JP7202563B2

JP7202563B2 - 電気化学センサー用電極、電気化学センサー、及び電気化学的検出装置

Info

Publication number: JP7202563B2
Application number: JP2018206584A
Authority: JP
Inventors: 仁志水口; 真充飯山
Original assignee: Nomura Micro Science Co Ltd; University of Tokushima
Current assignee: Nomura Micro Science Co Ltd; University of Tokushima
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2023-01-12
Anticipated expiration: 2038-11-01
Also published as: JP7202563B6; JP2020071172A

Description

本発明は、電気化学センサー用電極、電気化学センサー、電気化学的検出装置及び電気化学的検出方法に関する。

ヒトの健康状態の指標となる物質を可能なかぎり簡便な方法で検出することは、疾病の早期発見と適切な処置のためには極めて重要である。そのため、そのような物質の測定方法が種々検討され、中でも、電気化学的な分析法には簡便かつ小型化が容易であるという利点があり、これまで多くの手法が開発され、実用化されてきている。

今日では、生理学的に関連のある物質を簡易な操作で検出することがさらに重要視されており、核酸アプタマーや分子インプリンティングを用いた測定も提案されている（例えば、特許文献１，２参照）。ところで、核酸アプタマーや分子インプリンティングによる電極の修飾は、標的分子に対する選択性の確保において有用であるが、認識した物質を検出するにはフェロセンやアントラキノンなどの酸化還元プローブを用いることが多い。この場合、多項目を分析するには、分離された電気化学シグナルを得る必要があり、その戦略として（１）酸化還元電位が大きく離れた物質をプローブとして用いること、（２）それぞれ独立した電極から別々のシグナルを取得すること、に大別される。

ところで、前者の場合、電流検出において互いに干渉しないほどに酸化還元電位が大きく離れた物質を用いる必要があり、水溶液の電位窓という制限のもとでは、現状では２種類のプローブを使った同時測定が事実上の限界である。一方、後者の場合、先に集積化した複数の微小電極に対してそれぞれ異なる修飾を施す必要があり、特にマイクロチップのような狭小流路を用いる場合はその作成方法が極めて煩雑であった。

特開２０１０－６０３７５号公報特開２０１１－２４２３８７号公報特開２０１１－９８０７７３号公報

そこで、本発明においては、多項目の測定操作を簡便にでき、検出感度を維持しつつ、その検出を簡便、かつ正確に行うことができる電気化学センサー用電極、電気化学センサー、電気化学的検出装置及び電気化学的検出方法を提供することを目的とする。

なお、物質を電気化学的に検出する際に、検出感度を維持しつつ、検出対象物質の検出を簡便、かつ正確に行うことができる電気化学的検出装置及び方法について、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するフィルター表面に導電膜を形成した電極を用いた電気化学センサーを本出願人は特許出願し、公知の技術となっている（特許文献３参照）。

本発明の電気化学センサー用電極は、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するろ過膜と、前記ろ過膜の表面に形成された導電膜と、前記導電膜の表面に固定されたアプタマーと、を有することを特徴とするものである。

本発明の電気化学センサーは、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するろ過膜と、前記ろ過膜の表面に形成された導電膜と、前記導電膜の表面に固定されたアプタマーと、を有する作用極となる電気化学センサー用電極を有することを特徴とするものである。

本発明の電気化学的検出装置は、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するろ過膜と、前記ろ過膜の表面に形成された導電膜と、前記導電膜の表面に固定されたアプタマーと、を有する作用極となる電気化学センサー用電極、対極及び参照極を有する電気化学センサーと、前記作用極及び前記対極間の電位差を一定にする電位制御手段と、前記電気化学センサー用電極において、検出対象物質の捕捉に起因する酸化又は還元による電流値の変化を測定する電流測定手段と、を有することを特徴とするものである。

本発明の電気化学的検出方法は、サイクリックボルタンメトリーや交流インピーダンス法を用いる電気化学的検出方法において、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するろ過膜と、前記ろ過膜の表面に形成された導電膜と、前記導電膜の表面に固定されたアプタマーと、を有する作用極となる電気化学センサー用電極、対極及び参照極を有する電気化学センサーに、前記作用極及び前記対極間の電位差を一定にし、前記電気化学センサー用電極における電流値又は抵抗値の変化を測定することを特徴とするものである。

本発明の電気化学センサー用電極は、その電極となる導電膜が、フィルターの細孔内部まで導電膜でコーティングされているため電極としての表面積が大きく、さらに測定に用いる際に、フィルター細孔への電解液の強制流によって反応物質の電極表面への輸送を促すことができる。また、導電膜の表面に特定の物質と結合可能なアプタマーを固定しているため、特定の物質の有無を測定できる。

そして、このような電気化学センサー用電極を用いた電気化学センサー、電気化学的検出装置及び検出方法は、検出対象物質の電極表面への輸送が促され、検出対象物質をアプタマーで捕捉することで、検出漏れを抑制しながら測定を行うことができ、高感度に検出対象物質を検出することができる。

電気化学センサー用電極の構成を示した概略断面図本発明の一実施形態における電気化学的検出装置の概略構成図本発明の他の実施形態における電気化学的検出装置の概略構成図本発明のさらに他の実施形態における電気化学的検出装置の概略構成図実施例１において、トロンビン検出時のサイクリックボルタンメトリーの変化を示した図実施例２において、リゾチーム検出時のサイクリックボルタンメトリーの変化を示した図

以下、本発明について、実施形態を参照しながら詳細に説明する。
本実施形態の電気化学的検出装置及び方法は、その電気化学センサーに特徴があるものであって、特に、そのセンサーには新規な電気化学センサー用電極を用いることにより、検出対象物質を簡便、かつ正確に検出することができるものである。

＜電気化学センサー用電極＞
まず、本実施形態の電気化学センサー用電極について説明する。この電気化学センサー用電極は、例えば、図１に示したような構造を有するものであり、図１は電気化学センサー用電極の構成を示した概略断面図である。

すなわち、この電気化学センサー用電極１は、基材となっている孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するろ過膜２と、その表面に形成された導電膜３と、さらに導電膜３の表面に固定されたアプタマー４と、で構成されたものである。

本発明に用いるろ過膜２は、その形成された孔に特徴を有するものであり、その孔構造について、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するという物理的な特徴を有している。

このろ過膜２は、例えば、ポリカーボネートやポリエステル等のポリマー製のフィルムに、高エネルギーの重イオンでトラッキング（軌跡付け）するプロセスと、円筒状の孔構造を作るエッチングのプロセスによるトラックエッチングにより製造することができる。

トラッキングプロセスでは、ポリマーフィルムにアクセラレーターで加速した高エネルギーの重イオンを貫通させ、トラック（軌跡）を形成させ、このとき、重イオンの数量とフィルムの巻き取りスピードにより単位面積当たりのトラック数（孔密度）をコントロールする。次いで、エッチングプロセスでは、トラックしたフィルムをエッチング液へ浸漬し、トラック部分を優先的に溶解し孔を形成させ、このとき、エッチング条件により孔径をコントロールする。このときろ過膜の孔径は均一なものとして得られ、その孔道はフィルムの厚さ方向（フィルムの表面に対して垂直又は略垂直）に形成される。

そして、この孔道について、例えば、公称孔径が１μｍである場合、本発明のろ過膜のように、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な特徴を有するものは孔径分布が０．８～１μｍ（－２０％～＋０％）と非常にシャープなものとなる。また、本発明で用いるろ過膜２の開孔率は１５％未満と小さい。

検出感度の観点から、本発明で用いられるろ過膜２の孔径は、０．０１～２０．０μｍが好ましく、０．０５～５．０μｍがより好ましく、０．４～１．０μｍがさらに好ましい。この傾向の理由は、孔内への水や検出対象物質の拡散し易さ、膜の透水性、アプタマーの検出対象物質の捕捉の際の立体障害などが関連するものと思われる。
検出対象物質が細菌の場合、孔径は、たとえば、１．０μｍ～２０．０μｍが好ましい。

本発明で用いるろ過膜２としては、その厚みが６～１１μｍ、開孔率が１５％未満、孔密度が１×１０^５～６×１０^８個／ｃｍ^２、のものが好ましい。

また、このろ過膜２は、上記したようにポリマー製のフィルムとして形成されるようにその表面が平滑度、すなわち表面粗さＲａ＝１μｍ以下であることが好ましい。なお、ここでのＲａは、算術平均高さを示すものであり、ＪＩＳＢ０６０１－２００１に準拠するものである。

本発明で用いる導電膜３は、このろ過膜２の表面に形成される導電性を有する膜であり、電気化学センサー用電極として作用する。この導電膜３としては、白金、金等の金属膜や、グラファイトカーボン、ボロンドープダイヤモンド等の膜、ポリアニリン、ポリチオフェン等の導電性ポリマーによる高分子膜を形成するようにすればよい。

このような導電膜３をろ過膜２上に形成するには、金属膜であれば、スパッタリング、気相合成法等、高分子膜であれば、化学修飾等により形成することができる。

また、この電気化学センサー用電極における、ろ過膜の厚さは１～５００μｍであることが好ましく、１～１００μｍであることがより好ましく、１～１０μｍであることが特に好ましい。また、導電膜の厚さは０．００１～０．５μｍであることが好ましいが、安定的に導電性を保つことができれば特に限定されるものではない。

また、このろ過膜は、その構造が検出対象物質を検出できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、通常の平膜状であってもよいし、ろ過面積を稼ぐためにプリーツ状に加工したフィルターカートリッジとしてもよいが、平膜状であることが好ましい。

本発明で用いるアプタマー４は、特定の物質と結合、捕捉できる核酸分子やペプチドであり、公知のアプタマーを特に限定することなく用いることができる。このアプタマー４としては、検出対象物質と結合することができるものであればよく、例えば、重金属イオン、低分子有機化合物、タンパク質をはじめとする高分子有機化合物、アプタマーと相補的な塩基配列を持つ分子、金等の金属原子、ウイルス、大腸菌等の細菌などと結合可能なものが挙げられる。

疾病等の診断に用いる場合には、生体内の物質、例えば、タンパク質、と結合可能なアプタマーが好ましく、例えば、トロンビン、リゾチーム、α－フェトプロテイン、ｃ反応性タンパク質、免疫グロブリン，ＡＴＰ等と結合できるアプタマーが好ましいものとして挙げられる。

アプタマー４は、導電膜３の表面に複数固定されており、電気化学センサー用電極１と検出対象物質を含有する溶液とを接触させることで、検出対象物質と結合し、捕捉できる。この結合、捕捉により、後述する電気化学測定において、ピーク電流の減少や、電荷移動抵抗の増加等の電気化学的な変動が生じ、検出対象物質の測定が可能となる。

このとき、アプタマー４は、導電膜３の表面に固定されるが、その密度が低すぎると検出対象物質の捕捉量が少ないため測定感度が十分に向上せず、その密度が高すぎると隣接するアプタマーにより検出対象物質の捕捉が阻害され、やはり測定感度が十分に向上しないと考えられる。そのため、導電膜３の表面に固定されるアプタマー４の密度は、例えば、１×１０^－１５～１×１０^－８ｍｏｌ／ｃｍ^２が好ましく、１×１０^－１３～１×１０^－１０ｍｏｌ／ｃｍ^２がより好ましく、１×１０^－１２～１×１０^－１０ｍｏｌ／ｃｍ^２がさらに好ましく、１×１０^－１１～１×１０^－１０ｍｏｌ／ｃｍ^２が特に好ましい。

（アプタマーの固定方法）
表面に導電膜３が設けられたろ過膜２に対して、固定するアプタマー４を導電膜３上に固定するには、導電膜３上に直接アプタマー４を固定してもよいし、間接的にアプタマー４を固定してもよい。

直接固定する場合、例えば、導電膜３が貴金属で形成されている場合、核酸断片であるアプタマー４の有する原子、例えば硫黄原子、を利用することで、固定できる。この固定の方法は、従来公知の方法により行うことができ、貴金属とチオール（－ＳＨ）やジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）等の硫黄化合物を接触させ、貴金属表面に硫黄化合物を化学吸着させることで容易に固定できる。このとき、導電膜３上に、貴金属の微粒子（ナノ粒子）を配列して固定し、その微粒子にアプタマーを固定させることもできる。

また、間接的に固定する場合、導電膜３と結合する部分とアプタマー４と結合する部分を併せ持つ物質を用いることで、固定できる。この固定の方法は、例えば、Kenzo Maehashi, et al., ”Label-Free Protein Biosensor Based on Aptamer-Modified Carbon Nanotube Field-Effect Transistors”,Analytical Chemistry, Vol.79, No.2, 2007, p782-787に記載されているようなピレン誘導体等の物質を用いればよく、このときカーボン膜上にアプタマーを固定できる。

なお、アプタマーを固定する際には、その電気化学センサー用電極としての機能を確保するために、固定する前に導電膜３の表面を前処理することが好ましい。この前処理としては、紫外線照射、強力な酸化剤を用いる処理、熱処理等が挙げられ、紫外線照射が好ましく、特にエキシマ光照射が好ましい。前処理をしない場合、従来の導電金属板と同様の固定では測定感度が十分に上がらない場合があったが、前処理をすることで、ろ過膜上に形成した導電膜上に、測定に寄与するアプタマーを増加させ、効率的な測定を可能とできる。

また、本実施形態の電気化学センサー用電極は、上記した構成を必須の要素としているが、アプタマー４を固定した後、電極表面に検出対象物質以外のタンパク質等による非特異反応が起こらないように、表面処理を行うことが好ましい。この表面処理としては、メルカプトヘキサノール、メルカプトヘキサン，アミノエタンチオール等のメルカプタン類のように、測定に影響を及ぼさない物質を、アプタマー４の結合していない電極表面に吸着させることで容易に行うことができる。

なお、この表面処理は、後述する対極となる電気化学センサー用電極（導電膜表面にアプタマー４が固定されていない）に対しても行うことが好ましい。

次に、この電気化学センサー用電極を用いた電気化学センサー、その電気化学センサーを用いた電気化学的検出装置及び検出方法について説明する。

＜電気化学センサー＞
本発明の電気化学センサーは、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するろ過膜と、前記ろ過膜の表面に形成された導電膜と、前記導電膜の表面に固定されたアプタマーと、を有する作用極となる電気化学センサー用電極と、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するろ過膜の表面に導電膜を形成した対極となる電気化学センサー用電極と、を有し、これらの電気化学センサー用電極を短絡しないように重ねてなるものである。

すなわち、この電気化学センサーは、本発明の電気化学センサー用電極と、アプタマーが結合されていないこと以外は本発明の電気化学センサー用電極と同一の構成を有する電気化学センサー用電極を重ねて構成されるものであり、その際に電極が短絡しないようにしたものである。例えば、図２及び３には、電気化学的検出装置の概略構成図を示しているが、電気化学センサーはそのうち、図２における１１、図３における１２で表されるものである。

例えば、図２に示した電気化学センサー１１は、作用極となる電気化学センサー用電極１１Ａと、対極となる電気化学センサー用電極１１Ｂと、から構成されるものである。

このとき、電気化学センサー用電極１１Ａと１１Ｂは、互いの電極が短絡しないように、上から電気化学センサー用電極１１Ａを上向き（導電膜が検出対象溶液供給部２５側）に、電気化学センサー用電極１１Ｂを下向き（導電膜が吸引部２６側）にして重ねることが好ましい。その他にも電極の孔道を塞ぐことなく、電極同士が短絡しないようにするものであれば特に限定されずに適用することができ、例えば、電気化学センサー用電極１１Ａと１１Ｂの間に孔の空いた絶縁膜などをスペーサーとして挿入する方法等が挙げられる。なお、この図２では、電気化学センサー用電極として、片面に導電膜を形成したものを例示しているが、両面に導電膜を形成してもよい。

そして、図３に示した電気化学センサー１２は、第１の作用極となる電気化学センサー用電極１２Ａと、第２の作用極となる電気化学センサー用電極１２Ｂと、対極となる電気化学センサー用電極１２Ｃと、から構成されるものである。

このとき、電気化学センサー用電極１２Ａ、１２Ｂ及び１２Ｃは、互いの電極が短絡しないように、上から電気化学センサー用電極１２Ａを上向き（導電膜が検出対象溶液供給部３５側）に、電気化学センサー用電極１２Ｂを上向き（導電膜が検出対象溶液供給部３５側）に、電気化学センサー用電極１２Ｃを下向き（導電膜が吸引部３６側）に、して重ね、さらに、電気化学センサー１２Ａと１２Ｂとの間にスペーサー１２Ｄを挟んで重ねるようにすることで、短絡を防止するようにしている。このスペーサー１２Ｄとしては、本発明の電気化学センサー用電極において基材として用いるろ過膜を用いることが好ましい。

このとき、作用極となる電気化学センサー用電極１２Ａと１２Ｂにおいて、それぞれアプタマー４の種類を異なるものとすることで、２種類の検出対象物質について一度の通液操作で検出対象物質の有無を検知できる電気化学センサーとできる。

さらに、作用極となる電気化学センサー用電極として、異なるアプタマー４を固定したものを用意し、これらを積層して電気化学センサーとすることで、多数の検出対象物質に対して一度の通液操作で測定が可能となる。この電気化学センサーは、従来、電気化学的測定としては２種類程度の同時測定がせいぜいであったものが、３種類以上の測定も可能とするものであり、そのセンサーの構成が簡易で、製造も容易なものである。

＜電気化学的検出装置及び方法＞
本発明の電気化学的検出装置は、上記したように、例えば、図２及び図３に示した構成のものが挙げられる。なお、この図２及び図３は、構成を説明するために、積層体を展開して示したものである。

まず、図２に示した電気化学的検出装置２１について説明する。この電気化学的検出装置２１は、電気化学センサー１１と、電位制御手段２２と、電流測定手段２３と、参照極２４と、検出対象溶液供給部２５と、吸引部２６と、から構成されるものである。

電気化学センサー１１は、上記説明したとおりのものである。そして、この電気化学センサー１１は、１１Ａ及び１１Ｂの各電極が電位制御手段２２に接続されている。電位制御手段２２は、このように接続した電極に電位を与えるものであり、さらにこの電位差を一定にする機能を有するものであり、例えば、ポテンショスタットが挙げられる。ポテンショスタットには、ファンクションジェネレーターを用いるようにしてもよい。また、このようにポテンショスタットからなるような電位制御手段２２には、電流測定手段２３が接続され、作用極上における電流値の変化を測定し、記録することができるようになっている。また、電位制御手段２２には参照極２４が接続され、参照極２４は、作用極の電位を決定する際の基準となる電極として働き、飽和カロメル（水銀）電極や銀電極、銀／塩化銀電極等が用いられる。

そして、この電気化学的検出装置２１は、検出対象溶液を電気化学センサー１１に供給しながら電気化学センサー１１を通過させることができるように、作用極側に検出対象溶液供給部２５が、対極側に吸引部２６が電気化学センサー１１を挟むようにして設けられている。

この電気化学的検出装置２１を用いた電気化学的検出方法は、電気化学センサー１１の作用極となる電気化学センサー用電極１１Ａ及び対極となる電気化学センサー用電極１１Ｂ間に電位制御手段２２により所定の電圧を印加し、電位差を設けるようにする。このとき、参照極２４の電位を参照しながら所定の電位に設定するようにする。

このように所定の電位が設けられた状態で、検出対象物質を含む検出対象溶液の通水の前後において、電気化学的測定を行う。検出対象物質が、作用極となる電気化学センサー用電極１１Ａの導電膜の表面や孔道の側面に接近してアプタマー４に捕捉されると、アプタマー４に捕捉された検出対象物質により、導電膜上で行われる電子の授受による酸化又は還元反応が阻害されるため、通水前に測定した電流値や抵抗値等の電気化学的な変化が測定され検出対象物質の有無の判断や存在量の算出等を行うことができる。そして、この作用極となる電気化学センサー用電極１１Ａは電気化学センサー用電極１で構成されており、その基材となっているろ過膜２の表面が平滑で孔道が円筒状かつ真直であり、孔径が均一であるという特徴を有しているため、検出対象溶液中の検出対象物質がそのろ過膜の孔道に強制的に流されるようになり、簡便かつ正確に検出操作を行うことができるものである。

また、その表面に形成された導電膜３は、ろ過膜２の表面に加え、その孔道の側面にも導電膜３が形成されるものと考えられる（図１参照）。このことも、作用極となる電気化学センサー用電極１１Ａを用いてろ過操作を行った場合に、検出対象物質は孔道を通過する際に、ろ過膜の表面又は孔道の側面に固定されたアプタマー４と接近することとなるため効果的に検出対象物質の有無を検出することができると考えられる。

また、このように微小な孔道を通過させるようにして検出を行うため、溶液中の検出対象物質の電極表面までの拡散距離が小さくなり、効果的にアプタマー４に捕捉させることができるため、特にサイクリックボルタンメトリーにおいて、大きな電流変化を伴い迅速かつ正確に検出結果を得ることができる。なお、ここで、検出対象物質は、導電膜３上に固定されたアプタマー４に捕捉される物質である。

また、測定時における溶液は電気化学的測定であるサイクリックボルタンメトリーや交流インピーダンス法により測定することが可能なものであればよく、通常は電解質を用いるものであり、例えば、フェリシアン化カリウム／フェロシアン化カリウム水溶液、塩化ヘキサアンミンルテニウム錯体水溶液、アントラキノン誘導体の水溶液、メチレンブルー水溶液等が挙げられる。

次に、図３に示した電気化学的検出装置３１について説明する。この電気化学的検出装置３１は、電気化学センサー１２と、電位制御手段３２と、電流測定手段３３と、参照極３４と、検出対象溶液供給部３５と、吸引部３６と、から構成されるものである。

電気化学センサー１２は、上記説明したとおりのものである。そして、この電気化学センサー１２は、１２Ａ、１２Ｂ及び１２Ｃの各電極が電位制御手段３２に接続されている。電位制御手段３２は、このように接続した電極に電位を与えるものであり、さらにこの電位差を一定にする機能を有するものであり、例えば、バイポテンショスタットが挙げられる。バイポテンショスタットには、ファンクションジェネレーターを用いるようにしてもよい。また、このようにバイポテンショスタットからなるような電位制御手段３２には、電流測定手段３３が接続され、作用極上における検出対象物質の捕捉に起因する酸化又は還元による電流値の変化を測定し、記録することができるようになっている。また、電位制御手段３２には参照極３４が接続され、参照極３４は、作用極の電位を決定する際の基準となる電極として働き、飽和カロメル（水銀）電極や銀電極、銀／塩化銀電極等が用いられる。

そして、この電気化学的検出装置３１は、検出対象溶液を電気化学センサー１２に供給しながら電気化学センサー１２を通過させることができるように、作用極側に検出対象溶液供給部３５が、対極側に吸引部３６が電気化学センサー１２を挟むようにして設けられている。このとき、第１の作用極となる電気化学センサー用電極１２Ａと検出対象溶液供給部３５との間に目詰まり等による電極劣化の防止のためカバー３７、またはガードカラム等を設けてもよい。

この電気化学的検出装置３１を用いた電気化学的検出方法は、第１の作用極となる電気化学センサー用電極１２Ａ及び対極となる電気化学センサー用電極１２Ｃ、第２の作用極１２Ｂとなる電気化学センサー用電極及び対極となる電気化学センサー用電極１２Ｃ間に電位制御手段３２により所定の電位差を設けるようにする。このとき、参照極３４の電位を参照しながら所定の電位に設定するようにする。

ここでも基本的には電気化学的検出装置２１と同様の操作により検出操作を行うものであり、異なるのは作用極を２つ設けている点である。このように複数の作用極を設けることにより、異なる電位差を有する作用極を作ることができる。そして、異なる電位差の作用極を利用することで、同一溶液中の複数の検出対象物質を一度の通液操作で検出することを可能としている。

以上で説明したように、本実施形態の電気化学センサー用電極は、表面に特定のアプタマーが固定され、数十ナノメートル～マイクロメートルオーダーの均一な円筒型直孔を持ち、表面が平滑で、かつ厚さが数マイクロメートル～十マイクロメートル前後と極めて薄いという特徴を持つものであり、これを複数枚重ねてモジュール化して電気化学センサーとし、これを用いて検出対象物質を測定することで従来の構造的限界を超えた新しい電気化学的検出装置及び方法を提供することができる。

そして、作用極となる電気化学センサー用電極を複数枚重ねて用い、それぞれ独立して電位を設定することによって、極めて高い検出感度を有する多重電極が実現する。この電極の間に必要に応じて適当なスペーサーを挿入し、さらに電解液の流速をコントロールして、作用極から対極への反応物質の輸送時間を制御しながら検出対象物質を検出する。

本実施形態の電気化学センサー用電極は、ろ過膜の細孔内部まで導電膜でコーティングされているため電極としての表面積が大きく、さらにろ過膜細孔への電解液の強制流によって反応物質の電極表面への輸送が促されるため優れた反応効率を示し、高感度に検出対象物質を検出することができる。またこの電極は極めて薄いという特長を持つことから、複数枚重ねて作製した多重電極では、それぞれ異なるアプタマーを固定しておくことで、多項目の測定が簡便かつ容易な操作で可能となる。

また、図４は、電気化学的検出装置を小型の簡易測定を可能とする装置の一例、電気化学的検出装置４１、を示している。この電気化学的検出装置４１は、第１の作用極となる電気化学センサー用電極１２Ａ、第２の作用極となる電気化学センサー用電極１２Ｂ、対極４２と、参照極４３と、検出対象溶液供給部４４と、電気化学センサー用電極を挟み込む上基材４５及び下基材４６と、から構成されるものである。なお、電位制御手段および電流測定手段は、図示は省略しているが、図３に示した電気化学的検出装置３１と同様の構成とすればよい。なお、この図４も、図２及び３と同様、構成を説明するために、積層体を展開して示したものである。

このように薄い基材を用い本実施形態の電気化学センサー用電極を挟み込むことで、装置の薄型化が可能となる。ここで、上基材４５には検出対象溶液の導入流路４５ａ、下基材４６には検出対象溶液の排出流路４６ａが、それぞれ設けられており、検出対象溶液を、検出対象溶液供給部４４から導入流路４５ａに供給し、次いで排出流路４６ａから排出することで測定が可能である。このとき、排出にあたっては、吸引して排出を促進することが好ましく、シリンジ等を使用することで微小な流路の吸引を容易に行うこともできる。

また、このように基材で挟む場合には、基材間の流路の周囲に、ゴム等の弾性部材を設けることで、その検出対象溶液の流路を密閉して、検出対象溶液が漏れないようにすることが好ましい。

ここで用いる基材としては、プレート状でも、フィルム状でもよい。密閉性を考慮すると、プレート状であることが好ましい。また、薄型化を考慮するとフィルム状であることが好ましい。ここで用いる材料としては、特に限定されるものではないが、軽量で加工性が良好であることから、アクリル、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン等の樹脂製であることが好ましい。

次に、本発明の実施例について説明する。
（実施例１）
孔径が２０．０μｍ、厚さ９．５μｍ、直径４７ｍｍのトラックエッチドメンブレンフィルター（ＧＶＳ社製）の両表面に、イオンスパッター装置（日立製作所製、商品名：Ｅ－１０３０型）を用いて、スパッタリング電流４０ｍＡの条件で金を２００秒間真空蒸着した。

得られた金層を有するメンブレンフィルターの表裏両面に、それぞれ３０分間エキシマ光（ウシオ電機株式会社製、商品名：Ｍｉｎ－Ｅｘｃｉｍｅｒ）を照射し、表面処理を行い、次いで、濃度２×１０^－７Ｍでトロンビンアプタマーを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）に１４時間浸漬した後、そのまま９０℃まで加熱して６分間保持し、９０分かけて常温まで徐冷した。

さらに、このメンブレンフィルターを０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）に１０分間漬け置きして洗浄し、１ｍＭメルカプトヘキサノール溶液に１時間浸漬した後、再度０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）に１０分間漬け置きして洗浄して、アプタマー密度２×１０^－１１ｍｏｌ／ｃｍ^２以下の電気化学センサー用電極を作製した。

また、２０．０μｍ、直径４７ｍｍのトラックエッチドメンブレンフィルター（ＧＶＳ社製）の両表面に、イオンスパッター装置（日立製作所製、商品名：Ｅ－１０３０型）を用いて、スパッタリング電流４０ｍＡの条件で白金を２００秒間真空蒸着して、電気化学センサー用電極を作製した。

金電極を基盤として形成した電気化学センサー用電極を作用極とし、白金電極を形成した電気化学センサー用電極を対極とし、また両電極の間に孔径２０．０μｍのトラックエッチドメンブレンフィルター（ＧＶＳ社製）をスペーサーとして挟んで重ね、径４ｍｍの試料挿入口および排出口を備えた厚さ５ｍｍのアクリル樹脂製の上下基材の間に挟み（図４）、それぞれの電極をポテンショスタット（Ｂｉｏ－Ｌｏｇｉｃ製、商品名：ＳＰ－１５０型）に接続した。参照極には銀／塩化銀を用い、液絡部の先を作用極の上部、約１０ｍｍの位置にセットした（図４参照）。

電解液として、１ｍＭフェリシアン化カリウム／フェロシアン化カリウム水溶液（支持電解質として０．１Ｍ濃度のＫＣｌを含む）を用い、初期電位０．２００Ｖｖｓ．参照極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）、測定範囲０～０．５００Ｖ、スキャン速度５０ｍＶ／ｓ、サイクル数５で、電気化学測定を行った。

次いで、作用極として得られた電気化学センサー用電極を、濃度１．２×１０^－７Ｍのトロンビンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）に、３７℃で３０分間浸漬させた後、０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）に１０分間漬け置きして洗浄し、トロンビンを捕捉した電極を得た。この電極を、上記と同条件で電気化学測定を行った。

電気化学センサー用電極において、トロンビンとの浸漬処理の前後における上記電気化学測定で得られた結果をそれぞれ図５に示す。図５（ａ）はトロンビンアプタマーで修飾した後のサイクリックボルタモグラムであり、図５（ｂ）は，トロンビンを捕捉した後のサイクリックボルタモグラムである。この図から、トロンビンを捕捉した電極においては、捕捉していないものと比べて、フェリシアン化カリウム／フェロシアン化カリウムの酸化／還元に伴う電流が低下し、トロンビンを捕捉したこと、すなわち検出対象溶液中に検出対象物質が含まれていると判断できる。

（実施例２）
実施例１において、トロンビンアプタマーを含有するリン酸緩衝液の代わりに濃度１×１０^－６Ｍでリゾチームアプタマーを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）を用いて、導電層の表面に密度１×１０^－１０ｍｏｌ／ｃｍ^２以下のリゾチームアプタマーが固定された電気化学センサー用電極を製造した。

次いで、作用極として得られた電気化学センサー用電極を、濃度２．３×１０^－４Ｍのリゾチームを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）に、３７℃で３０分間浸漬させた後、０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）に１０分間漬け置きして洗浄し、リゾチームを捕捉した電極を得た。この電極を、実施例１と同条件で電気化学測定を行った。

電気化学センサー用電極において、リゾチームとの浸漬処理の前後における上記電気化学測定で得られた結果をそれぞれ図６に示す。図６（ａ）はリゾチームアプタマーで修飾した後のサイクリックボルタモグラムであり、図６（ｂ）は，リゾチームを捕捉した後のサイクリックボルタモグラムである。この図から、リゾチームを捕捉した電極においては、捕捉していないものと比べて、フェリシアン化カリウム／フェロシアン化カリウムの酸化／還元に伴う電流が低下し、リゾチームを捕捉したこと、すなわち検出対象溶液中に検出対象物質が含まれていると判断できる。

以上より、本発明の電気化学センサー用電極を用いた電気化学センサーにより測定を行うことで、特定の物質の存在の有無を、簡便かつ容易な操作で検出、判断できることが確認できた。

１…電気化学センサー用電極、２…ろ過膜、３…導電膜、４…アプタマー、１１，１２…電気化学センサー、１１Ａ…作用極となる電気化学センサー用電極、１１Ｂ…対極となる電気化学センサー用電極、１２Ａ…第１の作用極となる電気化学センサー用電極、１２Ｂ…第２の作用極となる電気化学センサー用電極、１２Ｃ…対極となる電気化学センサー用電極、１２Ｄ…スペーサー、２１…電気化学的検出装置、２２…電位制御手段、２３…電流測定手段、２４…参照極、２５…検出対象溶液供給部、２６…吸引部

Claims

孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するろ過膜と、
前記ろ過膜の表面に形成された導電膜と、
前記導電膜の表面に固定されたアプタマーと、
を有し、
前記ろ過膜がトラックエッチメンブレンフィルターであることを特徴とする電気化学センサー用電極。
前記ろ過膜の孔径が、０．０１～２０．０μｍである請求項１に記載の電気化学センサー用電極。
前記アプタマーが、特定のタンパク質を捕捉可能なアプタマーである請求項１又は２に記載の電気化学センサー用電極。
前記アプタマーが、トロンビンアプタマー又はリゾチームアプタマーである請求項３に記載の電気化学センサー用電極。
孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するろ過膜と、前記ろ過膜の表面に形成された導電膜と、前記導電膜の表面に固定されたアプタマーと、を有する作用極となる電気化学センサー用電極と、
孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するろ過膜の表面に導電膜を形成した対極となる電気化学センサー用電極と、を有し、
前記作用極及び前記対極となる電気化学センサー用電極が短絡しないように重ねられていることを特徴とする電気化学センサー。
孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するろ過膜と、前記ろ過膜の表面に形成された導電膜と、前記導電膜の表面に固定されたアプタマーと、を有する作用極となる電気化学センサー用電極を複数有することを特徴とする電気化学センサー。
孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するろ過膜と、前記ろ過膜の表面に形成された導電膜と、前記導電膜の表面に固定されたアプタマーと、を有する作用極となる電気化学センサー用電極、対極及び参照極を有する電気化学センサーと、
前記作用極及び前記対極間の電位差を一定にする電位制御手段と、
前記電気化学センサー用電極において、検出対象物質の捕捉に起因する酸化又は還元による電流値の変化を測定する電流測定手段と、
を有し、
前記対極が、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径を有するろ過膜の表面に導電膜を形成した電気化学センサー用電極であり、
前記作用極及び前記対極となる電気化学センサー用電極が短絡しないように重ねられていることを特徴とする電気化学的検出装置。