CN114214328A - 一种核酸药物及其应用 - Google Patents

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邓萌
郭晓兰
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Abstract

本发明公开了一种核酸药物及其应用，属于生物医学技术领域，该核酸药物是来源于小鼠源长链非编码RNA AK018451的RNA序列，发现该序列可以对骨质疏松起到抑制作用，因而将其功能区的一部分序列作为核酸药物，命名为DORA。同时，基于AK018451序列的DORA序列可通过靶向PIEZO1对骨质疏松起到治疗效果，可以作为一种RNA药物，且相比其他骨质疏松治疗药物，它具有专一性强，安全性高的特点，对于治疗和/或预防废用性骨质疏松具有巨大潜在应用价值。

Description

一种核酸药物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及到一种核酸药物及其应用。
背景技术
废用性骨质疏松症是一种骨骼所受力学刺激减少或缺失，导致骨量丢失，并表现出骨质疏松症状的疾病。长期卧床患者由于缺乏运动，73.3％患有骨质疏松症，患者髋部及腰椎骨密度均显著下降。此外，长期制动、中长期太空飞行(失重环境)、以及老龄化导致的运动减少，均会导致骨形成速率下降，骨吸收速率升高，最终引起废用性骨质疏松。我国目前处于人口老龄化加速进程，废用性骨质疏松将会成为未来我国老年人健康的重大威胁之一。
RNA药物的研究始于1978年，并在近年来受到了越来越多的关注；相对于传统的通过对蛋白质的调控来控制或治愈疾病，RNA药物可以从源头上遏制不良基因的表达，进而抑制疾病的发展。目前，美国FDA已经批准了多个针对不同疾病的RNA类药物。如Fomivirsen用于治疗CMV引起的视网膜炎。Mipomersen用于治疗家族性高胆固醇血症。Pegaptanib治疗年龄相关黄斑变性等等。RNA药物获批数量逐年增加充分证明了RNA疗法的可行性，也说明了RNA疗法作为新一代治疗方案正在快速发展。当前获批RNA药物主要基于siRNA和miRNA这类短核酸，而将mRNA和LncRNA序列作为RNA药物，具有半衰期长，专一性强的特点，目前已经成为了RNA药物研究的新方向。同时，目前的RNA药物主要基于类似黄斑变性、肝炎等局部疾病和类似亨廷顿病的罕见病，而针对骨质疏松症的RNA药物研究，由于靶向性和给药方式的问题，目前仍鲜见报道。
发明内容
针对上述的不足，本发明的目的是提供一种核酸药物及其应用。本发明具体提供了一种来源于小鼠源长链非编码RNA AK018451的RNA序列，发现该序列可以对骨质疏松起到抑制作用，因而将其功能区的一部分序列作为核酸药物，命名为DORA(DisusedOsteoporosis RNA Alleviator)。同时，基于AK018451序列的DORA序列可通过靶向PIEZO1对骨质疏松起到治疗效果，可以作为一种RNA药物。
为达上述目的，本发明采取如下的技术方案：
本发明提供一种核酸药物，该核酸药物来源于小鼠转录组中的一条长链非编码RNA，名为AK018451，采用AK018451功能区的一部分序列作为RNA药物，其核酸序列为：TCAGTAGCAGTATTGTTACTTC(SEQ ID NO.1)。
本发明中的核酸药物将其命名为废用性骨质疏松RNA药物，英文简称为DORA(Disused Osteoporosis RNA Alleviator)。DORA的序列是来自小鼠转录组中的一条长链非编码RNA，名为AK018451，直接采用AK018451功能区的一部分序列作用RNA药物；同时，DORA被证明可以对细胞和实验动物小鼠的骨形成起到促进作用。另外，本发明所提供的核酸药物-DORA序列，既可以通过直接的RNA合成方式生产，亦可以通过包括体外转录和重组RNA技术等等，不需要繁复的制备工艺及流程，生成后可以直接用于RNA治疗。治疗方式可以通过递送载体通过多种方式(包括静脉注射、微创骨髓腔局部注射、皮下微针注射等)递送至骨质疏松患者体内，并可以治疗患者的骨质疏松。
本发明还提供上述核酸药物在制备用于治疗和/或预防废用性骨质疏松的药物中的应用。
进一步地，上述药物包括但不限于核酸药物组合物、注射制剂等。
本发明还提供一种核酸药物组合物，该核酸药物组合物的活性成分包括上述核酸药物和药学上可接受的载体。
本发明还提供一种注射制剂，该注射制剂的活性成分包括上述核酸药物和药学上可接受的辅料。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括上述核酸药物。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明首次提供了一种来源于小鼠源长链非编码RNA AK018451的RNA序列，发现该序列可以对骨质疏松起到抑制作用，因而将其功能区的一部分序列作为核酸药物，命名为DORA(Disused Osteoporosis RNA Alleviator)。同时，基于AK018451序列的DORA序列可通过靶向PIEZO1对骨质疏松起到治疗效果，可以作为一种RNA药物，对于治疗和/或预防废用性骨质疏松具有巨大潜在应用价值。
2、本发明提供了一种可治疗骨质疏松的核酸(RNA)药物及其应用，相比其他骨质疏松治疗药物，它具有专一性强，安全性高的特点。
附图说明
图1为本发明中力学去负荷条件下AK018451在BMSC中的表达水平；
图2为本发明中AK018451与成骨/成脂相关因子表达水平的相关性；
图3为本发明中AK018451促进BMSC成骨分化结果；
图4为本发明中小鼠颅骨钙黄绿素标记结果图；
图5为本发明中小鼠颅骨矿物沉积速率结果图；
图6为本发明中AK018451对miR-103/107的调控作用结果图；
图7为本发明中miR-103/107对Piezo1的调控作用结果图；
图8为本发明中AK018451对Piezo1的调控作用结果图；
图9为本发明中过表达AK018451对PIEZO1敲除BMSC成骨/成脂分化的影响结果图；
图10为本发明中小鼠骨髓腔局部转染AK018451不同片段对骨形成的影响结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本实施例中所涉及的实验步骤及具体参数，若无特殊限定或具体说明，可参照本领域的常规实验步骤和参数；同时具体所使用的试剂若无特殊限定或具体说明，直接购买市售产品。
1、力学去负荷条件抑制AK018451表达水平
构建RPM(random positioning machine，三维随机回转，指将细胞在不同方向以不同速度随机旋转的条件下培养，从而对细胞模拟力学去负荷环境)体外力学去负荷模型，以及HLU(Hind Limb Unloading，后肢尾悬吊，指将实验小鼠尾部悬挂饲养，从而使小鼠后肢因不接触地面而去负荷)体内力学去负荷模型，检测AK018451在BMSC(骨髓间充质干细胞，哺乳动物的骨髓基质中的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪等多种组织分化潜能的细胞亚群)中的表达水平；具体过程为：
RPM力学去负荷条件下的细胞培养
将对数生长期的骨髓间充质干细胞接种于Opticell细胞培养板上，37℃，5％CO2，完全培养基(DMEM添加10％FBS、100units/ml链霉素与100units/ml青霉素)培养12h后，更换并灌满新鲜培养基，排尽气泡，随机分为两组：正常对照组(静置培养)，随机回转力学去负荷条件组(0-10r/min)，培养时间为12h、24h或36h。
尾悬吊(HLU)力学去负荷小鼠模型的构建
选用4月龄C57BL/6小鼠，用肥皂水清洗尾部，去除油脂和皮屑，剔除尾毛，涂抹安息香酊剂后用医用胶带、回形针制作成悬吊用吊带粘于小鼠尾部两侧，悬挂于尾悬吊装置吊环上，小鼠脊柱与地面呈30°进行尾悬吊。实验期间动物自由进食、饮水，28d后处死小鼠，进行后续实验。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离：取小鼠股骨，剔除软组织，用2-3ml无菌PBS将骨髓冲出；将骨髓团块吹成单细胞悬液，用细胞网筛将悬液过滤后收集于10ml离心管中；将收集的骨髓细胞用完全培养基清洗并重悬、计数，以3×105个细胞/孔的密度接种于6孔板，分别在正常培养3h、8h、16h、24h、36h后换液，36h后将细胞传代，获得骨髓间充质干细胞。
AK018451表达水平：在不同时间点取出细胞后，加Trizol裂解细胞，提取RNA并将其逆转录为cDNA。采用qPCR检测AK018451的表达变化。
检测结果发现，力学去负荷条件下，BMSC中的AK018451表达水平显著降低(如图1所示，其中，图1中(A)RPM条件对AK018451表达的影响，(B)HLU条件对AK018451表达的影响)。
2、在小鼠群体中，AK018451的表达水平与成骨分化基因正相关，与成脂分化基因负相关
在年龄在6-24个月的小鼠群体中，分别检测股骨组织中AK018451和成骨/成脂分化相关基因Alp，Runx2，Tcf7和PPAR-γ的表达水平，并进行相关性分析；具体过程为：
选取不同年龄，不同性别的小鼠75只，处死小鼠，剥离股骨，研磨并提取股骨RNA，采用qPCR技术检测AK018451和成骨/成脂分化相关基因Alp，Runx2，Tcf7和PPAR-γ的表达水平，并进行相关性分析。
结果表明，AK018451的表达水平与成骨分化相关基因Alp，Runx2，Tcf7表达水平呈正相关，而与成脂分化相关基因PPAR-γ呈负相关(如图2所示，图2中(A，B，C)AK018451与成骨分化基因Alp、Runx2和Tcf7表达水平的相关性，(D)AK018451与成脂分化基因PPAR-γ表达水平的相关性)。
4、AK018451促进BMSC成骨分化，抑制BMSC成脂分化
在小鼠BMSC中转染AK018451的siRNA，并检测BMSC的成骨和成脂分化水平；具体过程为：
采用lipofectamine 2000转染试剂将AK018451的siRNA转染至小鼠BMSC中，检测以下指标：
AK018451表达水平：在不同时间点取出细胞后，加Trizol裂解细胞，提取RNA并将其逆转录为cDNA。采用qPCR检测AK018451的表达变化。
成骨/成脂分化相关基因表达水平：在不同时间点取出细胞后，加Trizol裂解细胞，提取RNA并将其逆转录为cDNA。采用qPCR检测成骨分化相关基因Runx2、Osterix、Alp、Col I、Bglap，以及成脂分化相关基因PPAR-γ、Cebp、Ap2的表达变化。
ALP活性变化：在不同时间点取出细胞后，使用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒对细胞进行染色，检测ALP活性变化。
矿化能力：BMSC生长至融合状态后，更换为成骨诱导分化培养基(完全培养基添加50μg/ml维生素C，10mMβ-甘油磷酸钠与1mM地塞米松)，继续培养17d、21d、28d后，取出细胞并使用茜素红染液对细胞进行染色，检测矿化结节形成水平。
结果表明，转染AK018451的siRNA后，BMSC的碱性磷酸酶活性和矿化结节生成速率显著降低，成骨分化相关基因Alp，Runx2表达水平显著下降，而成脂分化相关基因Cebp和PPAR-γ表达水平则显著升高，说明AK018451促进BMSC成骨分化，抑制BMSC成脂分化(如图3所示，其中，图3中(A)细胞ALP和茜素红染色结果，(B)成骨分化基因Alp和Runx2表达水平，(C)成脂分化基因Cebp和PPAR-γ表达水平)。
4、过表达AK018451可以对去卵巢小鼠的骨质疏松起到治疗效果
构建去卵巢骨质疏松小鼠模型，并采用颅骨皮下局部注射技术体内转染AK018451过表达质粒，一个月后处死小鼠，并对颅骨进行冰冻切片，检测小鼠颅骨矿物沉积速率；结果表明，过表达AK018451可以对去卵巢骨质疏松小鼠起到治疗效果(如图4-5所示，其中，图4为小鼠颅骨钙黄绿素标记，图5为小鼠颅骨矿物沉积速率)。
5、AK018451靶向调控miR-103/107
分别使用AK018451过表达质粒和siRNA转染小鼠BMSC，检测miR-103-3p和miR-107-3p的表达水平，并用报告基因检测技术验证AK018451与miR-103/107的结合作用；具体过程为：
采用EntransterTM-D4000转染试剂将AK018451的过表达质粒转染至小鼠BMSC中，提取RNA，采用qPCR技术miR-103-3p和miR-107-3p的表达水平；
采用lipofectamine 2000转染试剂将AK018451的siRNA转染至小鼠BMSC中，提取RNA，采用qPCR技术miR-103-3p和miR-107-3p的表达水平；
使用双荧光素酶报告基因检测AK018451与miR-103/107的结合位点。将AK018451与miR-103/107的结合位点序列扩增后插入到pMIR-Reporter质粒Luciferase片段下游，构建报告基因质粒，并在同样位置插入突变的AK018451与miR-103/107结合位点序列作为阴性对照质粒；通过EntransterTM-D4000转染试剂将报告基因质粒与mimic-103/107共转染骨髓间充质干细胞。转染细胞培养72h后，用Promega Luciferase Assay System作为底物与细胞中的荧光素酶反应；采用BioTek_Synergy多功能酶标仪检测荧光水平，分析AK018451与miR-103/107之间的相互作用。
结果表明，过表达AK018451可以降低miR-103-3p和miR-107-3p水平，AK018451的siRNA可以提升miR-103-3p和miR-107-3p水平；此外报告基因检测结果亦表明AK018451和miR-103-3p及miR-107-3p结合，从而证明了AK018451对miR-103-3p和miR-107-3p的负向调控作用(如图6所示，图6中(A，B)高/低表达AK018451对miR-103-3p的调控，(C)AK018451对miR-103-3p的结合E)高/低表达AK018451对miR-107-3p的调控，(F)AK018451对miR-107-3p的结合)。
6、miR-103/107靶向Piezo1
分别使用miR-103-3p和miR-107-3p的模拟物和抑制剂转染小鼠BMSC，检测Piezo1的表达水平，并用报告基因检测技术检测miR-103/107与Piezo1 3’-UTR的结合作用；具体过程为：
采用lipofectamine 2000转染试剂将miR-103-3p和miR-107-3p的模拟物或抑制剂转染至小鼠BMSC中，提取RNA，采用qPCR技术Piezo1的表达水平；
使用双荧光素酶报告基因检测miR-103/107与Piezo1的结合位点。将miR-103/107与Piezo1的结合位点序列扩增后插入到pMIR-Reporter质粒Luciferase片段下游，构建报告基因质粒，并在同样位置插入突变的miR-103/107与Piezo1结合位点序列作为阴性对照质粒；通过EntransterTM-D4000转染试剂将报告基因质粒与mimic-103/107共转染骨髓间充质干细胞。转染细胞培养72h后，用Promega Luciferase Assay System作为底物与细胞中的荧光素酶反应；采用BioTek_Synergy多功能酶标仪检测荧光水平，分析miR-103/107与Piezo1之间的相互作用。
结果表明，过表达miR-103-3p和miR-107-3p可以降低Piezo1水平，低表达miR-103-3p和miR-107-3p可以提升Piezo1水平；此外报告基因检测结果亦表明miR-103/107结合Piezo1 3’-UTR，从而证明了miR-103-3p和miR-107-3p对Piezo1的负向调控作用(如图7所示，其中，图7中(A，B)高/低表达miR-103-3p对Piezo1的调控作用，(C)miR-103-3p对Piezo1的结合作用(D，E)高/低表达miR-107-3p对Piezo1的调控作用，(F)miR-107-3p对Piezo1的结合作用)。
7、AK018451正向调控Piezo1
分别使用AK018451过表达质粒和siRNA转染小鼠BMSC，检测Piezo1的表达水平；具体过程为：
采用EntransterTM-D4000转染试剂将AK018451的过表达质粒转染至小鼠BMSC中，提取RNA，采用qPCR技术Piezo1的表达水平；
采用lipofectamine 2000转染试剂将AK018451的siRNA转染至小鼠BMSC中，提取RNA，采用qPCR技术Piezo1的表达水平。
结果表明，AK018451的siRNA可以抑制Piezo1表达，过表达AK018451可以促进Piezo1表达；从而证明了AK018451对Piezo1的正向调控作用(如图8所示，其中，图8中(A)低表达AK018451对Piezo1的调控作用，(B)过表达AK018451对Piezo1的调控作用)。
8、AK018451通过PIEZO1调控BMSC成骨/成脂分化
采用CRISPR-CAS9技术构建PIEZO1敲除BMSC，并转染AK018451的过表达质粒，检测BMSC的成骨/成脂分化水平；具体过程为：
PIEZO1敲除BMSC细胞株的构建
设计合成PIEZO1的gRNA序列，并插入到PX330质粒的gRNA scanFord区，构建PX330-gPIEZO1质粒，将PX330-gPIEZO1质粒与pIRES-EGFP-puro质粒共转染至96孔板中的小鼠BMSC中。转染72小时后使用荧光显微镜观察细胞，选取含有绿色荧光细胞的孔换成嘌呤霉素筛选培养基，培养6天后换成普通培养基，挑选单克隆细胞，构建PIEZO1敲除BMSC细胞系。
AK018451在PIEZO1敲除条件下对BMSC成骨/成脂分化的影响
在PIEZO1敲除BMSC中分别转染AK018451过表达质粒及siRNA。检测细胞成骨/成脂分化相关基因表达水平、ALP活性变化、矿化水平，方法如下。
成骨/成脂分化相关基因表达水平：在不同时间点取出细胞后，加Trizol裂解细胞，提取RNA并将其逆转录为cDNA。采用qPCR检测成骨分化相关基因Runx2、Osterix、Alp、Col I、Bglap，以及成脂分化相关基因PPAR-γ、Cebp、Ap2的表达变化。
ALP活性变化：在不同时间点取出细胞后，使用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒对细胞进行染色，检测ALP活性变化。
矿化能力：BMSC生长至融合状态后，更换为成骨诱导分化培养基(完全培养基添加50μg/ml维生素C，10mMβ-甘油磷酸钠与1mM地塞米松)，继续培养17d、21d、28d后，取出细胞并使用茜素红染液对细胞进行染色，检测矿化结节形成水平。
结果表明，敲除PIEZO1可以抑制BMSC成骨分化，促进成脂分化，AK018451过表达可以促进BMSC成骨分化，抑制成脂分化，但过表达AK018451对PIEZO1敲除的BMSC的成骨/成脂分化水平没有影响，说明AK018451可能通过PIEZO1调控BMSC成骨/成脂分化(如图9所示，其中，图9中(A)细胞ALP与茜素红染色结果，(B，C)成骨分化基因Alp和Runx2表达水平，(D，E)成脂分化基因Cebp和PPAR-γ表达水平)。
9、AK018451通过与miR-103/107结合位点调控骨形成
本发明将AK018451序列分为多个不同大小的片段，并命名为片段1-7，将片段1-7分别插入到过表达载体中，采用骨形成药物快速筛选技术，将过表达载体分别微创局部注射至小鼠骨髓腔，并对小鼠的骨形成速率和原代BMSC细胞中Alp和Runx2的表达水平进行了检测；具体过程为：
小鼠的微创骨髓腔局部注射
选取健康的小鼠，进行股骨骨髓腔局部注射：小鼠麻醉后剃净膝关节内侧的毛发，酒精擦拭后剪开约2.5mm长的创口，使用胰岛素注射器将40ul AK018451载体局部注射到小鼠股骨骨髓腔内，在创口使用碘伏消毒。14天后进行第二次注射。
小鼠骨形成水平的检测
第二次股骨骨髓腔局部注射28d后，脱颈处死小鼠。检测小鼠骨形成和原代BMSC分化指标，方法如下。
骨形成检测：分别在小鼠处死前10d和3d对所有小鼠进行腹腔注射钙黄绿素(20mg/kg)。实验结束时处死小鼠后取股骨远端，经甲醛固定、梯度蔗糖/OCT混合液脱水后，采用OCT进行非脱钙包埋。使用冰冻切片机制成4μm厚度的股骨冰冻切片，荧光显微镜拍照，并采用Image J软件分析骨矿物沉积率和骨形成速率变化。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离：取小鼠股骨，剔除软组织，用2-3ml无菌PBS将骨髓冲出；将骨髓团块吹成单细胞悬液，用细胞网筛将悬液过滤后收集于10ml离心管中；将收集的骨髓细胞用完全培养基清洗并重悬、计数，以3×105个细胞/孔的密度接种于6孔板，分别在培养3h、8h、16h、24h、36h后换液，36h后将细胞传代，获得骨髓间充质干细胞。
小鼠骨髓间充质干细胞中Alp和Runx2基因表达水平检测：分离获得骨髓间充质干细胞，Trizol裂解提取总RNA后，采用qPCR检测成骨分化标志基因Alp、Runx2的表达。
结果表明，所有发现包含miR-103/107结合位点的片段(片段1、3、4、5、6)，均可以对小鼠骨形成和BMSC分化基因水平起到促进作用，而不包含miR-103/107结合位点的片段(片段2、7)，则无明显效果(如图10所示，其中，图10中(A)小鼠骨形成结果，(B，C)原代BMSC成骨分化基因Alp和Runx2表达水平)。该结果表明，AK018451序列上与miR-103/107结合的功能序列具有作为废用性骨质疏松的RNA治疗药物的可能性，本发明因此将该序列命名为DORA(Disused Osteoporosis RNA Alleviator)。
综上所述，本发明首次提供了一种核酸药物及其应用，该核酸药物是基于小鼠源长链非编码RNA AK018451设计的RNA序列，发现该序列可以对骨质疏松起到抑制作用，因而将其命名为DORA(Disused Osteoporosis RNA Alleviator)。同时，基于AK018451序列的DORA序列可通过靶向PIEZO1对骨质疏松起到治疗效果，可以作为一种RNA药物，且相比其他骨质疏松治疗药物，它具有专一性强，安全性高的特点，对于治疗和/或预防废用性骨质疏松具有巨大潜在应用价值。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。

Claims (6)

1.一种核酸药物，其特征在于，所述核酸药物为小鼠转录组中的一条长链非编码RNA功能区的一部分序列，所述长链非编码RNA名为AK018451。
2.如权利要求1所述的核酸药物，其特征在于，所述核酸药物的核酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.权利要求1或2所述的核酸药物在制备用于治疗和/或预防废用性骨质疏松的药物中的应用。
4.一种核酸药物组合物，其特征在于，所述核酸药物组合物的活性成分包括权利要求1或2所述的核酸药物和药学上可接受的载体。
5.一种注射制剂，其特征在于，所述注射制剂的活性成分包括权利要求1或2所述的核酸药物和药学上可接受的辅料。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的核酸药物。
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