CN114224947A - 一种蟅虫创愈胶囊、制备方法以及优化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药制备技术领域，公开了一种蟅虫创愈胶囊、制备方法以及优化方法，采用层次分析法多指标优化蟅虫创愈胶囊的提取工艺；优化蟅虫创愈胶囊的纯化精制工艺；对蟅虫创愈胶囊浓缩干燥工艺进行优化。本发明确定提取溶剂为水，溶剂总用量18倍，提取时间30min，提取2次；确定超滤膜超滤分子截留量为10万、工作压强0.07MPa、料液浓缩比为1:12。浓缩干燥工艺：真空减压浓缩，60℃、0.08‑0.09MPa，干燥工艺参数为：装盘厚度2cm、工作压力0.09MPa、温度为80℃。本发明提取工艺筛选、提取工艺优化、成型工艺、质量标准、稳定性分析和初步药效学分析，国内未见文献报道。

Description

一种蟅虫创愈胶囊、制备方法以及优化方法
技术领域
本发明属于中药制备技术领域，尤其涉及一种蟅虫创愈胶囊、制备方法以 及优化方法。
背景技术
目前，外科创伤性疾病的发病机理主要是气血凝滞，营气不从，经络阻塞， 脏腑功能失调。人身气血相辅而行，循环全身，周流不息，当人体感受六淫邪 毒、特殊之毒，承受外来伤害，或情志内伤、饮食失节、房室损伤，破坏了气 血的正常运行，局部气血凝滞，或阻于肌肤，或留于筋骨，或致脏腑失和，即 可发生外科疾病，经络分布于人体各部，内源于脏腑，外通于皮、肉、筋、骨 等处，具有运行气血、联络人体内外器官的作用，当各种致病因素引起局部气 血凝滞后，则形成经络阻塞，从而反应到人体的体表，产生局部的红肿热痛和 功能障碍。强调机体是一个内外统一的整体，损伤的发展是内因和外因综合作 用的结果。因此以中医理论为基础的中药制剂，辨治局部皮肉筋骨外伤同时， 更要重视外伤引起的气血、津液、脏腑、经络功能的病理变化。
兰州市中医医院蟅虫创愈胶囊的组方就是基于上述原理，以土鳖虫(又名 蟅虫)为君药行其破瘀血，续筋骨之功效；重用续断、骨碎补为臣药，行二者 补益肝肾、强健筋骨的作用，与土鳖虫共同起到调血脉、续折伤的作用；红参 可大补元气，通过补气助土鳖虫行瘀血之功效。当归可补血止痛，以防土鳖虫 破血过甚；巴戟天可佐助续断、骨碎补之强壮筋骨的功效；同时佐以煅龙骨、 煅牡蛎收敛固涩。全方补元气，行瘀血，续筋骨，更偏重于治疗外伤引起的气 血、津液、脏腑、经络功能的病理变化，用于跌打损伤和闭合性骨折所致的软组织挫伤，起到活血化瘀、消肿止痛的功效，能够缓解跌打损伤的急性期疼痛。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前药物的提取物成分复 杂，杂质多，患者服用剂量较大，对胃肠道刺激性较大，依存性不好。
由于制剂工艺技术限制，中药新药开发为新药存在粗、大、黑的问题，服 用剂量大，患者接受度不好。
目前的蟅虫创愈胶囊的提取工艺不能够火灯最佳工艺参数，不利于制剂有 效成分的最大提取。
近年来，中药制剂在治疗软组织损伤方面具疗效显著、不良反应少等优点， 在临床治疗上发挥了重要作用。但现有中药制剂已外用药物为主，多为敷贴药、 搽擦药等，而配合使用的内服中成药较少。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蟅虫创愈胶囊、制备方法以 及优化方法。
本发明是这样实现的：一种制备蟅虫创愈胶囊中优化方法，所述制备蟅虫 创愈胶囊中优化方法包括：
采用层次分析法多指标优化蟅虫创愈胶囊的提取工艺；
优化蟅虫创愈胶囊的纯化精制工艺；
对蟅虫创愈胶囊浓缩干燥工艺进行优化。
进一步，所述采用层次分析法多指标优化蟅虫创愈胶囊的提取工艺包括：
(1)AHP法确立权重系数根据复方中药味君臣佐使配伍规律及各成分药理 作用强弱，将各指标含量和出膏率作为权重指标予以量化，即将6项指标分成4 个层次，并确定各指标的优先顺序：川续断皂苷Ⅳ＞柚皮苷＞马钱苷酸＝当药 苷＝绿原酸＞浸膏，构建成对比较的优先判断矩阵，并赋予各项指标的相对评 分；
根据矩阵结果，川续断皂苷Ⅳ、柚皮苷、马钱苷酸、当药苷、绿原酸和干 膏率等6项指标经层次分析后得到的权重系数分别为0.3536，0.2184，0.1202， 0.1202，0.1202，0.0674，一致性比列因子(CR)＝0.0044＜0.1000，指标优先 比较判断矩阵具有满意的一致性，求得的权重系数有效，用于蟅虫创愈胶囊的 提取工艺综合评分；
(2)单因素试验以马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川续断皂苷及干 膏得率成分的含量为指标，采用单因素试验筛选料液比、提取时间及提取次数 等因素的水平取值范围；
(3)中心组合设计响应面法实验，基于单因素实验确定的各因素的水平范 围，进一步采用中心组合设计-响应面法对蟅虫创愈胶囊的提取工艺进行综合优 化，以马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川续断皂苷及干膏得率的权重和 为评价指标，对实验结果进行回归分析，最终筛选出各因素最佳工艺参数。
进一步，所述步骤(2)具体包括：(2.1)料液比的选择按照处方计量精 密称量药材粉末6份，以蒸馏水为提取溶剂，以料液比为1∶6、1∶8、1∶10、 1∶12、1∶15及1∶18分别回流提取，提取次数为1次，提取时间为60min， 测定以上5种指标成分的含量及干膏得率，对不同料液比进行评价，综合评分 结果分别为3.2110，4.2837，4.5000，4.6000，4.9828，5.0266，后续实验优化料 液比范围为6～18倍；
(2.2)提取时间的选择按照处方计量精密称量药材粉末5份，以蒸馏水为 提取溶剂，以提取时间为30min，60min，90min，120min，150min分别回流提 取，提取次数为1次，料液比为1∶15，测定以上5种指标成分的含量及干膏得 率，对不同提取时间进行评价，综合评分结果分别为4.1113，4.1563，4.1337， 4.0771，后续实验优化提取时间范围为30～90min；
(2.3)提取次数的选择按照处方计量精密称量药材粉末3份，以蒸馏水为 提取溶剂，以提取次数为1次、2次、3次分别回流提取，提取时间为60min， 料液比为1∶15，测定以上5种指标成分的含量及干膏得率，对不同提取次数进 行评价，综合评分结果分别为3.5546，4.5833，4.6265，根据综合评分结果，提 取2次的得分最高。
进一步，所述步骤(3)具体包括：(3.1)根据中心组合设计响应面法，得 到因素代码及水平；
(3.2)中心组合设计响应面法实验设计及结果称取处方药材每份12g，共 13份，制备供试品，测定干膏得率及马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川 续断皂苷等指标性成分的提取率，按AHP法所得权重系数计算综合得分为评价 指标，用软件对实验设计的结果进行分析处理。实验设计和综合得分结果；
利用软件，对表数据进行多元二次回归，得回归方程 Y＝+4.85+0.29*A+0.012*B-0.046*A*B-0.21*A2-3.264E-003*B2，r＝0.9379，P＜ 0.01；
依据确立的多项式模型，分别绘制因素A、B对综合评分的二维等高线图和 三维效应曲面图，并优选两个因素的最佳取值范围；
根据效应面和等高线图选取较佳工艺范围为：回流提取，提取时间为30min， 提取溶剂为蒸馏水，料液比为1∶18；
按照优选方案进行验证实验，共平行3次，综合得分分别为4.9397、4.9503 以及4.9459，平均值为4.9453，预测值为4.95403，RSD为0.11％。
进一步，采用层次分析法多指标优化蟅虫创愈胶囊的提取工艺最佳提取工 艺条件为：提取溶剂为水，溶剂总用量18倍，提取时间30min，提取2次.
进一步，所述优化蟅虫创愈胶囊的纯化精制工艺包括：
1)评价指标川续断皂苷Ⅵ含量测定方法建立：对照品溶液的制备、供试品 溶液的制备、阴性供试品溶液的制备、标准曲线的制备以及含量测定
2)正交实验、正交实验测定，综合极差分析和方差分析，得出纯化精制最 佳工艺条件：超滤膜超滤分子截留量为10万、工作压强0.07MPa、料液浓缩比 为1:12。
进一步，所述对蟅虫创愈胶囊浓缩干燥工艺进行优化工艺条件：真空减压 浓缩60℃、0.08-0.09MPa，干燥工艺参数：装盘厚度2cm、工作压力0.09MPa、 温度为80℃。
本发明的另一目的在于提供一种所述制备蟅虫创愈胶囊中优化方法制备的 蟅虫创愈胶囊，所述蟅虫创愈胶囊由土鳖虫、续断、骨碎补、煅龙骨、煅牡蛎、 红参、巴戟天和当归组成；其中土鳖虫76.5g、续断153g、骨碎补153g、煅 龙骨75g、煅牡蛎75g、红参75g、巴戟天153g、当归76.5g。
本发明的另一目的在于提供一种所述蟅虫创愈胶囊的制备方法所述蟅虫创 愈胶囊的制备方法包括：将土鳖虫、续断、骨碎补、煅龙骨、煅牡蛎、红参、 巴戟天和当归粉碎为粗粉；
加水浸泡1小时，以18倍水加热回流提取2次，各30min，合并滤液，60℃ 压浓缩成相对密度为1.20-1.38的浸膏，70℃真空干燥8小时，粉碎，过80目 筛，填充，即得。
本发明的另一目的在于提供一种所述蟅虫创愈胶囊的制备的用于镇痛、消 肿、止血作用的多种制剂。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
1.首次采用AHP层次分析法多指标优化了蟅虫创愈胶囊的提取工艺，确定 的确定最佳提取工艺条件为：提取溶剂为水，溶剂总用量18倍，提取时间30min， 提取2次；
2.首次对蟅虫创愈胶囊采用正交试验优选精制工艺，确定的最佳纯化精制 工艺为：超滤膜超滤分子截留量为10万、工作压强0.07MPa、料液浓缩比为1:12； 3.首次对蟅虫创愈胶囊浓缩干燥工艺进行分析；得到浓缩干燥工艺参数为：真 空减压浓缩(60℃、0.08-0.09MPa)浓缩至相对密度微1.2，干燥工艺参数为： 装盘厚度2cm、工作压力0.09MPa、温度为80℃。
4.首次研究了其成型工艺参数为:浸膏粉+0.4％微粉硅胶改善其流动性，堆 密度为0.8056g/cm3，药粉的临界相对湿度为71.3％，确定1号胶囊填充，铝塑pvc 包装；
本发明首次优化了蟅虫创愈胶囊的纯化精制工艺；首次对蟅虫创愈胶囊浓 缩干燥工艺进行分析；根据查新报告，本发明关于蟅虫创愈胶囊的提取工艺筛 选、提取工艺优化、成型工艺、质量标准、稳定性分析和初步药效学分析，国 内未见文献报道。
本发明首次对蟅虫创愈胶囊采用层次分析法多指标优化蟅虫创愈胶囊的提 取工艺，获得最佳工艺参数，有利于制剂有效成分的最大提取，首次对其纯化 精制工艺进行研究，目的在于最大限度的保留有效成分，去除杂质，有利于临 床疗效及患者服用；首次对其浓缩干燥工艺、成型工艺进行考察，有利于生产 工艺关键技术点控制，以便其制剂生产过程控制；首次对其进行质量标准进行 研究，以便其制剂质量控制；首次对其药效学进行研究，验证其在抗炎、镇痛、 促进凝血等方面的药效。
附图说明
图1是本发明实施例提供的蟅虫创愈胶囊制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的料液比和提取时间对综合评分的等高线图(A) 和效应曲面图(B)。
图3是本发明实施例提供的吸湿百分率曲线图。
图4是本发明实施例提供的川续断皂苷ⅥHPLC色谱图；
图中：A.对照品溶液色谱图；B.供试品溶液色谱图；C.阴性样品溶液色谱 图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蟅虫创愈胶囊、制备方法以 及优化方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明提供一种制备蟅虫创愈胶囊中优化方法，所述制备蟅虫创愈胶囊中 优化方法包括：
采用层次分析法多指标优化蟅虫创愈胶囊的提取工艺；
优化蟅虫创愈胶囊的纯化精制工艺；
对蟅虫创愈胶囊浓缩干燥工艺进行优化。
进一步，所述采用层次分析法多指标优化蟅虫创愈胶囊的提取工艺包括：
(1)AHP法确立权重系数根据复方中药味君臣佐使配伍规律及各成分药理 作用强弱，将各指标含量和出膏率作为权重指标予以量化，即将6项指标分成4 个层次，并确定各指标的优先顺序：川续断皂苷Ⅳ＞柚皮苷＞马钱苷酸＝当药 苷＝绿原酸＞浸膏，构建成对比较的优先判断矩阵，并赋予各项指标的相对评 分；
根据矩阵结果，川续断皂苷Ⅳ、柚皮苷、马钱苷酸、当药苷、绿原酸和干 膏率等6项指标经层次分析后得到的权重系数分别为0.3536，0.2184，0.1202， 0.1202，0.1202，0.0674，一致性比列因子(CR)＝0.0044＜0.1000，指标优先 比较判断矩阵具有满意的一致性，求得的权重系数有效，用于蟅虫创愈胶囊的 提取工艺综合评分；
(2)单因素试验以马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川续断皂苷及干 膏得率成分的含量为指标，采用单因素试验筛选料液比、提取时间及提取次数 等因素的水平取值范围；
(3)中心组合设计响应面法实验，基于单因素实验确定的各因素的水平范 围，进一步采用中心组合设计-响应面法对蟅虫创愈胶囊的提取工艺进行综合优 化，以马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川续断皂苷及干膏得率的权重和 为评价指标，对实验结果进行回归分析，最终筛选出各因素最佳工艺参数。
进一步，所述步骤(2)具体包括：(2.1)料液比的选择按照处方计量精 密称量药材粉末6份，以蒸馏水为提取溶剂，以料液比为1∶6、1∶8、1∶10、 1∶12、1∶15及1∶18分别回流提取，提取次数为1次，提取时间为60min， 测定以上5种指标成分的含量及干膏得率，对不同料液比进行评价，综合评分 结果分别为3.2110，4.2837，4.5000，4.6000，4.9828，5.0266，后续实验优化料 液比范围为6～18倍；
(2.2)提取时间的选择按照处方计量精密称量药材粉末5份，以蒸馏水为 提取溶剂，以提取时间为30min，60min，90min，120min，150min分别回流提 取，提取次数为1次，料液比为1∶15，测定以上5种指标成分的含量及干膏得 率，对不同提取时间进行评价，综合评分结果分别为4.1113，4.1563，4.1337， 4.0771，后续实验优化提取时间范围为30～90min；
(2.3)提取次数的选择按照处方计量精密称量药材粉末3份，以蒸馏水为 提取溶剂，以提取次数为1次、2次、3次分别回流提取，提取时间为60min， 料液比为1∶15，测定以上5种指标成分的含量及干膏得率，对不同提取次数进 行评价，综合评分结果分别为3.5546，4.5833，4.6265，根据综合评分结果，提 取2次的得分最高。
进一步，所述步骤(3)具体包括：(3.1)根据中心组合设计响应面法，得 到因素代码及水平；
(3.2)中心组合设计响应面法实验设计及结果称取处方药材每份12g，共 13份，制备供试品，测定干膏得率及马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川 续断皂苷等指标性成分的提取率，按AHP法所得权重系数计算综合得分为评价 指标，用软件对实验设计的结果进行分析处理。实验设计和综合得分结果；
利用软件，对表数据进行多元二次回归，得回归方程 Y＝+4.85+0.29*A+0.012*B-0.046*A*B-0.21*A2-3.264E-003*B2，r＝0.9379，P＜ 0.01；
依据确立的多项式模型，分别绘制因素A、B对综合评分的二维等高线图和 三维效应曲面图，并优选两个因素的最佳取值范围；
根据效应面和等高线图选取较佳工艺范围为：回流提取，提取时间为30min， 提取溶剂为蒸馏水，料液比为1∶18；
按照优选方案进行验证实验，共平行3次，综合得分分别为4.9397、4.9503 以及4.9459，平均值为4.9453，预测值为4.95403，RSD为0.11％。
进一步，采用层次分析法多指标优化蟅虫创愈胶囊的提取工艺最佳提取工 艺条件为：提取溶剂为水，溶剂总用量18倍，提取时间30min，提取2次.
进一步，所述优化蟅虫创愈胶囊的纯化精制工艺包括：
1)评价指标川续断皂苷Ⅵ含量测定方法建立：对照品溶液的制备、供试品 溶液的制备、阴性供试品溶液的制备、标准曲线的制备以及含量测定
2)正交实验、正交实验测定，综合极差分析和方差分析，得出纯化精制最 佳工艺条件：超滤膜超滤分子截留量为10万、工作压强0.07MPa、料液浓缩比 为1:12。
进一步，所述对蟅虫创愈胶囊浓缩干燥工艺进行优化工艺条件：真空减压 浓缩60℃、0.08-0.09MPa，干燥工艺参数：装盘厚度2cm、工作压力0.09MPa、 温度为80℃。
本发明的提供一种所述制备蟅虫创愈胶囊中优化方法制备的蟅虫创愈胶 囊，所述蟅虫创愈胶囊由土鳖虫、续断、骨碎补、煅龙骨、煅牡蛎、红参、巴 戟天和当归组成。
如图1所示，本发明提供一种所述蟅虫创愈胶囊的制备方法所述蟅虫创愈 胶囊的制备方法包括：
S101，将土鳖虫、续断、骨碎补、煅龙骨、煅牡蛎、红参、巴戟天和当归 粉碎为粗粉；
S102，加水浸泡1小时，以18倍水加热回流提取2次，各30min；
S103，合并滤液，60℃压浓缩成相对密度为1.20-1.38的浸膏，70℃真空 干燥8小时，粉碎，过80目筛，填充，即得。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1：
一、本发明所研制的蟅虫创愈胶囊，源于甘肃省名老中医贾奇峰的经典验 方“损伤散”。后经我院开发为院内制剂蟅虫创愈胶囊，该方由土鳖虫、续断、 骨碎补等8味药组成，多年来运用于兰州市中医医院骨伤科，临床疗效确切。 主要用于跌打损伤和闭合性骨折所致的软组织挫伤，起到消肿止痛、活血化瘀 的功效，能够缓解跌打损伤的急性期疼痛。但是由于服用剂量偏大，患者依从 性差，为了将其开发成为安全、有效、稳定、可控、符合临床和市场要求、提 高患者依从性，本发明组拟将其进行二次开发。
二、跌打损伤，又称急性软组织损伤，泛指人因跌、打、碰、磕等原因导 致机体皮肤、皮下组织、筋膜、肌肉、肌腱韧带等部位发生损伤，产生一系列 病理变化，多表现为淤血阻滞，局部肿胀，伴有疼痛感。西医主要以合成类固 醇、甾体抗炎免疫药、非甾体抗炎免疫药等抗炎止痛药治疗，常用的口服药品 为非甾体类药物(NSALDs)，如阿司匹林、吲哚美辛等。此类抗炎药物具有很 好的镇痛作用，但适用人群有限，如有消化道溃疡的患者。但该类药物副作用 较大，不宜长期服用。中医学对于本病的认识和治疗已有数千年历史，并将其纳入“筋伤”范畴，认为其病机为“气滞与血瘀”并见。《圣济总录·折伤门》 云：“若因伤折内动经络，血行之道不得宜通。瘀积不散，为肿为痛。”中医 把凡因外力作用于人体而引起的筋骨伤损、瘀血肿痛、气血不和、经络不通以 至脏器受损等，统称为跌打损伤，主要以活血化瘀、消肿止痛、续筋接骨、活 血通络等中药复方予以治疗，《跌打大全》中记载有81首方剂。从《中国药 典》(2015版)中检索含“跌打”、“跌扑”字眼的单味中药和中成药，共检索 出单味中药71味，中成药方剂48首。
三、本发明分析的创新性和先进性以及主要分析内容、方法、结果与结论
(1)根据查新报告，本发明关于蟅虫创愈胶囊的提取工艺筛选、提取工艺 优化、成型工艺、质量标准、稳定性分析和初步药效学分析，国内未见文献报 道。
1.首次采用AHP层次分析法多指标优化了蟅虫创愈胶囊的提取工艺；
2.首次优化了蟅虫创愈胶囊的纯化精制工艺；
3.首次对蟅虫创愈胶囊浓缩干燥工艺进行分析；
(2)主要分析内容、方法、结果与结论
1.为提高药品质量，提高患者依从性，本发明对其进行二次开发分析，使 蟅虫创愈胶囊更加符合临床和市场要求、服用方便。具体分析内容如下：
(1)建立蟅虫创愈胶囊的提取工艺；
(2)优化蟅虫创愈胶囊的纯化精制工艺；
(3)筛选考察蟅虫创愈胶囊的浓缩干燥工艺；
(4)完善蟅虫创愈胶囊的成型工艺；
(5)建立蟅虫创愈胶囊的质量标准；
(6)完成蟅虫创愈胶囊的初步药效学分析。
2.分析方法
(1)筛选提取工艺：以川续断皂苷Ⅳ、柚皮苷、马钱苷酸、当药苷、绿 原酸和干膏得率为综合考察指标，采用AHP层次分析法确定各指标的权重系数， 优选蟅虫创愈胶囊的提取工艺。
(2)筛选精制工艺：以川续断皂苷Ⅳ，柚皮苷，马钱苷酸，当药苷，绿原 酸和固含物得率为综合考察指标，考察蟅虫创愈胶囊超滤膜超滤法最佳工艺参 数。
(3)优化干燥工艺：选择干燥温度、干燥时间、真空压力对蟅虫创愈胶囊 干燥工艺参数进行关键技术点优化。
(4)成型工艺的分析：①考察浸膏粉的吸湿性、确定其生产条件及包装材 料；②通过考察堆密度、休止角，考察粉末的流动性，确定所用胶囊型号；
(5)建立质量标准：主要成分定性鉴别方法：采用薄层色谱法对红参、续 断、骨碎补等药材进行鉴别；主要成分的定量方法：采用高效液相色谱法对续 断中川续断皂苷Ⅵ进行含量测定。
(6)初步药效学分析：通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型，考察制剂的消肿 作用；通过醋酸致小鼠扭体试验，考察制剂的止痛作用；通过断尾试验：考察 制剂的止血作用。
3.分析结果
(1)确定最佳提取工艺条件为：提取溶剂为水，溶剂总用量18倍，提取 时间30min，提取2次；
(2)确定的最佳纯化精制工艺为：超滤膜超滤分子截留量为30万、工作 压强0.07MPa、料液浓缩比为1:8。
(3)浓缩干燥工艺：
(4)成型工艺参数为:确定1号胶囊填充，铝塑pvc包装；
(5)建立制剂质量标准，具有很好的重现性；
(6)初步药效学显示：该制剂具有良好的镇痛、消肿、止血作用。
4.分析结论
本发明所建立的提取路线、工艺方法、质量标准切实可行，重现性高，可 以适用于生产过程。
四、推广应用的条件和前景
存在的问题：经费缺乏，研发周期不足。缺少相应的产业政策支持。
建议：加大资金投入，为下一步的药效试验、急性/长期毒性试验的开展提 供相应的扶持。扶持医疗机构制剂完成6类2型新药规定的临床前分析申报资 料，为申请临床分析批文奠定基础。对于按计划进行的项目，在中期考核期间 应适当考虑追加科研经费。
前景：随着人们生活节奏的加快，跌打碰撞以及创伤骨折的情况屡有发生。 这类外科损伤不仅伴有极大的痛楚，倘若在急性发作期未得到好的治疗，还有 可能影响静脉回流和动脉供血，使损伤部位得不到足够的营养和血液供应，从 而造成肌肉拘挛、反复性疼痛等后遗症，严重降低了伤患的生活质量。蟅虫创 愈胶囊研制为临床跌打损伤和闭合性骨折所致的软组织损伤患者提供了安全、 有效、方便的中药制剂，创造了良好的社会效益和经济效益，在弘扬中医药传 承方面具有重要的意义。
实施例2：
第一部分蟅虫创愈胶囊的文献资料
1蟅虫创愈胶囊分析概况
随着人们生活节奏的加快，跌打碰撞以及创伤骨折的情况屡有发生。这类 外科损伤不仅伴有极大的痛楚，倘若在急性发作期未得到好的治疗，还有可能 影响静脉回流和动脉供血，使损伤部位得不到足够的营养和血液供应，从而造 成肌肉拘挛、反复性疼痛等后遗症，严重降低了伤患的生活质量。
蟅虫创愈胶囊在在中医药理论指导下，将名医经典验方“损伤散”，经提 取和成型工艺改进，结合现代制剂工艺药效学分析而制成口服胶囊剂，用于治 疗急性软组织损伤。
该制剂主要由鳖虫(又名蟅虫)、续断、骨碎补、红参、当归、煅龙骨、 煅牡蛎等药组成，方中以土鳖虫(又名蟅虫)为君药行其破瘀血，续筋骨之功 效；重用续断、骨碎补为臣药，行二者补益肝肾、强健筋骨的作用，与土鳖虫 共同起到调血脉、续折伤的作用；红参可大补元气，通过补气助土鳖虫行瘀血 之功效。当归可补血止痛，以防土鳖虫破血过甚；巴戟天可佐助续断、骨碎补 之强壮筋骨的功效；同时佐以煅龙骨、煅牡蛎收敛固涩。全方补元气，行瘀血， 续筋骨，更偏重于治疗外伤引起的气血、津液、脏腑、经络功能的病理变化， 用于跌打损伤和闭合性骨折所致的软组织挫伤，起到活血化瘀、消肿止痛的功 效，能够缓解跌打损伤的急性期疼痛。
2组方各药味的基源、化学成分和药理活性分析
2.1土鳖虫(Eupolyphaga seu Steleophaga)
性味归经：性寒，味咸；有小毒。归肝经。
功能主治：破瘀血，续筋骨。用于筋骨折伤，瘀血经闭，症瘕痞块。
化学成分：含挥发当归油和氨基酸。挥发油总量约22％，主要为萘、脂肪 醛、芳香醛；氨基酸总量约40％。
药理活性：总生物碱具有扩张血管、保护心脑缺氧(血)作用；水提取物能显 著延长出血时间和复钙时间，明显抑制血小板聚集率，表现为有抗血栓形成和 溶解血栓的作用；水煎液能调节脂肪代谢，对动脉粥样硬化具有延缓作用；提取物 对D-半乳糖所致的肝损害有保护作用。
2.2川续断(Dipsacus asperoides C.Y.Cheng etT.M.Ai)
为川续断科多年生草本植物川续断的根，因能“续折接骨”而得名。
性味归经：性微温，味苦、辛。归肝，肾经。
功效主治：补肝肾，续筋骨，调血脉。治腰背酸痛，足膝无力，胎漏，崩 漏，带下，遗精，跌打损伤，金疮，痔漏，痈疽疮肿。
化学成分：主要含三萜皂苷类、环烯醚萜类、生物碱类和挥发油。还含正 二十五烷酸、正三十二烷酸、蔗糖、β－谷甾醇、胡萝卜苷等。
药理活性：续断水煎液高中低剂量组能显著促进成骨细胞增殖，增加碱性 磷酸酶(ALP)表达，增加矿化结节形成的数量，促进成骨细胞骨钙素和
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型前胶 原mRNA的表达，促进骨伤愈合。续断水提醇沉后的浸膏，有延缓骨质疏松的 作用。
2.3骨碎补(Davalliamariesii Moore ex Bak.)
性味归经：性苦，味温。归肝，肾经。
功效主治：补肾，活血，止血。治肾虚久泻及腰痛，风湿痹痛，齿痛，耳 鸣，跌打闪挫、骨伤，阑尾炎，斑秃，鸡眼。
化学成分：(2R and 2S)-Naringin、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、咖啡酸 -4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、4-O-β-D-吡喃葡萄糖基香豆酸、羟基反式肉桂酸、反式 桂皮酸、3，4-二羟基苯甲酸等。
药理活性：骨碎补总黄酮可促成骨细胞增殖，具有较强的抗膝骨关节炎作 用。
2.4红参(Panax ginseng C.A.Mey.)
红参是生晒参的熟用品，其加工方法是经过浸润、清洗、分选、蒸制、晾 晒、烘干等工序加工而成。红参在蒸制过程中，因为热处理会发生化学反应， 成份上发生变化。
性味归经：甘、微苦，温。归脾、肺、心经。
功效主治：大补元气，复脉固脱，益气摄血。用于体虚欲脱，肢冷脉微， 气不摄血，崩漏下血；心力衰竭，心原性休克。
化学成分：三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg3、20(R)-人参皂苷Rg3、20(S)- 人参皂苷Rg2、20(R)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、 人参皂苷Rh4、-Ro、-Rb1、-Rg1、-Re、-Rf等。
药理作用：调节神经、心血管及内分泌系统，促进机体物质代谢及蛋白质 和RNA、DNA的合成。还能提高脑、体力活动能力和免疫功能，增强抗应激、 抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老、抗辐射能力。其对高血压和动脉粥样硬化症，糖尿 病、贫血、肝病、肿瘤及老年病等均有效。
2.5当归(Angelica sinensis(Oliv.)Diels)
性味归经：甘、辛、温。归肝、心、脾经。
功效主治：补血；活血；调经止痛；润燥滑肠。主血虚诸证；月经不调； 经闭；痛经；症瘕结聚；崩漏；虚寒腹痛；痿痹；肌肤麻木；肠燥便难；赤痢 后重；痈疽疮疡；跌扑损伤。
化学成分：挥发油是当归的重要组成成分，包括中性油，酚性油和酸性油 三种。主要成分A中性油成分，含量最高，约占总油的88％，主要有藁本内酯、 川芎内酯、亚丁基苯酞、当归酮、新当归内酯、松柏醇阿魏酸酯、邻羧基苯正 戊酮、佛手柑内酯等约19种。有机酸：主要包括阿魏酸、丁二酸、邻苯二甲酸 酐、茴香酸、癸二酸、烟酸等。
药理作用：主要有保护心脏、抗心律失常、抗动脉粥样硬化心肌梗死，抑 制平滑肌，抗血小板聚集，抗炎作用，增强机体免疫功能，脑缺血损伤的保护， 抗肿瘤，使细胞增殖，保护肝脏和肾脏等作用现代药理学分析进一步证明了 当归活血化瘀、补血止痛等作用，同时还发现，当归有抗炎、清除氧自由基、 保肝利胆、保护肾脏、增强免疫功能等作用。
2.6巴戟天(Morinda officinalis How.)
性味归经：味辛，甘；性微温。归肾，肝经
功效主治：补肾阳，强筋骨，祛风湿。用于阳痿遗精，宫冷不孕，月经不 调，少腹冷痛，风湿痹痛，筋骨痿软。
化学成分：甲基异茜草素、甲基异茜草素-1-甲醚、大黄素甲醚、2-羟基羟 甲基蒽醌，1-羟基蒽醌、1-羟基-2-甲基蒽醌(1-hydroxy-2-methyl anthraquinone)、 1，6-二羟基-2，4-二甲氧基蒽醌、1，6-二羟基-2-甲氧基蒽醌、2-甲基蒽醌。还 含环烯醚萜成分：水晶兰甙、四乙酰车叶草甙等。
药理作用：主要有保护心脏、抗心律失常、抗动脉粥样硬化心肌梗死，抑 制平滑肌、抗血小板聚集、抗炎作用、增强机体免疫功能，脑缺血损伤的保护、 抗肿瘤、保护肝脏和肾脏等作用。分析进一步证明了当归活血化瘀、补血止痛 等作用，同时还发现，当归有抗炎、清除氧自由基、保肝利胆、保护肾脏、增 强免疫功能等作用。
2.7煅龙骨(FossiliaOssiaMastodi)
性味归经：味甘涩，平；入心、肝、肾、大肠经。
功效主治：安神镇惊。
2.8煅牡蛎(Ostreariuularis Gould)
性味归经：味咸，微寒。归肝、胆、肾经
功效主治：收敛固涩。用于自汗盗汗，遗精崩带，胃痛吞酸。
现市售用于治疗跌打损伤所致的软组织损伤药物多以外用药为主，而内服 药物较少(如云南白药散)，其中中药胶囊剂更少。因此开发用于治疗的内服 药物有很好的市场前景。
第二部分蟅虫创愈胶囊的提取工艺分析
1仪器与材料
1.1仪器
Agilent1260Ⅱ高效液相色谱仪；红外真空干燥箱(上海锦屏仪器仪表有限 公司，766-3)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) 水浴锅(金坛市恒丰仪器厂，HH-601)；电子天平(德国赛多利斯BS110S， 万分之一)；电子天平(德国赛多利斯BT125D，十万分之一)；紫外可见分 光光度计(日本岛津公司UV—2401)；粉碎机(QE-200g高速万能粉碎机浙江 屹立工贸有限公司)等。
1.2药物、试剂
1.2.2药物土鳖虫(药用级，河北祁新中药颗粒饮片有限公司，批号 20180304)，续断(药用级，甘肃省国草药业有限公司，批号20171101)，骨 碎补(药用级，成都济宏药业有限公司，批号20170609)，当归(药用级，甘 肃·陇西百宝药业有限责任公司，批号20180504)，巴戟天(药用级，河北祁新 中药颗粒饮片有限公司，批号20170609)，红参(药用级，甘肃·陇西百宝药业 有限责任公司，批号20171206)，煅龙骨(药用级，甘肃·陇西百宝药业有限责 任公司，批号20180913)，煅牡蛎(药用级，甘肃·陇西百宝药业有限责任公司，批号20181120)。
1.2.2试剂马钱苷酸(成都克洛玛生物科技有限公司，批号CHB171220)； 绿原酸(成都克洛玛生物科技有限公司，批号CHB170713)；当药苷(成都克 洛玛生物科技有限公司，批号CHB180115)；川续断皂苷Ⅳ(成都克洛玛生物 科技有限公司；批号CHB180508)；柚皮苷(成都克洛玛生物科技有限公司， 批号CHB171010)；无水乙醇(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂，批号：20170206)； 异丙醇(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂，批号：20170710)；甲醇(色谱纯， 天津市大茂化学试剂厂，批号：20170901)；乙腈(色谱纯，天津市大茂化学 试剂厂，批号：20170318)；水为娃哈哈纯净水。
2方法与结果
2.1供试品溶液的制备
在优化提取工艺的过程中，考虑到各成分的溶解性能及成本，选择以水煎 煮回流提取有效成分。按比例精密称取处方药材，加入一定体积蒸馏水，回流 提取，放置至室温，补足重量，抽滤，药渣中加入一定体积蒸馏水，重复上述 操作，共回流提取3次，合并滤液，得供试品溶液。4℃保存备用。
2.2干膏得率的测定
精密量取“2.1”项下供试品溶液10mL，置已干燥至恒定质量的蒸发皿中，水 浴蒸干，于105℃干燥3h，取出，置干燥器中冷却30min，精密称定质量，计 算出膏率。
2.3马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷及川续断皂苷定量测定
2.3.1色谱条件Agilent-1260Ⅱ型高效液相色谱仪；Thermo ODS HYPERSIL C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；Spectra-physics ODS-1色谱柱 (250mm×4.6mm，5μm)；AgilentZORBAX SB-C18色谱柱(250mm×4.6mm， 5μm)；流动相：0.1％的磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱：0-20min，5％～10％ 乙腈；20-30min，10％～20％乙腈；30-45min，20％～25％乙腈；45-70min，25％～50％ 乙腈；检测器：DAD检测器；检测波长：川续断皂苷Ⅳ-212nm，马钱苷酸、绿 原酸、当药苷-240nm，柚皮苷-280nm、320nm；体积流量：1mL/min；进样量 10μL；柱温：30℃。
2.3.2混合对照品溶液的制备分别取马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、 川续断皂苷Ⅳ适量，精密称定，同置于2mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻 度，制成含马钱苷酸0.7mg/mL、绿原酸1.97mg/mL、当药苷0.72mg/mL、柚皮 苷1.98mg/mL、川续断皂苷3.8mg/mL的混合对照品溶液，即得。
2.3.3标准曲线的绘制精密移取“2.3.2”项下混合对照品溶液适量，置于10mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列不同质量浓度的对照品溶液。精 密吸取系列不同质量浓度对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。 以各对照品质量浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，进 行回归分析，得到各指标成分的回归方程、相关系数及线性范围分别为马钱苷 酸Y1＝17078X-15.76，r＝1.0000，0.7～0.0105mg/mL；绿原酸Y2＝19905X+ 52.00，r＝0.9999，0.02955～1.97000mg/mL；当药苷Y3＝14561X-24.88，r＝ 1.0000，0.0108～0.7200mg/mL；柚皮苷Y4＝12767X+37.04，r＝1，0.0297～1.9800mg/mL；川续断皂苷Y5＝1655X-3.745，r＝1.0000，0.057～3.800 mg/mL。
2.3.4精密度试验精密吸取“2.3.2”对照品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条 件连续测定6次马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川续断皂苷Ⅳ的峰面积， 6次峰面积的RSD分别为0.76％、0.63％、0.82％、0.55％、0.79％。结果表明该 方法精密度良好。
2.3.5稳定性试验称取以上药材共12g，按“2.1”项下供试品溶液的制备方 法制备，“2.3.1”项下色谱条件于0h、2h、4h、8h、12h、24h进行测定马 钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川续断皂苷Ⅳ的含量，测得峰面积积分值 RSD：马钱苷酸为1.35％，绿原酸为0.87％，当药苷为1.68％，柚皮苷为2.35％， 川续断皂苷Ⅳ为1.54％。
2.3.6重复性试验称取以上药材共6份，每份约12g，按“2.1”项下供试品 溶液的制备方法制备，“2.3.1”项下色谱条件测定马钱苷酸、绿原酸、当药苷、 柚皮苷、川续断皂苷Ⅳ的含量，测得峰面积积分值RSD：马钱苷酸为0.98％， 绿原酸为0.63％，当药苷为1.24％，柚皮苷为1.79％，川续断皂苷Ⅳ为1.36％。
2.3.7加样回收率试验以马钱苷酸的加样回收率为例，称取以上药材共9份， 每份约12g，随机分为3组，每组分别加入浓度为0.7mg/mL的马钱苷酸对照品 溶液0.9mL、1.8mL、2.7mL，按“2.1”项下供试品溶液的制备方法制备，“2.2.1” 项下色谱条件测定马钱苷酸的含量，测得马钱苷酸平均加样回收率为100.14％， 马钱苷酸峰面积积分值RSD为0.42％。
2.4提取工艺优化
2.4.1AHP法确立权重系数根据复方中药味君臣佐使配伍规律及各成分药 理作用强弱，将各指标含量和出膏率作为权重指标予以量化，即将6项指标分 成4个层次，并确定各指标的优先顺序：川续断皂苷Ⅳ＞柚皮苷＞马钱苷酸＝ 当药苷＝绿原酸＞浸膏，构建成对比较的优先判断矩阵，并赋予各项指标的相 对评分，见表1。
表1指标成对比较的优先判断矩阵
Figure BDA0003442539920000131
根据表1矩阵结果，川续断皂苷Ⅳ、柚皮苷、马钱苷酸、当药苷、绿原酸 和干膏率等6项指标经层次分析后得到的权重系数分别为0.3536，0.2184， 0.1202，0.1202，0.1202，0.0674，一致性比列因子(CR)＝0.0044＜0.1000， 即指标优先比较判断矩阵具有满意的一致性，求得的权重系数有效，可用于蟅 虫创愈胶囊的提取工艺综合评分。
2.4.2单因素试验以马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川续断皂苷及干 膏得率等主要成分的含量为考察指标，采用单因素试验筛选料液比、提取时间 及提取次数等因素的水平取值范围，为中心组和设计实验提供参考。
2.4.2.1料液比的选择按照处方计量精密称量药材粉末6份，以蒸馏水为提 取溶剂，以料液比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15及1∶18分别回流提 取，提取次数为1次，提取时间为60min，测定以上5种指标成分的含量及干膏 得率，对不同料液比进行评价，综合评分结果分别为3.2110，4.2837，4.5000， 4.6000，4.9828，5.0266，后续实验优化料液比范围为6～18倍。
2.4.2.2提取时间的选择按照处方计量精密称量药材粉末5份，以蒸馏水为 提取溶剂，以提取时间为30min，60min，90min，120min，150min分别回流提 取，提取次数为1次，料液比为1∶15，测定以上5种指标成分的含量及干膏得 率，对不同提取时间进行评价，综合评分结果分别为4.1113，4.1563，4.1337， 4.0771，后续实验优化提取时间范围为30～90min。
2.4.2.3提取次数的选择按照处方计量精密称量药材粉末3份，以蒸馏水为 提取溶剂，以提取次数为1次、2次、3次分别回流提取，提取时间为60min， 料液比为1∶15，测定以上5种指标成分的含量及干膏得率，对不同提取次数进 行评价，综合评分结果分别为3.5546，4.5833，4.6265，根据综合评分结果，提 取2次的得分最高，因此，选择2次为提取次数，后续实验不再优化。
2.4.3中心组合设计-响应面法实验基于单因素实验确定的各因素的水平范 围，进一步采用中心组合设计-响应面法对蟅虫创愈胶囊的提取工艺进行综合优 化，以马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川续断皂苷及干膏得率的权重和 为评价指标，使用DesignExpert 8.0软件对实验结果进行回归分析，最终筛选 出各因素最佳工艺参数。
2.4.3.1因素及水平在单因素试验的基础上，根据中心组合设计-响应面法的 设计原理，得到因素代码及水平见表2。
表2中心组合设计因素与水平
Figure BDA0003442539920000141
2.4.3.2中心组合设计-响应面法实验设计及结果称取处方药材每份12g，共 13份，按“2.1”、“2.2”和“2.3”项下方法制备供试品，测定干膏得率及马 钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川续断皂苷等指标性成分的提取率，按“2.4.1” 项下AHP法所得权重系数计算综合得分为评价指标，根据实验表进行设计，用 Design Expert 8.0软件对实验设计的结果进行分析处理。实验设计和综合得分结 果见表3。
表3中心组合实验设计及结果
Figure BDA0003442539920000151
利用Design Expert软件，对表数据进行多元二次回归，得回归方程 Y＝+4.85+0.29*A+0.012*B-0.046*A*B-0.21*A2-3.264E-003*B2，(r＝0.9379，P ＜0.01)。对该模型进行分析，结果显示模型具有高度的显著性(P＜0.01)， 失拟项不显著以及R2＝0.8797，由上可知方程拟合度和可信度均良好，试验误差 小，故可用此模型对蟅虫创愈胶囊的提取工艺进行分析和预测。
依据确立的多项式模型，分别绘制因素A、B对综合评分的二维等高线图和 三维效应曲面图，并优选两个因素的最佳取值范围，结果见图2。
根据效应面和等高线图选取较佳工艺范围为：回流提取，提取时间为30min， 提取溶剂为蒸馏水，料液比为1∶18。
按照优选方案进行验证实验，共平行3次，综合得分分别为4.9397、4.9503 以及4.9459，平均值为4.9453，预测值为4.95403，RSD为0.11％，表明所建立 的数学模型预测性良好，优选工艺条件重现性理想。
3讨论
3.1中医治疗跌打损伤具有悠久的历史，古称“跌打损伤”为诸伤之总论。 中医把凡因外力作用而引起的筋骨伤损、瘀血肿痛、气血不和、经络不通以至 脏器受损等，统称为“跌打损伤”，主要以活血化瘀、消肿止痛、续筋接骨、 活血通络等中药复方予以治疗。
3.2蟅虫创愈胶囊的组方以土鳖虫(又名蟅虫)为君药行其破瘀血，续筋骨 之功效；重用续断、骨碎补为臣药，行二者补益肝肾、强健筋骨的作用，与土 鳖虫共同起到调血脉、续折伤的作用；红参可大补元气，通过补气助土鳖虫行 瘀血之功效。当归可补血止痛，以防土鳖虫破血过甚；巴戟天可佐助续断、骨 碎补之强壮筋骨的功效；同时佐以煅龙骨、煅牡蛎收敛固涩。全方补元气，行 瘀血，续筋骨，更偏重于治疗外伤引起的气血、津液、脏腑、经络功能的病理 变化，用于跌打损伤和闭合性骨折所致的软组织挫伤，起到活血化瘀、消肿止 痛的功效，能够缓解跌打损伤的急性期疼痛。同时其还兼有舒筋活络之功效， 有利于伤痛的愈后。
3.3复方中药味较多，本发明选择续断中的川续断皂苷Ⅵ、当药苷、马钱苷 酸、绿原酸，骨碎补中的柚皮苷以及浸膏得率为考察指标，能够较为全面的反 映提取工艺对复方药物成分的提取效率。采用单因素试验结合中心组合设计-响 应面法对提取工艺进行综合优化，能够克服正交设计及均匀设计预测性不高、 精确度较差的不足，通过非线性模型拟合来预测最佳实验条件，使得提取操作 工艺得到最大程度的优化，既能实现节约能源，又能保证药物成分得到最大程 度提取，可为本复方全面开发利用奠定坚实的实验基础。
第三部分蟅虫创愈胶囊精制浓缩干燥工艺分析
中药水提液通常体积较大、杂质较多等问题严重，给进一步的制剂带来困 难。尤其胶囊制剂载药量有限，常需采用各种精制纯化方法对中药复方提取液 进行纯化分离，富集中药复方有效部位(群)或有效成分群，临去除淀粉等杂质影 响，达到“去粗取精”的效果，以提高疗效，减少服用剂量，增加制剂稳定性。 本发明以川续断皂苷Ⅳ，柚皮苷，马钱苷酸，当药苷，绿原酸和固含物得率为 综合考察指标，考察蟅虫创愈胶囊超滤膜超滤法最佳工艺参数。旨在找出最适 合本制剂的一种精制方法，为更好地发挥疗效提供实验依据，为工业化大生产 奠定基础。
1仪器与材料
1.1仪器Agilent1260Ⅱ高效液相色谱仪；红外真空干燥箱(上海锦屏仪器 仪表有限公司，766-3)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有 限公司)水浴锅(金坛市恒丰仪器厂，HH-601)；电子天平(德国赛多利斯 BS110S，万分之一)；电子天平(德国赛多利斯BT125D，十万分之一)等。
1.2试药
药材规格为统货，均购自于兰州百宝药业有限责任公司，由我院赵小梅副 主任中药师鉴定为正品。
川续断皂苷Ⅳ(成都克洛玛生物科技有限公司，批号CHB180508)
无水乙醇(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂，批号：20170206)；异丙醇 (色谱纯，天津市大茂化学试剂厂，批号：20170710)；甲醇(色谱纯，天津 市大茂化学试剂厂，批号：20170901)；乙腈(色谱纯，天津市大茂化学试剂 厂，批号：20170318)；水为娃哈哈纯净水。
2方法与结果
2.1评价指标川续断皂苷Ⅵ含量测定方法建立
2.1.1色谱条件
Agilent-1260Ⅱ型高效液相色谱仪，色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(32：68)；流速：1.0mL·min-1； 检测波长：212nm；柱温：30℃；进样量：20μL。理论板数按川续断皂苷Ⅵ峰 值计算不低于3000。
2.1.2对照品溶液的制备
称取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，加甲醇制成每含川续断皂苷 Ⅵ2.42mg/mL的溶液。
2.1.3供试品溶液的制备
取按优化后的提取工艺参数制备的提取物粉末约0.3g，精密称定，置10mL 容量瓶中，加甲醇超声处理10min，溶解定容至刻度，即得。
2.1.4阴性供试品溶液的制备
称取不含续断的阴性处方按该制剂优化后的提取工艺参数制备的阴性样 品，按2.1.3项下的制备方法制备成阴性供试品溶液。
2.1.5标准曲线的制备
分别精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液0.3、0.6、1.0、1.5、2.0、2.5mL， 定容至10mL容量瓶中，精密吸取上述系列对照品溶液各20μL注入液相色谱仪， 记录峰面积。分别以峰面积Y为纵坐标，浓度X(mg/ml)为横坐标，绘制标准 曲线，得到其线性回归方程Y＝4×106x-35125(r＝0.9999)。结果表明川续断皂 苷Ⅵ在1.446～12.05mg的范围内呈良好的线性关系。
2.1.6含量测定
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪中，按标 准曲线制备项下条件，测定川续断皂苷Ⅵ色谱峰峰面积积分值，计算，即得。
2.1.7方法学考察精密度、重复性、稳定性及加样回收率实验结果均符合要 求。
2.2精制工艺考察
2.2.1正交实验设计
超滤工艺主要受分子截留量、工作压力、料液比影响。取土鳖虫、续断、 骨碎补等8味药材按处方比例称取，粉成粗粉，用水提取。以川续断皂苷Ⅳ和 干膏得率为综合考察指标(川续断皂苷Ⅳ和干膏得率权重系数分别为70，30)， 采用正交实验设计，以膜分子截留量、工作压力、料液比为考察因素，优化超 滤工艺参数。因素水平见表1，正交试验结果见表2。
表1超滤工艺L9(34)正交试验因素水平表
Figure BDA0003442539920000171
2.2.2正交实验测定及结果
表2超滤工艺正交实验安排及结果表
Figure BDA0003442539920000172
Figure BDA0003442539920000181
注：综合评分＝出膏率/最大出膏率*30+川续断皂苷Ⅵ含量/最大川续断皂苷 Ⅵ含量*70
由表2极差分析可知，通过综合评分结果，影响超滤的因素大小为A>B>C， 即膜分子截留量>工作压力>料液比。以综合评分为评价指标得出最佳工艺条件 为：A3B2C2。但直观分析只能得出影响因素的主次，不能反映这些因素对提取的 影响是否具有显著性，为此，进行了方差分析，结果详见表3。
表3超滤工艺方差分析表
方差来源 离差平方和 自由度 均方(MS) F值 显著性
A 77.94 2 38.97 22.79 P<0.05
B 49.06 2 24.53 14.34
C 11.22 2 5.61 3.28
误差 3.42 2 1.71 1.00
综合极差分析和方差分析，得出最佳超滤工艺条件为：A3B2C2，即膜分子 截留量10000、工作压力0.07MPa、料液比1:12。
2.3浓缩工艺考察
取超滤后的药液，分成等量的2份，其中1份采用敞口式常压法浓缩；另 外1份采用减压法(温度60℃，真空度0.08～0.09MPa)浓缩。在浓缩至相对密 度约为1.20(60℃)时取样检测，并记录时间。
试验结果表明，浓缩方法对提超滤液中川续断皂苷Ⅵ含量影响不大，但是 其浓缩时间差异较大，所以为适应工业化大生产，缩短生产周期，综合评价最 终采用减压浓缩(温度60℃，真空度0.08～0.09MPa)作为该制剂的浓缩工艺。
2.4干燥工艺考察
目前中药浸膏常用的干燥方法有常压干燥、减压干燥、喷雾干燥、微波干 燥、冷冻干燥等，不同干燥方法对中药浸膏中有效成分的含量均产生不同的影 响。因该制剂为院内制剂，为适合医院制剂室生产需要，在对其进行常压干燥 和减压干燥对比分析后，本发明采用减压干燥方法，并对其工艺参数进行优化。
2.4.1正交试验设计
影响干燥工艺的因素较多，为确定蟅虫创愈胶囊的最佳干燥工艺。取浓缩 后的浓缩液进行实验，经前期分析和查阅文献，发现川续断皂苷Ⅵ相对稳定， 所以只以含水量为考察指标，采用正交实验设计，以装盘厚度、真空压力、温 度为考察因素，优化超滤工艺参数。因素水平见表4，正交试验结果见表5、表 6。
表4干燥工艺L9(34)正交试验因素水平表
Figure BDA0003442539920000191
2.4.2正交实验测定及结果
表5干燥工艺正交实验安排及结果表
Figure BDA0003442539920000192
注：含水量指标＝100-每克含水量。
表6干燥工艺方差分析表
方差来源 离差平方和 自由度 均方(MS) F值 显著性
A 112.16 2 56.08 77.61
B 3.64 2 1.82 2.52
C 35.52 2 17.76 24.58
误差 1.45 2 0.72 1.00
F(0.05)＝19
由表5极差分析可知，影响干燥的因素大小依次为A>C>B，即铺盘厚度> 温度>工作压力。但直观分析只能得出影响因素的主次，不能反映这些因素对提 取的影响是否具有显著性，通过方差分析，可知因素A对干燥工艺影响比较显 著(P<0.05)，通过极差分析和方差分析，得出最佳工艺条件为：A2B3C2，即蟅 虫创愈胶囊干燥时装盘厚度为2cm，真空压力为0.09MPa，干燥温度为80℃。
2.5工艺条件验证
取三份提取液，通过重复试验将得到的最佳超滤浓缩干燥工艺条件进行精 制浓缩干燥工艺验证，验证试验结果结果见表7
表7验证试验及结果表
Figure BDA0003442539920000201
由验证实验结果可知，优化后精制浓缩干燥工艺可行、稳定、重现性好。 优选出的超滤工艺参数：膜分子截留量10万、工作压力0.07MPa、料液比1:12； 浓缩工艺参数为：真空减压浓缩，温度60℃、压力0.08～0.09Mpa；干燥工艺参 数为装盘厚度2cm、工作压力0.09MPa、温度80℃，可作为该制剂工业化生产 的控制参数。
第四部分蟅虫创愈胶囊成型工艺分析
1.休止角测定
休止角是指在重力作用下中，粒子在粉体堆积层的自由斜面上滑动时所受 重力和粒子之间摩擦力达到平衡而处于静止状态下测得的最大角。粉末的流动 性是填充准确性的重要因素。它与药粉粒形状、尺寸和含水量有关。休止角越 小，摩擦力越小，流动性越好，一般认为θ≤30度时流动性好，θ≤40度 时可以满足生产过程中的流动性需求。粉体的流动性对剂型的生产影响较大。
将3只漏斗自下而上串联固定于水平放置的坐标纸上方，使最下面的漏 斗的下口距坐标纸的距离控制在1cm处。小心将药粉沿漏斗壁倒入最上面的漏 斗，直到漏斗下形成的圆锥体的尖端接触到漏斗的出口为止。由直尺测出高 度，坐标纸测出圆锥底部的直径，按此法反复定测定5次，求平均值， 计算出休止角(tgα＝H/R)。实验结果见表1。
表1蟅虫创愈胶囊休止角测定结果表
Figure BDA0003442539920000202
由实验结果可知，蟅虫创愈胶囊的休止角为28.98°，表明蟅虫创愈胶囊的 流动性良好，可满足生产工艺中流动性的需求。
2.堆密度测定
堆密度是指粉体质量除以该粉体所占容器的体积V求得的密度，亦称堆密 度。堆密度越小，说明药物颗粒之间含有的空隙越大
测量方法：
取10ml量筒，称取其重量(m1)，取一定量药粉置量筒中，称定其重量(m2)， 药粉重量即为m2-m1。轻摇粉末，使自然压紧后读取体积，由粉末重量和体积 比求出堆密度，重复5次，求得平均堆密度，实验结果见表2。
表2蟅虫创愈胶囊堆密度测定结果表
Figure BDA0003442539920000211
3.相对临界湿度测定
水溶性药物在相对湿度较低的环境下，几乎不吸湿，而当相对湿度增大到 一定值时，吸湿量急剧增加，一般把这个吸湿量开始急剧增加的相对湿度称为 临界相对湿度(CRH)，CRH是水溶性药物固定的特征参数。测定CRH有以下意 义：(1)CRH值可作为药物吸湿性指标，一般CRH愈大，愈不易吸湿；(2)为 生产、贮藏的环境提供参考，应将生产及贮藏环境的相对湿度控制在药物的CRH 值以下，以防止吸湿；(3)为选择防湿性辅料提供参考，一般应选择CRH值大 的物料作辅料。
配置不同的盐的过饱和溶液(CH3COOK，MgCL2，K2CO3，Mg(NO3)2，NaNO2， NaCl，(NH4)2SO4，KCl，KNO3，K2SO4的过饱和溶液，他们的相对湿度分别为22％， 33％，43％，54％，65％，75％，80％，85％，92％，97％，不用饱和溶液对应的不同湿 度环境与相关参考资料有关，置于密闭干燥器中，25摄氏度恒温饱和24h。使 其内部形成不同的相对湿度环境。取蟅虫创愈胶囊内容物粉末分别放置于已恒 重的称量瓶中，在底部摊平均厚约2mm，干燥至恒重，精密称定，打开瓶盖，放 入底部分别盛有不同过饱和溶液的干燥器内，于25℃条件下放置至少72h后， 称重，计算相对湿度下的吸湿百分率。以吸湿百分率为纵坐标，以相对湿度为 横坐标作不同环境下吸湿率曲线图(见图3)。
由图3可知，分别在曲线两端作切线，两切线交点的横坐标即为临界相对 湿度(CRH)。通过CRH的测定来考察药粉的吸湿性。
(见图3)，求得药粉的临界相对湿度为71.3％，可见药粉临界相对湿度偏高， 一般生产环境均可满足，铝塑pvc板包装也可满足其运输贮存要求。
4.服用胶囊规格及剂量的确定
通常，硬胶囊共有八种规格，常用的为0-5号。0#胶囊壳容量为0.75ml、 1#胶囊壳容量为0.55ml、2#胶囊壳容量为0.40ml、3#胶囊壳容量为0.30ml、 4#胶囊壳容量为0.25ml、5#胶囊壳容量为0.15ml，因此，堆密度与胶囊剂的 装量有很大关系。
胶囊壳的可装量＝颗粒的堆密度×胶囊壳的容积。
表3胶囊型号选择结果表
Figure BDA0003442539920000221
根据药物成人临床推荐量与各胶囊壳体积选出服药最方便的胶囊型号为1 号胶囊。
经过以上试验分析得出，粉末的休止角为28.98°，表明粉末流动性良好， 决定了胶囊的装量差异在规定范围之内。根据堆密度测定结果，服用剂量及患 者顺应性，选择1号胶囊进行填充。粉末的临界相对湿度为71.3％，表明粉末不 易吸潮，为保证成品在运输和储存过程中稳定，采用铝塑pvc板进行包装。
第五部分蟅虫创愈胶囊的质量标准分析
1材料
Agilent1260Ⅱ高效液相色谱仪，二极管阵列检测器(Waters 2998)， KH-500DE型数控超声波清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司)，FA2004B型 电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。
蟅虫创愈胶囊三批中试供试品(规格0.45g/粒，批号20190805、20190812、20190816)，川续断皂苷Ⅳ(成都克洛玛生物科技有限公司；批号CHB180508)； 柚皮苷(成都克洛玛生物科技有限公司，批号CHB171010)。阴性对照为缺味 蟅虫创愈胶囊提取物(制备方法同中试样品)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工 厂)，乙腈为色谱纯(天津市精细化工有限公司)，纯化水，其他化学试剂均 为分析纯。
2方法与结果
2.1主要药材定性鉴别
2.1.1红参鉴别
称取供试品内容物1.5g，加三氯甲烷40ml，超声10min，弃去三氯甲烷液， 药渣挥干，加水0.5ml润湿，加水饱和正丁醇10ml，超声处理20min，过滤，滤 液加3倍氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇3ml溶解，作 为供试品溶液。另取红参对照药材粉末0.5g，同法制成对照药材溶液。取缺红 参药材的阴性样品1.5g，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试 验，吸取上述三种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷- 乙酸乙酯-甲醇-水(3:8:4.5:2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，置紫外灯(365nm)下 检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上显相同颜色斑点，且阴性 无干扰。
2.1.2续断鉴别
称取供试品内容物1g，加甲醇15ml，超声处理30min，离心(4000r/min， 5min)取上清液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取续断 对照药材粉末0.2g，同法制成对照药材溶液。取缺续断药材的阴性样品1g，同 法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各 2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)的上层溶 液为展开剂，展开，展距约6cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风 吹至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位 置上显相同颜色斑点，且阴性无干扰。
2.1.3骨碎补鉴别
称取供试品内容物2g，加甲醇30ml，超声10min，离心(4000r/min，5min) 取上清液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取柚皮苷对照 品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。取缺骨碎补药 材的阴性样品2g，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验， 吸取上述三种溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯- 甲酸-水(1:12:2.5:3)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％香 草醛硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中， 在与对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点，且阴性无干扰。
2.2川续断皂苷Ⅵ的含量测定
2.2.1色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动 相：乙腈-水(32：68)；流速：1.0mL·min-1；检测波长：212nm；柱温：30℃； 进样量：20μL。理论板数按川续断皂苷Ⅵ峰值计算不低于3000。
2.2.2对照品溶液的制备
称取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，加甲醇制成每含川续断皂苷 Ⅵ2.42mg/mL的溶液。
2.2.3供试品溶液的制备
取蟅虫创愈胶囊内容物粉末约1g，精密称定，置10mL容量瓶中，加甲醇 超声处理10min，溶解定容至刻度，即得。
2.2.4阴性供试品溶液的制备
按该制剂的处方制备不含续断的阴性样品，按2.2.3项下的制备方法制备成 阴性供试品溶液。
2.2.5标准曲线的制备
分别精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液0.3、0.6、1.0、1.5、2.0、2.5mL， 定容至10mL容量瓶中，精密吸取上述系列对照品溶液各20μL注入液相色谱 仪，记录峰面积。分别以峰面积Y为纵坐标，浓度X(mg/ml)为横坐标，绘制 标准曲线，得到其线性回归方程Y＝4×106x-35125(r＝0.9999)。结果表明川 续断皂苷Ⅵ在1.446～12.05mg的范围内呈良好的线性关系。
2.2.6精密度试验
精密吸取“2.2.2”项下的对照品溶液10μL，在上述色谱条件下连续进样6 次，测定峰面积，得到川续断皂苷Ⅵ峰面积RSD(n＝6)为0.2％，表明该方法 精密度良好。
2.2.7稳定性试验
精密吸取同一份供试品溶液20μL，分别于0，1，2，4，6，8h进样测定峰 面积积分值，结果川续断皂苷Ⅵ峰面积的RSD为1.6％，表明供试品溶液在8h 内稳定性良好。
2.2.8重复性试验
取同一批供试品(20130311)粉末6份，精密称定，分别按2.2.3项下的制 备方法制备，在上述色谱条件下进行测定，测得其平均含量为3.98mg/g，RSD (n＝6)为0.8％，表明该方法重复性良好。
2.2.9回收率试验
精密称取已知含量的样品粉末约0.5g，共9份，精密称定，分别精密加入 一定量的对照品，按2.2.3项下的方法制备，在上述色谱条件下测定，计算川续 断皂苷Ⅵ的回收率。结果川续断皂苷Ⅵ的平均回收率为97.4％，RSD值为 1.29％，结果表明该方法准确可靠。见表1。
表1川续断皂苷Ⅵ加样回收率测定结果
Figure BDA0003442539920000241
Figure BDA0003442539920000251
2.2.10样品测定
分别取三批供试品内容物粉末约1g，精密称定，按“2.2.3”项下的方法制 备供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，并计算川续断皂苷Ⅵ的含量。见 表2。
表2样品中川续断皂苷Ⅵ含量测定结果
批号 含量(mg/g) 平均含量(mg/g)
20190805 3.9840
20190812 3.9713 3.9859
20190816 4.0025
本发明实施例提供的胶囊具体说明如下：
【处方】土鳖虫 续断 骨碎补 煅龙骨 煅牡蛎 红参 巴戟天 当归。
【制法】将土鳖虫、续断等药材粉碎为粗粉。加水浸泡1小时。以18倍水 加热回流提取2次(30min，30min)，合并滤液，60℃压浓缩成相对密度为 1.20-1.38的浸膏，70℃真空干燥8小时，粉碎，过80目筛，填充，即得。
【性状】本品为硬胶囊，内容物为深褐色粉末，气香，味辛、苦、凉。
【鉴别】(1)称取本品内容物1.0g，加三氯甲烷40ml，超声10min，弃去 三氯甲烷液，药渣挥干，加水0.5ml润湿，加水饱和正丁醇10ml，超声20min， 过滤，滤液加3倍氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇3ml 溶解，作为供试品溶液。另取红参对照药材粉末0.5g，同法制成对照药材溶液。 照薄层色谱法(中国药典2010年版附录ⅥB)试验，吸取上述二种溶液5～10μ L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3:8:4.5:2) 10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶 液，热风吹至斑点显色清晰，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与 对照药材色谱相应位置上显相同颜色斑点.
(2)称取供试品内容物1.0g，加甲醇15ml，超声处理30min，离心(4000r/min，5min)取上清液，蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。另取续断对 照药材粉末0.2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版 附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各2～5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上， 以正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)的上层溶液为展开剂，展开，展距约6cm，取出， 晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，置日光下检视。供试 品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上显相同颜色斑点。
(3)称取供试品内容物1.0g，加甲醇10ml，超声10min，离心(4000r/min， 5min)取上清液，蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。另取柚皮苷 对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色 谱法(中国药典2010年版附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各5～10μL，分 别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(1:12:2.5:3)的上层 溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％香草醛硫酸乙醇溶液，热风吹至 斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显 相同颜色斑点。
【检查】应符合胶囊剂项下有关的各项规定(中国药典2015年版一部附录 I L)。
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2015年版一部附录ⅥD)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈- 水(32：68)为流动相；检测波长212nm；柱温：30℃。理论塔板数按川续断 皂苷Ⅵ计算应不低于3000
对照溶液制备精密称取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，加甲醇制成 每1mL含川续断皂苷Ⅵ2.42mg的溶液。
供试品溶液的制备取装量差异下的本品内容物，精密称取约1.0g，置具塞 锥形瓶中，加甲醇10ml，超声处理10min，〔功率(250±70)W，频率(33±2) KHz〕，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液， 即得。
测定法进样量分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入液相 色谱仪，测定，即得。
本品每克含续断以川续断皂苷Ⅵ(C17H76O18)计，不得少于3.1mg/g。
【功能与主治】舒筋活络、消肿止痛。用于治疗肝肾不足所致腰
膝酸痛，足软无力等症，特别适用于跌打损伤急性期的治疗。
【用法与用量】用温黄酒或温开水送服。一次3粒，一日三次。
【规格】每粒装0.45g。
【贮藏】密封，置阴凉处。
【有效期】12个月。
第七部分蟅虫创愈胶囊的药效学分析
1材料与仪器
1.1实验动物
昆明种小鼠200只(6-8周)龄，雌雄各半，体重22～25g，实验动物购自 于甘肃中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(甘)2015-0002。
1.2药品与试剂
1.2.1试药
受试药：蟅虫创愈胶囊(自制)。
阳性药物：云南白药(生产厂家：云南白药集团股份有限公司批号： ZBA1702)。
1.2.2二甲苯(天津市大茂化学试剂厂，批号20181006)；冰醋酸(天津市 百世化工化工有限公司，批号20140718)。
1.3仪器胶塞打孔器，BS110S电子天平(万分之一)德国赛多利斯公司。
2.方法与结果
2.1对冰醋酸引起的小鼠扭体反应的影响：
取昆明种小鼠50只，按体重随机分为模型组、云南白药组(0.206g/kg)、 蟅虫创愈胶囊低剂量组(0.312g/kg)、蟅虫创愈胶囊中剂量组(0.624g/kg)和 蟅虫创愈胶囊高剂量组(1.248g/kg)每组10只，雌雄各半。空白对照组小鼠， 给予等体积生理盐水(0.2ml/10g)，云南白药组和蟅虫创愈胶囊组连续按量给 药10天。末次给药后30分钟后，腹腔注射0.6％冰醋酸生理盐水0.2ml/只，开 始计数注射冰醋酸后15分钟内小鼠扭体(以腹部内凹，躯体与后腿伸张，臀部 高起为指标)次数。数据均以
Figure BDA0003442539920000271
表示，通过SPSS16.0软件采用t检验，进行 统计分析。结果如表1所示。
表1蟅虫创愈胶囊对冰醋酸引起的小鼠扭体次数的影响(
Figure BDA0003442539920000272
n＝10)
Figure BDA0003442539920000273
vs模型组：*p<0.05，**p<0.01。
实验结果表明，与模型组相比，云南白药组和蟅虫创愈胶囊的三个剂量组 都可以显著降低冰醋酸所致的小鼠扭体次数，蟅虫创愈胶囊高剂量组可极显著 降低冰醋酸所致的小鼠牛蹄次数(p<0.01)。说明蟅虫创愈胶囊对于化学性刺激 导致的疼痛具有良好的镇痛作用。
2.2对二甲苯所致的小鼠耳肿胀的影响：
取昆明种小鼠50只，按体重随机分为空白对照组、云南白药组、蟅虫创愈 胶囊低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只，雌雄各半。空白对照组小鼠， 给予生理盐水(0.2ml/10g)，云南白药组和蟅虫创愈胶囊组连续按组灌胃给药 10天，末次给药后于小鼠右耳用微量进样器均匀涂布二甲苯致炎(0.02ml/只)。 3小时后处死小鼠(颈椎脱臼法)，并迅速沿耳廓基线剪下双耳，用直径8mm 的打孔器打下耳片并精密称重，计算肿胀度(肿胀度＝右耳耳片重量-左耳耳片重 量)。数据均以
Figure BDA0003442539920000274
表示，通过SPSS16.0软件采用t检验，进行统计分析。
表2蟅虫创愈胶囊对小鼠耳肿胀的影响(
Figure BDA0003442539920000275
n＝10)
Figure BDA0003442539920000276
Figure BDA0003442539920000281
vs对照组：*p<0.05。
表2结果显示，与空白对照组相比，云南白药组和蟅虫创愈胶囊的三个剂 量组都可以显著降低二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀度(p<0.05)。说明蟅虫创愈胶 囊具有良好的消肿作用。
2.3对断尾小鼠出血时间的影响：
取昆明种小鼠50只，按体重随机分为空白对照组、云南白药组、蟅虫创愈 胶囊低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只，雌雄各半。空白对照组小鼠， 给予生理盐水(0.2ml/10g)，云南白药组和蟅虫创愈胶囊组连续按组灌胃给药 10天，末次给药1小时后将小鼠固定，距离尾尖0.5cm处用利剪截断，立即计 时。每隔30s用滤纸轻轻吸去渗出的血液直至不再出血为止，记录出血时间。数 据均以
Figure BDA0003442539920000282
表示，通过SPSS16.0软件采用t检验，进行统计分析。结果如表3 所示。
表3蟅虫创愈胶囊对断尾小鼠出血时间的影响(
Figure BDA0003442539920000283
n＝10)
Figure BDA0003442539920000284
vs对照组：*p<0.01，**p<0.001。
表3结果表明，与空白对照组相比，云南白药组和蟅虫创愈胶囊的三个剂 量组都可以显著缩短断尾小鼠的出血时间。说明蟅虫创愈胶囊具有良好的止血 作用。
2.4对小鼠凝血时间的影响：
取昆明种小鼠50只，按体重随机分为空白对照组、云南白药组、蟅虫创愈 胶囊低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只，雌雄各半。空白对照组小鼠， 给予生理盐水(0.2ml/10g)，云南白药组和蟅虫创愈胶囊组连续按组灌胃给药 10天，末次给药1小时后，用内径为1mm的玻璃毛细管插入各鼠眼内眦球后静 脉丛，取血，至毛细管内血柱达5cm，每隔30s折断玻璃毛细管一小段，检查有 无出现血凝丝，计算从玻璃毛细管采血到出现血凝丝的时间，即为凝血时间。 数据均以
Figure BDA0003442539920000291
表示，通过SPSS16.0软件采用t检验，进行统计分析。结果如表4 所示。
表4蟅虫创愈胶囊对小鼠凝血时间的影响(
Figure BDA0003442539920000292
n＝10)
Figure BDA0003442539920000293
vs对照组：*，**p<0.001。
结果表明，与空白对照组相比，蟅虫创愈胶囊的低剂量组和中剂量都可以 显著缩短小鼠的凝血时间(p<0.01)。蟅虫创愈胶囊高剂量组和云南白药组可以 极显著缩短小鼠的凝血时间(p<0.001)，说明蟅虫创愈胶囊具有较强的促进凝 血的作用。
本发明实施例提供的最加工艺参数为：
(1)确定最佳提取工艺条件为：提取溶剂为水，溶剂总用量18倍，提取 时间30min，提取2次；
(2)确定的最佳纯化精制工艺为：超滤膜超滤分子截留量为10万、工作 压强0.07MPa、料液浓缩比为1:12。
(3)浓缩干燥工艺：真空减压浓缩(60℃、0.08-0.09MPa)，干燥工艺参 数为：装盘厚度2cm、工作压力0.09MPa、温度为80℃。
(4)成型工艺参数为:确定1号胶囊填充，铝塑pvc包装；
(5)建立制剂质量标准，具有很好的重现性；
(6)初步药效学显示：该制剂具有良好的镇痛、消肿、止血作用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明 的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的 保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备蟅虫创愈胶囊中优化方法，其特征在于，所述制备蟅虫创愈胶囊中优化方法包括：
采用层次分析法多指标优化蟅虫创愈胶囊的提取工艺；
优化蟅虫创愈胶囊的纯化精制工艺；
对蟅虫创愈胶囊浓缩干燥工艺进行优化。
2.如权利要求1的制备蟅虫创愈胶囊中优化方法，其特征在于，所述采用层次分析法多指标优化蟅虫创愈胶囊的提取工艺包括：
(1)AHP法确立权重系数根据复方中药味君臣佐使配伍规律及各成分药理作用强弱，将各指标含量和出膏率作为权重指标予以量化，即将6项指标分成4个层次，并确定各指标的优先顺序：川续断皂苷Ⅳ＞柚皮苷＞马钱苷酸＝当药苷＝绿原酸＞浸膏，构建成对比较的优先判断矩阵，并赋予各项指标的相对评分；
根据矩阵结果，川续断皂苷Ⅳ、柚皮苷、马钱苷酸、当药苷、绿原酸和干膏率等6项指标经层次分析后得到的权重系数分别为0.3536，0.2184，0.1202，0.1202，0.1202，0.0674，一致性比列因子(CR)＝0.0044＜0.1000，指标优先比较判断矩阵具有满意的一致性，求得的权重系数有效，用于蟅虫创愈胶囊的提取工艺综合评分；
(2)单因素试验以马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川续断皂苷及干膏得率成分的含量为指标，采用单因素试验筛选料液比、提取时间及提取次数等因素的水平取值范围；
(3)中心组合设计响应面法实验，基于单因素实验确定的各因素的水平范围，进一步采用中心组合设计-响应面法对蟅虫创愈胶囊的提取工艺进行综合优化，以马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川续断皂苷及干膏得率的权重和为评价指标，对实验结果进行回归分析，最终筛选出各因素最佳工艺参数。
3.如权利要求2的制备蟅虫创愈胶囊中优化方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：(2.1)料液比的选择按照处方计量精密称量药材粉末6份，以蒸馏水为提取溶剂，以料液比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15及1∶18分别回流提取，提取次数为1次，提取时间为60min，测定以上5种指标成分的含量及干膏得率，对不同料液比进行评价，综合评分结果分别为3.2110，4.2837，4.5000，4.6000，4.9828，5.0266，后续实验优化料液比范围为6～18倍；
(2.2)提取时间的选择按照处方计量精密称量药材粉末5份，以蒸馏水为提取溶剂，以提取时间为30min，60min，90min，120min，150min分别回流提取，提取次数为1次，料液比为1∶15，测定以上5种指标成分的含量及干膏得率，对不同提取时间进行评价，综合评分结果分别为4.1113，4.1563，4.1337，4.0771，后续实验优化提取时间范围为30～90min；
(2.3)提取次数的选择按照处方计量精密称量药材粉末3份，以蒸馏水为提取溶剂，以提取次数为1次、2次、3次分别回流提取，提取时间为60min，料液比为1∶15，测定以上5种指标成分的含量及干膏得率，对不同提取次数进行评价，综合评分结果分别为3.5546，4.5833，4.6265，根据综合评分结果，提取2次的得分最高。
4.如权利要求2的制备蟅虫创愈胶囊中优化方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：(3.1)根据中心组合设计响应面法，得到因素代码及水平；
(3.2)中心组合设计响应面法实验设计及结果称取处方药材每份12g，共13份，制备供试品，测定干膏得率及马钱苷酸、绿原酸、当药苷、柚皮苷、川续断皂苷等指标性成分的提取率，按AHP法所得权重系数计算综合得分为评价指标，用软件对实验设计的结果进行分析处理。实验设计和综合得分结果；
利用软件，对表数据进行多元二次回归，得回归方程Y＝+4.85+0.29*A+0.012*B-0.046*A*B-0.21*A2-3.264E-003*B2，r＝0.9379，P＜0.01；
依据确立的多项式模型，分别绘制因素A、B对综合评分的二维等高线图和三维效应曲面图，并优选两个因素的最佳取值范围；
根据效应面和等高线图选取较佳工艺范围为：回流提取，提取时间为30min，提取溶剂为蒸馏水，料液比为1∶18；
按照优选方案进行验证实验，共平行3次，综合得分分别为4.9397、4.9503以及4.9459，平均值为4.9453，预测值为4.95403，RSD为0.11％。
5.如权利要求1的制备蟅虫创愈胶囊中优化方法，其特征在于，采用层次分析法多指标优化蟅虫创愈胶囊的提取工艺最佳提取工艺条件为：提取溶剂为水，溶剂总用量18倍，提取时间30min，提取2次。
6.如权利要求1的制备蟅虫创愈胶囊中优化方法，其特征在于，所述优化蟅虫创愈胶囊的纯化精制工艺包括：
1)评价指标川续断皂苷Ⅵ含量测定方法建立：对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、阴性供试品溶液的制备、标准曲线的制备以及含量测定
2)正交实验、正交实验测定，综合极差分析和方差分析，得出纯化精制最佳工艺条件：超滤膜超滤分子截留量为10万、工作压强0.07MPa、料液浓缩比为1:12。
7.如权利要求1的制备蟅虫创愈胶囊中优化方法，其特征在于，所述对蟅虫创愈胶囊浓缩干燥工艺进行优化工艺条件：真空减压浓缩60℃、0.08-0.09MPa，干燥工艺参数：装盘厚度2cm、工作压力0.09MPa、温度为80℃。
8.一种如权利要求1～7任意一项所述制备蟅虫创愈胶囊中优化方法制备的蟅虫创愈胶囊，其特征在于，所述蟅虫创愈胶囊由土鳖虫、续断、骨碎补、煅龙骨、煅牡蛎、红参、巴戟天和当归组成；其中土鳖虫76.5g、续断153g、骨碎补153g、煅龙骨75g、煅牡蛎75g、红参75g、巴戟天153g、当归76.5g。
9.一种如权利要求8所述蟅虫创愈胶囊的制备方法，其特征在于，所述蟅虫创愈胶囊的制备方法包括：将土鳖虫、续断、骨碎补、煅龙骨、煅牡蛎、红参、巴戟天和当归粉碎为粗粉；
加水浸泡1小时，以18倍水加热回流提取2次，各30min，合并滤液，60℃压浓缩成相对密度为1.20-1.38的浸膏，70℃真空干燥8小时，粉碎，过80目筛，填充，即得。
10.一种如权利要求8所述蟅虫创愈胶囊的制备的用于镇痛、消肿、止血作用的多种制剂。
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