CN114214252A - 一种枯草芽孢杆菌及表面活性素的生产方法 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌及表面活性素的生产方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种枯草芽孢杆菌及表面活性素的生产方法，包括：利用枯草芽孢杆菌来生产表面活性素，其中，在生产表面活性素的过程中使用的发酵培养基中包括脂肪醇或其衍生物，并且通过调节发酵中后期pH值至弱酸性，使部分表面活性素形成絮状物，解除产物抑制，进而促进表面活性素合成，该方法可以有效提高表面活性素产量。

Description

一种枯草芽孢杆菌及表面活性素的生产方法
技术领域
本发明涉及生物发酵工程技术领域，涉及一种枯草芽孢杆菌及表面活性素的生产方法。
背景技术
表面活性素(surfactin)是一类由微生物代谢产生的脂肽类生物表面活性剂，在化妆品、食品、制药、生物采油、环境修复等领域都具有广阔的应用前景。
surfactin由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成，其中，肽链部分为由7个α氨基酸(由Leu、Glu、Asp和Val 4种、共7个氨基酸组成)按照LLDLLDL手性顺序组成的七肽，脂肪烃链部分为β-羟基脂肪酸长链(C12–C17)，肽链和脂肪烃链通过内酯键相结合。
目前表面活性素主要采用发酵的方式生产，但是发酵过程中发酵产量较低，主要原因是表面活性素合成能力低和发酵过程中表面活性素合成量受限，前者主要受菌种特性影响，后者则更多的受到发酵生产工艺的限制，如发酵过程中碳氮源种类是否充足合适、发酵过程能否有效解除产物抑制(表面活性素有较好的抑菌性，能结合并破坏细胞膜，影响菌体生长及产物合成)等；另外表面活性素生产中还存在发酵过程泡沫多而难以控制；分离纯化单元操作多且成本较高等问题，这些问题是表面活性素商业化的主要障碍。
已有研究尝试通过产表面活性素基因工程菌构建、发酵设备重构、优化发酵方式等方式提高表面活性素的产量，其理论依据即为改良菌种，提高表面活性素的合成能力和促进表面活性素合成并降低表面活性素积累造成的产物抑制。
专利文献1公开了一种生物表面活性素的生产方法，以解淀粉芽孢杆菌为发酵菌株，经发酵碳源(黄豆粉、麦芽糖浆等)优化后，表面活性素产量达到14.23g/L；专利文献2通过补充表面活性素的非组成氨基酸提高了表面活性素产量(由1.61g/L提升至2.04g/L)；另有研究表明发酵过程中补充表面活性素的组成氨基酸能明显提高表面活性素产量；专利文献3公开了一种提高生物表面活性素产率的工业发酵罐，通过罐体上部溢流分离泡沫来解决发酵过程中存在的产物抑制及泡沫过多两大问题，但设备较为复杂，且溢流分离泡沫会造成发酵液体积减少，影响表面活性素的总产量。
现有技术文献
专利文献1CN 105695543 A公开文本
专利文献2CN110669811A公开文本
专利文献3CN112608831A公开文本
发明内容
现有技术中，尚未发现有通过补充发酵过程中脂肪醇及其衍生物(如脂肪酸、脂肪醛等)促进表面活性素合成的研究；现有技术中目前尚未发现利用表面活性素本身特性(酸性条件下絮凝析出，中性及碱性条件下溶解)，通过调节发酵过程中pH值，促使表面活性素析出，降低发酵液中表面活性素含量进而解除部分产物抑制，促进表面活性素合成的文献研究。
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种通过优化补充发酵培养基中碳源，如脂肪醇及其衍生物(如脂肪酸、脂肪醛等)，来提高表面活性素的产量的方法，同时提供一种通过调节发酵中后期pH值，促使部分表面活性素形成絮状物，解除产物抑制，进而促进表面活性素合成，提高表面活性素产量的方法。通过以上发酵生产工艺优化，有效提高了表面活性素产量，降低表面活性素生产的经济成本，有利于促进商业化生产，加快其商品化进程。
本发明技术方案如下：
1、一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏编号为CGMCC 24027。
2、根据项1所述的枯草芽孢杆菌，其16S rDNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。
3、一种表面活性素的生产方法，包括：利用枯草芽孢杆菌来生产表面活性素，其中，在生产表面活性素过程中使用的发酵培养基包括脂肪醇或其衍生物。
4、根据项3所述的生产方法，所述枯草芽孢杆菌为项1或2所述的枯草芽孢杆菌。
5、根据项3所述的生产方法，所述脂肪醇选自十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、十七醇、十六醇、十六十八醇中的一种或几种，优选为十三醇和/或十六醇。
6、根据项3所述的生产方法，所述脂肪醇衍生物包括脂肪酸和/或脂肪醛；
优选地，所述脂肪酸为十六酸和/或十八酸，所述脂肪醛为十四醛和/或十五醛。
7、根据项3所述的生产方法，所述脂肪醇或其衍生物的添加量为2g/L～6g/L。
8、根据项3所述的生产方法，所述发酵培养基的配方中还包括蔗糖50～75g/L、L-谷氨酸钠15～25g/L、酵母粉0.5～2g/L、蛋白胨0.5～2g/L、MgSO4·7H2O 0.8～1.2g/L、KCl0.3～1g/L、K2HPO4·3H2O 1.0～2.0g/L、FeSO4·7H2O 4～10mg/L、L-Leu 3～10g/L、MnSO4·H2O 4～10mg/L、CuSO4·5H2O 0.1～0.5mg/L、CaCl2 5～10mg/L、Vbmix 1～5mg/L、VH 1～5mg/L。
9、根据项3-8任一项所述的生产方法，在生产表面活性素的发酵培养过程中，在发酵培养进行给定时间后，在调节发酵培养液的pH至5.0～5.5后继续进行培养以生产表面活性素。
10、根据项3-8任一项所述的生产方法，所述发酵培养全过程中，初始pH为7.0；
优选地，所述发酵培养全过程中，控制pH为7。
与现有技术相比，本发明的技术效果：
(1)本发明通过优化发酵培养基配方，具体为在配方中添加脂肪醇(十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、十七醇、十六十八醇中的一种或几种)及其衍生物(脂肪酸或脂肪醛)能有效提高表面活性素的产量。
(2)通过调节发酵中后期pH值至弱酸性，使部分表面活性素形成絮状物，解除产物抑制，进而促进表面活性素合成，提高表面活性素的产量。
(3)以上两种发酵方法可结合使用，产量提升显著，同时使用时效果更佳。
(4)本发明提供的表面活性素的生产方法优化了生产工艺，有效提高了表面活性素产量，降低表面活性素生产的经济成本，能够实现工业化大规模生产，生产条件易于控制，生产得到的产品纯度高，有效弥补了目前不能大规模制备生物表面活性素的不足，有利于促进商业化生产，加快其商品化进程。
具体实施方式
下面结合实施方式对本发明做以详细说明，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明提供的菌株为枯草芽孢杆菌(CGMCC24027)，拉丁名为Bacillus subtilis，为实验室分离菌株，分离自果园土壤(山东济南)。采集土样后采用常规的十倍稀释分离法稀释分离，划平板获得单菌落，将单菌落转接斜面培养，镜检菌体。再次进行稀释分离倒平板获得单菌落，如此重复，直至获得单菌落。然后经初筛、复筛(经发酵培养基发酵培养后，进行发酵液中表面活性素含量的检测对比)，筛选出表面活性素产量较高的野生菌株，进行菌种保藏及菌种鉴定。
本发明的枯草芽孢杆菌(CGMCC24027)的生理生化特征及遗传学特征如下：
(1)菌体特征：单个细胞(0.7～0.8)×(2.0～3.0)μm，着色均匀；芽孢(0.6～0.9)×(1.0～1.5)μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大；在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
(2)菌落特征：菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。
(3)遗传学特征：枯草芽孢杆菌(CGMCC24027)的16S rDNA序列如下：
(GGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCA
CGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTT)
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2021年12月02日，菌种保藏号：CGMCC24027，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
菌种具有较弱的抑制细菌和酵母能力，较强抑制霉菌的能力。该菌株经过中国普通微生物菌种保藏管理中心鉴定为枯草芽孢杆菌，其拉丁名为Bacillus subtilis。
本发明提供了一种表面活性素的生产方法，包括：利用枯草芽孢杆菌来生产表面活性素，其中，在生产表面活性素过程中使用的发酵培养基中包括脂肪醇或其衍生物。
本发明中的发酵培养基必须包含合适的碳底物。合适的底物可以包括但不限于，单糖例如葡萄糖和果糖、寡糖例如乳糖或蔗糖、多糖例如淀粉或纤维素或其混合物，和来自可再生原料的未纯化混合物，例如玉米浆、蔗糖蜜、和大麦芽。此外碳底物也可以是已证实代谢转化为关键生物化学中间物的单碳底物，因此预期本发明中利用的碳源可以包含广泛多样的含碳底物，且将只受宿主选择限制。
尽管预期所有上文提及的碳底物及其混合物都适合于本发明，但优选碳底物是蔗糖。
除了合适的碳源，发酵培养基必须包含本领域技术人员已知的，适合于培养物生长和促进表面活性素生产所需酶促途径的合适矿物质、盐、辅因子、缓冲液及其他组分。
在本发明的一些具体实施方式中，所述发酵培养基的基础配方中包括蔗糖50～75g/L、L-谷氨酸钠15～25g/L、酵母粉0.5～2g/L、蛋白胨0.5～2g/L、MgSO4·7H2O 0.8～1.2g/L、KCl 0.3～1g/L、K2HPO4·3H2O 1.0～2.0g/L、FeSO4·7H2O 4～10mg/L、L-Leu 3～10g/L、MnSO4·H2O 4～10mg/L、CuSO4·5H2O 0.1～0.5mg/L、CaCl2 5～10mg/L、VBmix1～5mg/L、VH1～5mg/L。
优选地，所述发酵培养基的基础配方为，所述蔗糖70g/L，所述L-谷氨酸钠20g/L，所述酵母粉1g/L，所述蛋白胨1g/L，所述MgSO4·7H2O 1g/L，所述KCl 0.5g/L，所述K2HPO4·3H2O 1.3g/L，所述FeSO4·7H2O 6mg/L，所述L-Leu 5g/L，所述MnSO4·H2O 5.6mg/L，所述CuSO4·5H2O 0.25mg/L，所述CaCl2 7.5mg/L，所述VBmix 2mg/L，所述VH 2mg/L。
在本发明的一些具体实施方式中，发酵培养基的基础配方中加入脂肪醇或其衍生物，所述脂肪醇或其衍生物的添加量为2g/L～6g/L；
例如，所述脂肪醇或其衍生物的添加量可以为2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L、5.5g/L、6g/L或其之间的任意范围。
在本发明的一些具体实施方式中，脂肪醇选自十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、十七醇、十六醇、十六十八醇中的一种或几种，优选为十三醇和/或十六醇。
所述十六十八醇为主要含有十八醇(C18H38O)和十六醇(C16H34O)的固态脂肪醇的混合物。十八醇与十六醇的比例不一，但经常含有约50％一70％的十八醇和20％-35％的十六醇。十八醇与十六醇总共占此混合物的至少90％，其余为少量其他醇，主要是十四醇组成。本次实验所用十六十八醇中十六醇含量60％、十八醇含量30％，其余为十四醇。
在本发明的一些具体实施方式中，所述脂肪醇衍生物包括脂肪酸和/或脂肪醛；其中，所述脂肪酸为十六酸和/或十八酸，所述脂肪醛为十四醛和/或十五醛。
本发明还提供了一种通过控制发酵培养过程中的pH来提高表面活性素的方法。
在本发明的一些具体实施方式中，在生产表面活性素的发酵培养过程中，在发酵培养进行给定时间后，在调节发酵培养液的pH至5.0～5.5后继续进行培养以生产表面活性素。
在本发明的一些具体实施方式中，所述发酵培养过程中，先发酵培养24-30h后，再调节pH至5.0～5.5，继续培养12-36h以生产表面活性素。
例如，先发酵培养时间可以为24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30h或其之间的任意范围；
所述发酵培养过程中，先发酵培养24-30h后，调节pH可以为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5或其之间的任意范围；
所述发酵培养过程中，先发酵培养24-30h后，在调节pH至5.0～5.5，继续培养时间可以为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36h或其之间的任意范围。
在本发明的一些具体实施方式中，所述发酵培养全过程中，控制初始pH为7.0。
在本发明的一些具体实施方式中，所述发酵培养全过程中，控制初始pH为7.0，发酵过程中调节pH一直为7。
在本发明的一些具体实施方式中，所述发酵培养全过程中，控制初始pH为7.0，发酵过程中pH自然。
在本发明的一些具体实施方式中，先将所述枯草芽孢杆菌接种通过种子培养基活化，然后再取经种子培养基活化的菌液接种于发酵培养基进行发酵培养后得到含有生物表面活性素的发酵液。
在本发明的一些具体实施方式中，在进行种子培养之前，还包括将枯草芽孢杆菌利用斜面培养基活化。
其中，各个培养基基础配方为本领域常见的商业制备培养基，其他确定成分或合成生长培养基也可以使用，并且关于特定微生物生长的合适培养基将是微生物学或发酵科学领域技术人员已知的。
在本发明的一些具体实施方式中，斜面培养基配方为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g/L，pH值自然。
在本发明的一些具体实施方式中，种子培养基配方为葡萄糖5g/L，L-谷氨酸钠2g/L，MgSO4 0.5g/L，KCl 0.5g/L，K2HPO4 1.0g/L，pH值自然。
在本发明的一些具体实施方式中，发酵培养基配方为蔗糖70g/L，L-谷氨酸钠20g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KCl 0.5g/L，K2HPO4·3H2O 1.3g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，L-Leu 5g/L，MnSO4·H2O 5.6mg/L，CuSO4·5H2O 0.25mg/L，CaCl2 7.5mg/L，VBmix 2mg/L，VH 2mg/L，初始pH值调为7.0。
在本发明的一些具体实施方式中，将接枯草芽孢杆菌接种于LB斜面培养基活化培养16～30h，再将LB斜面培养基培养后的菌种接种于种子培养基继续培养16～20h，当OD600值为10～14时，结束培养，按接种密度为OD600 0.1～0.2转接至发酵培养基培养，在35～38℃、转速100～800rpm条件下培养38～60h。
本发明提供的上述生产方法中，在枯草芽孢杆菌菌株发酵培养基中添加脂肪醇时，在不改变其它发酵参数的情况下，显著提高表面活性素的产量，其中以十三醇、十六醇效果最好，在添加量4g/L时，表面活性素产量从5.8g/L提升至8.5g/L和8.3g/L。添加十六酸、十八酸等脂肪酸，十四醛、十五醛等脂肪醛也能提高表面活性素产量，但是效果低于脂肪醇。
本发明提供的上述生产方法中，发酵后期调节pH值至弱酸性(5.0～5.5)可以显著提升表面活性素产量，最高可至20.3g/L。
本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。其他的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。
实施例
本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品，其中，表1为实施例中所用到的原料的来源。
表1实施例中所用到的原料来源
Figure BDA0003447589120000091
实施例1
将枯草芽孢杆菌(CGMCC24027)菌株在LB斜面培养基上活化培养24h后，接种到种子培养基中，经18h培养，种子液OD600值为12时，结束培养，转接至发酵培养基至接种密度为OD600 0.2继续发酵培养，发酵培养基采用1L三角瓶装液量为250ml，温度37℃，搅拌速度为200rpm，得到含有表面活性素的发酵液；
其中，斜面培养基配方为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g/L，pH值自然；
种子培养基配方为葡萄糖5g/L，L-谷氨酸钠2g/L，MgSO4 0.5g/L，KCl 0.5g/L，K2HPO4 1.0g/L，pH值自然；
发酵培养基配方为蔗糖70g/L，L-谷氨酸钠20g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KCl 0.5g/L，K2HPO4·3H2O 1.3g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，L-Leu 5g/L，MnSO4·H2O 5.6mg/L，CuSO4·5H2O 0.25mg/L，CaCl2 7.5mg/L，VBmix 2mg/L，VH 2mg/L，十二醇4g/L，初始pH值为7.0。
实施例2
实施例2与实施例1的区别仅在于：发酵培养基配方中，使用十三醇4g/L替换实施例1中的十二醇4g/L，其余条件相同。
实施例3
实施例3与实施例1的区别仅在于：发酵培养基配方中，使用十四醇4g/L替换实施例1中的十二醇4g/L，其余条件相同。
实施例
实施例与实施例1的区别仅在于：发酵培养基配方中，使用十五醇4g/L替换实施例1中的十二醇4g/L，其余条件相同。
实施例5
实施例5与实施例1的区别仅在于：发酵培养基配方中，使用十六醇4g/L替换实施例1中的十二醇4g/L，其余条件相同。
实施例6
实施例6与实施例1的区别仅在于：发酵培养基配方中，使用十七醇4g/L替换实施例1中的十二醇4g/L，其余条件相同。
实施例7
实施例7与实施例5的区别仅在于：发酵培养基配方中，使用十六醇2g/L替换实施例5中的十六醇4g/L，其余条件相同。
实施例8
实施例8与实施例5的区别仅在于：发酵培养基配方中，使用十六醇6g/L替换实施例5中的十六醇4g/L，其余条件相同。
实施例9
实施例9与实施例1的区别仅在于：发酵培养基配方中，使用十六十八醇4g/L替换实施例1中的十二醇4g/L，其余条件相同。
实施例10
实施例10与实施例1的区别仅在于：发酵培养基配方中，使用十六酸4g/L替换实施例1中的十二醇4g/L，其余条件相同。
实施例11
实施例11与实施例1的区别仅在于：发酵培养基配方中，使用十八酸4g/L替换实施例1中的十二醇4g/L，其余条件相同。
实施例12
实施例12与实施例1的区别仅在于：发酵培养基配方中，使用十四醛4g/L替换实施例1中的十二醇4g/L，其余条件相同。
实施例13
实施例13与实施例1的区别仅在于：发酵培养基配方中，使用十五醛4g/L替换实施例1中的十二醇4g/L，其余条件相同。
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅在于：发酵培养基配方中，不添加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸，即发酵培养基配方为蔗糖70g/L，L-谷氨酸钠20g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KCl 0.5g/L，K2HPO4·3H2O 1.3g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，L-Leu 5g/L，MnSO4·H2O 5.6mg/L，CuSO4·5H2O 0.25mg/L，CaCl2 7.5mg/L，VBmix 2mg/L，VH 2mg/L，初始pH值调为7.0。
实验例1表面活性素测定方法
取上述实施例1-13及对比例1中发酵培养38h和60h的发酵液20ml，调节pH值至7.0，在温度为20℃、200rpm搅拌下孵化1h；
在转速为4000rpm下离心5min得到上清液；
取上清液1ml，加入5ml无水乙醇溶解，过0.22微米有机膜后进行HPLC检测；
其中，采用waters BEH C18色谱柱，流动相：含有0.1％甲酸的甲醇溶液，流速：0.7ml/min，检测器：二极管阵列检测器，检测波长：210nm。
表2实施例1-13及对比例1的表面活性素的产量
Figure BDA0003447589120000111
如表2所示，在枯草芽孢杆菌(CGMCC24027)菌株发酵培养基中添加十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、十七醇、十六十八醇等脂肪醇时，在不改变其它发酵参数的情况下，显著提高表面活性素的产量，其中以十三醇、十六醇效果最好，在添加量4g/L时，表面活性素产量从5.8g/L提升至8.5g/L和8.3g/L。添加十六酸、十八酸等脂肪酸，十四醛、十五醛等脂肪醛也能提高表面活性素产量，但是效果低于脂肪醇。分析其原因，可能是12～18碳脂肪醇的添加，促进了表面活性素前体物C12～C17脂肪酸的合成，具体地，表面活性素是一种混合物，有脂肪酸和7个氨基酸组成，脂肪酸链长度为C12～C17，计算产量时，以混合物的总产量计。
实施例14
将枯草芽孢杆菌(CGMCC24027)菌株在LB斜面培养基上活化培养24h后，接种到种子培养基中，经18h培养，种子液OD600值为12时，结束培养，转接至发酵培养基至接种密度为OD600 0.2继续发酵培养60h得到含有表面活性素的发酵液，发酵培养基采用10L发酵罐，10L发酵罐装液量为6L，初始发酵条件为：转速300rpm、通气量1vvm、温度35～37℃、罐压0.03～0.05MPa，发酵罐过程中前20h，控制溶氧值>40％，20h后控制溶氧值>10％(同过增加转速及通气量进行)；
其中，斜面培养基配方为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g/L，pH值自然；
种子培养基配方为葡萄糖5g/L，L-谷氨酸钠2g/L，MgSO4 0.5g/L，KCl 0.5g/L，K2HPO4 1.0g/L，pH值自然；
发酵培养基配方为蔗糖70g/L，L-谷氨酸钠20g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KCl 0.5g/L，K2HPO4·3H2O 1.3g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，L-Leu 5g/L，MnSO4·H2O 5.6mg/L，CuSO4·5H2O 0.25mg/L，CaCl2 7.5mg/L，VBmix 2mg/L，VH 2mg/L，十六醇4g/L。
其中，发酵培养过程中，初始pH值为7.0，发酵过程中全过程pH值自然。
实施例15
实施例15与实施例14的区别仅在于：其中，发酵培养过程中，初始pH值为7.0，发酵过程中全过程以10％NaOH溶液和16％H3PO4溶液调节pH值为7.0，其余条件相同。
实施例16
实施例16与实施例14的区别仅在于：其中，发酵培养过程中，初始pH值为7.0，发酵过程中前28h发酵过程中pH值自然，28h后调节pH值为5.0，使部分表面活性素絮凝析出(可以观察到发酵液颜色明显的变白，变浑)，继续发酵培养至60h，其中在发酵培养28h至60h过程中以16％H3PO4溶液调节pH值为5.0，其余条件相同。
实施例17
实施例17与实施例14的区别仅在于：其中，发酵培养过程中，初始pH值为7.0，发酵过程中前28h发酵过程中pH值自然，28h后调节pH值为5.5，使部分表面活性素絮凝析出(可以观察到发酵液颜色明显的变白，变浑)，继续发酵培养至60h，其中在发酵培养28h至60h过程中以16％H3PO4溶液调节pH值为5.0，其余条件相同。
实施例18
实施例18与实施例14的区别仅在于：其中，发酵培养过程中，初始pH值为7.0，发酵过程中前28h发酵过程中pH值自然，28h后调节pH值为6.0，继续发酵培养至60h，其中在发酵培养28h至60h过程中pH值为6.0，其余条件相同。
实施例19
实施例19与实施例14的区别仅在于：其中，发酵培养过程中，初始pH值为5.5，发酵过程中全过程以10％NaOH溶液和16％H3PO4溶液调节pH值为5.5，其余条件相同。
实验例2表面活性素测定方法
取上述实施例14-19中发酵培养28h、44h、60h的发酵液20ml，进行表面活性素的测定，测定方法同实验例1.
表3实施例14-20的表面活性素的产量
Figure BDA0003447589120000131
由表3数据可知，发酵后期调节pH值至弱酸性(5.0～5.5)可以显著提升表面活性素产量，最高可至20.3g/L。实施例16、17相比于实施例14、15，28h时的产量基本一致，而不同于实施例14、15发酵28h后产量仅有少量增长，实施例16、17发酵培养至44h、60h时的产量相较28h有显著提升，可能是由于调节pH值至5.0～5.5后，使部分表面活性素絮凝析出，可以观察到发酵液颜色明显的变白，变浑，解除了部分产物抑制，促进了表面活性素的继续合成，其中实施例16产量稍低于实施例17，推测原因可能为发酵后期ph值调为5.0后，pH值太低，一定程度上影响了菌体生长及表面活性素合成。实施例18中发酵培养至44h及60h时的产量较实施例14、15没有明显提升，原因可能为pH值6.0条件下，表面活性素絮凝效果差，发酵液中仍存有大量表面活性素，未能有效解除产物抑制，进而促进表面活性素的合成。实施例19发酵液肉眼观察较为澄清，经检测发酵液中菌体量少，发酵培养至28h、44h、60h时的产量都较低且随发酵时间延长，产量提升很少，推测原因为发酵初期调节ph值为5.5不适合菌体增殖，造成发酵液中菌体量过少，影响了表面活性素合成。
虽然本案已以实施例揭露如上然其并非用以限定本案，任何所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本案的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，故本案的保护范围当视后附的专利申请范围所界定者为准。
Figure BDA0003447589120000151
序列表
<110> 华熙生物科技股份有限公司
华熙生物科技（天津）有限公司
<120> 一种枯草芽孢杆菌及表面活性素的生产方法
<130> TPE01818
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成序列
<400> 1
ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcgga cagatgggag 60
cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga 120
ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatggt tgtttgaacc gcatggttca 180
aacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg 240
gtgaggtaac ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac 300
actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa 360
tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc 420
tctgttgtta gggaagaaca agtaccgttc gaatagggcg gtaccttgac ggtacctaac 480
cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg 540
tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc 600
ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg 660
gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg 720
actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat 780
accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta 840
gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc 900
aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc 960
gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg 1020
ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080
agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag 1140
gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1200
tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt 1260
aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa 1320
gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380
acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaacctttt 1440

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏编号为CGMCC 24027。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其16S rDNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。
3.一种表面活性素的生产方法，其特征在于，包括：利用枯草芽孢杆菌来生产表面活性素，其中，在生产表面活性素过程中使用的发酵培养基包括脂肪醇或其衍生物。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌。
5.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述脂肪醇选自十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、十七醇、十六醇、十六十八醇中的一种或几种，优选为十三醇和/或十六醇。
6.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述脂肪醇衍生物包括脂肪酸和/或脂肪醛；
优选地，所述脂肪酸为十六酸和/或十八酸，所述脂肪醛为十四醛和/或十五醛。
7.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述脂肪醇或其衍生物的添加量为2g/L～6g/L。
8.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方中还包括蔗糖50～75g/L、L-谷氨酸钠15～25g/L、酵母粉0.5～2g/L、蛋白胨0.5～2g/L、MgSO4·7H2O 0.8～1.2g/L、KCl 0.3～1g/L、K2HPO4·3H2O1.0～2.0g/L、FeSO4·7H2O 4～10mg/L、L-Leu 3～10g/L、MnSO4·H2O
4～10mg/L、CuSO4·5H2O 0.1～0.5mg/L、CaCl2 5～10mg/L、Vbmix 1～5mg/L、VH 1～5mg/L。
9.根据权利要求3-8任一项所述的生产方法，其特征在于，在生产表面活性素的发酵培养过程中，在发酵培养进行给定时间后，在调节发酵培养液的pH至5.0～5.5后继续进行培养以生产表面活性素。
10.根据权利要求3-8任一项所述的生产方法，其特征在于，所述发酵培养全过程中，初始pH为7.0；
优选地，所述发酵培养全过程中，控制pH为7。
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