CN114199971A - 基于化学修饰的纳米孔对整合素构象检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于化学修饰的纳米孔对整合素构象检测的方法，通过共价修饰构建功能化的纳米孔电学检测通道，配置不同浓度不同离子种类条件的整合素缓冲液样品，在外加偏压条件下检测具有不同构象的整合素穿过纳米孔的电学信息，对电学信息进行分析以实现定量与构象区分检测。本方法制样简单、操作便捷、响应灵敏，通过不同条件的电学信息对比，能够更清晰的呈现整合素的单分子构象信息；还能提供整合素的体积、表面电荷属性、浓度等信息；同时也可以进行单分子穿孔速率调控和特异性检测。

Description

基于化学修饰的纳米孔对整合素构象检测的方法

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一种基于化学修饰的纳米孔对整合素构象检测的方法。

背景技术

整合素(整联蛋白)是一种由α、β亚基通过非共价相互作用组成的单次跨膜蛋白，也是一类广泛存在于哺乳动物细胞表面的细胞粘附分子，参与调控细胞生命活动，介导细胞之间以及细胞与外界基质间的粘附与识别。目前整合素由18种α亚基和8种β亚基构成24种亚型，其中α与β亚基存在能与二价阳离子结合的结构域。因此不同二价阳离子结合可以通过调控整合素弯折低亲和态、站立中间亲和态和站立且腿部分开的高亲和态构象进而调控其活性；不同β亚基有不同功能，比如β1亚基介导细胞间粘附，β2亚基介导白细胞与内皮细胞作用参与血栓形成、免疫反应等，β3亚基则参与血小板聚集及血管形成等。整合素可通过细胞外信号传递调控细胞增殖、分化、迁移等活动，故表征和调控整合素的复杂结构对理解其在生物体中生理、病理过程的作用机制及指导整合素高表达相关的肿瘤等疾病诊疗有重要生物学意义。

目前对整合素的研究主要是利用生物学的方法，通过一些靶向肽配体、DNA配体、金属离子等调控和刺激整合素构象变化诱导细胞表达来推断整合素结构与功能的关联；也有通过电学、荧光标记和单分子力谱等手段考察整合素在细胞粘附反应过程中的行为和构象变化；圆二色谱在蛋白构象检测中也有较好的分辨力；当然冷冻电镜是最直观的表征整联蛋白单分子信息的手段。以上基于光、电、力学等的表征手段大多是间接的蛋白检测和调控方式，而且电镜的操作手段制样和检测成本等限制使其无法推广使用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基于化学修饰的纳米孔对整合素构象检测的方法，该方法通过整合素穿过化学修饰的纳米孔时的电学信号，对整合素进行定量和定性检测。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种基于化学修饰的纳米孔对整合素构象检测的方法，所述方法采用化学修饰的纳米孔，在外加偏压的条件下测试待测样本通过纳米孔的电学信息，通过电学信息对待测样本中的整合素进行定性和/或定量分析；

所述待测样本包括二价金属离子缓冲液，以及整合素与二价金属离子缓冲液组合而成的复合溶液。

优选的，所述纳米孔载体为硅基氮化硅薄膜；所述纳米孔的孔径为20-30nm。

优选的，所述纳米孔在氮气保护氛围中通过中性的亲水性聚合物进行化学修饰。

优选的，在氮气保护氛围中，将亲水活化处理并干燥的所述硅基氮化硅薄膜与氯硅烷试剂在无水四氢呋喃中反应，经过溶剂清洗去除过量氯硅烷试剂后再与末端功能化的聚乙二醇在干燥条件下震荡反应2h，数次微热清洗去除物理吸附的聚合物，完成对纳米孔的化学修饰。

优选的，所述纳米孔的制备方法包括以下步骤：

对所述硅基氮化硅薄膜进行预处理；

将预处理后的硅基氮化硅薄膜固定在液体池中，在液体池中添加缓冲液；

对所述硅基氮化硅薄膜施加电流脉冲，将氮化硅薄膜暴露于与其介电强度相当的电场中，以介电击穿的方式获得孔径为20-30nm的固态纳米孔。

优选的，对所述硅基氮化硅薄膜进行预处理包括以下步骤：使用过热的食人鱼溶液对所述硅基氮化硅薄膜进行处理；然后依次使用乙醇和超纯水进行清洗；最后进行亲水活化处理，获得预处理后的硅基氮化硅薄膜。

优选的，所述二价金属离子缓冲液包括1M KCl,、1×PBS、pH 7.4缓冲液，和/或1MKCl、1×PBS、5mM MgCl2、pH 7.4缓冲液，和/或1M KCl,、1×PBS、1mM MnCl2、pH 7.4缓冲液；

将溶于1×PBS缓冲液中冷冻保存的100ug/mL的整合素母液放置室温，用所述二价金属离子缓冲液稀释，获得浓度为1-10ug/mL的所述复合溶液。

优选的，在外加偏压的条件下，先对所述二价金属离子缓冲液进行测试，采集空白基线电流信号；然后对所述复合溶液进行测试，采集整合素穿过纳米孔的方向和穿过纳米孔时的电学信号。

优选的，将所述电学信号转换为文本数据并统计作图，对比不同金属离子条件下整合素穿过纳米孔时的信号频率和数据特征。

优选的，所述信号频率和数据特征包括过孔方向、穿孔捕获率、易位时间、阻塞幅值和阻孔率；对所述过孔方向、穿孔捕获率、易位时间、阻塞幅值和阻孔率进行对比分析，对不同金属离子诱导的整合素构象特征进行鉴别。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明是基于单分子固态纳米孔电学检测技术，用硅基氮化硅薄膜作为纳米孔载体材料，通过化学修饰策略在纳米孔内壁引入中性的亲水性聚合物作为功能化检测通道。在外加偏压条件下与不同金属离子结合的整合素进入纳米孔通道，由于不同二价金属离子诱导的整合素电荷分布状态及构象差异所产生的不同离子阻塞电流分布和阻塞时长，通过分子穿孔模型计算出整合素的体积，推断整合素不同构象态和浓度等信息。相比于传统的光、电及力学间接检测手段，本检测方法制样简单，操作便捷，响应灵敏，还可以进行单分子穿孔速率调控和特异性检测。同时，本方法也适用与其他生物功能蛋白与其适配体、抗体等修饰的纳米孔检测和构象调控。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明的纳米孔检测平台的构建与电学检测原理示意图，其中a为纳米孔化学修饰，b为采集的电信号；

图2为实施例中复合溶液A中的整合素穿过纳米孔时的阻塞时间统计图；

图3为实施例中复合溶液A中的整合素穿过纳米孔时的阻塞电导统计图；

图4为实施例中复合溶液A中的整合素穿过纳米孔时的阻塞率统计图；

图5为实施例中复合溶液B中的整合素穿过纳米孔时的阻塞时间统计图；

图6为实施例中复合溶液B中的整合素穿过纳米孔时的阻塞电导统计图；

图7为实施例中复合溶液B中的整合素穿过纳米孔时的阻塞率统计图；

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例中基于化学修饰的纳米孔对整合素构象进行检测，首先是对纳米孔薄膜载体材料进行表面去污活化处理，接着将芯片与定制的flowcell进行组装，再用介电击穿方式在氮化硅薄膜上制备孔径恰当的纳米孔道。本实施例中flowcell用的是PDMS或PEEK材质的液体池，有较好的疏水性，且耐一定的有机溶剂，PDMS透明，利于观察细节；PEEK不透明，酸碱及有机溶剂耐受性强。一对液体池侧边两腔室容积200uL，中间有凹和凸嵌合结构把纳米孔芯片夹用垫圈在中间。制备好的纳米孔再拆出来进行化学修饰处理后重新装配在flowcell液体池中进行稳定性测试。同时，配置整合素的不同二价金属离子生理缓冲体系，将不同条件下的整合素样品加入flowcell的顺式一侧。通过膜片钳记录分子通过纳米孔的电学信息，纳米孔检测平台的构建与电学检测原理参见图1，其中a为纳米孔化学修饰，b为采集的电信号。

本实施例中的整合素构象检测方法具体包括以下步骤：

(1)纳米孔载体材料芯片预处理及纳米孔的制备

采用氮化硅薄膜为纳米孔载体材料，规格为：膜厚12～20nm，窗口10-20μm²。氮化硅薄膜在使用前需经80℃的食人鱼溶液处理1-1.5h，并依次用乙醇和超纯水清洗数次去除酸液，清洁膜表面的有机与无机污染物，同时进行亲水活化处理使后续制孔过程溶液浸润性更好。将处理后的氮化硅薄膜固定在定制的flowcell中，注入1M KCl、10mM Tris、1mMEDTA、pH 8缓冲液。然后通过电源表Keithley 2450提供电流脉冲，氮化硅薄膜会暴露于强度与膜的介电强度相当的电场中。强电场的电荷聚集以及热效应会在薄膜的结构缺陷处产生漏电流，从而导致膜的不可逆物理击穿并形成纳米孔，生成的纳米孔的孔径为20-30nm。

(2)纳米孔的化学修饰

将带有预定纳米孔的氮化硅薄膜重新进行亲水处理使其表面带上可进一步反应的羟基官能团(干法处理：在氧等离子体氛围中30W处理1分钟；湿法处理：用食人鱼洗液80℃处理一小时)。在氮气保护氛围中，将前述表面活化处理并干燥的氮化硅纳米孔与氯丙基三氯硅烷试剂在无水四氢呋喃中温室反应2h，用反应溶剂清洗去除过量硅烷试剂后再与末端氨基化的聚乙二醇(分子量为800-5000)在干燥条件下震荡反应2h，数次微热清洗去除物理吸附的聚合物，并将聚合物修饰的纳米孔保存在水相环境过夜后待装片测试，多次测试I-V，直到修饰孔的电导稳定不变且基线噪音在50pA后开始测试样品。

(3)不同金属离子条件下整合素样品的配制

首先配置三种不同金属离子的检测样品缓冲液：缓冲液A(1M KCl、1×PBS、pH7.4)；缓冲液B(1M KCl、1×PBS、5mM MgCl2、pH 7.4)；缓冲液C(1M KCl、1×PBS、1mM MnCl2、pH 7.4)。

然后将溶于1×PBS缓冲液中冷冻保存的100ug/mL的整合素母液放置室温，并用缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C稀释至浓度为1-10ug/mL，获得复合溶液A、复合溶液B、复合溶液C。

(4)纳米孔电学信号的采集与分析

先在装有修饰纳米孔芯片的flowcell样品池两侧注入缓冲液A、或缓冲液B、或缓冲液C，采集没有整合素时的空白基线电流信号；再将flowcell的顺式端置换为含整合素的复合溶液A、或复合溶液B、或复合溶液C。开始测试时，通过施加±100、±150、±200mV偏压，考察整合素穿过纳米孔的方向并记录其穿孔电学信号。通过Clampfit软件将原始电信号转换为文本数据并在Origin中统计作图，对比不同金属离子条件下的信号频率与数据特征，包括过孔方向，穿孔捕获率，易位时间，阻塞幅值及阻孔率。通过多参数的对比分析，鉴别不同金属离子诱导的整合素构象特征。以上所有的纳米孔测试过程都是在一个黑暗的法拉第屏蔽罩中进行的。

本实施例中分别对缓冲液A、缓冲液B、复合溶液A、复合溶液B进行了检测。图2-图7为5ug/mL整合素在缓冲液A和缓冲液B中形成的不同结构过孔信号统计分析柱状图，纳米孔为15nm膜厚孔径为20nm，测试数据统计包括阻塞时间、阻塞电导及阻塞率。由初步检测结果可以看出，整合素在不同离子诱导下的构象变化，通过过孔信号特征的多重参数分析，均表现明显的统计差异，理论分析表明整合素在缓冲液A中表现为低亲和性，在缓冲液B中则表现为中亲和性；物理尺寸上，整合素在缓冲液B中较在缓冲液A中有较大差别的长径比。穿过纳米孔的时间表明，整合素在缓冲液B中的过孔时间短，属于径向过孔概率较大；且由于整合素在缓冲液B中结构有较大的长径差异，呈现多种模式过孔行为，因而阻塞率呈现多重分布。纳米孔统计数据与理论的结构特征较为吻合，后续可做更多的实验以验证结构与数据特征的对应性和重现性。

整合素介导细胞之间或细胞与基质之间的粘附并起到胞内外信号转导的作用，影响细胞的增殖、迁移、分化等重要生理过程，也是肿瘤等重大疾病的靶标，故整合素的构象调控与检测将在临床医学及生命科学研究领域具有广阔的应用前景。本发明凭借简单的检测原理、便捷的操作方法和高效可靠的检测精度，能实现整合素在生理条件下不同金属离子调控的构象变化监控，为测定哺乳动物细胞内，尤其是病灶区域及肿瘤血管内部整合素的表达程度和构象态提供优异的检测手段，也为整合素蛋白表达相关的疾病病理机制研究提供实验参考。本方法为整联蛋白的临床研究提供了一种科学、高效的检测方法，为快速准确的识别整联蛋白不同离子调节的构象态及其疾病相关的病理研究开拓新思路，会有很好的应用前景。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种基于化学修饰的纳米孔对整合素构象检测的方法，其特征在于：所述方法采用化学修饰的纳米孔，在外加偏压的条件下测试待测样本通过纳米孔的电学信息，通过电学信息对待测样本中的整合素进行定性和/或定量分析；

所述待测样本包括二价金属离子缓冲液，以及整合素与二价金属离子缓冲液组合而成的复合溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纳米孔载体为硅基氮化硅薄膜；所述纳米孔的孔径为20-30nm。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述纳米孔在氮气保护氛围中通过中性的亲水性聚合物进行化学修饰。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在氮气保护氛围中，将亲水活化处理并干燥的所述硅基氮化硅薄膜与氯硅烷试剂在无水四氢呋喃中反应，经过溶剂清洗去除过量氯硅烷试剂后再与末端功能化的聚乙二醇在干燥条件下震荡反应2h，数次微热清洗去除物理吸附的聚合物，完成对纳米孔的化学修饰。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述纳米孔的制备方法包括以下步骤：

对所述硅基氮化硅薄膜进行预处理；

将预处理后的硅基氮化硅薄膜固定在液体池中，在液体池中添加缓冲液；

对所述硅基氮化硅薄膜施加电流脉冲，将氮化硅薄膜暴露于与其介电强度相当的电场中，以介电击穿的方式获得孔径为20-30nm的固态纳米孔。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对所述硅基氮化硅薄膜进行预处理包括以下步骤：使用过热的食人鱼溶液对所述硅基氮化硅薄膜进行处理；然后依次使用乙醇和超纯水进行清洗；最后进行亲水活化处理，获得预处理后的硅基氮化硅薄膜。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述二价金属离子缓冲液包括1M KCl,、1×PBS、pH 7.4缓冲液，和/或1M KCl、1×PBS、5mM MgCl2、pH 7.4缓冲液，和/或1M KCl,、1×PBS、1mM MnCl2、pH 7.4缓冲液；

将溶于1×PBS缓冲液中冷冻保存的100ug/mL的整合素母液放置室温，用所述二价金属离子缓冲液稀释，获得浓度为1-10ug/mL的所述复合溶液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在外加偏压的条件下，先对所述二价金属离子缓冲液进行测试，采集空白基线电流信号；然后对所述复合溶液进行测试，采集整合素穿过纳米孔的方向和穿过纳米孔时的电学信号。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：将所述电学信号转换为文本数据并统计作图，对比不同金属离子条件下整合素穿过纳米孔时的信号频率和数据特征。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述信号频率和数据特征包括过孔方向、穿孔捕获率、易位时间、阻塞幅值和阻孔率；对所述过孔方向、穿孔捕获率、易位时间、阻塞幅值和阻孔率进行对比分析，对不同金属离子诱导的整合素构象特征进行鉴别。

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