CN114231508A

CN114231508A - 一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN114231508A
Application number: CN202111627375.7A
Authority: CN
Inventors: 宋建芳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114231508B

Abstract

本发明公开了一种7β‑羟基类固醇脱氢酶突变体，属于生物酶技术领域。本发明通过突变野生型7β‑羟基类固醇脱氢酶氨基酸序列的第115位天冬酰胺为非极性更强的缬氨酸，改变了分子表面的疏水性，在不影响活性的前提下使7β‑羟基类固醇脱氢酶的热稳定性得到了提升，延长酶在温度较高的反应体系中的活性时间，避免了酶在温度高时活性高维持时间短、温度低时活性低但维持时间长的尴尬局面，可以有效解决工业生产控制低温需要消耗较多能源且很难实现的问题，适用于工业大规模生产中。

Description

一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物酶技术领域，具体涉及一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)和牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)是名贵中药熊胆的主要有效成分，在临床上用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，具有良好的效果。从人工养殖的熊的熊胆中提取UDCA收率低，来源有限，而且有违于动物保护，因而人工合成UDCA具有重要意义。目前，UDCA和TUDCA的人工合成方法通常有化学合成法和生物转化法，其中是生物转化法由于具有成本低、工艺简单、绿色环保及反应温和等优点而日益受到重视。

生物转化法主要是利用7α-羟基类固醇脱氢酶(7β-hydroxysteroiddehydrogenase，7α-HSDH)催化鹅去氧胆酸(CDCA)和牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)7位上的羟基脱氢变成酮基，从而转化为7-酮石胆酸(7-KLCA)和牛磺-7-酮石胆酸(T-7-KLCA)，然后7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-hydroxysteroid dehydrogenase，7β-HSDH)催化7-酮石胆酸(7-KLCA)和牛磺-7-酮石胆酸(T-7-KLCA)7位上的酮基加氢变成羟基，从而转化为UDCA和TUDCA。但是，生物转化法受限于酶的性质：如野生型7β-HSDH的来源十分广泛，目前国内外科研工作者已经筛选出众多产7β-HSDH的微生物并将其编码基因克隆出来，它们分别来自于活泼瘤胃菌属(Ruminococcus gnavus)、产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)、撒丁岛梭菌(Clostridium absonum)等，但是这些野生型菌株普遍存在活性偏低、热稳定性差等缺点。为了解决这一问题，国内外科研工作者采用基因工程手段对酶进行突变改造来提升酶的活性和稳定性，但是所获得的突变酶的活力以及热稳定性欠佳。酶的活性和热稳定性是决定能否投入工业生产的重要参数，现有的羟基类固醇脱氢酶的活性和稳定性还不能同时满足工业生产的需求。因此，需要进一步寻找和开发新的适用于工业大规模生产的7β-羟基类固醇脱氢酶。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，以解决现有野生型7β-HSDH和突变酶存在酶活力低、热稳定性欠佳且难以应用到工业大规模化生产中的问题。

为解决上述问题，本发明第一方面，提供了一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的7β-HSDH(源自撒丁岛梭菌(Clostridium absonum)，uniprot:G9FRD6)的第115位天冬酰胺替换为缬氨酸得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明第二方面，提供了一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因，所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因编码上述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体。

根据大肠杆菌的密码子偏好性对上述氨基酸序列的编码基因进行优化，获得适合大肠杆菌表达的DNA序列，优选地，所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明第三方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因。所述重组表达载体为质粒，质粒优选为pET28a。

本发明第四方面，提供了一种重组表达细胞，所述重组表达细胞含有上述重组表达载体。优选地，所述重组表达细胞为大肠杆菌。

本发明第五方面，提供了一种催化剂，所述催化剂的有效成分包含上述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体。

本发明第六方面，提供了上述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体或催化剂在催化7-酮石胆酸制备熊去氧胆酸中的应用。

本发明第七方面，提供了上述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体或催化剂在催化牛磺-7-酮石胆酸制备牛磺熊去氧胆酸中的应用。

本发明第八方面，提供了制备上述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的方法，具体包括以下步骤：

S1、构建7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因工程菌株，所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因工程菌株含有上述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因；

S2、将所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因工程菌株接种于发酵培养基中，进行发酵培养，得到所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明通过结构对比野生型撒丁岛梭菌7β-羟基类固醇脱氢酶与同源酶蛋白的异同，确定了影响酶学性质的位点为野生型7β-HSDH的第115位氨基酸--天冬酰胺，通过突变天冬酰胺变成非极性更强的缬氨酸，改变了分子表面的疏水性，在不影响酶活性的前提下使7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的热稳定性得到了提升，延长酶在温度较高的反应体系中的活性时间，避免了酶在温度高时活性高维持时间短、温度低时活性低但维持时间长的尴尬局面，可以有效解决工业生产控制低温需要消耗较多能源且很难实现的问题，适用于工业大规模生产中。

附图说明

图1为本发明的NADPH标准曲线图；

图2为本发明实施例3所制得的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的方法，主要是对7β-羟基类固醇脱氢酶的基因密码子进行优化和定点突变，构建表达7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的表达载体；将表达载体转入大肠杆菌，进行酶蛋白的异源表达和纯化；测定7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的活性和稳定性。具体包括以下步骤：

S101、合成所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因：

a.基因密码子优化

对基因序列进行大肠杆菌表达密码子优化，并进行全基因合成，7β-羟基类固醇脱氢酶基因记为7β-HSDH(DNA序列：SEQ ID NO:2，编码的蛋白质序列：SEQ ID NO:1)；

b.突变体基因获取

通过overlapping PCR法获取突变体基因；通过结构对比野生型撒丁岛梭菌7β-羟基类固醇脱氢酶与同源酶蛋白的异同，确定了影响酶学性质的位点为野生型7β-HSDH的第115位氨基酸--天冬酰胺，因此将7β-羟基类固醇脱氢酶第115位的天冬酰胺突变为缬氨酸，得到突变体基因，突变体命名为7β-HSDH(N115V)：

S102、将7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因克隆至pET28a载体，构建突变体重组表达载体：

将步骤S101中获得的突变基因片段用NdeI和XhoI酶切，用Dpn I酶消化模板；用NdeI和XhoI酶切pET28a载体；用连接酶连接7β-HSDH(N115V)基因片段和载体，得到连接产物；连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布在卡那霉素抗性的LB平板进行筛选；挑选单克隆，接种到5mL卡那霉素抗性的LB培养基中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序，保存测序正确的质粒。

S103、将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选高表达量的阳性转化子，得到7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因工程菌株，具体操作如下：

将测序正确的pET28a-7β-HSDH(N115V)的质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，得到pET28a-7β-HSDH(N115V)的菌株；菌液涂布卡那霉素抗性的LB平板，挑选单克隆，接种至5mL含有卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃，220rpm，进行培养，OD值为0.6-1.0时，加入1mM IPTG诱导2h，SDS-PAGE检测表达量，选取表达量高的克隆，进行菌种保藏，得到7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因工程菌株。

S2、将7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因工程菌株接种于发酵培养基中，进行扩大培养，得到所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体。具体操作如下：

S201、将20μL上述工程菌株接种至200mL卡那霉素抗性LB培养基中过夜培养，OD值为2.5-4.0，取20mL培养液接种至1L卡那霉素抗性培养基中培养，OD值为0.8-1.2时，降温至16℃，加入IPTG诱导过夜表达，收集菌体；

S202、按每克菌体加5-10mL Lysis buffer(1XPBS)的比例重悬菌体，超声破菌至菌液澄清。8000-20000rpm，4℃，离心30-60min取上清液。上清液低温下过镍柱，流速1-5ml/min，用Lysis buffer洗去未结合的样品至紫外检测仪示数不变，用wash buffer(1XPBS，20mM咪唑)洗去结合的杂蛋白至紫外检测仪示数不变，用Elution buffer(1XPBS，300mM咪唑)洗脱目的蛋白，-80℃保存。将所得样品进行SDS-PAGE，鉴定其分子量大小及纯度、BCA试剂盒测试纯化蛋白的浓度。

S3、酶活力测定

NADPH标准曲线绘制：用磷酸缓冲液(100mM，pH 8.0)分别配制0、0.0078、0.0156、0.0313、0.0625、0.125、0.25和0.5mM的NADPH溶液。3mL的反应体系中加入2.97mL的100mM磷酸缓冲液、30μL终浓度0.5mM的牛磺熊去氧胆酸、10μL的酶液，调零后将30μL各个浓度的NADPH溶液分别加入3mL比色皿中混匀，在340nm测定光吸收值OD340。以NADPH溶液的浓度为横坐标，对应的340nm光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线如图1所示。

标准曲线方程式为：y＝5.5847x+0.0025，R²＝0.9999。

在一个3mL的反应体系中加入2.97mL pH为8.0的100mM磷酸缓冲液，30μL终浓度0.5mM的牛磺熊去氧胆酸，10μL的梯度稀释的酶液，至紫外分光光度计中混匀并归零，加入30μL终浓度0.5mM的NADP+，立即开始计时，于25℃，读取1min内的340nm波长的吸收变化值，计算△OD/min；然后用NADPH标准曲线计算7β-羟基类固醇脱氢酶的酶活。

本发明中，限制性内切酶Nde I、Xho I、Dpn I和T4 Ligase采购自Takara。其余为常规试剂。

若未特殊说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特殊说明，以下实施例所使用的实验方法和实验条件均为本领域常规的实验方法和实验条件。可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

实施例1含有7β-HSDH(N115V)的表达载体的构建

1、将7β-羟基类固醇脱氢酶基因(DNA序列：SEQ ID NO:2，编码的蛋白质序列：SEQID NO:1)，先用引物对(SEQ ID NO:5)和(SEQ ID NO:7)通过PCR进行扩增，再用引物对(SEQID NO:6)和(SEQ ID NO:8)通过PCR进行扩增，回收2次PCR产物，然后以2次PCR的产物为模板，用引物对(SEQ ID NO:5)和(SEQ ID NO:6)通过PCR进行扩增克隆，酶切位点为：NdeI和XhoI，所用引物如下表：

第1次PCR反应体系和条件如下表所示：

PCR反应条件：98℃预变性5分钟；35个循环，其中包括：98℃变性10秒，55℃退火5秒，72℃延伸5秒；反应结束后于72℃延伸10分钟。

第2次PCR反应体系和条件如下表所示：

第3次PCR反应体系和条件如下表所示：

PCR反应条件：98℃预变性5分钟；35个循环，其中包括：98℃变性10秒，55℃退火5秒，72℃延伸10秒；反应结束后于72℃延伸10分钟。

酶切和连接反应：

利用NdeI和XhoI限制性内切酶分别对重叠PCR获得的7β-HSDH(N115V)基因以及pET28a载体进行双酶切，然后按照以下体系和条件进行连接：

连接条件：16℃连接过夜，得到pET28a-7β-HSDH(N115V)。

2、连接产物转化DH5α感受态细胞：

取50μL感受态细胞E.coli DH5α放置冰上融化，将2μL连接产物pET28a-7β-HSDH(N115V)加入融化的E.coli DH5α感受态中，冰上放置30分钟。42℃热激90s，冰浴3分钟。加入LB培养基450μL，摇床温度37℃，摇床摇速180rpm，时间45分钟。吸取200μL培养液涂布kana+抗性LB平板培养基，37℃过夜培养。挑取单菌落，接种Kana+抗性LB培养基中，摇床温度37℃，摇床摇速220rpm。OD600≈1.0时，12000rpm离心5分钟获取菌体用于质粒提取。提取质粒按天根质粒小提试剂盒说明书操作提取质粒，送测序，保存测序正确的质粒作为重组表达载体。

实施例2含有pET28a-7β-HSDH(N115V)的重组质粒在大肠杆菌中表达

1、质粒转化BL21(DE3)感受态细胞：

在-80℃中取出50μL BL21(DE3)感受态细胞冰上放置解冻，加入pET28a-7β-HSDH(N115V)质粒1μL，冰上放置30分钟。42℃热激90秒，冰上放置3分钟。加入450μL LB培养基，37℃，180rpm，45分钟。吸取200μL培养液涂布于Kana+LB平板培养基，37℃过夜培养。

2、小剂量表达测试：挑选5个单克隆，分别接种至5mL含有卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm，进行培养，OD值为0.6-1.0时，加入终浓度1mM IPTG诱导2h，SDS-PAGE检测表达量，选取表达量高的克隆，进行菌种保藏。

3、大剂量表达培养：

取20μL菌种接种至200mL含有卡那霉素的LB培养基中，180rpm，37℃过夜培养，OD值为2.5-4.0。取20mL培养液接种至1L含有卡那霉素的LB培养基中，120rpm，37℃，培养至OD值为0.8-1.2时，降温至16℃，加入终浓度0.5mM IPTG诱导过夜表达，3800rpm，15min收集菌体。

实施例3 7β-HSDH(N115V)蛋白的纯化

称取25g 7β-HSDH(N115V)菌体加250mL Lysis buffer(1XPBS)重悬菌体，超声破菌至菌液澄清。4℃，10000rpm，离心60min取上清液。上清液过镍柱5ml，4℃，流速3ml/min，用100mL Lysis buffer洗柱子至紫外检测仪示数不变，用50ml wash buffer(1XPBS，20mM咪唑)洗去结合的杂蛋白至紫外检测仪示数不变，用20ml Elution buffer(1XPBS，300mM咪唑)洗脱目的蛋白，-80℃保存。将所得样品进行SDS-PAGE，鉴定其分子量大小及纯度、BCA试剂盒测试纯化蛋白的浓度，结果如图2所示。

如图2所示，目的蛋白的纯度较高，可达95％以上，分子量在29KD左右，蛋白浓度为6.32mg/mL。

对比例1

将7β-羟基类固醇脱氢酶基因(DNA序列：SEQ ID NO:2，编码的蛋白质序列：SEQ IDNO:1)，先用引物对(SEQ ID NO:5)和(SEQ ID NO:9)通过PCR进行扩增，再用引物对(SEQ IDNO:6)和(SEQ ID NO:10)通过PCR进行扩增，回收2次PCR产物，然后以2次PCR的产物为模板，用引物对(SEQ ID NO:5)和(SEQ ID NO:6)通过PCR进行扩增克隆，酶切位点为：NdeI和XhoI，所用引物如下表：

其他实验步骤参照7β-HSDH(N115V)构建方法，可得到7β-HSDH(R113V)。

实施例4野生型7β-HSDH、7β-HSDH(N115V)及7β-HSDH(R113V)的活性测定

在一个3mL的比色皿中加入2.97mL的100mM磷酸缓冲液、30μL终浓度0.5mM的牛磺熊去氧胆酸、10μL的梯度稀释的酶液，至紫外分光光度计中混匀并归零，加入30μL终浓度0.5mM的NADP+，立即开始计时，于25℃，读取1min内的340nm波长的吸收变化值，计算△OD/min；然后用NADPH标准曲线计算7β-羟基类固醇脱氢酶的酶活。

比活力(U/mg)定义：在上述反应条件下，每毫克蛋白所含的酶活力单位数。

表1.野生型7β-HSDH与7β-HSDH(N115V)和7β-HSDH(R113V)酶比活力比较

由表1可知，野生型7β-HSDH酶活为24.52U/ml,7β-HSDH(N115V)酶活为25.57U/ml,对比例7β-HSDH(R113V)酶活为24.67U/ml，三者酶活相当，由此证明突变后酶活依然稳定并未降低。

实施例5野生型7β-HSDH、7β-HSDH(N115V)及7β-HSDH(R113V)的热稳定性测定

将实施例3中的酶样品(不含甘油)在50℃水浴放置20分钟，按照实施例4测定酶活的方法检测残余酶活。每个样品进行不少于3次的重复实验，结果如表2所示。

残余酶活的计算方式为：(水浴前酶活-水浴后酶活)/水浴前酶活×100％。

表2.野生型7β-HSDH与7β-HSDH(N115V)和7β-HSDH(R113V)热稳定性比较

由表2可知，热处理20分钟后，野生型7β-HSDH酶活迅速下降，仅保留21.65％的酶活，而7β-HSDH(N115V)仍保留80.19％的酶活，对比例7β-HSDH(R113V)保留活性19.51％。表明相比野生型7β-HSDH，7β-HSDH(N115V)具有更好的热稳定性，更适于工业应用。

综上所述，本发明通过将野生型7β-HSDH的第115位氨基酸天冬酰胺突变为非极性更强的缬氨酸，改变了分子表面的疏水性，在不影响酶活性的前提下使7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的热稳定性得到了提升，与野生型7β-HSDH相比，更适于工业大规模生产。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 宋建芳

<120> 一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用

<130> 20211217

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Asn Phe Arg Glu Lys Tyr Gly Gln Trp Gly Ile Val Leu Gly Ala

1 5 10 15

Thr Glu Gly Ile Gly Lys Ala Ser Ala Phe Glu Leu Ala Lys Arg Gly

20 25 30

Met Asp Val Ile Leu Val Gly Arg Arg Lys Glu Ala Leu Glu Glu Leu

35 40 45

Ala Lys Ala Ile His Glu Glu Thr Gly Lys Glu Ile Arg Val Leu Pro

50 55 60

Gln Asp Leu Ser Glu Tyr Asp Ala Ala Glu Arg Leu Ile Glu Ala Thr

65 70 75 80

Lys Asp Leu Asp Met Gly Val Ile Glu Tyr Val Ala Cys Leu His Ala

85 90 95

Met Gly Gln Tyr Asn Lys Val Asp Tyr Ala Lys Tyr Glu Gln Met Tyr

100 105 110

Arg Val Asn Ile Arg Thr Phe Ser Lys Leu Leu His His Tyr Ile Gly

115 120 125

Glu Phe Lys Glu Arg Asp Arg Gly Ala Phe Ile Thr Ile Gly Ser Leu

130 135 140

Ser Gly Trp Thr Ser Leu Pro Phe Cys Ala Glu Tyr Ala Ala Glu Lys

145 150 155 160

Ala Tyr Met Met Thr Val Thr Glu Gly Val Ala Tyr Glu Cys Ala Asn

165 170 175

Thr Asn Val Asp Val Met Leu Leu Ser Ala Gly Ser Thr Ile Thr Pro

180 185 190

Thr Trp Leu Lys Asn Lys Pro Ser Asp Pro Lys Ala Val Ala Ala Ala

195 200 205

Met Tyr Pro Glu Asp Val Ile Lys Asp Gly Phe Glu Gln Leu Gly Lys

210 215 220

Lys Phe Thr Tyr Leu Ala Gly Glu Leu Asn Arg Glu Lys Met Lys Glu

225 230 235 240

Asn Asn Ala Met Asp Arg Asn Asp Leu Ile Ala Lys Leu Gly Lys Met

245 250 255

Phe Asp His Met Ala

260

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgaacttcc gtgaaaagta cggtcagtgg ggcatcgttc tgggtgcgac cgagggtatc 60

ggtaaagctt ccgcatttga actggctaaa cgtggcatgg atgttatcct ggtaggtcgc 120

cgtaaagagg ctctggaaga gctggcaaaa gctatccacg aagaaaccgg taaagaaatt 180

cgtgttctgc ctcaggacct gtctgaatat gatgccgcgg aacgtctgat cgaagcaacc 240

aaagatctgg atatgggtgt tatcgaatac gtagcttgtc tgcacgcgat gggtcagtac 300

aataaagtgg actacgccaa atacgaacag atgtaccgtg tcaatattcg caccttctcc 360

aagctgctgc accactacat cggtgaattt aaagaacgcg atcgtggtgc atttatcacc 420

atcggcagcc tgtctggttg gacttctctg ccgttttgcg ccgaatacgc tgctgaaaaa 480

gcatatatga tgaccgttac tgaaggcgtt gcgtatgaat gcgcaaacac caacgttgac 540

gttatgctgc tgagcgcggg ttctaccatt actccgacct ggctgaaaaa caaaccgtct 600

gatccgaaag cggtagctgc ggccatgtac ccggaagacg taatcaaaga cggcttcgaa 660

cagctgggta aaaaattcac ctacctggcg ggtgaactga accgcgaaaa aatgaaagaa 720

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gct 783

<210> 3

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Met Asn Phe Arg Glu Lys Tyr Gly Gln Trp Gly Ile Val Leu Gly Ala

1 5 10 15

Thr Glu Gly Ile Gly Lys Ala Ser Ala Phe Glu Leu Ala Lys Arg Gly

20 25 30

Met Asp Val Ile Leu Val Gly Arg Arg Lys Glu Ala Leu Glu Glu Leu

35 40 45

Ala Lys Ala Ile His Glu Glu Thr Gly Lys Glu Ile Arg Val Leu Pro

50 55 60

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65 70 75 80

Lys Asp Leu Asp Met Gly Val Ile Glu Tyr Val Ala Cys Leu His Ala

85 90 95

Met Gly Gln Tyr Asn Lys Val Asp Tyr Ala Lys Tyr Glu Gln Met Tyr

100 105 110

Arg Val Val Ile Arg Thr Phe Ser Lys Leu Leu His His Tyr Ile Gly

115 120 125

Glu Phe Lys Glu Arg Asp Arg Gly Ala Phe Ile Thr Ile Gly Ser Leu

130 135 140

Ser Gly Trp Thr Ser Leu Pro Phe Cys Ala Glu Tyr Ala Ala Glu Lys

145 150 155 160

Ala Tyr Met Met Thr Val Thr Glu Gly Val Ala Tyr Glu Cys Ala Asn

165 170 175

Thr Asn Val Asp Val Met Leu Leu Ser Ala Gly Ser Thr Ile Thr Pro

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Lys Phe Thr Tyr Leu Ala Gly Glu Leu Asn Arg Glu Lys Met Lys Glu

225 230 235 240

Asn Asn Ala Met Asp Arg Asn Asp Leu Ile Ala Lys Leu Gly Lys Met

245 250 255

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260

<210> 4

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

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ggtaaagctt ccgcatttga actggctaaa cgtggcatgg atgttatcct ggtaggtcgc 120

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aagctgctgc accactacat cggtgaattt aaagaacgcg atcgtggtgc atttatcacc 420

atcggcagcc tgtctggttg gacttctctg ccgttttgcg ccgaatacgc tgctgaaaaa 480

gcatatatga tgaccgttac tgaaggcgtt gcgtatgaat gcgcaaacac caacgttgac 540

gttatgctgc tgagcgcggg ttctaccatt actccgacct ggctgaaaaa caaaccgtct 600

gatccgaaag cggtagctgc ggccatgtac ccggaagacg taatcaaaga cggcttcgaa 660

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aacaacgcga tggaccgtaa cgacctgatc gcgaaactgg gcaaaatgtt cgatcacatg 780

gct 783

Claims

1.一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的7β-HSDH的第115位天冬酰胺替换为缬氨酸得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因，其特征在于：所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因编码如权利要求1所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体。

3.根据权利要求2所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因，其特征在于：所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体含有如权利要求2或3所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因。

5.一种重组表达细胞，其特征在于：所述重组表达细胞含有如权利要求4所述的重组表达载体。

6.一种催化剂，其特征在于：所述催化剂的有效成分包含如权利要求1所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体。

7.如权利要求1所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体或权利要求6所述的催化剂在催化7-酮石胆酸制备熊去氧胆酸中的应用。

8.如权利要求1所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体或权利要求6所述的催化剂在催化牛磺-7-酮石胆酸制备牛磺熊去氧胆酸中的应用。

9.一种制备7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、构建7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因工程菌株，所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因工程菌株含有如权利要求2或3所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因；

S2、将所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因工程菌株接种于发酵培养基中，进行扩大培养，得到所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤S1包括以下具体步骤：

S101、合成所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因；

S102、将所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因克隆至pET28a载体，得到重组载体；

S103、将所述重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选高表达量的阳性转化子，得到所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体基因工程菌株。