CN116531576A - 一种双层引导组织再生膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双层引导组织再生膜及其制备方法；所述的双层引导组织再生膜包括：致密层和疏松层；所述致密层的材料包括：天然I型胶原蛋白和高分子聚合物；所述的致密层由若干亚致密层层叠构成，且若干所述的亚致密层中所述高分子聚合物的含量依次递减、所述天然I型胶原蛋白的含量依次递增；所述天然I型胶原蛋白含量多的亚致密层与所述疏松层通过交联剂连接。本发明中的致密层由天然I型胶原蛋白和高分子聚合物混合静电纺丝制成，致密层为梯度纺丝层，高分子聚合物的含量由高到低逐渐减少，而胶原蛋白的含量由低到高逐渐增大；本发明的这种致密层设置可以在保证膜层隔离功能和力学性能的前提下逐步释放胶原蛋白，持续达到促进再生的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种双层引导组织再生膜及其制备方法。
背景技术
种植牙已成为治疗牙列缺损以及缺失的重要手段，但由于牙槽嵴自然萎缩、外伤、牙周疾病等各种原因导致的骨量不足，降低了种植修复的成功率，部分患者的牙槽嵴会出现过窄或过低，发生局部凹陷，种植体侧方造成穿孔，进一步导致牙种植手术的失败，而牙引导组织再生技术(GTR)的应用能够有效解决骨量不足、牙槽嵴缺损等问题。
牙引导组织再生技术是80年代末90年代初发展起来的一项新技术，是口腔临床上经常使用的一种治疗骨缺损和获得牙周组织再生的方法，可通过口腔修复再生膜对骨缺损部分进行覆盖，形成一层屏障从而得到封闭效果，缓解覆盖组织的压力，并对血凝块进行保护，形成一个良好的成骨空间，对影响骨形成的纤维细胞，结缔组织等进行阻挡，使具有成长潜力的前体成骨细胞进入到骨缺损区，对缺损区的骨修复进行诱导再生，从而增加牙种植修复的成功率。
组织工程支架材料是组织工程构建的一个重要因素，选择合适的支架材料对再生修复策略的成功与否起着非常重要的作用。目前,国内外应用较多的可吸收口腔修复膜主要是聚乳酸类口腔修复膜和胶原类口腔修复膜。取得较好效果的胶原膜在临床上得到了最广泛的应用，胶原基的GTR引导组织再生膜贴服性好，具有较好的组织相容性，免疫原性低，可提供8周以上的有效支撑，但仅作为屏蔽膜使用，引导再生能力差；另外，聚乳酸类人工膜具有疏水性，吸收渗液效果差，不能有效形成血凝块，为受损组织的再生增加血供和营养物质，导致诱导骨再生效果不佳。
另外，目前文献或专利报道的引导组织再生膜大多设计成双层或多层膜的形式，实现膜的屏障及再生功能，但是各层结构的引导组织再生膜易出现断裂分层的问题，各层膜粘接不紧密，导致使用过程中致密层和疏松层脱离，影响使用效果。专利CN115006597A提供了一种口腔修复膜及其制备方法，致密层由多层膜状细胞外基质经真空复合制备，简单的物理方式结合，各层膜间的牢固度不够，影响治疗效果。专利CN105457107A提供了一种双功能口腔修复膜及其制备方法，修复膜由疏松多孔层与致密抑菌层两层组成，双层结构经过两次真空冷冻干燥复合而成，结合方式为物理结合，贴合性和牢固度较差，使用过程中容易断裂分层。
综上，现有技术中至少存在再生膜功能单一，仅有屏蔽效果，没有良好的骨诱导再生功能等问题；膜的吸渗、锁水性能差，不能有效的为骨缺损区提供营养物质，再生效果不佳；并且现有的再生膜各层之间多采用物理方式结合，牢固度差，临床使用过程中容易出现分层、断裂的问题，影响产品的力学稳定性，导致使用效果不佳。因此，如何开发一种复合引导组织再生膜，以解决上述技术问题迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于针对现有再生膜存在的问题，而提供了一种双层引导组织再生膜及其制备方法，解决了现有技术存在的问题。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种双层引导组织再生膜，其特征在于，所述的双层引导组织再生膜包括：致密层和疏松层；
所述致密层的材料包括：天然I型胶原蛋白和高分子聚合物；
所述的致密层由若干亚致密层层叠构成，且若干所述的亚致密层中所述高分子聚合物的含量依次递减、所述天然I型胶原蛋白的含量依次递增；所述天然I型胶原蛋白含量多的亚致密层与所述疏松层通过交联剂连接。
具体的，本发明中的致密层由天然I型胶原蛋白和高分子聚合物混合静电纺丝制成，致密层为梯度纺丝层，高分子聚合物的含量由高到低逐渐减少，而胶原蛋白的含量由低到高逐渐增大；本发明的这种致密层设置可以在保证膜层隔离功能和力学性能的前提下逐步释放胶原蛋白，持续达到促进再生的目的。胶原蛋白含量多的一侧与疏松层相连，在胶原蛋白随时间降解过程中，细胞可以从疏松层向致密层逐步渗透。
进一步的，一种双层引导组织再生膜：所述的高分子聚合物选自聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯、聚乳酸己内酯共聚物、聚乙二醇共聚物中的任一种或几种。优选聚乳酸。
进一步的，一种双层引导组织再生膜：所述致密层的厚度为0.1～1.0mm；所述的致密层由三层亚致密层依次层叠构成，分别为第一亚致密层、第二亚致密层和第三亚致密层；所述第一亚致密层、第二亚致密层和第三亚致密层中所述高分子聚合物的含量依次递减、但天然I型胶原蛋白的含量依次递增；所述第三亚致密层与所述疏松层通过交联剂连接。
进一步的，一种双层引导组织再生膜：所述的交联剂选用醛基化透明质酸(OHA)。
具体的，本发明采用的醛基化透明质酸不仅起到对各层胶原蛋白的交联作用，还起到连接的目的，将疏松层和致密层相连，在界面处形成稳定的化学键，保证了膜使用过程中的力学性能。本发明以醛基化的透明质酸作为交联剂，在湿润状态下将两层膜相连，提供了最佳反应条件；一方面对各层的胶原蛋白进行交联；另一方面，通过交联致密层与疏松层的胶原蛋白，在双层膜的界面处起到连接的作用。
进一步的，一种双层引导组织再生膜：所述醛基化透明质酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)将透明质酸水溶液与高碘酸钠水溶液混合反应；
(2)然后加入乙二醇终止反应，经透析，冷冻干燥，制得醛基化透明质酸。
优选的，本发明采用的醛基化透明质酸交联剂，一方面对各层的胶原蛋白进行交联，增强膜的力学性能，并延长降解时间；另一方面，通过交联致密层与疏松层的胶原蛋白，在双层膜的界面处起到连接的作用，使双层膜结合更为牢固，确保使用过程中层与层之间不开裂。
进一步的，一种双层引导组织再生膜：所述醛基化透明质酸的制备方法：
步骤(1)将所述高碘酸钠水溶液滴加至所述透明质酸水溶液中，在20～40℃下避光反应3～6小时；
其中：所述透明质酸水溶液的浓度为1.0～5.0wt％；所述高碘酸钠水溶液的浓度为50～150mg/ml；所述透明质酸水溶液与高碘酸钠水溶液的体积比为1：(0.5～1.0)。
进一步的，一种双层引导组织再生膜：所述的疏松层的厚度为0.1～1.0mm。
一种双层引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，该方法用于制备上述的双层引导组织再生膜，该方法包括如下步骤：
一、致密层的制备：
S1、按各层亚致密层中材料的含量，将不同比例的天然I型胶原蛋白与高分子聚合物溶于有机溶剂中，获得若干份纺丝液；
S2、分别对所述纺丝液进行静电纺丝，依次形成亚致密层，直至获得完整的致密层；
二、疏松层的制备：
S1、将胶原蛋白溶液与缓冲液混合，然后再加入钙磷盐搅拌均匀，获得混合液；
S2、将所述混合液静置，冷却，得到胶原蛋白水凝胶；
S3、将所述胶原蛋白水凝胶挤压成型，干燥，制得所述疏松层；
三、双层引导组织再生膜的制备：
S1、将所述交联剂溶解，得到交联液；
S2、将所述疏松层浸入所述交联液中；
S3、将浸渍后的所述疏松层贴合于所述致密层上进行反应；
S4、反应后进行冷冻干燥处理，即制得双层引导组织再生膜。
具体的，本发明提供的是一种利用静电纺丝技术与自组装技术相结合的的方式制备的双层引导组织再生膜。
其中：致密层由天然I型胶原蛋白和高分子聚合物混合静电纺丝制成，致密层为梯度纺丝层，高分子聚合物的含量由高到低逐渐减少，而胶原蛋白的含量由低到高逐渐增大；本发明的这种致密层可以在保证隔离功能和力学性能的前提下逐步释放胶原蛋白，持续达到促进再生的目的。胶原蛋白含量多的一侧与疏松层相连，在胶原蛋白随时间降解过程中，细胞可以从疏松层向致密层逐步渗透。
疏松层采用自组装技术制备，在机体内胶原蛋白自发组装成有序的胶原纤维和胶原纤维束，进而形成宏观三维网络结构，是许多生物组织的结构框架。自发形成的纤维结构与基体组织高度一致，通过控制胶原蛋白溶液及磷酸盐溶液的浓度来调控纤维的疏密程度，制备出更有利于细胞的黏附、爬行和生长的疏松层结构。胶原蛋白溶液中加入了天然骨成分钙磷盐，在自组装过程中均匀分散在三维网络结构中，为新骨的形成提供钙元素和磷元素。
具体的，疏松层的制备结构高度模拟了人体骨组织，更有利于骨生长；以梯度膜作为致密层，以静电纺丝技术控制膜的孔隙，在保证隔离功能和力学性能的前提下逐步释放胶原蛋白，持续达到促进再生的目的，细胞由疏松层向致密层逐步渗透生长。
进一步的，一种双层引导组织再生膜的制备方法：一、致密层的制备：
步骤S1中所述的天然I型胶原蛋白与高分子聚合物的质量比为(1～9)：(1～9)；
步骤S1中所述的天然I型胶原蛋白与高分子聚合物的总质量与所述有机溶剂的质量比为1：(5～20)；
所述的有机溶剂选自六氟异丙醇、三氟乙酸、三氯甲烷、二氯甲烷、四氢呋喃中的一种。
进一步的，一种双层引导组织再生膜的制备方法：一、致密层的制备：
其中：步骤S2包括如下具体步骤：
S2-1、分别将若干份纺丝液装入静电纺丝注射器中；然后调节所述静电纺丝注射器的推进速度为2～6ml/h，静电纺丝机的电压为10～20KV，接收装置的接收距离为8～20cm；
S2-2、按各亚致密层的层叠顺序依次进行静电纺丝，直至获得完整的致密层。
进一步的，一种双层引导组织再生膜的制备方法：二、疏松层的制备：
步骤S1、将胶原蛋白溶液与缓冲液按体积比1：(2～5)混合，然后再加入钙磷盐搅拌均匀，获得混合液；
其中：所述的胶原蛋白溶液为浓度1.0～20.0mg/ml的胶原蛋白醋酸溶液；所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液；
所述钙磷盐与所述胶原蛋白的质量比为1：(2～10)。
进一步的，一种双层引导组织再生膜的制备方法：二、疏松层的制备：步骤S1中所述的钙磷盐选自羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸四钙、磷酸八钙、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、氟磷灰石中的一种或几种；所述钙磷盐的粒径为20～200μm。优选的钙磷盐为羟基磷灰石。
优选的，钙磷盐的粒径越小，越有利于成骨细胞分泌出骨基质，进而促进骨的形成。
进一步的，一种双层引导组织再生膜的制备方法：二、疏松层的制备：
步骤S2、调节所述混合液的pH为5～8，然后在35～45℃下静置2～4小时，冷却至室温并放置6～10小时，得到胶原蛋白水凝胶。
进一步的，一种双层引导组织再生膜的制备方法：三、双层引导组织再生膜的制备：步骤S1、将所述交联剂溶于水中，得到浓度0.1～10.0wt％的交联液。
进一步的，一种双层引导组织再生膜的制备方法：三、双层引导组织再生膜的制备：
步骤S2、将所述疏松层浸入所述交联液中1～5分钟。
进一步的，一种双层引导组织再生膜的制备方法：三、双层引导组织再生膜的制备：
步骤S3中所述的反应时间为10～60分钟。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的双层引导组织再生膜通过选用天然骨成分胶原蛋白和钙磷盐为主要原料，采用静电纺丝与自组装技术相结合的方式，所制备的双层引导组织再生膜由复合在一起的致密层和疏松层经交联制得。双层膜通过化学键连接，结合更牢固，力学性能得到明显改善；同时致密层能很好的起到屏障作用，疏松层吸渗、锁水效果好，解决了现有合成高分子再生膜不具有良好吸液性能、不能有效锁住渗血形成稳定的血凝块，导致诱导骨再生效果不佳的问题；本发明提供的双层引导组织再生膜是引导牙槽骨再生的理想材料。
(2)本发明中双层膜通过醛基化透明质酸连接，疏松层在醛基化透明质酸中浸润后，在湿态下与致密层贴合，溶液可渗透至致密层中，静置过程中不仅完成了疏松层和致密层胶原蛋白的无毒交联，还在界面处形成稳定的连接结构，虽为双层膜，实为一体结构，层与层间不易开裂；所得再生膜结构稳定、力学性能良好、降解时间较长、吸渗性能好，解决了现有再生膜各层间因结合不紧密而导致的分层断裂、屏蔽效果不好、体内植入不稳定等问题。
(3)本发明通过优化设计的致密层结构并控制致密层中材料含量梯度，保证了致密层在兼具隔离功能和力学性能的前提下，能够逐步释放层中的胶原蛋白，达到持续促进再生的目的；本发明制备的疏松层还具有利于细胞的黏附、爬行和生长的功能，其能够进一步促进再生能力的提升，综上本发明的提供的再生膜解决了目前引导组织再生膜功能单一，仅有屏蔽效果，引导再生能力差的问题。
(4)在本发明的双层引导组织再生膜中以胶原蛋白、透明质酸和羟基磷灰石(钙磷盐)等天然成分为主，提供了骨再生的最佳环境，并且羟基磷灰石具有一定的硬度，可增加膜的支撑性能。
(5)与现有引导组织再生膜单独的吸水作用相比，本发明通过醛基化透明质酸的加入，不仅增强了吸渗性，更增加了锁水性，能有效锁住渗血，避免了血液中复合再生因子的流失，更有利于骨再生
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为本发明实施例1制备的醛基化透明质酸的红外检测图；
图2为本发明实施例1～2和对比例1～2所得双层组织再生膜的吸水倍率图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含的包括一个或者更多个该特征。而且，术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。
实施例1
一种双层引导组织再生膜，其特征在于，所述的双层引导组织再生膜包括：厚度0.3mm的致密层和厚度0.2mm的疏松层；
所述致密层的材料包括：天然I型胶原蛋白和聚乳酸(高分子聚合物)；所述的致密层由三层厚度相同的亚致密层依次层叠构成，分别为第一亚致密层、第二亚致密层和第三亚致密层；
所述第一亚致密层、第二亚致密层和第三亚致密层中聚乳酸的含量依次递减、但天然I型胶原蛋白的含量依次递增；所述第三亚致密层与所述疏松层通过醛基化透明质酸(交联剂)连接。
上述实施例1提供的一种双层引导组织再生膜的制备方法，包括如下具体步骤：
一、致密层的制备：
S1、按天然I型胶原蛋白与聚乳酸质量比1：9，天然I型胶原蛋白和聚乳酸总质量与六氟异丙醇的质量比1：10混合制得第一纺丝液，第一纺丝液用于静电纺丝形成第一亚致密层；
按天然I型胶原蛋白与聚乳酸质量比1：1，天然I型胶原蛋白和聚乳酸总质量与六氟异丙醇质量比1：10混合制得第二纺丝液，第二纺丝液用于静电纺丝形成第二亚致密层；
按天然I型胶原蛋白与聚乳酸质量比9：1，天然I型胶原蛋白和聚乳酸总质量与六氟异丙醇质量比1：10混合制得第三纺丝液，第三纺丝液用于静电纺丝形成第三亚致密层；
S2、步骤S2包括如下具体工序：
S2-1、分别将第一纺丝液、第二纺丝液和第三纺丝液装入静电纺丝注射器中；然后调节静电纺丝注射器的推进速度为4ml/h，静电纺丝机的电压为15KV，接收装置的接收距离为15cm；
S2-2、按第一亚致密层、第二亚致密层和第三亚致密层的层叠顺序依次进行静电纺丝，直至获得完整的致密层；
二、疏松层的制备：
S1、将胶原蛋白溶解于醋酸溶液中并搅拌均匀，获得浓度为10.0mg/ml的胶原蛋白溶液；将胶原蛋白溶液与磷酸盐缓冲液按体积比1：3混合均匀，然后再加入平均粒径30μm的羟基磷灰石(钙磷盐)搅拌均匀，获得混合液；其中：羟基磷灰石与胶原蛋白的质量比为1：3；
S2、将所述混合液的pH调节为7.4，然后在37℃下静置3小时，冷却至室温并放置8小时，得到胶原蛋白水凝胶；
S3、将所述胶原蛋白水凝胶放入模具中，挤压平整，真空干燥24小时，得到疏松层，疏松层厚度为0.2mm，孔径大小约为15μm；
三、双层引导组织再生膜的制备：
S1、将体积比0.5：1，且浓度80mg/ml的高碘酸钠水溶液滴加至浓度1.0wt％的透明质酸水溶液中，在35℃下避光反应5小时；然后加入乙二醇终止反应，经透析，冷冻干燥，制得醛基化透明质酸；将醛基化透明质酸(交联剂)溶于水，得到浓度0.5wt％的醛基化透明质酸溶液；
S2、将所述疏松层浸入到所述醛基化透明质酸溶液中5分钟；
S3、将浸渍后的所述疏松层，沥干多余溶液，湿润状态下贴合于致密层上，即贴合于第三亚致密层上，静置50分钟，充分反应；
S4、反应后冷冻干燥处理24小时，制得双层引导组织再生膜。
实施例2
一种双层引导组织再生膜，其特征在于，所述的双层引导组织再生膜包括：厚度0.2mm的致密层和厚度0.3mm的疏松层；
所述致密层的材料包括：天然I型胶原蛋白和聚己内酯(高分子聚合物)；所述的致密层由三层厚度相同的亚致密层依次层叠构成，分别为第一亚致密层、第二亚致密层和第三亚致密层；
所述第一亚致密层、第二亚致密层和第三亚致密层中聚己内酯的含量依次递减、但天然I型胶原蛋白的含量依次递增；所述第三亚致密层与所述疏松层通过醛基化透明质酸(交联剂)连接。
上述实施例2提供的一种双层引导组织再生膜的制备方法，包括如下具体步骤：
一、致密层的制备：
S1、按天然I型胶原蛋白与聚己内酯质量比1：8，天然I型胶原蛋白和聚己内酯质量与三氟乙酸的质量比1：5混合制得第一纺丝液，第一纺丝液用于静电纺丝形成第一亚致密层；
按天然I型胶原蛋白与聚己内酯质量比1：1，天然I型胶原蛋白和聚己内酯质量与三氟乙酸的质量比1：5混合制得第二纺丝液，第二纺丝液用于静电纺丝形成第二亚致密层；
按天然I型胶原蛋白与聚己内酯质量比8：1，天然I型胶原蛋白和聚己内酯质量与三氟乙酸的质量比1：5混合制得第三纺丝液，第三纺丝液用于静电纺丝形成第三亚致密层；
S2、步骤S2包括如下具体工序：
S2-1、分别将第一纺丝液、第二纺丝液和第三纺丝液装入静电纺丝注射器中；然后调节静电纺丝注射器的推进速度为5ml/h，静电纺丝机的电压为18KV，接收装置的接收距离为13cm；
S2-2、按第一亚致密层、第二亚致密层和第三亚致密层的层叠顺序依次进行静电纺丝，直至获得完整的致密层；
二、疏松层的制备：
S1、将胶原蛋白溶解于醋酸溶液中并搅拌均匀，获得浓度为20.0mg/ml的胶原蛋白溶液；将胶原蛋白溶液与磷酸盐缓冲液按体积比1：5混合均匀，然后再加入平均粒径35μm的磷酸三钙(钙磷盐)搅拌均匀，获得混合液；其中磷酸三钙与胶原蛋白的质量比为1：5；
S2、将所述混合液的pH调节为7.4，然后在45℃下静置2小时，冷却至室温并放置6小时，得到胶原蛋白水凝胶；
S3、将所述胶原蛋白水凝胶放入模具中，挤压平整，真空干燥24小时，得到厚度0.3mm的疏松层；
三、双层引导组织再生膜的制备：
S1、将体积比0.8：1，且浓度为100mg/ml的高碘酸钠水溶液滴加至浓度2.0wt％的透明质酸水溶液中，在40℃下避光反应6小时；然后加入乙二醇终止反应，经透析，冷冻干燥，制得醛基化透明质酸；将醛基化透明质酸(交联剂)溶于水，得到浓度1.0wt％的醛基化透明质酸溶液；
S2、将所述疏松层浸入到所述醛基化透明质酸溶液中3分钟；
S3、将浸渍后的所述疏松层，沥干多余溶液，湿润状态下贴合于致密层上，即贴合于第三亚致密层上，静置60分钟，充分反应；
S4、反应后冷冻干燥处理24小时，制得双层引导组织再生膜。
实施例3
一种双层引导组织再生膜，其特征在于，所述的双层引导组织再生膜包括：厚度1.0mm的致密层和厚度1.0mm的疏松层；
所述致密层的材料包括：天然I型胶原蛋白和聚乳酸乙醇酸共聚物(高分子聚合物)；所述的致密层由三层厚度相同的亚致密层依次层叠构成，分别为第一亚致密层、第二亚致密层和第三亚致密层；
所述第一亚致密层、第二亚致密层和第三亚致密层中聚乳酸乙醇酸共聚物的含量依次递减、但天然I型胶原蛋白的含量依次递增；所述第三亚致密层与所述疏松层通过醛基化透明质酸(交联剂)连接。
上述实施例3提供的一种双层引导组织再生膜的制备方法，包括如下具体步骤：
一、致密层的制备：
S1、按天然I型胶原蛋白与聚乳酸乙醇酸共聚物量比1：2，天然I型胶原蛋白和聚己内酯质量与四氢呋喃的质量比1：20混合制得第一纺丝液，第一纺丝液用于静电纺丝形成第一亚致密层；
按天然I型胶原蛋白与聚乳酸乙醇酸共聚物量比1：1，天然I型胶原蛋白和聚己内酯质量与四氢呋喃的质量比1：20混合制得第二纺丝液，第二纺丝液用于静电纺丝形成第二亚致密层；
按天然I型胶原蛋白与聚乳酸乙醇酸共聚物量比2：1，天然I型胶原蛋白和聚己内酯质量与四氢呋喃的质量比1：20混合制得第三纺丝液，第三纺丝液用于静电纺丝形成第三亚致密层；
S2、步骤S2包括如下具体工序：
S2-1、分别将第一纺丝液、第二纺丝液和第三纺丝液装入静电纺丝注射器中；然后调节静电纺丝注射器的推进速度为3ml/h，静电纺丝机的电压为10KV，接收装置的接收距离为8cm；
S2-2、按第一亚致密层、第二亚致密层和第三亚致密层的层叠顺序依次进行静电纺丝，直至获得完整的致密层；
二、疏松层的制备：
S1、将胶原蛋白溶解于醋酸溶液中并搅拌均匀，获得浓度为3.0mg/ml的胶原蛋白溶液；将胶原蛋白溶液与磷酸盐缓冲液按体积比1：2混合均匀，然后再加入平均粒径20μm的磷酸二氢钙(钙磷盐)搅拌均匀，获得混合液；其中：磷酸二氢钙与胶原蛋白的质量比为1：10；
S2、将所述混合液的pH调节为5.5，然后在35℃下静置4小时，冷却至室温并放置10小时，得到胶原蛋白水凝胶；
S3、将所述胶原蛋白水凝胶放入模具中，挤压平整，真空干燥24小时，得到厚度1.0mm的疏松层；
三、双层引导组织再生膜的制备：
S1、将体积比1：1，且浓度为50mg/ml的高碘酸钠水溶液滴加至浓度5.0wt％的透明质酸水溶液中，在20℃下避光反应3小时；然后加入乙二醇终止反应，经透析，冷冻干燥，制得醛基化透明质酸；将醛基化透明质酸(交联剂)溶于水，得到浓度10.0wt％的醛基化透明质酸溶液；
S2、将所述疏松层浸入到所述醛基化透明质酸溶液中4分钟；
S3、将浸渍后的所述疏松层，沥干多余溶液，湿润状态下贴合于致密层上，即贴合于第三亚致密层上，静置20分钟，充分反应；
S4、反应后冷冻干燥处理24小时，制得双层引导组织再生膜。
对比例1
对比例1中致密层制备过程与实施例1相同；对比例1中的疏松层制备过程与实施例1相同，对比例1与实施例1的区别在于：双层组织再生膜的制备不同；对比例1中双层组织再生膜的制备步骤如下：
①配制浓度0.5wt％的戊二醛溶液，溶剂为80wt％的乙醇水溶液；
②将干燥的疏松层和致密层分别浸入配制好的戊二醛溶液中，浸润5分钟；
③取出疏松层和致密层，沥干多余溶液，分开静置60分钟，充分反应；
④用去离子水冲洗疏松层和致密层三遍，然后将疏松层和致密层浸入0.5wt％的赖氨酸溶液中，在4℃下浸泡2小时，封闭疏松层和致密层中的戊二醛；
⑤浸泡后，再用去离子水充分冲洗三遍，将两层膜放入模具重力压合，冷冻干燥处理24小时，得到厚度0.5mm的双层组织再生膜。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于：对比例2中采用的是透明质酸，不同于实施例1中的醛基化透明质酸；对比例2其余与实施例1相同。
测试：
(1)细胞毒性检测：对实施例1～3及对比例1～2制备的双层组织再生膜进行细胞毒性检测：选用L929细胞，各组供试品加入含血清培养基，在37℃条件下浸提24小时，浸提液加入细胞中培养24小时，采用MTT法进行细胞毒性检测(n＝3)，检测结果如表1所示；表1为实施例1～3及对比例1～2制备的双层组织再生膜的细胞毒性检测结果
从表1可以看出实施例1～3及对比例2样品组的细胞存活率分别为95.25％、94.49％、95.03％和94.87％，表明了制备的双层引导组织再生膜无细胞毒性(即以醛基化透明质酸作为交联剂，安全无毒)；而对比例1的交联剂选用戊二醛，虽然工艺中添加了处理残留戊二醛的步骤，但仍然有少量戊二醛残留导致细胞存活率与其他样品组相比较低，可见残留戊二醛对细胞有一定的影响。
(2)红外检测：采用KBr压片法，取少量透明质酸(HA)和本发明实施例1制备的醛基化透明质酸(OHA)于研钵中，加入KBr粉末，压片后，利用傅里叶变换红外光谱仪在波长400～4000cm-1范围内对样品进行表征；表征结果如图1所示，从图1中可以看出OHA与HA的红外光谱图相似，但是在1732cm-1处出现新的特征峰，该特征峰对应于醛基中-C＝O的伸缩振动，具有OHA的特征，表明本发明方法可成功制备醛基化透明质酸(OHA)。
(3)体外降解及拉伸强度实验：
①体外降解：将实施例1～3及对比例1～2所得样品称重，分别记录重量为W0，通过无菌操作在37℃条件下，将各样品浸入PBS缓冲溶液中，静置。在4、8、12周分别取样，真空干燥后称量重量记为W1，按照下式计算降解率，降解计算结果如表2所示：
表2为降解率结果
由表2可以看出本发明制备的双层引导再生膜的降解速率慢，能够逐步释放胶原蛋白，持续达到促进再生的效果。
②拉伸强度实验：将降解0、4、8、12周后的样品，裁剪成长20mm、宽为10mm的样品，然后用万能试验机以1mm/min的速度测定拉伸强度(MPa)，其检测结果如表3所示：
表3为拉伸强度测试结果
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | |
| 0周 | 12.22 | 12.36 | 19.64 | 11.39 | 5.44 |
| 4周 | 9.70 | 9.27 | 16.58 | 5.63 | 3.97 |
| 8周 | 7.99 | 7.29 | 12.73 | 3.81 | 1.71 |
| 12周 | 4.93 | 4.95 | 7.90 | 1.99 | - |
注：“-”表示样品不成形，无法称量与检测
由表3的结果可以看出随着时间的增加，各组样品均开始降解；实施例1～3及对比例1因为双层膜进行过交联处理，降解到达12周时，降解率分别为68.39％、69.97％、58.89％和70.93％，仍能保持基本结构，并可看出本发明采用的醛基化透明质酸与常用交联剂戊二醛对再生膜的交联性能无显著性差异；对比例2没有进行交联处理，降解到达12周时，观察不到膜结构，基本完全降解。另外实施例1～3样品在降解到达12周后拉伸强度仍约为5～8MPa，具有较好的机械强度，可满足临床使用。对比例1因为双层界面没有化学键合的连接过程，导致双层膜结合不牢固，在浸泡过程中开裂，影响拉伸强度，对比例2到达12周时，无法检测机械强度。
(4)吸渗性能测试：膜的吸渗性能通过将相同重量的实施例1～2及对比例1～2样品浸泡于PBS溶液中，37℃条件下浸泡6小时后，对比浸泡前重量W0h和浸泡6小时后重量W6h的变化，按下式计算吸水倍率，测试结果如图2所示：
吸水率可以直观判断膜材料维持水分和吸渗的能力，实施例1～2可吸收自身重量约五十多倍的水分；对比例1因为没有醛基化透明质酸成分，吸水率大大下降，只能吸收自身重量17.9倍的水分；对比例2虽然加入了透明质酸，但是没有交联工艺，透明质酸溶解流失，随着时间延长，会流失更严重，无法起到吸渗锁水的作用。
上述为本发明的较佳实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。凡由本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (16)
1.一种双层引导组织再生膜，其特征在于，所述的双层引导组织再生膜包括：致密层和疏松层；
所述致密层的材料包括：天然I型胶原蛋白和高分子聚合物；
所述的致密层由若干亚致密层层叠构成，且若干所述的亚致密层中所述高分子聚合物的含量依次递减、所述天然I型胶原蛋白的含量依次递增；
所述天然I型胶原蛋白含量多的亚致密层与所述疏松层通过交联剂连接。
2.根据权利要求1所述的一种双层引导组织再生膜，其特征在于，所述的高分子聚合物选自聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚乳酸己内酯共聚物、聚乙二醇共聚物中的任一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种双层引导组织再生膜，其特征在于，所述致密层的厚度为0.1～1.0mm；
所述的致密层由三层亚致密层依次层叠构成，分别为第一亚致密层、第二亚致密层和第三亚致密层；
所述第一亚致密层、第二亚致密层和第三亚致密层中所述高分子聚合物的含量依次递减、但天然I型胶原蛋白的含量依次递增；
所述第三亚致密层与所述疏松层通过交联剂连接。
4.根据权利要求1或3所述的一种双层引导组织再生膜，其特征在于，所述的交联剂选用醛基化透明质酸。
5.根据权利要求4所述的一种双层引导组织再生膜，其特征在于，所述醛基化透明质酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)将透明质酸水溶液与高碘酸钠水溶液混合反应；
(2)然后加入乙二醇终止反应，经透析，冷冻干燥，制得醛基化透明质酸。
6.根据权利要求5所述的一种双层引导组织再生膜，其特征在于，所述醛基化透明质酸的制备方法：
步骤(1)将所述高碘酸钠水溶液滴加至所述透明质酸水溶液中，在20～40℃下避光反应3～6小时；
其中：所述透明质酸水溶液的浓度为1.0～5.0wt％；所述高碘酸钠水溶液的浓度为50～150mg/ml；所述透明质酸水溶液与高碘酸钠水溶液的体积比为1：(0.5～1)。
7.根据权利要求1所述的一种双层引导组织再生膜，其特征在于，所述疏松层的厚度为0.1～1.0mm。
8.一种双层引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，该方法用于制备权利要求1～7任一项所述的双层引导组织再生膜，该方法包括如下步骤：
一、致密层的制备：
S1、按各层亚致密层中材料的含量，将不同比例的天然I型胶原蛋白与高分子聚合物溶于有机溶剂中，获得若干份纺丝液；
S2、分别对所述纺丝液进行静电纺丝，依次形成亚致密层，直至获得完整的致密层；
二、疏松层的制备：
S1、将胶原蛋白溶液与缓冲液混合，然后再加入钙磷盐搅拌均匀，获得混合液；
S2、将所述混合液静置，冷却，得到胶原蛋白水凝胶；
S3、将所述胶原蛋白水凝胶挤压成型，干燥，制得所述疏松层；
三、双层引导组织再生膜的制备：
S1、将所述交联剂溶解，得到交联液；
S2、将所述疏松层浸入所述交联液中；
S3、将浸渍后的所述疏松层贴合于所述致密层上进行反应；
S4、反应后进行冷冻干燥处理，即制得双层引导组织再生膜。
9.根据权利要求8所述的一种双层引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，一、致密层的制备：
步骤S1中所述的天然I型胶原蛋白与高分子聚合物的质量比为(1～9)：(1～9)；
步骤S1中所述的天然I型胶原蛋白与高分子聚合物的总质量与所述有机溶剂的质量比为1：(5～20)；
所述的有机溶剂选自六氟异丙醇、三氟乙酸、三氯甲烷、二氯甲烷、四氢呋喃中的一种。
10.根据权利要求8所述的一种双层引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，一、致密层的制备：
其中：步骤S2包括如下具体步骤：
S2-1、分别将若干份纺丝液装入静电纺丝注射器中；然后调节所述静电纺丝注射器的推进速度为2～6ml/h，静电纺丝机的电压为10～20KV，接收装置的接收距离为8～20cm；
S2-2、按各亚致密层的层叠顺序依次进行静电纺丝，直至获得完整的致密层。
11.根据权利要求8所述的一种双层引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，二、疏松层的制备：
步骤S1、将胶原蛋白溶液与缓冲液按体积比1：(2～5)混合，然后再加入钙磷盐搅拌均匀，获得混合液；
其中：所述的胶原蛋白溶液为浓度1.0～20.0mg/ml的胶原蛋白醋酸溶液；所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液；
所述钙磷盐与所述胶原蛋白的质量比为1：(2～10)。
12.根据权利要求8所述的一种双层引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，二、疏松层的制备：
步骤S1中所述的钙磷盐选自羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸四钙、磷酸八钙、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、氟磷灰石中的一种或几种；
所述钙磷盐的粒径为20～200μm。
13.根据权利要求8所述的一种双层引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，二、疏松层的制备：
步骤S2、调节所述混合液的pH为5～8，然后在35～45℃下静置2～4小时，冷却至室温并放置6～10小时，得到胶原蛋白水凝胶。
14.根据权利要求8所述的一种双层引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，三、双层引导组织再生膜的制备：
步骤S1、将所述交联剂溶于水中，得到浓度0.1～10.0wt％的交联液。
15.根据权利要求8所述的一种双层引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，三、双层引导组织再生膜的制备：
步骤S2、将所述疏松层浸入所述交联液中1～5分钟。
16.根据权利要求8所述的一种双层引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，三、双层引导组织再生膜的制备：
步骤S3中所述的反应时间为10～60分钟。
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