CN114225110A - 一种胶原基硬脑膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胶原基硬脑膜及其制备方法，胶原基硬脑膜包括朝向脑组织侧的胶原膜层和朝向颅骨侧的复合胶原膜层；胶原膜层包括至少两层胶原膜，胶原膜由I型胶原构成；胶原膜层为由至少两层胶原膜经喷涂粘合介质、叠加复合、辊压得到的致密层；至少两层胶原膜包括第一胶原膜和至少一层第二胶原膜，且第一胶原膜朝向脑组织侧；第一胶原膜与第二胶原膜的厚度之比为1:(1.5～2)；复合胶原膜层由I型胶原和矿化胶原颗粒复合而成，内部为多孔状结构；在将胶原膜层和复合胶原膜层复合后，还对复合后的材料依次进行辊压成形和交联处理，以得到胶原基硬脑膜。本发明提供的胶原基硬脑膜具有优异的力学性能和抗粘连性能。

Description

一种胶原基硬脑膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，特别涉及一种胶原基硬脑膜及其制备方法。

背景技术

硬脑膜是位于人脑组织表面的一道重要屏障，位于颅骨之下，覆盖于脑组织和脊柱之上，是一种厚而坚韧的双层膜，主要作用是保护大脑，防止脑脊液渗漏、维持脑神经稳定。恶性肿瘤硬脑膜转移、肿瘤侵犯以及术中切除受累等是造成硬脑膜损伤的主要原因，同时硬脑膜损伤的患者常伴有广泛的脑肿胀，导致患者的硬脑膜缺损，甚至引发颅内感染、脑膨出、癫痫等严重并发症，因此及时、有效的修复缺损的硬脑膜组织，能够避免上述相关并发症的发生，减少住院时间和成本。目前，常采取硬脑膜重建的方法，将人工脑膜补片用于覆盖脑膜缺损部位，保持颅脑稳定，诱导周边正常脑膜细胞在脑膜补片上生长并向内迁移，分泌胶原及糖类，以形成新生硬脑膜。

近年来，人工合成不可吸收材料也被用于硬脑膜重建中，如涤纶硅橡胶、聚氨甲酸乙酯、膨胀体聚四氟乙烯等人工材料，其中，授权公告号为CN106668935B的专利申请文件公开了一种膨胀体聚四氟乙烯人工硬脑膜及制备工艺，采用该膨胀体聚四氟乙烯人工硬脑膜可以防止脑组织粘连，方便制造，易于消毒储存，但其硬度较大、顺应性较低、易有脑脊液漏出且不被人体降解吸收。

生物可降解材料是目前研究较多的一类用于硬脑膜重建修复的材料。由于生物可降解材料可选择性地引导组织等受损部位组织再生后，材料完全降解或被组织吸收，避免了长期存留体内引起的病毒感染风险和免疫排斥反应，不需要二次手术取出材料，减少了患者的痛苦且手术方便，是一类较理想的新材料。但现有用于硬脑膜重建修复的生物可降解材料的力学性能较差，导致手术操作时稍有难度，易出现脑脊液漏出的情况，且该材料对组织再生和创伤愈合没有明显的促进作用。

胶原为人体硬脑膜的主要成分，具有良好的生物相容性、生物降解性、低毒性以及弱抗原性，又有利于细胞的粘附生长和增殖分化，因此基于胶原研制的各类人工硬脑膜也备受关注。然而胶原的力学性能较差，需要与载体共同作用于缺损部位，这又使得胶原的效果大打折扣；另外由于胶原具有较强的粘连性，使用过程中往往还需要添加交联或抗粘连成分，以防止胶原与脑组织粘连而引发癫痫等并发症。

发明内容

本发明实施例提供了一种胶原基硬脑膜及其制备方法，该胶原基硬脑膜具有优异的力学性能和抗粘连性能。

第一方面，本发明提供了一种胶原基硬脑膜，

所述胶原基硬脑膜包括朝向脑组织侧的胶原膜层和朝向颅骨侧的复合胶原膜层；

所述胶原膜层包括至少两层胶原膜，所述胶原膜由I型胶原构成；其中，所述胶原膜层为由所述至少两层胶原膜经喷涂粘合介质、叠加复合、辊压得到的致密层；

所述至少两层胶原膜包括第一胶原膜和至少一层第二胶原膜，且所述第一胶原膜朝向脑组织侧；所述第一胶原膜与所述第二胶原膜的厚度之比为1:(1.5～2)；

所述复合胶原膜层由I型胶原和矿化胶原颗粒复合而成，内部为多孔状结构；

在将所述胶原膜层和所述复合胶原膜层复合后，还对复合后的材料依次进行辊压成形和交联处理，以得到所述胶原基硬脑膜。

优选地，所述胶原膜的密度为0.02～0.1g/cm³；优选所述第二胶原膜的厚度为0.3～2.0mm，优选所述第二胶原膜的层数为1～8层。

优选地，所述复合胶原膜层的平均孔径为25～500μm，孔隙率为60～75％，优选所述复合胶原膜层的厚度为0.3～2.0mm。

优选地，所述胶原基硬脑膜的厚度为0.3～2mm。

优选地，所述复合胶原膜中I型胶原和矿化胶原颗粒的质量比为100:(0.3～1)。

优选地，所述矿化胶原颗粒的粒径为200～500μm。

优选地，所述粘合介质为由I型胶原配制的固含量为0～0.015％的胶原凝胶液；

所述胶原膜层中任意相邻两层胶原膜之间喷涂粘合介质时所用的喷涂量均相同，优选地，该喷涂量为0.0015～0.0061mL/cm²；

所述胶原膜层和所述复合胶原膜层复合时，还包括在所述胶原膜层喷涂所述粘合介质；优选地，所述胶原膜层和所述复合胶原膜层复合时喷涂粘合介质所用的喷涂量低于所述胶原膜层中任意相邻两层胶原膜之间喷涂粘合介质时所用的喷涂量；

在所述胶原膜层喷涂粘合介质时所用的喷涂量为0.00075～0.003mL/cm²。

优选地，所述胶原膜和所述复合胶原膜层均通过冷冻干燥获得。

优选地，所述交联处理时所用的交联液浓度为5～50mmol/L，所述交联液中交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述交联液中溶剂为含有70％乙醇的水溶液。

第二方面，本发明提供了上述第一方面所述的胶原基硬脑膜的制备方法，所述制备方法包括：

(1)制备矿化胶原颗粒；

(2)利用I型胶原制备第一胶原膜和第二胶原膜，并利用所述矿化胶原颗粒和所述I型胶原制备复合胶原膜层；所述第一胶原膜与所述第二胶原膜的厚度之比为1:(1.5～2)；

(3)在所述第一胶原膜上喷涂粘合介质并叠加复合至少一层第二胶原膜后，经过辊压得到胶原膜层；所述粘合介质为由I型胶原配制的固含量为0～0.015％的胶原凝胶液；

(4)在所述胶原膜层上复合所述复合胶原膜层，并对复合后的材料依次进行辊压成形和交联处理，得到所述胶原基硬脑膜。

优选地，所述步骤(4)包括如下子步骤：

(41)对所述复合胶原膜层进行预辊压；所述预辊压的压力为2～10MPa，辊压线速度为25～100cm/min，辊压厚度小于所述复合胶原膜层的厚度；

(42)在所述胶原膜层上喷涂所述粘合介质后，将预辊压的复合胶原膜层复合在所述胶原膜层上；其中，在所述胶原膜层上喷涂粘合介质时所用的喷涂量为0.00075～0.003mL/cm²；

(43)将由所述胶原膜层和所述复合胶原膜层复合后的材料于2～10MPa的压力下进行辊压；其中，辊压线速度为25～100cm/min，所述辊压的辊压厚度为所述胶原膜层和所述复合胶原膜层厚度之和的35～65％；

(44)将经步骤(43)辊压后的材料置于浓度为5～50mmol/L的交联液中并于-5～0℃下交联20～60min；所述交联液中交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述交联液中溶剂为含有70％乙醇的水溶液；

(45)将经步骤(44)交联后的材料依次用纯水和所述溶剂进行清洗，然后再于35～50℃的条件下干燥8～16h，得到所述胶原基硬脑膜；

其中，所述胶原基硬脑膜包括由上至下的复合胶原膜层、至少一层第二胶原膜和第一胶原膜。

优选地，所述步骤(3)包括如下子步骤：

(31)将所述第一胶原膜和所述第二胶原膜分别进行预辊压；所述预辊压的压力为2～10MPa，辊压线速度为25～100cm/min，辊压厚度小于进行预辊压的胶原膜的厚度；

(32)在预辊压后的第一胶原膜上依次复合至少一层预辊压后的第二胶原膜，然后进行辊压，得到所述胶原膜层；其中，每复合一层预辊压后的第二胶原膜前均进行喷涂粘合介质，所述喷涂粘合介质的喷涂量为0.0015～0.0061mL/cm²；所述辊压的压力为2～10MPa，辊压线速度为25～100cm/min，所述辊压的辊压厚度为所述第一胶原膜和至少一层所述第二胶原膜厚度之和的35～65％。

优选地，所述步骤(2)包括如下子步骤：

(21)将I型胶原配制成固含量为0.8～1.5％的胶原凝胶液；

(22)将所述胶原凝胶液涂覆在平板模具上，流延平整或借助工具刮平整，然后进行冷冻干燥，得到所述第一胶原膜和所述第二胶原膜；优选所述第二胶原膜的厚度为0.3～2.0mm；

(23)在所述胶原凝胶液和步骤(1)制备的所述矿化胶原颗粒进行混合，得到混合液，将所述混合液涂覆在平板模具上，流延平整或借助工具刮平整，然后进行冷冻干燥，得到所述复合胶原膜；其中，所述胶原凝胶液中的胶原与所述矿化胶原颗粒的质量比为100:(0.3～1)，优选所述复合胶原膜层的厚度为0.3～2.0mm。

优选地，所述冷冻干燥包括预冻阶段、第一升华阶段、第二升华阶段和降温阶段，各个阶段的工艺条件如下：

预冻阶段：目标温度为-12～-8℃，速率为3～4℃/min，恒温时长为250～280min；

第一升华阶段进行抽真空，真空度为50～120Pa，包括四个升温阶梯，分别为：

-4～-2℃，升温速率为0.2～0.3℃/min，恒温时长为200～220min；

1～2℃，升温速率为0.1～0.2℃/min，恒温时长为200～220min；

4～6℃，升温速率为0.3～0.4℃/min，恒温时长为160～180min；

8～10℃，升温速率为0.4～0.5℃/min，恒温时长为160～180min；

第二升华阶段抽进行真空，真空度为50～120Pa，包括五个升温阶梯，分别为：

14～16℃，升温速率为1～1.2℃/min，恒温时长为120～140min；

20～22℃，升温速率为1～1.2℃/min，恒温时长为120～140min；

36～38℃，升温速率为1.6～1.8℃/min，恒温时长为70～80min；

42～45℃，升温速率为1.6～1.8℃/min，恒温时长为70～80min；

55～60℃，升温速率为0.8～1℃/min，恒温时长：每隔1小时进行终点判断，至终点判断合格为止；终点≤0.5Pa/10min；

降温阶段：目标温度为室温，降温速率为4～6℃/min。

优选地，所述制备矿化胶原颗粒包括：

(11)将I型胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中，配制成浓度为0.01～0.2g/mL的胶原酸液；

(12)向胶原酸液中滴加钙盐溶液；其中，钙离子的加入量为每克胶原对应加入钙离子0.1～2mol；

(13)向步骤(12)所得溶液中滴加磷酸溶液；其中磷酸根离子的加入量与步骤(12)中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝1:1～2:1；

(14)向步骤(13)所得溶液中滴加NaOH溶液，得到混合溶液；其中，所述混合溶液的pH值为6～8；

(15)将步骤(14)所得的混合溶液静置4～12h后，以3000～6000r/min的转速离心并取出沉淀物，然后将所述沉淀物在50～70℃下鼓风干燥24～72h，得到所述矿化胶原颗粒。

本发明与现有技术相比至少具有如下有益效果：

(1)本发明通过将至少两层由I型胶原构成的胶原膜经喷涂粘合介质、叠加复合、辊压得到致密层，再将致密层和由I型胶原和矿化胶原颗粒构成的内部多孔的复合胶原膜依次进行辊压、交联，得到胶原基硬脑膜。如此，基于I型胶原和矿化胶原颗粒，在未添加任何抗粘合剂的基础上，制备了具有极佳力学强度和抗粘连性能的胶原基硬脑膜，克服了胶原本身力学性能较差且易黏附的缺陷。

(2)在本发明中，至少两层胶原膜和复合胶原膜均由冷冻干燥获得，通过将至少两层胶原膜通过预辊压、喷涂粘合介质粘合、辊压，再喷涂粘合介质粘合复合胶原膜、再辊压而得到了胶原基硬脑膜，而且粘合介质为由I型胶原配制的固含量为0～0.015％的胶原凝胶液，喷涂操作更简单；通过这一系列的方式使得该胶原基硬脑膜不仅相对于直接复合风干的膜具有更优异的柔韧性，且相对于仅直接复合上述冷冻干燥的膜同样具有更优异的抗缝合性和抗拉伸性能。

(3)在本发明中，在胶原膜层上复合所述复合胶原膜层时，通过控制喷涂粘合介质时所用的喷涂量，能够使该复合胶原膜层保持内部为多孔状结构，从而使得本发明制备的胶原基硬脑膜在使用时，经水化后仍能保持其复合胶原膜层侧的疏水多孔的三维结构，进而有利于细胞的爬行替代；同时由于该复合胶原膜层中含有能促进成骨的矿化胶原颗粒，更有利于细胞的增值和分化。

(4)在本发明中，将至少两层胶原膜通过预辊压、喷涂粘合介质粘合、辊压而得到的胶原膜层具有较为致密的结构，与复合胶原膜层相比，该胶原膜层为致密层，能够有效防止脑脊液的溢出。

(5)在对胶原膜层和复合胶原膜层复合后的材料进行辊压成形后，经过交联处理，使得胶原基硬脑膜的胶原膜层侧(即朝向脑组织侧的胶原基硬脑膜侧)不会黏附软硬组织，且在水化后仍不易发生变形。

(6)在本发明中，胶原本身具有极强的亲水性和粘附性，如此通过层与层之间通过喷涂粘合介质使层吸水发生溶胀，相互粘连在一起，然后再通过辊压的作用使其聚集在一起，并在每层的粘合界面之间都形成了一道致密的屏障层，从而提高胶原基硬脑膜力学性能，同时使该胶原基硬脑膜不易分层；此外，层与层之间通过交联处理后，再通过鼓风干燥或风干，便能使定型，得到具有致密层和疏松层的胶原基硬脑膜。

附图说明

图1是本发明实施例提供的一种胶原基硬脑膜的结构示意图；

图2是本发明实施例提供的一种胶原基硬脑膜的制备方法的流程图；

图3是本发明实施例1提供的一种胶原基硬脑膜的结构示意图；

图4是本发明实施例1提供的朝向颅骨侧的一种胶原基硬脑膜的电镜图；

图5是本发明实施例1提供的朝向脑组织侧的一种胶原基硬脑膜的电镜图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

由于胶原的力学性能较差，为防止漏液通常都需要与支架载体一起作用于缺损部位；其次由于胶原的粘附性较强，为防止胶原与脑组织粘连而引发癫痫等并发症，通常需要交联或添加抗粘连成分，但这会使得胶原的效果大大折扣。现有胶原的成型方法包括冷冻干燥、风干、静电纺丝等，虽然冷冻干燥能够保证胶原膜内部的孔隙结构，以吸水、贴敷性好，但其力学性能较差；采用风干方法能够使胶原具有较好的力学性能，但因较硬其贴敷性差；采用静电纺丝方法同样会使胶原的力学性能较差。

授权公告号为CN106390204B的专利申请公开了复合型人工硬脑膜，其包括两层包含生物蛋白和细胞生长因子的水凝胶层和一层高分子可降解材料编织层；授权公告号为CN105999419B的专利申请公开了仿生型可吸收硬脑膜补片，其包括由可降解合成生物高分子材料和天然生物高分子制得的润滑层，以及由可降解合成生物高分子材料和亲水性合成高分子制得的促硬脑膜再生层。上述专利均将胶原蛋白作为其主要活性成分，用于引导新生组织的生成，但同时又都鉴于胶原蛋白的力学性能差、易粘连等特点而采用其他材料与其共同复合使用。

为此，本发明基于胶原本身极强的亲水性和粘附性，通过喷涂粘合介质、辊压的方式制备了由纯胶原制备的具有高力学性能且防粘连的胶原基硬脑膜。

下面描述以上构思的具体实现方式。

如图1所示，本发明实施例提供了一种胶原基硬脑膜，

所述胶原基硬脑膜包括朝向脑组织侧的胶原膜层101和朝向颅骨侧的复合胶原膜层102；

所述胶原膜层101包括至少两层胶原膜，所述胶原膜由I型胶原构成；其中，所述胶原膜层101为由所述至少两层胶原膜经喷涂粘合介质、叠加复合、辊压得到的致密层；

所述至少两层胶原膜包括第一胶原膜1001和至少一层第二胶原膜1002，且所述第一胶原膜1001朝向脑组织侧；所述第一胶原膜1001与所述第二胶原膜1002的厚度之比为1:(1.5～2)(例如，可以为1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9或1:2)；

所述复合胶原膜层102由I型胶原和矿化胶原颗粒复合而成，内部为多孔状结构；

在将所述胶原膜层101和所述复合胶原膜层102复合后，还对复合后的材料依次进行辊压成形和交联处理，以得到所述胶原基硬脑膜。

需要说明的是，本发明的胶原基硬脑膜包括如图1所示的结构示意图，同时还包括由第一胶原膜、一层第二胶原膜和复合胶原膜层复合得到的胶原基硬脑膜的结构示意图。且每层第二胶原膜的厚度均相同。喷涂粘合介质时选择可持续、定量的喷雾设备。

在本发明中，由至少两层胶原膜经喷涂粘合介质、叠加复合、辊压得到的胶原膜层为致密层，能够朝向脑组织侧，不仅为该胶原基硬脑膜提供一定的力学强度，还能够有效防止脑脊液的溢出；复合胶原膜层复合到胶原膜层后仍能保持其内部的多孔结构，能够朝向颅骨侧，利于细胞的爬行替代，而且复合胶原膜层内的矿化胶原颗还能够促进成骨以及细胞的增值和分化。

根据一些优选的实施方式，所述粘合介质为由I型胶原配制的固含量为0～0.015％(例如，可以为0％、0.001％、0.002％、0.004％、0.005％、0.006％、0.008％、0.01％、0.012％、0.014％或0.015％)的胶原凝胶液。需要说明的是，固含量为0％的胶原凝胶液即为水。

在本发明中，粘合介质为水或固含量较低的胶原凝胶溶液，其主要成分为水和/或I型胶原，无需引入其他粘合剂便能实现各胶原膜层之间的粘结。

需要说明的是，在将第一胶原膜和至少一层第二胶原膜经喷涂粘合介质、叠加复合、辊压时，喷涂粘合介质能够使胶原膜吸水溶胀进而粘结在一起，但经过同样的喷涂粘合介质处理步骤，厚度较薄的第一胶原膜比厚度较厚的第二胶原膜更易溶胀，因而第一胶原膜由于吸水较多，在后续辊压作用下能够形成更为致密的结构，因此，将该第一胶原膜朝向脑组织侧，则更能有效防止脑脊液的溢出。

在本发明中，在对胶原膜层和复合胶原膜层复合后的材料进行辊压成形后，经过交联处理，使得胶原基硬脑膜的胶原膜层侧(即朝向脑组织侧的胶原基硬脑膜侧)不会黏附软硬组织，且在水化后仍不易发生变形。

根据一些优选的实施方式，所述胶原膜的密度为0.02～0.1g/cm³(例如，可以为0.02g/cm³、0.03g/cm³、0.04g/cm³、0.05g/cm³、0.055g/cm³、0.06g/cm³、0.065g/cm³、0.07g/cm³、0.075g/cm³、0.08g/cm³、0.085g/cm³、0.09g/cm³、0.095g/cm³或0.1g/cm³)。

根据一些优选的实施方式，所述第二胶原膜的厚度为0.3～2.0mm(例如，可以为0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm、0.5mm、0.55mm、0.6mm、0.65mm、0.7mm、0.75mm、0.8mm、0.85mm、0.9mm、0.95mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm或2.0mm)。

根据一些更优选的实施方式，所述第二胶原膜的层数为1～8层(例如，可以为1层、2层、3层、4层、5层、6层、7层或8层)。

根据一些优选的实施方式，所述复合胶原膜层的平均孔径为25～500μm(例如，可以为25μm、50μm、75μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm)，孔隙率为60～75％(例如，可以为60％、71％、72％、73％、74％或75％)。

根据一些更优选的实施方式，所述复合胶原膜层的厚度为0.3～2.0mm(例如，可以为0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm、0.5mm、0.55mm、0.6mm、0.65mm、0.7mm、0.75mm、0.8mm、0.85mm、0.9mm、0.95mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm或2.0mm)。

需要说明的是，在本发明中，复合胶原膜层的厚度大于第一胶原膜的厚度，优选地复合胶原膜层的厚度与第二胶原膜的厚度相同。

根据一些更优选的实施方式，所述胶原基硬脑膜的厚度为0.3～2mm(例如，可以为0.3mm、0.5mm、0.6mm、0.8mm、1mm、1.2mm、1.5mm、1.6mm、1.8mm或2mm)。

需要说明的是，胶原基硬脑膜的厚度具体根据实际使用需要进行设计，包括但不限于0.3～2mm。

根据一些优选的实施方式，所述复合胶原膜中I型胶原和矿化胶原颗粒的质量比为100:(0.3～1)(例如，可以为100:0.3、100:0.4、100:0.5、100:0.6、100:0.7、100:0.8、100:0.9或100:1)。

根据一些优选的实施方式，所述矿化胶原颗粒的粒径为200～500μm(例如，可以为200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm)。

在本发明中，复合胶原膜中胶原的质量与加入的矿化胶原颗粒的质量比为100:(0.3～1)，该质量比低于100:0.3时，由于矿化胶原颗粒较少，不利于成骨；而当质量比大于100:1时，矿化胶原颗粒过多则会影响所制备的胶原基硬脑膜的力学性能。

根据一些优选的实施方式，所述胶原膜和所述复合胶原膜层均通过冷冻干燥获得。

需要说明的是经冷冻干燥获得的，能够保证胶原膜和复合胶原膜层呈海绵状，保留内部多孔的三维结构。

根据一些优选的实施方式，所述胶原膜层中任意相邻两层胶原膜之间喷涂粘合介质时所用的喷涂量均相同；

所述胶原膜层和所述复合胶原膜层复合时，还包括在所述胶原膜层喷涂所述粘合介质；所述胶原膜层和所述复合胶原膜层复合时喷涂粘合介质所用的喷涂量低于所述胶原膜层中任意相邻两层胶原膜之间喷涂粘合介质时所用的喷涂量。

需要说明的是，在本发明中，一方面，由于胶原膜和复合胶原膜层均为冷冻干燥获得的，均保留了其三维孔隙结构，虽然其经机械辊压后其厚度会小，三维结构也会变得较为致密，但遇水仍能恢复一定的三维结构；另一方面，胶原膜和复合胶原膜层吸水均会发生一定的溶胀，且I型胶原本身具有较强的粘附性。因此，通过控制任意相邻两层胶原膜之间的喷涂粘合介质的用量，借助胶原膜的吸水溶胀特性以及胶原本身的粘附性，在喷涂粘合介质后再进行辊压，便能借助辊压的压力将喷涂后的两层胶原膜牢固地黏附在一起，形成较为致密的结构。如此，通过将第一胶原膜和至少一层第二胶原膜进行叠加，即将具有这样较为致密的结构的胶原膜进行叠加从而达到了增强力学效果的作用。此外，在辊压压力的作用下，界面处的水分会有预压膜的表面向预压膜的中间部分迁移，由于含量较低不足以使该膜发生内部溶胀，使该膜内部密度相对界面粘接初较低，故能够在该膜水化时易吸水，保持该膜的柔韧性，进而保证胶原基硬脑膜的柔韧性。

在本发明中，在喷涂粘合介质的喷涂量相同时，厚度较薄的第一胶原膜比厚度较厚的第二胶原膜更易溶胀，因而辊压时，第一胶原膜能够形成更为致密的结构，因此，将该第一胶原膜朝向脑组织侧，则更能有效防止脑脊液的溢出。

同时，在本发明中，胶原膜层和复合胶原膜层复合时，在胶原膜层喷涂粘合介质，即控制第二胶原膜与复合胶原膜层之间的喷涂量，由于第二胶原膜厚度与复合胶原膜层的厚度相同，因此采用低于胶原膜层中任意相邻两层胶原膜之间喷涂粘合介质时所用的喷涂量时，复合胶原膜层溶胀程度低于第二胶原膜，故在辊压后，仅溶胀部分能够与第二层胶原膜黏附，而未溶胀部分仍能保持其疏松的三维结构。

根据一些更优选的实施方式，所述胶原膜层中任意相邻两层胶原膜之间喷涂粘合介质时所用的喷涂量为0.0015～0.0061mL/cm²(例如，可以为0.0015mL/cm²、0.002mL/cm²、0.003mL/cm²、0.0035mL/cm²、0.004mL/cm²、0.0045mL/cm²、0.005mL/cm²、0.0055mL/cm²、0.006mL/cm²或0.0061mL/cm²)。

根据一些更优选的实施方式，在所述胶原膜层喷涂粘合介质时所用的喷涂量为0.00075～0.003mL/cm²(例如，可以为0.00075mL/cm²、0.001mL/cm²、0.0015mL/cm²、0.002mL/cm²、0.0025mL/cm²或0.003mL/cm²)。

根据一些优选的实施方式，所述交联处理时所用的交联液浓度为5～50mmol/L(例如，可以为5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L或50mmol/L)，所述交联液中交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述交联液中溶剂为含有70％乙醇的水溶液。

需要说明的是，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(即EDC)，易溶解于含有70％体积分数乙醇的水溶液中，当乙醇含量低于70％时，EDC会发生溶胀；而当乙醇含量高于70％，EDC不溶。

本发明还提供了上述所提供的胶原基硬脑膜的制备方法，所述制备方法包括：

(1)制备矿化胶原颗粒；

(2)利用I型胶原制备第一胶原膜和第二胶原膜，并利用所述矿化胶原颗粒和所述I型胶原制备复合胶原膜层；所述第一胶原膜与所述第二胶原膜的厚度之比为1:(1.5～2)；

(3)在所述第一胶原膜上喷涂粘合介质并叠加复合至少一层第二胶原膜后，经过辊压得到胶原膜层；所述粘合介质为由I型胶原配制的固含量为0～0.015％的胶原凝胶液；

(4)在所述胶原膜层上复合所述复合胶原膜层，并对复合后的材料依次进行辊压成形和交联处理，得到所述胶原基硬脑膜。

根据一些优选的实施方式，步骤(1)所述制备矿化胶原颗粒包括：

(11)将I型胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中，配制成浓度为0.01～0.2g/mL(例如，可以为0.01g/mL、0.02g/mL、0.04g/mL、0.05g/mL、0.1g/mL、0.12g/mL、0.15g/mL、0.18g/mL或0.2g/mL)的胶原酸液；

(12)向胶原酸液中滴加钙盐溶液；其中，钙离子的加入量为每克胶原对应加入钙离子0.1～2mol(例如，可以为0.1mol、0.2mol、0.5mol、0.6mol、0.8mol、1.2mol、1.5mol、1.6mol、1.8mol或2mol)；

(13)向步骤(12)所得溶液中滴加磷酸溶液；其中磷酸根离子的加入量与步骤(12)中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝1:1～2:1(例如，可以为1:1、1.2:1、1.5:1、1.6:1、1.8:1或2:1)；

(14)向步骤(13)所得溶液中滴加NaOH溶液，得到混合溶液；其中，所述混合溶液的pH值为6～8(例如，可以为6、6.5、7、7.5或8)；

(15)将步骤(14)所得的混合溶液静置4～12h(例如，可以为4h、6h、8h、10h或12h)后，以3000～6000r/min(例如，可以为3000r/min、4000r/min、5000r/min或6000r/min)的转速离心并取出沉淀物，然后将所述沉淀物在50～70℃(例如，可以为50℃、60℃或70℃)下鼓风干燥24～72h(例如，可以为24h、30h、42h、48h、54h、60h、66h或72h)，得到所述矿化胶原颗粒。

根据一些优选的实施方式，所述矿化胶原颗粒的粒径为200～500μm。

根据一些优选的实施方式，所述步骤(2)包括如下子步骤：

(21)将I型胶原配制成固含量为0.8～1.5％(例如，可以为0.8％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％)的胶原凝胶液；

(22)将所述胶原凝胶液涂覆在平板模具上，流延平整或借助工具刮平整，然后进行冷冻干燥，得到所述第一胶原膜和所述第二胶原膜；

(23)在所述胶原凝胶液和步骤(1)制备的所述矿化胶原颗粒进行混合，得到混合液，将所述混合液涂覆在平板模具上，流延平整或借助工具刮平整，然后进行冷冻干燥，得到所述复合胶原膜；其中，所述胶原凝胶液中的胶原与所述矿化胶原颗粒的质量比为100:(0.3～1)；

其中，所述冷冻干燥包括预冻阶段、第一升华阶段、第二升华阶段和降温阶段，各个阶段的工艺条件如下：

预冻阶段：目标温度为-12～-8℃，降温速率为3～4℃/min，该目标温度下的保温时长为250～280min；

第一升华阶段进行抽真空，真空度为50～120Pa，包括四个升温阶梯，分别为：

-4～-2℃，升温速率为0.2～0.3℃/min，恒温时长为200～220min；

1～2℃，升温速率为0.1～0.2℃/min，恒温时长为200～220min；

4～6℃，升温速率为0.3～0.4℃/min，恒温时长为160～180min；

8～10℃，升温速率为0.4～0.5℃/min，恒温时长为160～180min；

第二升华阶段进行抽真空，真空度为50～120Pa，包括五个升温阶梯，分别为：

14～16℃，升温速率为1～1.2℃/min，恒温时长为120～140min；

20～22℃，升温速率为1～1.2℃/min，恒温时长为120～140min；

36～38℃，升温速率为1.6～1.8℃/min，恒温时长为70～80min；

42～45℃，升温速率为1.6～1.8℃/min，恒温时长为70～80min；

55～60℃，升温速率为0.8～1℃/min，恒温时长：每隔1小时进行终点判断，至终点判断合格为止；终点判断为≤0.5Pa/10min；

降温阶段：目标温度为室温(例如，可以为25℃)，降温速率为4～6℃/min。

需要说明的是，针对冷冻干燥，预冻阶段：目标温度为-12～-8℃(例如，可以为-12℃、-11℃、-10℃、-9℃或-8℃)，降温速率为3～4℃/min(例如，可以为3℃/min、3.2℃/min、3.4℃/min、3.6℃/min、3.8℃/min或4℃/min)，保温时长为250～280min(例如，可以为250min、260min、270min或280min)。

真空度为50～120Pa，例如，可以为50Pa、55Pa、60Pa、65Pa、70Pa、75Pa、80Pa、85Pa、90Pa、95Pa、100Pa、105Pa、110Pa、115Pa、或120Pa；

第一升华阶段的四个升温阶段中，-4～-2℃可以为-4℃、-3.5℃、-3℃、-2.5℃或-2℃；1～2℃可以为1℃、1.5℃或2℃；4～6℃可以为4℃、5℃或6℃；8～10℃可以为8℃、9℃或10℃；

升温速率为0.2～0.3℃/min，例如，可以为0.2℃/min、0.25℃/min或0.3℃/min；

升温速率为0.1～0.2℃/min，例如，可以为0.1℃/min、0.15℃/min或0.2℃/min；

升温速率为0.3～0.4℃/min，例如，可以为0.3℃/min、0.35℃/min或0.4℃/min；

升温速率为0.4～0.5℃/min，例如，可以为0.4℃/min、0.45℃/min或0.5℃/min；

恒温时长为200～220min，例如，可以为200min、205min、210min、215min或220min；

恒温时长为160～180min，例如，可以为160min、165min、170min、175min或180min。

第二升华阶段的五个升温阶段中，14～16℃可以为14℃、15℃或16℃；20～22℃可以为20℃、21℃或22℃；36～38℃可以为36℃、37℃或38℃；42～45℃可以为42℃、43℃、44℃或45℃；55～60℃可以为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃；

升温速率为1～1.2℃/min，例如，可以为1℃/min、1.05℃/min、1.1℃/min、1.15℃/min或1.2℃/min；

升温速率为0.2～0.3℃/min，例如，可以为0.2℃/min、0.25℃/min或0.3℃/min；

升温速率为1.6～1.8℃/min，例如，可以为1.6℃/min、1.65℃/min、1.7℃/min、1.75℃/min或1.8℃/min；

升温速率为0.8～1℃/min，例如，可以为0.8℃/min、0.9℃/min或1℃/min；

恒温时长为120～140min，例如，可以为120min、125min、130min、135min或140min；

恒温时长为70～80min，例如，可以为70min、75min或80min。

降温阶段的降温速率为4～6℃/min，例如，可以为4℃/min、4.5℃/min、5℃/min、5.5℃/min或6℃/min。

需要说明的是，胶原膜和复合胶原膜层的厚度均通过控制冷冻干燥后膜中的胶原净重进行控制。由于胶原凝胶液的固含量不同，相同质量的胶原凝胶液铺在单位面积上的厚度也不相同，因此主要通过控制胶原净重控制厚度。

在本发明中，采用这一冷冻干燥方式对材料进行冷冻干燥具有如下优点：干燥效果好，能排除95％～99％以上的水分；冷冻干燥在低温下进行，胶原不会发生变性或失去生物活力；冻干后产品体积几乎不变，保持了原来多孔的三维结构，不会发生缩皱现象。

根据一些优选的实施方式，步骤(2)胶原凝胶液通常采用现有方法制备得到。

根据一些更优选的实施方式，第二胶原膜的厚度为0.3～2.0mm；复合胶原膜层的厚度为0.3～2.0mm。

根据一些优选的实施方式，所述步骤(3)包括如下子步骤：

(31)将所述第一胶原膜和所述第二胶原膜分别进行预辊压；所述预辊压的压力为2～10MPa，辊压线速度为25～100cm/min，辊压厚度小于进行预辊压的胶原膜的厚度；

(32)在预辊压后的第一胶原膜上依次复合至少一层预辊压后的第二胶原膜，然后进行辊压，得到所述胶原膜层；其中，每复合一层预辊压后的第二胶原膜前均进行喷涂粘合介质，所述喷涂粘合介质的喷涂量为0.0015～0.0061mL/cm²；所述辊压的压力为2～10MPa，辊压线速度为25～100cm/min，所述辊压的辊压厚度为所述第一胶原膜和至少一层所述第二胶原膜厚度之和的35～65％。

需要说明的是，在步骤(31)中，优选地，辊压厚度小于进行预辊压的胶原膜的厚度的1/2。如此，通过预辊压将胶原膜压成薄片，使得预辊压后的表面致密平整，有利于喷涂粘合介质时使水或胶原凝胶液均匀分布，从而便于复合粘接两层胶原膜。

根据一些优选的实施方式，所述步骤(4)包括如下子步骤：

(41)对所述复合胶原膜层进行预辊压；所述预辊压的压力为2～10MPa，辊压线速度为25～100cm/min，辊压厚度小于所述复合胶原膜层的厚度；

(42)在所述胶原膜层上喷涂所述粘合介质后，将预辊压的复合胶原膜层复合在所述胶原膜层上；其中，在所述胶原膜层上喷涂粘合介质时所用的喷涂量为0.00075～0.003mL/cm²；

(43)将由所述胶原膜层和所述复合胶原膜层复合后的材料于2～10MPa的压力下进行辊压；其中，辊压线速度为25～100cm/min，所述辊压的辊压厚度为所述胶原膜层和所述复合胶原膜层厚度之和的35～65％；

(44)将经步骤(43)辊压后的材料置于浓度为5～50mmol/L的交联液中并于-5～0℃下交联20～60min；所述交联液中交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述交联液中溶剂为含有70％乙醇的水溶液；

(45)将经步骤(44)交联后的材料依次用纯水和所述溶剂进行清洗，然后再于35～50℃的条件下干燥8～16h，得到所述胶原基硬脑膜；

其中，所述胶原基硬脑膜包括由上至下的复合胶原膜层、至少一层第二胶原膜和第一胶原膜。

需要说明的是，对于步骤(3)和步骤(4)的预辊压和辊压来说，压力为2～10MPa，例如，可以为2MPa、4MPa、5MPa、6MPa、8MPa或10MPa；辊压线速度为25～100cm/min，例如，可以为25cm/min、30cm/min、40cm/min、50cm/min、60cm/min、70cm/min、80cm/min、90cm/min或100cm/min。

在进行辊压步骤(32)和步骤(43)中的辊压成形时的压力优选为2～10MPa。施加压力过小时，易造成胶原膜层中出现分层，或胶原膜层和复合胶原膜层分层；施加压力过大时，易造成复合胶原膜层掉粉，导致产品有效成分流失。

在步骤(43)中对胶原膜层和复合胶原膜层进行辊压成形时，辊压厚度为两个膜层之和的35～65％(例如，可以为35％、40％、45％、50％、55％或65％)。

针对步骤(44)中的交联，具体为于-5～0℃(例如，可以为-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃或0℃)下交联20～60min(例如，可以为20min、30min、40min、50min或60min)。在本发明中，为了防止EDC失活，设置交联处理的温度为-5～0℃。

针对步骤(45)的清洗，更具体地，进行清洗时，先用流动的纯水冲洗10～30s，重复3～5次，再用70％的乙醇水溶液洗涤3～5次，每次洗涤30～60s，以彻底去除残留的交联成分，然后置于70％的乙醇水溶液中浸泡，浸泡时间为12～48h(例如，可以为12h、24h、36h或48h)。

针对步骤(45)中的干燥，于35～50℃(例如，可以为35℃、40℃、45℃或50℃)下干燥8～16h(例如，可以为8h、10h、12h、14h或16h)。在本发明中，由于交联已初步将胶原膜层和复合胶原膜层复合后的材料进行了定型，故经鼓风干燥或风干后，该材料内部的致密层和疏松层结构不会随干燥处理发生变化，因而通过干燥处理便能使其进一步定型。需要说明的是，步骤(45)中的干燥不能为真空干燥，因为真空干燥会造成鼓包，破坏胶原基硬脑膜的结构。

本发明采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐作为交联剂，交联后能够使胶原基硬脑膜不易溶于水，且表面防粘连，同时相比于研究团队以往所用的戊二醛，还具有如下优点：制成的产品生物相容性好，碳化二亚胺盐酸盐本身不成为实际交联的一部分，而是形成了可溶于水的脲衍生物，可以通过冲洗除去，避免引入有毒物质导致细胞毒性；而且能提高胶原蛋白的结构稳定性，增强产品的力学性能。对于配制的交联液，乙醇浓度过大会降低交联效果；乙醇浓度过小会使产品交联过度，导致产品溶解成团。

现有技术中胶原的复合或胶原类膜的复合都需要涂层辊压在一起，涂层时无法精确掌握涂层的均匀度，且对于胶原膜来说，由于膜不太平整且较软易皱也不使用旋涂。但在本发明中，仅采用预辊压、喷涂粘合介质便能实现对胶原膜的复合粘接，而且通过控制喷涂量进行粘合得到的胶原膜层便具有较为致密的结构；同时，通过采用较少的喷涂量，在保证胶原膜层和复合胶原膜层粘结的同时，使得复合胶原膜层内部保持多孔状结构。

为了更加清楚地说明本发明的技术方案及优点，下面通过几个实施例对一种胶原基硬脑膜及其制备方法进行详细说明。

以下实施例中，胶原凝胶液均通过如下方法制备得到：

(a)剔除牛跟腱上多余的筋膜、脂肪、肌肉等，用自来水冲洗干净后置于冷冻盒中进行冷冻；

(b)将冷冻的牛跟腱切薄片进行翻洗至液体澄清；

(c)酶解：将清洗干净的牛跟腱薄片进行酶解，充分搅拌，酶解时间不少于72h；

(d)盐析：将酶解后的溶液离心，取其上清液，将上清液加入到氯化钠溶液中，析出白色絮状胶原蛋白，过滤清洗后沥干水分；

(e)透析：将盐析后的材料灌入透析袋中，将透析袋置于0.05mol/L的乙酸溶液中透析液6天；再将透析袋置于0.0005mol/L的乙酸溶液中透析5天；从第12天开始将透析袋置于0.000005mol/L的乙酸溶液中透析至pH为5～6之间，根据需要可每天换一次透析液；

(f)将透析袋中的材料作为胶原凝胶液，并测试胶原凝胶液中I型胶原的固含量。

以下实施例中，所采用的平板模具的平板大小为10cm*20cm*1cm。

实施例1

(1)制备矿化胶原颗粒：

(11)将I型胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中，配制成浓度为0.1g/mL的胶原酸液；

(12)向胶原酸液中滴加钙盐溶液；其中，钙离子的加入量为每克胶原对应加入钙离子1mol；

(13)向步骤(12)所得溶液中滴加磷酸溶液；其中磷酸根离子的加入量与步骤(12)中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝1.5:1；

(14)向步骤(13)所得溶液中滴加NaOH溶液，得到混合溶液；其中，混合溶液的pH值为6.5±0.5；

(15)将步骤(14)所得的混合溶液静置8h后，以4000r/min的转速离心并取出沉淀物，然后将沉淀物在60℃下鼓风干燥60h，得到矿化胶原颗粒(粒径为300μm)；

(2)制备第一胶原膜、第二胶原膜和复合胶原膜层：

(21)将I型胶原配制成固含量为1％的胶原凝胶液；

(22)将胶原凝胶液涂覆在平板模具上，流延平整，然后进行冷冻干燥，得到第一胶原膜(所含胶原净重为0.375g)和第二胶原膜(所含胶原净重为0.75g)；第一胶原膜与第二胶原膜的厚度之比为1:2；

(23)在胶原凝胶液和步骤(1)制备的矿化胶原颗粒进行混合，得到混合液，将混合液涂覆在平板模具上，流延平整，然后进行冷冻干燥，得到复合胶原膜(所含胶原净重为0.75g)；其中，胶原凝胶液中的胶原与矿化胶原颗粒的质量比为100:0.4；

冷冻干燥工艺如下：

将平板模具放入冻干机中，经预冻、第一升华、第二升华和降温四个阶段后，即完成冷冻干燥；其中，第一升华和第二升华阶段抽真空，经掺气后的真空度分别为80Pa和100Pa；其中，四个阶段的参数设置如表1所示；

表1

(3)制备胶原膜层：

(31)将第一胶原膜和3层第二胶原膜分别进行预辊压；预辊压的压力为6MPa，辊压线速度为50cm/min，其中，对应第一胶原膜的辊压厚度为0.25mm，对应第二胶原膜的辊压厚度为0.5mm；

(32)在预辊压后的第一胶原膜上依次复合3层预辊压后的第二胶原膜，每复合一层预辊压后的第二胶原膜前均在两层之间进行喷水0.5mL，以将这4层胶原膜复合在一起，然后将这4层胶原膜置于辊压机上，施加6MPa的压力，辊压线速度为50cm/min，辊压厚度为0.8mm，得到胶原膜层；

(4)制备胶原基硬脑膜：

(41)对复合胶原膜层进行预辊压；预辊压的压力为6MPa，辊压线速度为50cm/min；对应复合胶原膜层的辊压厚度为0.5mm；

(42)在胶原膜层上喷水0.25mL后，将预辊压的复合胶原膜层复合在胶原膜层上；

(43)将由胶原膜层和复合胶原膜层复合后的材料置于辊压机上，施加6MPa的压力，辊压线速度为30cm/min，辊压厚度为1mm，然后再反复辊压一次；

(44)将经步骤(43)辊压后的材料置于浓度为20mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的70％乙醇的水溶液中并于0℃下交联30min；

(45)将经步骤(44)交联后的材料先用流动的纯水冲洗30s，重复3次；再用70％的乙醇水溶液洗涤30s，重复3次；然后置于70％的乙醇水溶液中浸泡12h；将清洗后的膜用多孔的不锈钢膜夹住，然后置于42℃的鼓风干燥箱中干燥12h，得到胶原基硬脑膜。

实施例2

(1)制备矿化胶原颗粒：

(11)将I型胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中，配制成浓度为0.01g/mL的胶原酸液；

(12)向胶原酸液中滴加钙盐溶液；其中，钙离子的加入量为每克胶原对应加入钙离子0.1mol；

(13)向步骤(12)所得溶液中滴加磷酸溶液；其中磷酸根离子的加入量与步骤(12)中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝1:1；

(14)向步骤(13)所得溶液中滴加NaOH溶液，得到混合溶液；其中，混合溶液的pH值为6.5±0.5；

(15)将步骤(14)所得的混合溶液静置4h后，以3000r/min的转速离心并取出沉淀物，然后将沉淀物在50℃下鼓风干燥72h，得到矿化胶原颗粒(粒径为200μm)；

(2)制备第一胶原膜、第二胶原膜和复合胶原膜层：

(21)将I型胶原配制成固含量为0.8％的胶原凝胶液；

(22)将胶原凝胶液涂覆在平板模具上，流延平整，然后进行冷冻干燥，得到第一胶原膜(所含胶原净重为0.3g)和第二胶原膜(所含胶原净重为0.45g)；第一胶原膜与第二胶原膜的厚度之比为1:1.5；

(23)在胶原凝胶液和步骤(1)制备的矿化胶原颗粒进行混合，得到混合液，将混合液涂覆在平板模具上，流延平整，然后进行冷冻干燥，得到复合胶原膜(所含胶原净重为0.45g)；其中，胶原凝胶液中的胶原与矿化胶原颗粒的质量比为100:0.3；

冷冻干燥工艺如下：

将平板模具放入冻干机中，经预冻、第一升华、第二升华和降温四个阶段后，即完成冷冻干燥；其中，第一升华和第二升华阶段抽真空，经掺气后的真空度分别为80Pa和100Pa；其中，四个阶段的参数设置如表2所示；

表2

(3)制备胶原膜层：

(31)将第一胶原膜和3层第二胶原膜分别进行预辊压；预辊压的压力为2MPa，辊压线速度为25cm/min，其中，对应第一胶原膜的辊压厚度为0.15mm，对应第二胶原膜的辊压厚度为0.3mm；

(32)在预辊压后的第一胶原膜上依次复合3层预辊压后的第二胶原膜，每复合一层预辊压后的第二胶原膜前均在两层之间进行喷涂固含量为0.015％的胶原凝胶液0.35mL，以将这4层胶原膜复合在一起，然后将这4层胶原膜置于辊压机上，施加4MPa的压力，辊压线速度为40cm/min，辊压厚度为0.6mm，得到胶原膜层；

(4)制备胶原基硬脑膜：

(41)对复合胶原膜层进行预辊压；预辊压的压力为2MPa，辊压线速度为25cm/min；对应复合胶原膜层的辊压厚度为0.3mm；

(42)在胶原膜层上喷涂固含量为0.015％的胶原凝胶液0.15mL后，将预辊压的复合胶原膜层复合在胶原膜层上；

(43)将由胶原膜层和复合胶原膜层复合后的材料置于辊压机上，施加4MPa的压力，辊压线速度为40cm/min，辊压厚度为0.75mm，然后再反复辊压一次；

(44)将经步骤(43)辊压后的材料置于浓度为5mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的70％乙醇的水溶液中并于-2℃下交联60min；

(45)将经步骤(44)交联后的材料先用流动的纯水冲洗30s，重复3次；再用70％的乙醇水溶液洗涤30s，重复3次；然后置于70％的乙醇水溶液中浸泡24h；将清洗后的膜用多孔的不锈钢膜夹住，然后置于35℃的鼓风干燥箱中干燥16h，得到胶原基硬脑膜。

实施例3

(1)制备矿化胶原颗粒：

(11)将I型胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中，配制成浓度为0.2g/mL的胶原酸液；

(12)向胶原酸液中滴加钙盐溶液；其中，钙离子的加入量为每克胶原对应加入钙离子2mol；

(13)向步骤(12)所得溶液中滴加磷酸溶液；其中磷酸根离子的加入量与步骤(12)中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝2:1；

(14)向步骤(13)所得溶液中滴加NaOH溶液，得到混合溶液；其中，混合溶液的pH值为7±0.5；

(15)将步骤(14)所得的混合溶液静置12h后，以5000r/min的转速离心并取出沉淀物，然后将沉淀物在70℃下鼓风干燥24h，得到矿化胶原颗粒(粒径为500μm)；

(2)制备第一胶原膜、第二胶原膜和复合胶原膜层：

(21)将I型胶原配制成固含量为1.5％的胶原凝胶液；

(22)将胶原凝胶液涂覆在平板模具上，流延平整，然后进行冷冻干燥，得到第一胶原膜(所含胶原净重为0.6g)和第二胶原膜(所含胶原净重为1.2g)；第一胶原膜与第二胶原膜的厚度之比为1:2；

(23)在胶原凝胶液和步骤(1)制备的矿化胶原颗粒进行混合，得到混合液，将混合液涂覆在平板模具上，流延平整，然后进行冷冻干燥，得到复合胶原膜(所含胶原净重为1.2g)；其中，胶原凝胶液中的胶原与矿化胶原颗粒的质量比为100:1；

冷冻干燥工艺如下：

将平板模具放入冻干机中，经预冻、第一升华、第二升华和降温四个阶段后，即完成冷冻干燥；其中，第一升华和第二升华阶段抽真空，经掺气后的真空度为80Pa；其中，四个阶段的参数设置如表3所示；

表3

(3)制备胶原膜层：

(31)将第一胶原膜和2层第二胶原膜分别进行预辊压；预辊压的压力为10MPa，辊压线速度为100cm/min，其中，对应第一胶原膜的辊压厚度为0.4mm，对应第二胶原膜的辊压厚度为0.8mm；

(32)在预辊压后的第一胶原膜上依次复合2层预辊压后的第二胶原膜，每复合一层预辊压后的第二胶原膜前均在两层之间进行喷水1mL，以将这3层胶原膜复合在一起，然后将这3层胶原膜置于辊压机上，施加10MPa的压力，辊压线速度为100cm/min，辊压厚度为0.8mm，得到胶原膜层；

(4)制备胶原基硬脑膜：

(41)对复合胶原膜层进行预辊压；预辊压的压力为6MPa，辊压线速度为50cm/min；对应复合胶原膜层的辊压厚度为0.8mm；

(42)在胶原膜层上喷水0.5mL后，将预辊压的复合胶原膜层复合在胶原膜层上；

(43)将由胶原膜层和复合胶原膜层复合后的材料置于辊压机上，施加10MPa的压力，辊压线速度为100cm/min，辊压厚度为1.1mm，然后再反复辊压一次；

(44)将经步骤(43)辊压后的材料置于浓度为50mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的70％乙醇的水溶液中并于-5℃下交联20min；

(45)将经步骤(44)交联后的材料先用流动的纯水冲洗30s，重复3次；再用70％的乙醇水溶液洗涤30s，重复3次；然后置于70％的乙醇水溶液中浸泡12h；将清洗后的膜用多孔的不锈钢膜夹住，然后置于50℃的鼓风干燥箱中干燥8h，得到胶原基硬脑膜。

实施例4

实施例4与实施例1基本相同，其不同之处在于：

复合胶原膜中I型胶原和矿化胶原颗粒的质量比为100:0.5；

第二胶原膜的层数为8层；

交联液浓度为30mmol/L。

实施例5

实施例5与实施例1基本相同，其不同之处在于：

在步骤(32)中，每复合一层预辊压后的第二胶原膜前均在两层之间进行喷水0.6mL；

在步骤(42)中，在胶原膜层上喷水0.2mL后，将预辊压的复合胶原膜层复合在胶原膜层上。

对比例1

对比例1与实施例1基本相同，其不同之处在于：

第一胶原膜(所含胶原净重为0.75g)，第二胶原膜(所含胶原净重为0.75g)，第一胶原膜与第二胶原膜的厚度之比为1:1。

对比例2

对比例2与实施例1基本相同，其不同之处在于：

在步骤(42)中，在胶原膜层上喷水0.5mL后，将预辊压的复合胶原膜层复合在胶原膜层上。

对比例3

对比例3与实施例1基本相同，其不同之处在于：

在步骤(32)中，每复合一层预辊压后的第二胶原膜前均在两层之间进行喷水0.2mL。

对比例4

对比例4与实施例1基本相同，其区别之处在于：胶原膜层的制备不同

具体地，胶原膜层的制备方法为：将胶原凝胶液(固含量为1％)涂覆在平板模具上，流延平整，然后将该平板模具置于40℃烘箱中干燥36h，得到具有致密结构的胶原膜层；其中，该胶原膜层所含胶原净重为2.625g(0.375g+0.75g*3)。

将实施例1至5以及对比例1至4所制备的胶原基硬脑膜进行拉伸强度测试，得到拉伸强度、断裂伸长率数据和抗缝线拉张强度如表4所示。该拉伸强度测试依据ASTM-D882-02(中文)塑料薄板材抗拉伸性能的标准方法，将样品薄膜修剪成150mm×20mm的矩形试样，将试样置于试验机上进行拉伸强度测试，实验条件为：夹具间距为100mm，夹具分离速度：50mm/min，初始应变速度是50mm/min。抗缝线拉张强度测试条件为：夹具间距100mm，夹具分离速度：50mm/min，初始应变速度：0.5mm/min。使用3-0#的不可吸收性缝合线，样品正中间穿双股线，单股线长75mm。

将实施例1至5以及对比例1至4所制备的胶原基硬脑膜进行Co60灭菌，剂量为15KGy，在灭菌后分别进行上述测试。

表4

由表4可以看出，采用本发明的方法制备的胶原基硬脑膜均具有优异的力学强度。与实施例1相比，对比例1中由于第一胶原膜的厚度与第二胶原膜的厚度相同，在喷水量保持不变的情况下，第一胶原膜吸水并未达到相对饱和，因此溶胀程度有所降低，第一胶原膜所形成的致密结构的致密度仍不如实施例1中的第一胶原膜的致密结构的致密度，从而导致对比例1得到的胶原基硬脑膜无法应用于临床应用中。对比例2与实施例1相比，由于在复合胶原膜层与胶原膜层复合时，喷水用量过多，导致复合胶原膜层溶胀程度增加，呈现致密结构，而无法再保持内部多孔的三维结构，即无法得到胶原基硬脑膜的疏松层，同样导致对比例2得到的胶原基硬脑膜无法应用于临床应用。对比例3与实施例1相比，由于在制备胶原膜层时，各层胶原膜之间喷涂粘合介质用量过少，胶原膜的溶胀程度极低，使得各层胶原膜之间的粘结性较差，易出现分层的现象，且经辊压后无法得到具有致密结构的胶原膜层，即便多层胶原膜叠加也无法增强其力学效果。对比例4与实施例1相比，经鼓风干燥得到的致密的胶原膜层表面不平整，且与复合胶原膜层复合的界面极易分层，因此会导致其力学性能降低。

具体地，将实施例1制备得到的胶原基硬脑膜喷水水化后，再次按照实施例步骤(2)中的冷冻干燥工艺进行冷冻干燥后，对其表面分别进行形貌观察，得到图4和图5；其中，图4、图5分别对应实施例1中胶原基硬脑膜朝向颅骨侧和朝向脑组织侧的电镜图。从电镜图中可看出，水化后再次冷冻干燥的胶原基硬脑膜，其朝向脑组织侧的表面仍较为致密，且表面光滑；朝向颅骨侧的表面仍保持内部多孔的三维结构。另外，经检测，该胶原基硬脑膜的厚度为1.2mm。

综上所述，采用本发明的方法制备的胶原基硬脑膜具有优异的力学强度，克服了制备了具有极佳力学强度和抗粘连性能的胶原基硬脑膜，克服了胶原本身力学性能较差且易黏附的缺陷能够在该膜水化时易吸水，保持该膜的柔韧性，进而保证胶原基硬脑膜的柔韧性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种胶原基硬脑膜，其特征在于，

所述胶原基硬脑膜包括朝向脑组织侧的胶原膜层和朝向颅骨侧的复合胶原膜层；

所述胶原膜层包括至少两层胶原膜，所述胶原膜由I型胶原构成；其中，所述胶原膜层为由所述至少两层胶原膜经喷涂粘合介质、叠加复合、辊压得到的致密层；

所述至少两层胶原膜包括第一胶原膜和至少一层第二胶原膜，且所述第一胶原膜朝向脑组织侧；所述第一胶原膜与所述第二胶原膜的厚度之比为1:(1.5～2)；

所述复合胶原膜层由I型胶原和矿化胶原颗粒复合而成，内部为多孔状结构；

在将所述胶原膜层和所述复合胶原膜层复合后，还对复合后的材料依次进行辊压成形和交联处理，以得到所述胶原基硬脑膜。

2.根据权利要求1所述的胶原基硬脑膜，其特征在于，

所述胶原膜的密度为0.02～0.1g/cm³；优选所述第二胶原膜的厚度为0.3～2.0mm，优选所述第二胶原膜的层数为1～8层；和/或

所述复合胶原膜层的平均孔径为25～500μm，孔隙率为60～75％，优选所述复合胶原膜层的厚度为0.3～2.0mm；

优选地，所述胶原基硬脑膜的厚度为0.3～2mm。

3.根据权利要求1所述的胶原基硬脑膜，其特征在于，

所述复合胶原膜中I型胶原和矿化胶原颗粒的质量比为100:(0.3～1)；优选地，所述矿化胶原颗粒的粒径为200～500μm；和/或

所述粘合介质为由I型胶原配制的固含量为0～0.015％的胶原凝胶液；

所述胶原膜层中任意相邻两层胶原膜之间喷涂粘合介质时所用的喷涂量均相同，优选地，该喷涂量为0.0015～0.0061mL/cm²；

所述胶原膜层和所述复合胶原膜层复合时，还包括在所述胶原膜层喷涂所述粘合介质；优选地，所述胶原膜层和所述复合胶原膜层复合时喷涂粘合介质所用的喷涂量低于所述胶原膜层中任意相邻两层胶原膜之间喷涂粘合介质时所用的喷涂量；在所述胶原膜层喷涂粘合介质时所用的喷涂量为0.00075～0.003mL/cm²。

4.根据权利要求1至3中任一所述的胶原基硬脑膜，其特征在于，

所述胶原膜和所述复合胶原膜层均通过冷冻干燥获得；和/或

所述交联处理时所用的交联液浓度为5～50mmol/L，所述交联液中交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述交联液中溶剂为含有70％乙醇的水溶液。

5.一种根据权利要求1至4中任一所述的胶原基硬脑膜的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

(1)制备矿化胶原颗粒；

(2)利用I型胶原制备第一胶原膜和第二胶原膜，并利用所述矿化胶原颗粒和所述I型胶原制备复合胶原膜层；所述第一胶原膜与所述第二胶原膜的厚度之比为1:(1.5～2)；

(3)在所述第一胶原膜上喷涂粘合介质并叠加复合至少一层第二胶原膜后，经过辊压得到胶原膜层；所述粘合介质为由I型胶原配制的固含量为0～0.015％的胶原凝胶液；

(4)在所述胶原膜层上复合所述复合胶原膜层，并对复合后的材料依次进行辊压成形和交联处理，得到所述胶原基硬脑膜。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，

所述步骤(4)包括如下子步骤：

(41)对所述复合胶原膜层进行预辊压；所述预辊压的压力为2～10MPa，辊压线速度为25～100cm/min，辊压厚度小于所述复合胶原膜层的厚度；

(42)在所述胶原膜层上喷涂所述粘合介质后，将预辊压的复合胶原膜层复合在所述胶原膜层上；其中，在所述胶原膜层上喷涂粘合介质时所用的喷涂量为0.00075～0.003mL/cm²；

(43)将由所述胶原膜层和所述复合胶原膜层复合后的材料于2～10MPa的压力下进行辊压；其中，辊压线速度为25～100cm/min，所述辊压的辊压厚度为所述胶原膜层和所述复合胶原膜层厚度之和的35～65％；

(44)将经步骤(43)辊压后的材料置于浓度为5～50mmol/L的交联液中并于-5～0℃下交联20～60min；所述交联液中交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述交联液中溶剂为含有70％乙醇的水溶液；

(45)将经步骤(44)交联后的材料依次用纯水和所述溶剂进行清洗，然后再于35～50℃的条件下干燥8～16h，得到所述胶原基硬脑膜；

其中，所述胶原基硬脑膜包括由上至下的复合胶原膜层、至少一层第二胶原膜和第一胶原膜。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，

所述步骤(3)包括如下子步骤：

(31)将所述第一胶原膜和所述第二胶原膜分别进行预辊压；所述预辊压的压力为2～10MPa，辊压线速度为25～100cm/min，辊压厚度小于进行预辊压的胶原膜的厚度；

(32)在预辊压后的第一胶原膜上依次复合至少一层预辊压后的第二胶原膜，然后进行辊压，得到所述胶原膜层；其中，每复合一层预辊压后的第二胶原膜前均进行喷涂粘合介质，所述喷涂粘合介质的喷涂量为0.0015～0.0061mL/cm²；所述辊压的压力为2～10MPa，辊压线速度为25～100cm/min，所述辊压的辊压厚度为所述第一胶原膜和至少一层所述第二胶原膜厚度之和的35～65％。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，

所述步骤(2)包括如下子步骤：

(21)将I型胶原配制成固含量为0.8～1.5％的胶原凝胶液；

(22)将所述胶原凝胶液涂覆在平板模具上，流延平整或借助工具刮平整，然后进行冷冻干燥，得到所述第一胶原膜和所述第二胶原膜；优选所述第二胶原膜的厚度为0.3～2.0mm；

(23)在所述胶原凝胶液和步骤(1)制备的所述矿化胶原颗粒进行混合，得到混合液，将所述混合液涂覆在平板模具上，流延平整或借助工具刮平整，然后进行冷冻干燥，得到所述复合胶原膜；其中，所述胶原凝胶液中的胶原与所述矿化胶原颗粒的质量比为100:(0.3～1)，优选所述复合胶原膜层的厚度为0.3～2.0mm。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，

所述冷冻干燥包括预冻阶段、第一升华阶段、第二升华阶段和降温阶段，各个阶段的工艺条件如下：

预冻阶段：目标温度为-12～-8℃，降温速率为3～4℃/min，恒温时长为250～280min；

第一升华阶段进行抽真空，真空度为50～120Pa，包括四个升温阶梯，分别为：

-4～-2℃，升温速率为0.2～0.3℃/min，恒温时长为200～220min；

1～2℃，升温速率为0.1～0.2℃/min，恒温时长为200～220min；

4～6℃，升温速率为0.3～0.4℃/min，恒温时长为160～180min；

8～10℃，升温速率为0.4～0.5℃/min，恒温时长为160～180min；

第二升华阶段进行抽真空，真空度为50～120Pa，包括五个升温阶梯，分别为：

14～16℃，升温速率为1～1.2℃/min，恒温时长为120～140min；

20～22℃，升温速率为1～1.2℃/min，恒温时长为120～140min；

36～38℃，升温速率为1.6～1.8℃/min，恒温时长为70～80min；

42～45℃，升温速率为1.6～1.8℃/min，恒温时长为70～80min；

55～60℃，升温速率为0.8～1℃/min，恒温时长：每隔1小时进行终点判断，至终点判断合格为止；终点≤0.5Pa/10min；

降温阶段：目标温度为室温，降温速率为4～6℃/min。

10.根据权利要求5至9中任一所述的制备方法，其特征在于，所述制备矿化胶原颗粒包括：

(11)将I型胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中，配制成浓度为0.01～0.2g/mL的胶原酸液；

(12)向胶原酸液中滴加钙盐溶液；其中，钙离子的加入量为每克胶原对应加入钙离子0.1～2mol；

(13)向步骤(12)所得溶液中滴加磷酸溶液；其中磷酸根离子的加入量与步骤(12)中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝1:1～2:1；

(14)向步骤(13)所得溶液中滴加NaOH溶液，得到混合溶液；其中，所述混合溶液的pH值为6～8；

(15)将步骤(14)所得的混合溶液静置4～12h后，以3000～6000r/min的转速离心并取出沉淀物，然后将所述沉淀物在50～70℃下鼓风干燥24～72h，得到所述矿化胶原颗粒。

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