CN114252322A - 一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法，涉及微生物分离技术领域。一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法，包括实验材料的选取与培养、制备调节液、调节PH值、染色和分离。通过将同一水域采集的样本进行均匀搅拌处理，并依次分等分标记为检测液A、检测液B、检测液C和检测液D，通过对检测液A、检测液B、检测液C和检测液D采用不同的方式进行培养，以满足检测液A、检测液B、检测液C和检测液D中好氧微生物、兼性厌氧微生物和厌氧微生物的正常新陈代谢，从而有效地提高了对兼性微生物分离时数据的精确性，该方法操作简单，保证了检测数据精确度的同时，有效地提高了分离的效率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物分离技术领域，具体为一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法。
背景技术
微生物包括：细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，与人类关系密切，涵盖了有益跟有害的众多种类，广泛涉及食品、医药、工农业、环保、体育等诸多领域，在我国教科书中，将微生物划分为以下8大类：细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体，有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝、香菇等，还有微生物是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”。
在现阶段对微生物分离的方法中，基本上都是对水体中的微生物通过显微镜进行分离，在对碱性微生物的分离过程中存在操作复杂和效率不高的问题，同时，对于同一水域中碱性微生物进行分离时，碱性微生物也分为好氧微生物、兼性厌氧微生物和厌氧微生物，因此，采取统一的方式对其进行处理，易造成分离数据不精确的问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法，解决了操作复杂、效率不高和精确度不高的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法，包括实验材料的选取与培养、制备调节液、调节PH值、染色和分离，所述实验材料选取与培养包括以下步骤：
①.首先在同一水质污染地区提取120ml实验材料，随后将采样的实验材料放入搅拌器中进行均匀搅拌，待搅拌处理结束后，将120ml实验材料均分为四等分，并分别放入相对应的量筒中，随后，采用20ml的无菌注射器分别从四个量筒中抽取10ml的检测液并分别放入四个培养皿中，对培养皿进行标号，分别标记为检测液A、检测液B、检测液C和检测液D；
②.首先将检测液A、检测液B、检测液C和检测液D均至于温度环境为25～40℃的环境中，随后将盛装检测液A的培养皿以开盖状态置于振荡器中，然后将盛装检测液B的培养皿采用石蜡对底盖连接处进行密封处理，将盛装检测液C的培养皿盖顶中心处进行开孔处理，将盛装检测液D的培养皿不进行任何处理，最后每隔6～8h对盛装检测液A和检测液C的培养皿中滴加营养液。
优选的，所述调节液包括以下重量份的原材料：0.9％的氯化钠溶液30～35份、碳酸氢钠20～25份、三聚磷酸钠10～15份、碳酸钾5～8份、柠檬酸钾6～8份、碳酸氢三钠8～10份和柠檬酸一钠6～8份；
所述调节液的制备包括以下步骤：
①.首先将碳酸氢钠、三聚磷酸钠、碳酸钾、柠檬酸钾、碳酸氢三钠和柠檬酸一钠依次加入研磨机中，在压力控制为60～70kPa，上磨盘转速为220～240rpm，下磨盘转速为210～230rpm的条件下，进行充分研磨，随后将研磨完成的粉末状混合物置入高速搅拌机中，以转速为350～400r/min的条件下进行搅拌混合处理，即可得到粉末调节混合物；
②.首先将盛有0.9％的氯化钠溶液的烧杯放在恒温磁力搅拌器上，将温度设定为25～30℃，随后向烧杯中缓慢加入二分之一的上述粉末调节混合物，启动恒温磁力搅拌器进行首次搅拌处理，待搅拌完成后，将剩余二分之一的上述粉末调节混合物缓慢加入至烧杯中，并将温度上升至30～35℃，然后启动恒温磁力搅拌器进行二次搅拌处理，待搅拌结束后，自然冷却至室温，即可得到一份调节液。
优选的，所述调节PH值包括以下步骤：
采用四个20ml的无菌注射器分别从上述调节液中抽取10ml，将抽取的调节液分别加入检测液A、检测液B、检测液C和检测液D中，并将检测液A、检测液B、检测液C和检测液D均放入恒温箱中进行储存。
优选的，所述染色和分离包括以下步骤：
S1.染色
将上述检测液A、检测液B、检测液C和检测液D由恒温箱中取出，依次滴加刚果红，直至检测液A、检测液B、检测液C和检测液D呈现为稳定的红色后，停止滴加；
S2.分离
将上述染色后的检测液A、检测液B、检测液C和检测液D通过显微镜进行观测，并对染色后的碱性微生物进行分离、计数和记录。
优选的，所述检测液A至于振荡器中的时间为每隔10～15min进行一次振荡，所述检测液A和检测液C滴加营养液的量为2～3ml。
优选的，所述碳酸氢钠、三聚磷酸钠、碳酸钾、柠檬酸钾、碳酸氢三钠和柠檬酸一钠依次加入研磨机充分研磨的时间为30～40min，所述研磨完成的粉末状混合物置入高速搅拌机所处理的时间为20～30min，所述恒温磁力搅拌器进行首次搅拌的时间为15～20min，所述恒温磁力搅拌器进行二次搅拌的时间为20～25min。
(三)有益效果
本发明提供了一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法。具备以下有益效果：
1、本发明通过将同一水域采集的样本进行均匀搅拌处理，并依次分等分标记为检测液A、检测液B、检测液C和检测液D，通过对检测液A、检测液B、检测液C和检测液D采用不同的方式进行培养，以满足检测液A、检测液B、检测液C和检测液D中好氧微生物、兼性厌氧微生物和厌氧微生物的正常新陈代谢，从而有效地提高了对兼性微生物分离时数据的精确性。
2、本发明通过制备调节液对检测液A、检测液B、检测液C和检测液D进行PH值调整，以调节液的加入使检测液A、检测液B、检测液C和检测液D呈碱性，从而有效地抑制了待检测液中酸性微生物的新陈代谢，从而使待检测液中的酸性微生物失活，其次，通过采用刚果红对待检测液中剩余的碱性微生物进行染色处理，从而通过显微镜便于将检测液中的碱性微生物进行分离，该方法操作简单，保证了检测数据精确度的同时，有效地提高了分离的效率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
本发明实施例提供一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法，包括实验材料的选取与培养、制备调节液、调节PH值、染色和分离，实验材料选取与培养包括以下步骤：
①.首先在同一水质污染地区提取120ml实验材料，随后将采样的实验材料放入搅拌器中进行均匀搅拌，待搅拌处理结束后，将120ml实验材料均分为四等分，并分别放入相对应的量筒中，随后，采用20ml的无菌注射器分别从四个量筒中抽取10ml的检测液并分别放入四个培养皿中，对培养皿进行标号，分别标记为检测液A、检测液B、检测液C和检测液D，将采样的材料进行均匀搅拌处理的目的是使后续所等分的检测液中所含有的微生物数量尽量相同，以保证数据的精确性；
②.首先将检测液A、检测液B、检测液C和检测液D均至于温度环境为25～40℃的环境中，随后将盛装检测液A的培养皿以开盖状态置于振荡器中，然后将盛装检测液B的培养皿采用石蜡对底盖连接处进行密封处理，将盛装检测液C的培养皿盖顶中心处进行开孔处理，将盛装检测液D的培养皿不进行任何处理，最后每隔6～8h对盛装检测液A和检测液C的培养皿中滴加营养液，将检测液A的培养皿开盖并放在振荡器中的目的是为了使检测液A充分接触氧气，从而以保证其中的好氧微生物正常的新陈代谢，将检测液B的培养皿用石蜡进行密封处理的目的是保证外界的空气无法进入培养皿中，从而以保证其中厌氧微生物的正常新陈代谢，将检测液C的培养皿顶端中心处进行开孔处理的目的是为了少量的空气可以正常进入培养皿中，从而保证其中的兼性厌氧微生物正常的新陈代谢，将盛装检测液D的培养皿不进行任何处理的目的是以检测液D作为对比组，以保证实验的精确度；
调节液包括以下重量份的原材料：0.9％的氯化钠溶液30～35份、碳酸氢钠20～25份、三聚磷酸钠10～15份、碳酸钾5～8份、柠檬酸钾6～8份、碳酸氢三钠8～10份和柠檬酸一钠6～8份，采用0.9％的氯化钠溶液作为基液，0.9％的氯化钠溶液呈中性，在加入酸性或碱性物质后，都可以提高所配制溶液的稳定性，其中，碳酸氢钠、三聚磷酸钠、碳酸钾、柠檬酸钾、碳酸氢三钠和柠檬酸一钠均为易溶于水的材料，且上述材料溶于水后的溶液均为碱性，同时具有较高的安全性和采购价格低的优点；
调节液的制备包括以下步骤：
①.首先将碳酸氢钠、三聚磷酸钠、碳酸钾、柠檬酸钾、碳酸氢三钠和柠檬酸一钠依次加入研磨机中，在压力控制为60～70kPa，上磨盘转速为220～240rpm，下磨盘转速为210～230rpm的条件下，进行充分研磨，随后将研磨完成的粉末状混合物置入高速搅拌机中，以转速为350～400r/min的条件下进行搅拌混合处理，即可得到粉末调节混合物，将上述材料进行研磨处理的目的是为了更好的与0.9％的氯化钠溶液基液进行混合；
②.首先将盛有0.9％的氯化钠溶液的烧杯放在恒温磁力搅拌器上，将温度设定为25～30℃，随后向烧杯中缓慢加入二分之一的上述粉末调节混合物，启动恒温磁力搅拌器进行首次搅拌处理，待搅拌完成后，将剩余二分之一的上述粉末调节混合物缓慢加入至烧杯中，并将温度上升至30～35℃，然后启动恒温磁力搅拌器进行二次搅拌处理，待搅拌结束后，自然冷却至室温，即可得到一份调节液；
调节PH值包括以下步骤：
采用四个20ml的无菌注射器分别从上述调节液中抽取10ml，将抽取的调节液分别加入检测液A、检测液B、检测液C和检测液D中，并将检测液A、检测液B、检测液C和检测液D均放入恒温箱中进行储存，放入恒温箱中储存的目的是为了检测液A、检测液B、检测液C和检测液D与其中的检测液进行充分的混合；
染色和分离包括以下步骤：
S1.染色
将上述检测液A、检测液B、检测液C和检测液D由恒温箱中取出，依次滴加刚果红，直至检测液A、检测液B、检测液C和检测液D呈现为稳定的红色后，停止滴加，刚果红可对碱性物质进行染色，染色后呈红色，对酸性物质进行染色，染色后呈蓝紫色，方便后期通过显微镜对碱性微生物和酸性微生物的识别；
S2.分离
将上述染色后的检测液A、检测液B、检测液C和检测液D通过显微镜进行观测，并对染色后的碱性微生物进行分离、计数和记录，通过记录得到以下数据(单位为cfu)：
由上述实验数据可得知，碱性好氧微生物、碱性兼性厌氧微生物和兼性厌氧微生物在不同的培养环境中所存在的量是具有差异的，在实际分离过程中，可根据多组实验数据的平均值计算出分离后的数量，从而以保证实验的精确性，同时可对不同环境中的碱性微生物数量进行对比与分析，检测液D作为对比组，可根据与检测D的数据相对比确保对检测液A、检测液B和检测液C进行操作时是否存在问题，相对于检测液D中(碱性)好氧微生物的值必然小于检测液A，相对于检测液D中(碱性)碱性厌氧微生物的值必定小于检测液C，相对于检测液D中(碱性)厌氧微生物的值必定小于检测液B。
检测液A至于振荡器中的时间为每隔10～15min进行一次振荡，以保证检测液A可充分与空气接触，从而实现提高检测液A中氧含量的作用，为检测液A中的好氧微生物提供充足的氧气以用于正常的新陈代谢，检测液A和检测液C滴加营养液的量为2～3ml，营养液的加入为微生物的新陈代谢提供必要的元素，确保所培养的微生物可正常存活。
碳酸氢钠、三聚磷酸钠、碳酸钾、柠檬酸钾、碳酸氢三钠和柠檬酸一钠依次加入研磨机充分研磨的时间为30～40min，研磨的目的是为了让上述材料可以更完全的融入在0.9％的氯化钠溶液的基液中，研磨完成的粉末状混合物置入高速搅拌机所处理的时间为20～30min，搅拌的目的是为了让上述研磨的材料分布更加的均匀，恒温磁力搅拌器进行首次搅拌的时间为15～20min，恒温磁力搅拌器进行二次搅拌的时间为20～25min，采用二次搅拌的目的是为了使粉末状混合物更均匀充分的融合在0.9％的氯化钠溶液的基液中。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法，包括实验材料的选取与培养、制备调节液、调节PH值、染色和分离，其特征在于：所述实验材料选取与培养包括以下步骤：
①.首先在同一水质污染地区提取120ml实验材料，随后将采样的实验材料放入搅拌器中进行均匀搅拌，待搅拌处理结束后，将120ml实验材料均分为四等分，并分别放入相对应的量筒中，随后，采用20ml的无菌注射器分别从四个量筒中抽取10ml的检测液并分别放入四个培养皿中，对培养皿进行标号，分别标记为检测液A、检测液B、检测液C和检测液D；
②.首先将检测液A、检测液B、检测液C和检测液D均至于温度环境为25～40℃的环境中，随后将盛装检测液A的培养皿以开盖状态置于振荡器中，然后将盛装检测液B的培养皿采用石蜡对底盖连接处进行密封处理，将盛装检测液C的培养皿盖顶中心处进行开孔处理，将盛装检测液D的培养皿不进行任何处理，最后每隔6～8h对盛装检测液A和检测液C的培养皿中滴加营养液。
2.根据权利要求1所述的一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法，其特征在于：所述调节液包括以下重量份的原材料：0.9％的氯化钠溶液30～35份、碳酸氢钠20～25份、三聚磷酸钠10～15份、碳酸钾5～8份、柠檬酸钾6～8份、碳酸氢三钠8～10份和柠檬酸一钠6～8份；
所述调节液的制备包括以下步骤：
①.首先将碳酸氢钠、三聚磷酸钠、碳酸钾、柠檬酸钾、碳酸氢三钠和柠檬酸一钠依次加入研磨机中，在压力控制为60～70kPa，上磨盘转速为220～240rpm，下磨盘转速为210～230rpm的条件下，进行充分研磨，随后将研磨完成的粉末状混合物置入高速搅拌机中，以转速为350～400r/min的条件下进行搅拌混合处理，即可得到粉末调节混合物；
②.首先将盛有0.9％的氯化钠溶液的烧杯放在恒温磁力搅拌器上，将温度设定为25～30℃，随后向烧杯中缓慢加入二分之一的上述粉末调节混合物，启动恒温磁力搅拌器进行首次搅拌处理，待搅拌完成后，将剩余二分之一的上述粉末调节混合物缓慢加入至烧杯中，并将温度上升至30～35℃，然后启动恒温磁力搅拌器进行二次搅拌处理，待搅拌结束后，自然冷却至室温，即可得到一份调节液。
3.根据权利要求2所述的一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法，其特征在于：所述调节PH值包括以下步骤：
采用四个20ml的无菌注射器分别从上述调节液中抽取10ml，将抽取的调节液分别加入检测液A、检测液B、检测液C和检测液D中，并将检测液A、检测液B、检测液C和检测液D均放入恒温箱中进行储存。
4.根据权利要求3所述的一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法，其特征在于：所述染色和分离包括以下步骤：
S1.染色
将上述检测液A、检测液B、检测液C和检测液D由恒温箱中取出，依次滴加刚果红，直至检测液A、检测液B、检测液C和检测液D呈现为稳定的红色后，停止滴加；
S2.分离
将上述染色后的检测液A、检测液B、检测液C和检测液D通过显微镜进行观测，并对染色后的碱性微生物进行分离、计数和记录。
5.根据权利要求1所述的一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法，其特征在于：所述检测液A至于振荡器中的时间为每隔10～15min进行一次振荡，所述检测液A和检测液C滴加营养液的量为2～3ml。
6.根据权利要求2所述的一种用于碱性微生物检验的微生物分离方法，其特征在于：所述碳酸氢钠、三聚磷酸钠、碳酸钾、柠檬酸钾、碳酸氢三钠和柠檬酸一钠依次加入研磨机充分研磨的时间为30～40min，所述研磨完成的粉末状混合物置入高速搅拌机所处理的时间为20～30min，所述恒温磁力搅拌器进行首次搅拌的时间为15～20min，所述恒温磁力搅拌器进行二次搅拌的时间为20～25min。
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| RU2008141729A (ru) * | 2008-10-23 | 2010-04-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет прикладно | Способ определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов из мяса, субпродуктов, мясных полуфабрикатов и объектов внешней среды |
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| CN113583821A (zh) * | 2021-09-29 | 2021-11-02 | 深圳市路阳农业科技有限公司 | 一种用于碱性微生物检验的微生物分离装置 |
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