CN114208937A - 一种沙棘小分子肽及其制备方法 - Google Patents

一种沙棘小分子肽及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114208937A
CN114208937A CN202111321422.5A CN202111321422A CN114208937A CN 114208937 A CN114208937 A CN 114208937A CN 202111321422 A CN202111321422 A CN 202111321422A CN 114208937 A CN114208937 A CN 114208937A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seabuckthorn
small molecular
sea
buckthorn
molecular peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111321422.5A
Other languages
English (en)
Inventor
黄渊淼
岳红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gansu Jietao Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Gansu Jietao Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gansu Jietao Medical Technology Co ltd filed Critical Gansu Jietao Medical Technology Co ltd
Priority to CN202111321422.5A priority Critical patent/CN114208937A/zh
Publication of CN114208937A publication Critical patent/CN114208937A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23JPROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/30Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
    • A23J3/32Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
    • A23J3/34Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
    • A23J3/346Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of vegetable proteins
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23JPROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/006Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from vegetable materials
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23JPROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/14Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/20Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
    • A23L5/21Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification by heating without chemical treatment, e.g. steam treatment, cooking
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/20Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
    • A23L5/27Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification by chemical treatment, by adsorption or by absorption
    • A23L5/273Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification by chemical treatment, by adsorption or by absorption using adsorption or absorption agents, resins, synthetic polymers, or ion exchangers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种沙棘小分子肽及其制备方法,原料以重量份数计包括如下组分:沙棘果肉残渣20~40份、沙棘籽残渣30~60份和复合水解酶1~10份。本发明属于食品技术领域,具体是指一种以沙棘果榨汁剩下的果肉残渣和沙棘籽榨油之后剩下的沙棘籽残渣通过生物酶解技术分解成小分子肽,本发明可以使沙棘果和沙棘籽初加工剩下来的废料变废为宝,使沙棘资源得到最大价值化的利用,促进沙棘产业的可持续发展,为健康产业和医药产品提供有价值原料的沙棘小分子肽及其制备方法。

Description

一种沙棘小分子肽及其制备方法
技术领域
本发明属于食品技术领域,具体是指一种沙棘小分子肽及其制备方法。
背景技术
据统计,我国目前约有沙棘300多万公顷,是目前世界上沙棘面积最大、产量最多、种类最丰富的国家。沙棘做为全球唯一既保护环境防止沙化,又具有经济效应双重潜力的药食同源植物,富含有多种维生素、大量的有机酸和微量元素。在调节血脂、降低血糖、增强免疫力、延缓衰老等方面有独特的效果。
全国沙棘属植物资源大果,但沙棘产业化发展一直较缓慢,大多停留在利用天然野生资源沙棘果进行榨汁、沙棘子榨油的初级产品加工的水平,剩下大量的沙棘果榨汁剩下的果肉残渣和沙棘籽榨油之后剩下的沙棘籽残渣,都以丢弃或者做动物饲料原料浪费掉了,这些废料价值一直未得到充分的挖掘和体现。同本发明可以使沙棘果和沙棘籽初加工剩下来的废料变废为宝,使沙棘资源得到最大价值化的利用,促进沙棘产业的可持续发展,为健康产业和医药产品提供有价值的原料。
发明内容
为了解决上述难题,本发明提供了一种以沙棘果榨汁剩下的果肉残渣和沙棘籽榨油之后剩下的沙棘籽残渣通过生物酶解技术分解成小分子肽,为健康产业和医药产品提供有价值原料的沙棘小分子肽及其制备方法。
为了实现上述功能,本发明采取的技术方案如下:一种沙棘小分子肽,原料以重量份数计包括如下组分:沙棘果肉残渣20~40份、沙棘籽残渣30~60份和复合水解酶1~10份。
本发明还公开了一种沙棘小分子肽的制备方法,包括如下步骤:
(1)前处理:将沙棘果肉残渣和沙棘籽残渣加入3-5倍质量的去离子水充分搅拌1-2h,直到搅拌均匀无结块,得到沙棘混合液;
(2)研磨均值:将步骤(1)的沙棘混合液通过胶体磨进行研磨1-2次,然后泵入高压均质机进行均质0.5-1h,,然后用氢氧化钠调节pH值为5-8之间,得沙棘蛋白液;
(3)酶解:将步骤(2)沙棘蛋白液加热升温至70-90℃,保温搅拌15-30分钟,然后冷却至35-45℃,加入占沙棘蛋白液总体积0.2%-0.5%的复合水解酶,搅拌均匀,然后保持温度在35-45℃之间进行酶解反应5-8h,待酶解反应终止后,进行加温升温至60-80℃,保持恒温10-20分钟进行灭酶,使复合水解酶失去活性,得沙棘蛋白酶解备用;
(4)脱苦:将步骤(3)的沙棘蛋白酶解液中加入3-6%活性炭进行充分搅拌,然后让料液通过60目不锈钢滤网进行粗滤,粗滤后的滤液泵入高速离心机在6000转/分钟的转速下离心5-10分钟处理,将料液中的颗粒物通过分离机自动排渣除去,得分离沙棘小分子肽液;
(5)杀菌除臭:将步骤(4)的分离沙棘小分子肽液通过杀菌除臭机,料液经蒸汽杀菌后通过真空脱去异味,杀菌条件:130-140℃,保持3-5秒钟,真空度为0.03Mpa以上,通过杀菌脱臭机的料液在冷热罐中保持70-80℃,时间保持30-40分钟,进行第二次杀菌,也是喷雾干燥的需要,得到沙棘小分子肽液;
(6)喷雾干燥:将步骤(5)的沙棘小分子肽液通过高压均质泵进行压力喷雾干燥,在喷雾塔内干燥的同时,还有杀菌和排除异味的作用,干燥后得沙棘小分子肽。
优选地,所述步骤(2)中的复合水解酶是是由植物蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶按(0.8-1.5):(0.6-1.2):(0.3-0.6)的质量比例混合而成。
优选地,所述步骤(1)中中沙棘果肉残渣为经过榨完沙棘果汁之后剩下的果肉残渣和沙棘籽经过冷榨或者经过二氧化碳萃取沙棘籽油之后剩下的沙棘籽残渣。
优选地,所述步骤(6)中喷雾干燥的技术条件为:1.高压均质泵工作压力:14-17Mpa;2.供应蒸汽压力:5.5-6.5Mpa;3.进料温度:70℃以上;4.塔内进风温度:150-160℃;5.塔内排风温度50-70℃;6.正常工作塔内负压:0-4x100pa。
本发明采取上述结构取得有益效果如下:本发明提供的一种沙棘小分子肽及其制备方法以沙棘果榨汁剩下的果肉残渣和沙棘籽榨油之后剩下的沙棘籽残渣通过生物酶解技术分解成小分子肽,本发明可以使沙棘果和沙棘籽初加工剩下来的废料变废为宝,使沙棘资源得到最大价值化的利用,促进沙棘产业的可持续发展,为健康产业和医药产品提供有价值原料。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明一种沙棘小分子肽,原料以重量份数计包括如下组分:沙棘果肉残渣30份、沙棘籽残渣35份和复合水解酶8份。
本发明还公开了一种沙棘小分子肽的制备方法,包括如下步骤:
(1)前处理:将沙棘果肉残渣和沙棘籽残渣加入3倍质量的去离子水充分搅拌1.5h,直到搅拌均匀无结块,得到沙棘混合液;
(2)研磨均值:将步骤(1)的沙棘混合液通过胶体磨进行研磨1次,然后泵入高压均质机进行均质0.5h,,然后用氢氧化钠调节pH值为5,得沙棘蛋白液;
(3)酶解:将步骤(2)沙棘蛋白液加热升温至70℃,保温搅拌18分钟,然后冷却至35℃,加入占加入占沙棘蛋白液总体积0.2%的复合水解酶,搅拌均匀,然后保持温度在36℃之间进行酶解反应5h,待酶解反应终止后,进行加温升温至60℃,保持恒温10分钟进行灭酶,使复合水解酶失去活性,得沙棘蛋白酶解液备用;
(4)脱苦:将步骤(3)的沙棘蛋白酶解液中加入3%活性炭进行充分搅拌,然后让料液通过60目不锈钢滤网进行粗滤,粗滤后的滤液泵入高速离心机在6000转/分钟的转速下离心6分钟处理,将料液中的颗粒物通过分离机自动排渣除去,得分离沙棘小分子肽液;
(5)杀菌除臭:将步骤(4)的分离沙棘小分子肽液通过杀菌除臭机,料液经蒸汽杀菌后通过真空脱去异味,杀菌条件:130℃,保持3秒钟,真空度为0.04Mpa,通过杀菌脱臭机的料液在冷热罐中保持75℃,时间保持30分钟,进行第二次杀菌,也是喷雾干燥的需要,得到沙棘小分子肽液;
(6)喷雾干燥:将步骤(5)的沙棘小分子肽液通过高压均质泵进行压力喷雾干燥,在喷雾塔内干燥的同时,还有杀菌和排除异味的作用,干燥后得沙棘小分子肽。
所述步骤(2)中的复合水解酶是是由植物蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶按0.8:0.7:0.3的质量比例混合而成。
所述步骤(6)中喷雾干燥的技术条件为:1.高压均质泵工作压力:15Mpa;2.供应蒸汽压力:5.8Mpa;3.进料温度:75℃;4.塔内进风温度:150℃;5.塔内排风温度55℃;6.正常工作塔内负压:2x100pa。
实施例2
本发明一种沙棘小分子肽,原料以重量份数计包括如下组分:沙棘果肉残渣28份、沙棘籽残渣35份和复合水解酶9份。
本发明还公开了一种沙棘小分子肽的制备方法,包括如下步骤:
(1)前处理:将沙棘果肉残渣和沙棘籽残渣加入5倍质量的去离子水充分搅拌2h,直到搅拌均匀无结块,得到沙棘混合液;
(2)研磨均值:将步骤(1)的沙棘混合液通过胶体磨进行研磨2次,然后泵入高压均质机进行均质1h,,然后用氢氧化钠调节pH值为8,得沙棘蛋白液;
(3)酶解:将步骤(2)沙棘蛋白液加热升温至90℃,保温搅拌30分钟,然后冷却至45℃,加入占沙棘蛋白液总体积0.5%的复合水解酶,搅拌均匀,然后保持温度在45℃之间进行酶解反应8h,待酶解反应终止后,进行加温升温至80℃,保持恒温20分钟进行灭酶,使复合水解酶失去活性,得沙棘蛋白酶解液备用;
(4)脱苦:将步骤(3)的沙棘蛋白酶解液中加入6%活性炭进行充分搅拌,然后让料液通过60目不锈钢滤网进行粗滤,粗滤后的滤液泵入高速离心机在6000转/分钟的转速下离心10分钟处理,将料液中的颗粒物通过分离机自动排渣除去,得分离沙棘小分子肽液;
(5)杀菌除臭:将步骤(4)的分离沙棘小分子肽液通过杀菌除臭机,料液经蒸汽杀菌后通过真空脱去异味,杀菌条件:140℃,保持5秒钟,真空度为0.08Mpa,通过杀菌脱臭机的料液在冷热罐中保持80℃,时间保持40分钟,进行第二次杀菌,也是喷雾干燥的需要,得到沙棘小分子肽液;
(6)喷雾干燥:将步骤(5)的沙棘小分子肽液通过高压均质泵进行压力喷雾干燥,在喷雾塔内干燥的同时,还有杀菌和排除异味的作用,干燥后得沙棘小分子肽。
所述步骤(2)中的复合水解酶是是由植物蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶按1.5:1.2:0.6的质量比例混合而成。
所述步骤(6)中喷雾干燥的技术条件为:1.高压均质泵工作压力:17Mpa;2.供应蒸汽压力:6.5Mpa;3.进料温度:80℃;4.塔内进风温度:155℃;5.塔内排风温度70℃;6.正常工作塔内负压:3x100pa。
以上对本发明及其实施方式进行了描述,这种描述没有限制性,实施例中所示的也只是本发明的实施方式之一,实际的实施方式并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示,在不脱离本发明创造宗旨的情况下,不经创造性的设计出与该技术方案相似的工艺流程以及实施例,均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种沙棘小分子肽,其特征在于,原料以重量份数计包括如下组分:沙棘果肉残渣20~40份、沙棘籽残渣30~60份和复合水解酶1~10份。
2.一种根据权利要求1所述沙棘小分子肽的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)前处理:将沙棘果肉残渣和沙棘籽残渣加入3-5倍质量的去离子水充分搅拌1-2h,直到搅拌均匀无结块,得到沙棘混合液;
(2)研磨均值:将步骤(1)的沙棘混合液通过胶体磨进行研磨1-2次,然后泵入高压均质机进行均质0.5-1h,,然后用氢氧化钠调节pH值为5-8之间,得沙棘蛋白液;
(3)酶解:将步骤(2)沙棘蛋白液加热升温至70-90℃,保温搅拌15-30分钟,然后冷却至35-45℃,加入占沙棘蛋白液总体积0.2%-0.5%的复合水解酶,搅拌均匀,然后保持温度在35-45℃之间进行酶解反应5-8h,待酶解反应终止后,进行加温升温至60-80℃,保持恒温10-20分钟进行灭酶,使复合水解酶失去活性,得沙棘蛋白酶解液备用;
(4)脱苦:将步骤(3)的沙棘蛋白酶解液中加入3-6%活性炭进行充分搅拌,然后让料液通过60目不锈钢滤网进行粗滤,粗滤后的滤液泵入高速离心机在6000转/分钟的转速下离心5-10分钟处理,将料液中的颗粒物通过分离机自动排渣除去,得分离沙棘小分子肽液;
(5)杀菌除臭:将步骤(4)的分离沙棘小分子肽液通过杀菌除臭机,料液经蒸汽杀菌后通过真空脱去异味,杀菌条件:130-140℃,保持3-5秒钟,真空度为0.03Mpa以上,通过杀菌脱臭机的料液在冷热罐中保持70-80℃,时间保持30-40分钟,进行第二次杀菌,也是喷雾干燥的需要,得到沙棘小分子肽液;
(6)喷雾干燥:将步骤(5)的沙棘小分子肽液通过高压均质泵进行压力喷雾干燥,在喷雾塔内干燥的同时,还有杀菌和排除异味的作用,干燥后得沙棘小分子肽。
3.根据权利要求2所述一种沙棘小分子肽的制备方法,其特征在于,所述步步骤(2)中的复合水解酶是是由植物蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶按(0.8-1.5):(0.6-1.2):(0.3-0.6)的质量比例混合而成。
4.根据权利要求3所述一种沙棘小分子肽的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中沙棘果肉残渣为经过榨完沙棘果汁之后剩下的果肉残渣和沙棘籽经过冷榨或者经过二氧化碳萃取沙棘籽油之后剩下的沙棘籽残渣。
5.根据权利要求4所述一种沙棘小分子肽的制备方法,其特征在于,所述步骤(6)中喷雾干燥的技术条件为:1.高压均质泵工作压力:14-17Mpa;2.供应蒸汽压力:5.5-6.5Mpa;3.进料温度:70℃以上;4.塔内进风温度:150-160℃;5.塔内排风温度50-70℃;6.正常工作塔内负压:0-4x100pa。
CN202111321422.5A 2021-11-09 2021-11-09 一种沙棘小分子肽及其制备方法 Pending CN114208937A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111321422.5A CN114208937A (zh) 2021-11-09 2021-11-09 一种沙棘小分子肽及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111321422.5A CN114208937A (zh) 2021-11-09 2021-11-09 一种沙棘小分子肽及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114208937A true CN114208937A (zh) 2022-03-22

Family

ID=80696836

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111321422.5A Pending CN114208937A (zh) 2021-11-09 2021-11-09 一种沙棘小分子肽及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114208937A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115812791A (zh) * 2023-01-06 2023-03-21 广州仁航科技有限公司 一种营养奶粉及其制备方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115812791A (zh) * 2023-01-06 2023-03-21 广州仁航科技有限公司 一种营养奶粉及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107858393B (zh) 一种从核桃粕中提取蛋白多肽的方法
CN103937865B (zh) 牡丹多肽,及制备方法和应用
CN103445159B (zh) 一种全组分人参汁的酶法制备方法
CN104757564B (zh) 一种利用花生壳制备膳食纤维的方法
CN103571609A (zh) 一种同步制取高稳定化米糠油和米糠蛋白的方法
CN108112728B (zh) 一种茶叶中活性成分提取的工艺
CN103751479A (zh) 一种含植物和真菌多糖的虫草组合物及其制备方法
CN101914472A (zh) 一种杜仲叶提取物及其制备方法和应用
CN104996715A (zh) 一种复合发酵法制备小麦胚芽多肽的工艺
CN107753927A (zh) 具有消食化积作用的含鸡内金肽的中药组合物及其制备方法和用途
CN102344872A (zh) 一种含有花青素的大薯黄酒的制备方法
CN106282266A (zh) 一种利用柚苷酶制备浒苔寡糖的方法
CN105996028A (zh) 生姜提取物、生姜纤维及其制备方法
CN114208937A (zh) 一种沙棘小分子肽及其制备方法
CN105646301A (zh) 从大蒜中提取蒜氨酸联产蒜多糖和蒜粉的方法
CN102960807A (zh) 一种含薏仁多糖饮料的制备方法
CN106173186A (zh) 一种高值化综合利用小麦胚芽制备多肽的新方法
CN106360741A (zh) 一种降糖植物复合蛋白粉及其制备方法
CN111713622A (zh) 一种浓缩葛根汁的加工方法
CN105132119A (zh) 一种酶解法制备枸杞籽油的方法
CN109529404B (zh) 利用重瓣红玫瑰花渣制备多酚提取物的方法
CN103518943A (zh) 一种利用多频超声波从菜籽饼提取蛋白的方法
CN105341839A (zh) 一种清热去火瓜蒌仁精粉的制备方法
CN105647993A (zh) 一种液态低聚半乳糖醛酸果胶生产工艺
CN109463538A (zh) 一种奶牛小分子饲料肽的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination