CN114231479A - 一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒和提取方法 - Google Patents

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李航宇
张成宏
何帅
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Abstract

本发明公开了一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒和提取方法。所述试剂盒包括青链霉素双抗原液、胰蛋白酶／EDTA消化液、IV型胶原酶、α‑MEM培养基和胎牛血清。提取人肝癌成纤维细胞的方法包括以下步骤：将肝癌组织修剪后采用1%青链霉素双抗的培养基洗涤，弃洗液后加入胰蛋白酶／EDTA消化液消化5‑10min；加培养基洗液终止消化、弃洗液后加入IV型胶原酶消化20‑30min，终止消化后离心、洗涤胶原酶；最后沉淀中加入含20%胎牛血清、1%青链霉素双抗的α‑MEM培养基，在37℃、5%CO2条件下进行培养。本申请的试剂盒能够有效提高人原代肝癌成纤维细胞的提取成功率，节省成本并提高工作效率。

Description

一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒和提取方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒和提取方法。
背景技术
肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤间质中最主要的细胞成分，在肿瘤的发生和发展过程中扮演着至关重要的角色。这些肿瘤相关成纤维细胞在形态、功能、蛋白质表达、对细胞因子的反应性及遗传学水平上与正常成纤维细胞存在明显差异。
肿瘤相关成纤维细胞目前是研究热点之一，该细胞与肿瘤的发生发展和转移侵袭有着密不可分的关系，以肿瘤相关成纤维细胞为靶点的药物成为提高肿瘤治愈率的一种新方法。目前，现有的肿瘤相关成纤维细胞提取方法不能获得大量的肿瘤相关成纤维细胞，提取率较低，为研究其机制及作用带来很大的影响。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提供了一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒和提取方法。
本发明是通过以下技术方案得以实现的。
一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，包括青链霉素双抗原液、胰蛋白酶／EDTA消化液、IV型胶原酶、α-MEM培养基和胎牛血清。
进一步的，所述青链霉素双抗原液的浓度为10000U／ml。
进一步的，所述青链霉素双抗的使用终浓度为1%。
进一步的，所述胰蛋白酶／EDTA消化液为含有0.25%胰蛋白酶、0.04%EDTA的PBS溶液，pH=7.2。
进一步的，所述IV型胶原酶的使用终浓度为1mg/ml。
进一步的，胎牛血清的使用终浓度为20%。
一种提取人原代肝癌成纤维细胞的方法，包括以下步骤：
S1. 将肝癌组织放入含1%青链霉素双抗的培养基中，并用含1%青链霉素双抗的培养基洗涤组织，静置1-2min后，用含1%青链霉素双抗的培养基重复洗涤组织2-3遍；
S2. 弃去洗涤液，加入胰蛋白酶／EDTA消化液，37℃水浴中消化5-10min；
S3. 吸弃胰蛋白酶，加入含1%青链霉素双抗的培养基终止消化，并重复加入1%青链霉素双抗的培养基2-3次进行洗涤；
S4. 吸弃洗涤液，加入胶原酶，37℃水浴消化20-30min，加含1%青链霉素双抗的培养基终止消化；
S5. 3500-4000r／min离心2-3min，弃上清，用含1%青链霉素双抗的培养基洗涤胶原酶2-3遍，重复离心，弃上清；
S6.加入含20%胎牛血清、1%青链霉素双抗的α-MEM培养基，吹打均匀，在37℃、5%CO2条件下进行培养。
进一步的，步骤S1中，切取1-3cm3的肝癌组织。
本申请具有以下有益效果。
本申请的试剂盒能够有效提高人肝癌成纤维细胞的原代提取成功率，节省成本并提高工作效率。本申请肝癌成纤维细胞提取方法操作简单，实用性强，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明培养得到的人肝癌成纤维细胞图。
具体实施方式
一、本申请试剂盒中每一组分的具体含量
试剂1:青霉素链霉素原液（10000U／ml）: 2ml
试剂2:胰蛋白酶／EDTA消化液（含0.25%的胰蛋白酶、0.04%的EDTA以0.01mol的PBS溶解，PH≈7.2）:10ml
试剂3:胶原酶IV型(粉末):10mg
试剂4:α-MEM(α-Minimum Essential Medium)（with L-Glutamine,Ribonucleosides and Deoxyribonucleosides）培养基:10ml
试剂5:胎牛血清(Foetal Bovine Serum，FBS ):2ml
二、试剂盒的使用方法
保存：-20℃
各试剂具体使用方法如下：
试剂1：添加到培养基中（可为各种类型培养基，需自备），配制成含1%青链霉素的培养基100ml，用于暂存、转运新鲜肝癌组织，以及后续操作中作为培养基洗液用。
试剂2:用于消化组织团块。
试剂3:初次使用时，将胶原酶IV型粉末10mg直接溶解到10ml无血清培养基(可为各种类型培养基，需自备)中，配制成1mg/ml，过滤除菌。再次使用时可分装－20℃冻存。用于消化组织团块。
试剂4（10ml）+试剂5（2ml）＋试剂1（100ul）配制成含20%FBS、1%青链霉素的α-MEM培养基，用于原代细胞培养用。
三、本申请试剂盒有效性验证
实验过程：
试剂准备：试剂盒试剂1-5。
耗材准备：无菌操作器械（解剖剪刀、镊子、手术刀片各1副）；6cm培养皿（1个）；15ml离心管（若干）；50ml离心管（1个）；50ml注射器（1个）；0.22um滤菌器（1个）；巴式吸管（若干）。
组织准备：组织离体后第一时间切取小块肝癌组织（1cm3左右即可），放入含1%青链霉素双抗的培养基中，要求绝对无菌，尽快转至超净台，然后准备以下操作。
方法：酶促组织消化法。
操作如下：
1、在含1%青链霉素的培养基中修剪组织块，用器械将组织块修剪成1 平方毫米的碎片，边修剪组织块，边用含1%青链霉素的培养基清洗组织中的血液，将组织块连同洗液转入15ml离心管，静置1～2min，待组织块靠重力下沉后，用含1%青链霉素的培养基重复洗涤2～3遍至透明，以减少血细胞的残留。
2、弃洗液，加胰蛋白酶／EDTA消化液5ml，37度水浴中消化5～10分钟，至15ml离心管中观察组织凝聚、抱团粘连则提示消化程度为最好。
3、巴士吸管小心吸弃胰蛋白酶，加含1%青链霉素的培养基终止胰蛋白酶消化，重复加含1%青链霉素的培养基洗涤2～3遍，去除存留的胰蛋白酶。
4、巴士吸管小心吸弃洗液，加1mg/ml胶原酶IV 3~5ml，转入50ml离心管，37度水浴充分消化20～30分钟，观察至组织块之间黏连成丝则表示消化为最好，加含1%青链霉素的培养基终止消化，转入15ml离心管。
5、3500转／分钟离心3分钟，弃上清，用含1%青链霉素的培养基洗涤胶原酶2～3遍，重复离心，弃上清，加含20%FBS、1%青链霉素双抗的α-MEM培养基，适度吹打均匀，转入培养瓶／皿，放37度5%CO2培养箱中培养。
注意事项：
注意污染，严格无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。
避免细胞损伤和减少细胞应激的措施。
实验结果：
1、前2周内至少每3天一次于普通倒置显微镜下观察细胞形态。2周后每1～2天观察一次。
2、培养1周左右，细胞逐渐贴壁生长，换液采取半量换液方式。
早期贴壁的细胞主要以上皮细胞为主，呈长梭形成纤维细胞量少；后期（一般第2～4周后）上皮细胞逐渐减少，并被长梭形成纤维细胞取代。
3、待细胞铺满培养瓶／皿80%～100%，予以传代，待传代2～3代后成纤维细胞逐渐纯化，可用于鉴定、实验分析等。
培养得到的人肝癌成纤维细胞参见图1。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，其特征在于：包括青链霉素双抗原液、胰蛋白酶／EDTA消化液、IV型胶原酶、α-MEM培养基和胎牛血清。
2.根据权利要求1所述的一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，其特征在于：所述青链霉素双抗原液的浓度为10000U／ml。
3.根据权利要求1所述的一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，其特征在于：所述青链霉素双抗的使用终浓度为1%。
4.根据权利要求1所述的一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，其特征在于：所述胰蛋白酶／EDTA消化液为含有0.25%胰蛋白酶、0.04%EDTA的PBS溶液，pH=7.2。
5.根据权利要求1所述的一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，其特征在于：所述IV型胶原酶的使用终浓度为1mg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，其特征在于：胎牛血清的使用终浓度为20%。
7.一种提取人原代肝癌成纤维细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1. 将肝癌组织放入含1%青链霉素双抗的培养基中，并用含1%青链霉素双抗的培养基洗涤组织，静置1-2min后，用含1%青链霉素双抗的培养基重复洗涤组织2-3遍；
S2. 弃去洗涤液，加入胰蛋白酶／EDTA消化液，37℃水浴中消化5-10min；
S3. 吸弃胰蛋白酶，加入含1%青链霉素双抗的培养基终止消化，并重复加入1%青链霉素双抗的培养基2-3次进行洗涤；
S4. 吸弃洗涤液，加入胶原酶，37℃水浴消化20-30min，加含1%青链霉素双抗的培养基终止消化；
S5. 3500-4000r／min离心2-3min，弃上清，用含1%青链霉素双抗的培养基洗涤胶原酶2-3遍，重复离心，弃上清；
S6.加入含20%胎牛血清、1%青链霉素双抗的α-MEM培养基，吹打均匀，在37℃、5%CO2条件下进行培养。
8.根据权利要求7所述的一种提取人原代肝癌成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤S1中，切取1-3cm3的肝癌组织。
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