CN114199836B - 一种石墨烯嵌层式碳膜材料在肿瘤细胞检测分析中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种石墨烯嵌层式碳膜材料在肿瘤细胞检测分析中的应用，涉及循环肿瘤细胞的检测和释放领域。该应用包括以下步骤：首先采用石墨烯嵌层式碳膜基底捕获和/或释放肿瘤细胞，再对该肿瘤细胞进行分析。该应用在保持高特异性捕获循环肿瘤细胞的同时，能够在不引入外来物质，例如酶或者金纳米颗粒溶解明胶的前提下，凭借基底在近红外光照射下实现自热，进而释放细胞，以便后续的生物分析。

Description

一种石墨烯嵌层式碳膜材料在肿瘤细胞检测分析中的应用
技术领域
本发明涉及循环肿瘤细胞的检测和释放领域，特别是涉及一种石墨烯嵌层式碳膜材料在肿瘤细胞检测分析中的应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTCs)，由实体肿瘤病变脱落并进入外周血的肿瘤细胞形成。CTC通过血液传播到身体的其他器官，转移是癌症患者死亡的主要原因。因此，从外周血中高效、准确地捕获和释放CTCs对于早期癌症患者的诊断和预后至关重要。然而，CTCs在外周血液中极为罕见(每毫升全血中只有几个到数百个CTCs，109个红细胞和107个白细胞)，而且很难在保持生物活性的同时释放CTCs，这也影响了随后的再培养和医学分析。因此，需要发展一种在保持细胞高活性状态下的高效精准的捕获和释放方法。
Kim[Kim,Tae-Hyeong,Minji Lim et al.Fast:Size-Selective,Clog-FreeIsolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid–Liquid Interface[J].Analytical Chemistry.2017,89 (2):1155-1162]基于CTCs与血细胞尺寸差异，使用一种超高速、易操作、高灵敏度的离心微流控技术--FAST圆盘对采集到的患者外周血进行过滤，在离心式微流控装置中，随着圆盘的旋转，液体径向向外泵送。将全血样本注入样本装载室，轻轻推入过滤室，较大的 CTC被膜捕获，而较小的造血细胞通过膜被转移到废液室从而达到分离的目的。但是其缺点在于一方面部分白细胞尺寸范围会与CTC的尺寸范围重叠，导致白细胞被误捕获在膜上，降低CTCs的纯度，另一方面就是这种分离方式不能对CTCs进行特异性捕获。此外虽然流体辅助室完全浸润的设计可以降低液体流动所需的压差，但是这种机械分离方式仍可能对细胞造成损伤且有堵塞滤膜的风险。
Eduardo[Reategui Eduardo,Aceto Nicola,Lim Eugene J et al.TunableNanostructured Coating for the Capture and Selective Release of ViableCirculating Tumor Cells[J].ADVANCED MATERIALS.2015,27(9):1593-+]采用了一种双模明胶基纳米结构涂层捕获细胞，再利用明胶的温度响应性进行整体加热从而使得捕获的细胞被释放。而对于局部的释放该文献建立了频率控制微尖端系统的实验原型。通过微尖端在微流体装置的表面产生受控振动，产生可以选择性地去除单个细胞的正常惯性力。去除的薄膜的表面积(以及释放的细胞数量)取决于振动的频率，从而能够调整释放半径以进行单个CTC恢复。这种方法虽然既能够实现对循环肿瘤细胞的整体释放和局部释放，但是释放过程繁琐复杂，机械力的大小调节可能会造成细胞的机械损伤。
Lv[Song-Wei Lv,Ya Liu,Min Xie et al.Near-Infrared Light-ResponsiveHydrogel for Specific Recognition and Photothermal SiteRelease of CirculatingTumor Cells[J].ACS nano,2016,10: 6201-6210]利用在包埋金纳米棒(GNR)的水凝胶上压印目标细胞的细胞印记，制作了近红外光响应水凝胶基底，可以实现对捕获细胞的单细胞释放。这种方法的缺陷在于带有细胞形貌的明胶基底的制备过程繁琐复杂，过长的制备时间可能导致明胶随温度变化发生一定变化，不易保存基底。此外，文章中使用的金纳米棒能够在膜蛋白介导下通过内吞效应进入细胞，进入特定细胞器且有可能干扰细胞器的生理功能，因此具有潜在的细胞毒性。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种石墨烯嵌层式碳膜材料在肿瘤细胞检测分析中的应用，该应用在保持高特异性捕获循环肿瘤细胞的同时，能够在不引入外来物质，例如酶或者金纳米颗粒溶解明胶的前提下，凭借基底在近红外光照射下实现自热，进而释放细胞，以便后续的生物分析。
为了达到上述目的，本发明提供了一种石墨烯嵌层式碳膜材料在肿瘤细胞检测分析中的应用，包括以下步骤：首先采用石墨烯嵌层式碳膜基底捕获和/或释放肿瘤细胞，再对该肿瘤细胞进行分析。
本发明人在研究过程中发现，针对循环肿瘤细胞的捕捉和释放，已有3种技术手段：流体辅助分离技术、双模明胶基纳米结构涂层、在包裹金纳米棒的明胶上压印细胞印记作为基底来捕获细胞。然而，流体辅助分离技术(FAST disc)的检测方法依赖于循环肿瘤细胞与血细胞的尺寸差异，不具备对目标细胞特异性捕获的功能，滤膜无法过滤掉部分特殊的尺寸与循环肿瘤细胞相近的白细胞，而且在全血中血细胞的数量会远远高与循环肿瘤细胞。而仅根据细胞的尺寸大小来分离循环肿瘤细胞可能会导致混入大量的大尺寸的白细胞从而降低捕获的循环肿瘤细胞的纯度，且大量的血细胞通过滤膜可能会造成堵塞，且微滤装置的通病就是容易出现堵塞。这种靠压差使细胞通过滤膜的方法可能在排挤过程中会使细胞造成损伤。
双模明胶基纳米结构涂层虽然可以通过整体加热使细胞全部释放和微尖端系统的振动选择性地释放单个细胞，但是整个系统设计繁琐，尖端的振动幅度和力度大小难以把握，很难无损地释放单个的肿瘤细胞，容易对细胞造成严重的机械损伤，可能影响细胞后期的培养和研究。
在包裹金纳米棒的明胶上压印细胞印记作为基底来捕获细胞，整个基底制作时间过长，在此过程中明胶状态受温度影响容易出现变形，导致基底形貌发生改变，进而容易导致压印的细胞印记形状发生改变，最重要的是引入的金纳米棒具有潜在的细胞毒性，金纳米棒随细胞一起释放后，能够进入特定细胞器导致细胞器的生理功能受到干扰，同时，金纳米棒在细胞内的聚集会延长其在细胞内的停留时间，从而使细胞产生的活性氧自由基增加，进而影响细胞功能导致细胞凋亡。
因此，本发明人采用上述应用方式，利用石墨烯嵌层式碳膜材料的特性，能够在保持高特异性捕获循环肿瘤细胞的同时，能够在不引入外来物质，例如酶或者金纳米颗粒溶解明胶的前提下，凭借基底在近红外光照射下实现自热，进而释放细胞，以便后续的生物分析。
在其中一个实施例中，所述捕获通过以下方法实现：将所述石墨烯嵌层式碳膜基底和肿瘤细胞共同孵育。
采用上述方式，让石墨烯嵌层式碳膜基底和肿瘤细胞充分接触，利于捕获肿瘤细胞。
在其中一个实施例中，所述肿瘤细胞的细胞浓度为0.8×105个/ml-1.2×105个/ml。
在上述细胞浓度中，所述石墨烯嵌层式碳膜基底能捕捉到数量足够的肿瘤细胞。
在其中一个实施例中，所述孵育的温度为20℃-27℃，所述孵育的时间为0.8-1.2h。
采用上述孵育条件，能够保证石墨烯嵌层式碳膜基底捕获足够的肿瘤细胞。
在其中一个实施例中，所述释放通过以下方法实现：对石墨烯嵌层式碳膜基底进行近红外光照射，使石墨烯嵌层式碳膜基底释放肿瘤细胞。
利用石墨烯嵌层式碳膜基底的材料特性，通过近红外光照射，使石墨烯嵌层式碳膜基底吸光升温，进而使明胶融化，实现肿瘤细胞的释放；且采用近红外光照射更安全，短时间的近红外光照射具有低的光毒性，不会降低肿瘤细胞的生物活性，且释放过程中无需引入酶或者其他试剂，可以实现无损地释放细胞，比现有技术更加安全。
在其中一个实施例中，所述释放通过以下方法实现：
限定光照区域：通过掩模版控制石墨烯嵌层式碳膜基底的光照区域的大小和位置；
照射：采用近红外光照射。
采用掩模版可以通过控制光照区域的大小和位置，使基底在近红外光照射下实现局部自热，按照需求局部性、选择性、无损地释放肿瘤细胞。
在其中一个实施例中，所述近红外光照射的时间为5-10min，波长为750-850nm，强度为0.5-1.5W/cm2。
采用上述照射时间，能保证提供足够的光能给石墨烯嵌层式碳膜基底，转化成足够的热能，进而使明胶液态化，实现肿瘤细胞的释放。
在其中一个实施例中，所述石墨烯嵌层式碳膜基底包括：石墨烯嵌层式碳膜、明胶和适配体。
粗糙的石墨烯嵌层式碳膜表面提供大的表面积有利于细胞与基底的充分接触和为适配体修饰提供更多的位点；明胶具有良好的热敏性和生物相容性，可以借助近红外光照下石墨烯嵌层式碳膜产热的温度升高从凝胶态转变为液态；通过适配体的修饰与循环肿瘤细胞上的特异性蛋白结合进一步的提高细胞捕获效率，并且使石墨烯嵌层式碳膜基底具备了特异性识别肿瘤细胞的能力。
在其中一个实施例中，所述石墨烯嵌层式碳膜基底的制备方法包括以下步骤：
制备石墨烯嵌层式碳膜：采用ECR等离子溅射系统，通过电子辐照在硅衬底上沉积石墨烯嵌层式碳膜，即得；
涂覆明胶：在沉积了石墨烯嵌层式碳膜的硅衬底上涂覆明胶；
修饰适配体：在涂覆了明胶的硅衬底上修饰适配体。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种石墨烯嵌层式碳膜材料在肿瘤细胞检测分析中的应用，该应用在保持高特异性捕获循环肿瘤细胞的同时，能够在不引入外来物质，例如酶或者金纳米颗粒溶解明胶的前提下，凭借基底在近红外光照射下实现自热，进而释放细胞，以便后续的生物分析。
附图说明
图1为实施例2中修饰适配体GRO的光滑硅片Si基底在荧光视野下的细胞分布情况，比例尺100μm；
图2为实施例2中修饰适配体GRO的石墨烯嵌层式碳膜基底在荧光视野下的细胞分布情况，比例尺100μm；
图3为实施例2中两种基底对MCF-7细胞的捕获效率的结果统计图；
图4为实施例3中的实验流程图；
图5为实施例3中NIR照射前后具有明胶(Gel)涂层的修饰有适配体的Si衬底和石墨烯嵌层式碳膜基底的荧光视野内细胞密度分布情况，比例尺：100μm；
图6为实施例4中在GIC/Ap基底上的细胞在NIR照射前后分布示意图以及经过NIR照射过后细胞在基底上不同区域分布的荧光图，其中图6的左侧为NIR照射前后的流程图，图 6中的(a1)是没有NIR照射区域，图6中的(a2)为NIR照射区域的边界，比例尺： 500μm；
图7为实施例4中在NIR照射下Si衬底和石墨烯嵌层式碳膜基底上被捕获的细胞随光照释放的释放效率情况；
图8为实施例5中Hoechst/PI染色法检测释放的MCF-7细胞活性的结果图，比例尺：100μm；
图9为实施例5中培养MCF-7细胞在不同时间(6、12、24、48h)的增殖情况，比例尺：100μm。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义：
本发明所述的适配体：指一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合。
近红外光(NIR)：指介于可见光(VIS)和中红外光(MIR)之间的电磁波，按ASTM (美国试验和材料检测协会)定义是指波长在780-2526nm范围内的电磁波。
掩膜版：指在薄膜、塑料或玻璃基体材料上制作各种功能图形并精确定位，以便用于光致抗蚀剂涂层选择性曝光的一种结构，是微纳加工技术常用的光刻工艺所使用的图形母版。
石墨烯嵌层式碳膜：简称GIC，是石墨烯层垂直于硅基底生长的薄膜。
来源：
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
实施例1
制备石墨烯嵌层式碳膜基底。
1、制备石墨烯嵌层式碳膜：采用多功能ECR等离子溅射系统，采用低能电子辐照在p 型<100>的硅衬底上沉积石墨烯嵌层式碳膜(GIC)薄膜，粗糙的石墨烯嵌层式碳膜(GIC)薄膜表面提供大的表面积有利于细胞与基底的充分接触和为适配体修饰提供更多的位点。
2、涂覆明胶：利用镀膜机在石墨烯嵌层式碳膜(GIC)基底表面旋涂上一层明胶(Gel)，明胶具有良好的热敏性，可以借助近红外光照下石墨烯嵌层式碳膜(GIC)产热的温度升高从凝胶态转变为液态。
3、修饰适配体：在旋涂明胶的石墨烯嵌层式碳膜(GIC)基底上继续修饰GRO适配体，通过适配体的修饰与循环肿瘤细胞上的特异性蛋白结合进一步的提高细胞捕获效率，并且使石墨烯嵌层式碳膜(GIC)基底具备了特异性识别肿瘤细胞的能力。
在本实施例中，所述石墨烯嵌层式碳膜参照申请号为201810785781.8的中国专利制备。
实施例2
一种循环肿瘤细胞的捕获方法。
将实施例1得到的石墨烯嵌层式碳膜基底用于循环肿瘤细胞捕获实验。
捕获实验中，本发明人设置了修饰适配体的光滑硅片组(Si/Aptamer)和修饰适配体的 GIC(GIC/Aptamer)组作为实验对照，在2种不同基底上分别加入1ml相同浓度的细胞(105/ml)孵育捕获1h。
结果如图1、图2、图3所示，其中图1为Si/GRO荧光视野下的细胞分布情况，图2为GIC/GRO荧光视野下的细胞分布情况，图3为两种基底对于MCF-7细胞捕获效率的结果统计图。从图3中可以看出由于石墨烯嵌层式碳膜(GIC)的形貌和适配体的修饰，细胞的捕获效率被大大提高。
实施例3
一种石墨烯嵌层式碳膜材料在肿瘤细胞检测分析中的应用。
本实施例的实验流程图如图4所示。
1、捕获循环肿瘤细胞。
分别向适配体修饰的表面覆盖明胶的光滑硅衬底和适配体修饰的表面覆盖明胶的GIC 基底上加入1ml浓度为105/mL的MCF-7细胞，室温下共孵育1h，孵育完成后PBS冲洗3次以洗掉未捕获在基底上的细胞。
2、染色。
使用Hoechst染料对捕获在两种基底上的细胞进行30min染色，染色完成后用PBS冲洗 3次洗掉多余的染料。将染色完成后的细胞置于荧光显微镜下观察并且拍照记录细胞密度。
3、释放循环肿瘤细胞。
通过分别对捕获有细胞的Si和GIC基底进行NIR照射，验证GIC基底的细胞释放效果。
具体操作如下：将捕获到细胞的2种基底分别置于NIR照射下，所述NIR的波长为808nm，光照强度为0.9W/cm2，通过5min的照射后用PBS清洗表面以防止释放的细胞贴附。然后将基底置于荧光显微镜下观察。
4、结果分析。
NIR照射前后细胞分布密度情况如图5所示。
结果显示：NIR照射前后两种基底细胞保留情况进行比对发现，具有明胶涂层的Si衬底在NIR照射后，荧光视野细胞数目未发生明显变化，而覆盖有明胶涂层的GIC基底在NIR照射过后，荧光视野下细胞数量急剧减少，几乎看不见细胞存在，这说明在NIR照射下GIC基底吸光升温使得明胶融化导致了细胞被大量释放。而Si衬底在NIR照射前后视野内细胞密度未发生太大变化，说明细胞没有被释放。这里直接证明了捕获在修饰适配体的涂覆有明胶的GIC基底上的细胞可以在NIR照射后被释放。
实施例4
一种石墨烯嵌层式碳膜材料在肿瘤细胞检测分析中的应用。
1、捕获循环肿瘤细胞。
在修饰适配体GRO的具有明胶涂层的GIC基底上添加1ml浓度为105/ml的MCF-7细胞，室温下孵育1h，孵育完成后用PBS冲洗3次。
2、染色。
使用Hoechst染色30min，染色完成后用PBS冲洗3次。
3、局部释放循环肿瘤细胞。
基于实施例3的结果，本发明人决定采用掩模版进行捕获细胞的局部释放实验，掩膜板是常见的菲林掩模版，由透光部分和不透光部分组成，近红外光只能由未遮挡区域透过。
具体操作如下：
限定光照区域：选取透光部分长为边长3mm的正方形的掩膜板，近红外光透过透光区域形成一个相同尺寸的正方形光斑，光斑正对基底中央区域；
照射：持续照射5min，所述NIR的波长为808nm，光照强度为0.9W/cm2。
冲洗：照射结束后，PBS冲洗以防止释放的细胞贴附在基底上。接着在荧光倒置显微镜下观察。
4、结果分析。
由于受显微镜视野范围的限制，取照射光斑边界上的部分区域和基底上未受到NIR照射区域进行观察计数。局部释放结果如图6所示，其中图6的左侧为NIR照射前后的流程图，其中，图6中的(a1)展示的是遮光部分，图上所示GIC基底上仍剩余大量细胞，这说明细胞未被释放。图6中的(a2)展示的是遮光区与透过区交界处细胞的剩余情况，荧光视野下可以观察到红色虚线左侧透光区域内细胞几乎不可见，而在另一侧的遮光区域开始由大量的细胞分布，这是由于NIR照射使得透光区域GIC基底升温造成明胶融化从而使得细胞被释放，而在遮光区域由于不受NIR影响，从而未使该区域的明胶被加热溶解。这说明在可控光斑的NIR照射下可以选择性地释放目标区域细胞。这也意味着了基于本实施例的技术方案对循环肿瘤细胞的进行选择性释放是可行的。
此外，本发明人对铺有明胶的Si衬底和GIC基底修饰上适配体GRO进行多次的释放实验，经统计计算，释放效率如图7所示，结果显示，本实施例的GIC基底对于细胞的释放效率可以达到93％，而不具备加热功能的Si衬底释放效率只能达到14％。
实施例5
释放后循环肿瘤细胞的细胞活性验证。
回收实施例3、4释放的循环肿瘤细胞，通过Hoechst/PI染色和细胞再培养实验鉴定释放后细胞活性。
结果如图8所示，大多数释放的细胞可以被染成蓝色，几乎没有细胞被染成红色。由于细胞核都会被Hoechst染成蓝色，用以区分是否是细胞，而只有死细胞才能使PI透过细胞膜将细胞核染成红色，由此可见刚释放下来的细胞具有非常高细胞活性，几乎没有细胞死亡。为了进一步检测释放细胞的活性，本实施例还检测了在培养皿中重新培养的释放细胞的增殖情况。在不同时间点(6，12，24，48h)记录细胞密度。结果如图9所示，再培养的细胞增殖良好。这些实验足以证明本发明的方法可以在保持高细胞活力的情况下释放细胞。
实施例1-5的结果显示：本发明采用修饰有适配体GRO的石墨烯嵌入式碳膜(GIC)作为捕获细胞的基底，GIC提供的粗糙表面以及修饰上的适配体GRO，使本发明的石墨烯嵌层式碳膜基底可以高效地特异捕获循环肿瘤细胞。此外，由于基底上石墨烯在NIR照射下可以快速升温并融化明胶从而释放细胞，因此通过控制NIR光斑的大小和在GIC基底上的照射位置可以实现细胞的局部释放。同时，明胶具有良好的生物相容性，短时间的近红外光照射具有低的光毒性，且释放过程中无需引入酶或者其他试剂，可以实现无损地释放细胞。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种石墨烯嵌层式碳膜材料在肿瘤细胞检测分析中的非诊断目的的应用，其特征在于，包括以下步骤：首先采用石墨烯嵌层式碳膜基底捕获和释放肿瘤细胞，再对该肿瘤细胞进行分析；所述石墨烯嵌层式碳膜基底包括：石墨烯嵌层式碳膜、明胶和适配体；
所述石墨烯嵌层式碳膜基底的制备方法包括以下步骤：
制备石墨烯嵌层式碳膜：采用ECR等离子溅射系统，通过低能电子辐照在p型<100>的硅衬底上沉积石墨烯嵌层式碳膜，即得；
涂覆明胶：在沉积了石墨烯嵌层式碳膜的硅衬底上涂覆明胶；
修饰适配体：在涂覆了明胶的硅衬底上修饰适配体；
所述捕获通过以下方法实现：将所述石墨烯嵌层式碳膜基底和肿瘤细胞共同孵育；
所述释放通过以下方法实现：
限定光照区域：通过掩模版控制石墨烯嵌层式碳膜基底的光照区域的大小和位置；
照射：采用近红外光照射，使石墨烯嵌层式碳膜基底释放肿瘤细胞；所述近红外光照射的时间为5-10min，波长为750-850nm，强度为0.5-1.5W/cm2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞的细胞浓度为0.8×105个/ml-1.2×105个/ml。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述孵育的温度为20℃-27℃，所述孵育的时间为0.8-1.2h。
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