性剂耐受性差、易于高温降解等特点，将其与可溶性微针技术结合时，还存在对制作工艺要求苛刻、和保存运输困难等问题。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是，提供一种能够保证SOD稳定性、具有高效抗衰能力的可溶性微针贴片及其制备方法。

[技术方案]

本发明提供一种具有抗衰功效的超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，SOD)可溶性微针贴片，包括背衬层和针尖层；所述针尖层由阵列排布于背衬层上的可溶性微针组成，可溶性微针内装载SOD。

所述贴片的大小和形状可以根据用户的需求以及作用部位进行定制，如针对面部法令纹可以为椭圆状，针对颈纹可为长条状，这对鱼尾纹可为多边形等。

所述可溶性微针的底部直径40-400μm，高度为200-1000μm，针尖直径为1-20μm。相邻可溶性微针的之间的间距(中心之间)为100-3000μm，一个边长1.2～1.5cm的贴片上可排布50-5000根微针。单个微针的形状为四棱锥形、圆锥形或其它不规则锥形体。

所述SOD的种类可以是SOD1、SOD2、SOD3及其它所有亚型中的一种或几种，SOD的来源包括动植物提取，以及微生物发酵的方法获得的SOD。SOD的负载量为10ng-10μg，每个贴片中SOD酶活为5IU-5000IU。

所述可溶性微针内除了装载SOD，还可以同时装载其它具有抗衰功效成分的一种或多种复配成分，例如麦角硫因、依克多因、维生素C、辅酶Q10、谷胱甘肽、蓝铜胜肽、维生素E、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-烟酰胺单核苷酸、二裂酵母细胞溶液提取物、视黄醇A、肌肽、硫辛酸、白藜芦醇、阿魏酸、胶原蛋白等。

所述针尖层的基材可根据所需药物的释放速率选择合适的具有较高安全性的生物医用高分子。包括：明胶、纤维素及衍生物、淀粉类、壳聚糖、葡聚糖、透明质酸钠、海藻酸钠、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、麦芽糖、聚乙二醇、聚氨基酸、聚酯、环糊精、丝素蛋白、角蛋白、胶原蛋白等生物医用高分子中的至少一种。

所述背衬层(基座)的材料是具有一定的可塑性及与皮肤具有较好的兼容性的透皮贴剂膜材，可以为PE膜、PVC膜、PET膜、EVA膜、PU膜、PSA膜、PVA膜以及PVA/PVP复合膜等。

本发明还提供制备所述具有抗衰功效的SOD可溶性微针贴片的方法，包括以下步骤：

(1)将一种或者几种针尖层基材加入到溶剂中，于室温搅拌混匀，得到分散体系A；

(2)将占分散体系A的质量分数为0.1％-10％SOD或SOD与其它抗衰成分的复配物加入到分散体系A中，搅拌分散均匀，除去气泡得到针尖成型液；

(3)将所述针尖成型液倒入到微针模具中，在模具内形成的液层厚度为0.05-0.15毫米；

(4)将模具放置于-20℃～-5℃预处理5-8h，然后放置于冷冻干燥仪器中，1000mbar～0.01mbar条件下-20℃～-70℃冷冻干燥10-24h；

(5)取出微针模具，覆盖背衬层，最终剥离得到一种具有抗衰功效的超耐热SOD可溶性微针贴片。

所述步骤(1)中，溶剂可以选择乙醇、水或者是乙醇-水混合溶剂，针尖层基材与溶剂的比例是0.05-0.8g/mL。

[有益效果]

本发明的可溶性微针将生物大分子SOD用生物医用高分子包裹形成固体制剂的形式，可直接突破角质层生理屏障进入皮下组织，提高经皮制剂储存和运输的稳定性，并使SOD的经皮输送更高效和便捷。

与其它可溶性微针制作工艺相比，本发明利用冷冻干燥技术可以保证SOD在制作过程中不失活。

与传统的化妆品制剂相比，本发明可以解决SOD及复配成分的经皮吸收问题，可溶性微针制剂的经皮吸收效率更高，效果更显著。

附图说明

图1是本申请实施例中SOD可溶性微针的结构示意图；其中，1-背衬层、2-针尖层、21-SOD及复配成分。

图2是本申请实施例中SOD可溶性微针的实物图。

图3是本发明的SOD可溶性微针的透皮效率示意图。

图4是本发明的SOD可溶性微针作用于衰老皮肤成纤维细胞的半乳糖苷酶染色效果。

图5是本发明的SOD微针作用于衰老皮肤成纤维细胞的ROS染色效果。

具体实施方式

实施例1具有抗衰功效的超氧化物岐化酶可溶性微针贴片的制备方法

如图1所示，本实施例的可溶性微针包括背衬层1和针尖层2。所述针尖层2中含有SOD21，所述针尖层2最终作用并停留在皮下组织。

如图2所示，整个贴片为边长1.2cm～1.5cm的正方形，可溶性微针在背衬层1上呈阵列10×10分布，微针高度500μm，每根微针针尖直径为5-10μm、针座直径为200μm，针尖之间距离为800μm)。

所述背衬层采用PET膜，所述微针针尖层的基材为明胶，所述明胶内部均匀分散有

SOD；其中，明胶和

SOD的用量比例为99重量份的明胶和1重量份的SOD。

本实施例的SOD可溶性微针的制备方法包括以下步骤：

(1)将99mg的明胶加入1mL水中，室温超声15min溶解，得到分散体系A；

(2)将1mg的

SOD加入分散体系A中，搅拌分散均匀，除去气泡得到分散体系B；

(3)将分散体系B加入到材料为PDMS的微针模具中，-20℃处理8h，冷冻干燥12h；

(4)贴入背衬层PCT膜材，轻轻剥离贴片脱模，得到SOD可溶性微针贴片(图1)。

实施例2超氧化物岐化酶可溶性微针贴片的载药量和体外经皮扩散

均一载药和高效的给药效率才能保证SOD可溶性微针贴片具有很好的应用价值，因此，申请人进行了SOD可溶性微针的透皮效率研究。

参照实施例1，将SOD更换成FITC-SOD，制备FITC-SOD可溶性微针贴片，以便于用荧光定量的方法对SOD的经皮效率进行系统实时定量和评价。

在实验之前，对新鲜猪皮进行预处理，包括：脱毛、去脂、以及去除表面污垢。在通风处，将1片(1.5×1.5cm)干燥的可溶性FITC-SOD微针贴片垂直按压在猪皮表面并保持2min，将猪皮沿着微针贴片周围裁切成3×3cm，以便适应Franz扩散池的口径。随后转移到Franz体外透皮扩散池中，水浴温度为32℃，搅拌转速为600rpm，透皮面积为1cm²。接收池体积为6ml，接收池为pH7.2的PBS溶液。分别于30min、4h、8h、12h、16h、24h吸取全部样品，更换为同温度同体积的空白接收液。将吸取的样品溶液于96孔板中，设置3个复孔，每孔溶液200μl，在酶标仪下对荧光进行定量，FITC的激发波长为488nm。

本实施例的FITC-SOD的累积经皮量线性关系为y＝48.85x+40.5；R²＝0.998(x为荧光值，y为经皮量)。SOD的经皮效率(Transdermal efficiency,TE)的计算公式为TE＝累积透皮量/SOD负载量*100％。通过检测、计算得该微针贴片的SOD负载量为1μg。如图3所示，经皮效率随着时间增加，30min、4h、8h、12h、16h、24h的经皮效率分别为10％、20％、32％、48％、55％、61％，比传统的载药方式经皮效果更高效。

实施例3超氧化物岐化酶可溶性微针贴片的体外抗衰评价

活性氧(ROS)在有氧呼吸及机体活动ATP生成过程中发挥重要的作用，ROS在生理情况下具有抗菌作用在宿主防御和免疫调节中发挥作用，其副产物包括超氧阴离子(O2^-)和H₂O₂。但是，当ROS过多地蓄积时会被认为是机体的一个危险信号和致病因素。ROS产生的超氧阴离子(O₂ ^-)的积累会导致机体氧化应激的风险，这些自由基可攻击生物大分子，使其交联或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏。因此ROS与机体衰老相关疾病的发生和发展密切相关。

本实施例针对实施例1制备的SOD可溶性微针贴片，进行了皮肤成纤维细胞的抗衰作用实验。具体实验方法和结果如下：

1.H₂O₂诱导的细胞衰老模型的构建

构建前，将生长良好的皮肤成纤维细胞HFF-1均匀地接种在12孔板中，待细胞生长至密度为50％～60％时，使用100μM H₂O₂的基础培养基(基础培养基的配方是HyClone DMEM高糖液体培养基(货号:SH30022.01))刺激细胞3-5小时。接着用β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒(碧云天，RG0039)确定细胞的衰老状态及程度。

2.SOD可溶性微针贴片的刺激

吸除12孔板内含过氧化氢的基础培养基，将不同负载量的SOD可溶性微针贴片溶解于培养基(培养基的配方是HyClone DMEM高糖液体培养基(货号:SH30022.01))中，每板应有三个以上空白孔加入不含SOD的空白微针培养基溶液作为空白组。重新放置孔板于细胞培养箱中37℃培养24小时。

3.β-半乳糖苷酶染色

(a)染色工作液配制比例见表1(使用碧云天生物科技有限公司出售的细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(产品编号:C0602)。

表1

β-半乳糖苷酶染色液A	1％
		β-半乳糖苷酶染色液B	1％
β-半乳糖苷酶染色液C	93％
		X-Gal溶液	5％

(b)染色方法

吸除空板内的细胞培养液，用PBS洗涤1次，加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min。随后吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞2-3次，每次3min。吸除PBS，每孔加入1ml染色工作液，封口膜封住孔板防止溶液蒸发，于37℃恒温孵育箱放置过夜。普通倒置光学显微镜下观察拍照。如不能及时观察，可以去除染色工作液，加入2ml PBS，4℃保存数天；或者加上封片液封片可在4℃下保存较长时间。

如图4所示，空白组组经H₂O₂的衰老的成纤维细胞HFF-1的蓝紫色现象明显，表明衰老细胞模型的构建成功。随着不同浓度SOD的加入，蓝紫色物质减少，5000IU/ml SOD组中基本没有蓝紫色现象，细胞形态恢复成正常的成纤维状态，表明SOD有显著的抗皮肤细胞衰老的功效，并且与浓度呈正相关的关系。

4.ROS水平

应用活性氧检测试剂盒(碧云天，S0033S)检测给药后细胞的ROS水平。根据实施例3中的步骤1和2完成衰老细胞模型的构建和SOD微针溶液的刺激后，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μM。去除细胞培养液，加入0.5ml稀释好的DCFH-DA。37℃细胞培养箱内孵育20min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，每次3min，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用荧光倒置显微镜检测其ROS水平，488nm激发波长，525nm发射波长。

如图5所示，空白组衰老的成纤维细胞HFF-1绿色荧光较高，表明产生的ROS水平较多。随着SOD浓度的增加，绿色荧光降低，ROS水平降低，证明了SOD可以显著地降低皮肤成纤维细胞的ROS水平。

对比例1对比SOD粉末和SOD可溶性微针贴片的储存稳定性

将实施例1所制备得到的SOD可溶性微针贴片及SOD粉末放置在阴凉干燥的室温中，该SOD可溶性微针贴片的酶活为2000IU，SOD粉末酶活为50000IU/g，在12小时、24小时、2天、5天、7天、30天、60天分别取1个SOD可溶性微针贴片和40mg SOD粉末溶解于1ml蒸馏水中得到待测样品，利用邻苯三酚法(NBT)检测SOD酶活，每个样品重复测试三次，最终取平均值。

具体酶活测定方法如下：

(A)NBT/酶工作液的配制:按照每个反应160μl的体积配置适量的NBT/酶工作液。均匀混合158μl SOD检测缓冲液、1μl NBT和1μl酶溶液，即可配置成160μl NBT/酶工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配置适量的NBT/酶工作液。

(B)反应启动工作液的配制：把试剂盒(碧云天，产品编号:C0602)中的反应启动液(40X)融解后混匀，按照每1μl反应启动液(40X)加入39μl SOD检测缓冲液的比例进行稀释，混匀后即为反应启动工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配置适量的反应启动工作液。配制好的反应启动工作液4℃或冰浴保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

(C)样品测定：参考下表使用96孔板设置样品孔和各种空白对照孔。并按下表依次加入待测样品和其它各种溶液。加入反应启动工作液后充分混匀。在37℃条件下反应30min，在560nm条件下测吸光值。

表2

	样品	空白对照1	空白对照2	空白对照3
					待测样品	20μl	/	/	20μl
SOD检测缓冲液	/	20μl	40μl	20μl
					NBT/酶工作液	160μl	160μl	160μl	160μl
反应启动液	20μl	20μl	/	/

待测样品中总SOD活力的计算：抑制百分率＝[(A_{空白对照1}－A_{空白对照2})－(A_待测样品－A_{空白对照3})]/(A_{空白对照1}－A_{空白对照2})×100％

检测体系中SOD酶活力单位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units。

结果如表3所示，SOD装载于微针贴片中能够2个月在常温放置条件中保持一致的酶活，而SOD粉末的放置在常温下放置一周后降低5％的酶活，一个月内酶活降低将近45％。

表3 SOD粉末和SOD可溶性微针贴片的储存稳定性

时间	SOD微针贴片(IU/ml)	SOD粉末(IU/ml)
			12小时	1975	1978
24小时	1980	1968
			2天	1970	1965
5天	1968	1950
			7天	1970	1865
14天	1972	1280
			30天	1970	1075
60天	1968	740

对比例2对比三种制作方法对SOD酶活的影响

可溶性微针的制作方法主要有模具法、3D打印法、液滴拉升法等。其中，模具法因具有制作简单、可操作性强、批次稳定、容易大批量生产的优势，在实验室、生产车间等具有较为广泛的应用。本对比例以模具法为基本的制作途径，展现三种具体的制作方法，并对比该制作方法对SOD酶活的影响。具体如下：

(A)SOD聚合物溶液的制备：6g明胶溶液溶解于100ml蒸馏水中，加入5g PEG2000，充分搅拌混匀，得到澄清透明的聚合物溶液，在溶液中分散1g SOD粉末，最终SOD的酶活为500IU/ml。

(B)方法1：将准备好的可溶性微针贴片的模具用等离子体处理30s，将上述A获得的SOD聚合物溶液倒入模具，放置5min，使溶液充分进入模具的凹槽中；放入烘箱中40℃处理12h，脱模后得到SOD可溶性微针贴片。

(C)方法2：将准备好的可溶性微针贴片的模具用等离子体处理30s，将上述A获得的SOD聚合物溶液倒入模具，放置5min，使溶液充分进入模具的凹槽中；放入真空干燥箱中，常温真空干燥处理12h，脱模后得到SOD可溶性微针贴片。

(D)方法3：将准备好的可溶性微针贴片的模具用等离子体处理30s，将上述A获得的SOD聚合物溶液倒入模具，放置5min，使溶液充分进入模具的凹槽中；将模具放入冻干机当中，冷冻干燥12h，脱模后得到SOD可溶性微针贴片。

将B、C、D三种制作方法获得的SOD可溶性微针贴片溶解于200μl蒸馏水中，利用对比例1中的NBT法测定SOD的酶活。三种制备方法分别重复三个批次。理论上，SOD的酶活应为500IU/ml。

如表4所示，通过冷冻干燥获得的可溶性贴片的SOD酶活可以保持在91％以上，通过真空干燥获得的可溶性贴片SOD酶活在60％左右，而通过40℃脱水获得的可溶性贴片SOD酶活在10％左右。因此，制备工艺对SOD的酶活影响较大，且通过冷冻干燥的脱水方法是最能保证SOD酶活的一种可溶性微针贴片制备工艺。

表4三种方法获得的可溶性微针贴片中SOD酶活测定

SOD酶活检测	方法1	方法2	方法3
				第一批次	56IU/ml	298IU/ml	450IU/ml
第二批次	50IU/ml	300IU/ml	455IU/ml
				第三批次	45IU/ml	310IU/ml	464IU/ml
平均值	51IU/ml	303IU/ml	456IU/ml

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种具有抗衰功效的超氧化物岐化酶可溶性微针贴片，其特征在于，包括背衬层和针尖层；所述针尖层由阵列排布于背衬层上的可溶性微针组成，可溶性微针内装载超氧化物岐化酶。

2.根据权利要求1所述的一种具有抗衰功效的超氧化物岐化酶可溶性微针贴片，其特征在于，所述贴片的大小和形状根据用户的需求以及作用部位进行定制。

3.根据权利要求1所述的一种具有抗衰功效的超氧化物岐化酶可溶性微针贴片，其特征在于，所述可溶性微针的底部直径40-400μm，高度为200-1000μm，针尖直径为1-20μm。

4.根据权利要求1所述的一种具有抗衰功效的超氧化物岐化酶可溶性微针贴片，其特征在于，所述SOD的种类是SOD1、SOD2、SOD3及其它所有亚型中的一种或几种，SOD的来源包括动植物提取，以及微生物发酵的方法获得的SOD。

5.根据权利要求1所述的一种具有抗衰功效的超氧化物岐化酶可溶性微针贴片，其特征在于，所述可溶性微针内除了装载SOD，还同时装载其它具有抗衰功效成分的一种或多种复配成分，例如麦角硫因、依克多因、维生素C、辅酶Q10、谷胱甘肽、蓝铜胜肽、维生素E、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-烟酰胺单核苷酸、二裂酵母细胞溶液提取物、视黄醇A、肌肽、硫辛酸、白藜芦醇、阿魏酸、胶原蛋白等。

6.根据权利要求1所述的一种具有抗衰功效的超氧化物岐化酶可溶性微针贴片，其特征在于，所述针尖层的基材根据装载成分的释放速率选择合适的具有安全性的生物医用高分子；包括：明胶、纤维素及衍生物、淀粉类、壳聚糖、葡聚糖、透明质酸钠、海藻酸钠、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、麦芽糖、聚乙二醇、聚氨基酸、聚酯、环糊精、丝素蛋白、角蛋白、胶原蛋白等生物医用高分子中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的一种具有抗衰功效的超氧化物岐化酶可溶性微针贴片，其特征在于，所述背衬层的材料是具有可塑性及与皮肤具有较好的兼容性的透皮贴剂膜材；包括：PE膜、PVC膜、PET膜、EVA膜、PU膜、PSA膜、PVA膜以及PVA/PVP复合膜等。

8.制备权利要求1～7任一项所述具有抗衰功效的SOD可溶性微针贴片的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(4)将模具放置于-20℃～-5℃预处理5-8h，然后放置于冷冻干燥仪器中，1000mbar～0.01mbar条件下-30℃～-70℃冷冻干燥10-24h；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，溶剂是乙醇、水或者是乙醇-水混合溶剂，针尖层基材与溶剂的比例是0.05-0.8g/mL。

10.权利要求1～7任一项所述具有抗衰功效的SOD可溶性微针贴片在制备具有美白、抗衰或除皱产品中的应用。