CN114195821B - 一种心磷脂衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种心磷脂含有羧基衍生物的制备方法，以心磷脂为原料，将心磷脂化合物溶于无水叔丁醇中，依次加入K2CO3，NaIO4和KMnO4，室温搅拌一段时间；补加KMnO4，再反应一段时间，加入偏二亚硫酸钠，H2SO4和10mL水，室温搅拌一段时间；用乙酸乙酯和水进行萃取，有机相加无水硫酸钠干燥，过层析柱纯化。本发明提供的心磷脂含有羧基衍生物具备较佳的特异性和精确性，同时表现出良好的梯度，作为抗原的反应效果好，具有较高的经济价值。本发明还提供了一种心磷脂衍生物及其应用。
Description
技术领域
本发明属于心磷脂技术领域，尤其涉及一种心磷脂衍生物及其制备方法和应用。
新型心磷脂一种磷脂，亦称双磷脂酰甘油，是潘伯恩1941年从新鲜的牛心肌中分离出来的，新型心磷脂广泛存在于植物、微生物、高等动物界，新型心磷脂主要存在于动物细胞中线粒体的内膜，15%的新型心磷脂存在心肌。
自身免疫性疾病是非常多样化和丰富的，它们的一般特征是产生针对自身生物分子和组织的抗体，自身免疫性疾病的病因尚不完全清楚；然而，一些疾病的特征是早期产生针对细胞磷脂和磷脂蛋白结合的自身免疫抗体。目前研究的只有针对自身生物分子和组织的抗体，但针对细胞磷脂和磷脂蛋白结合的自身免疫抗体也可能成为抗磷脂抗体综合征(anti - phospholipantibody syndrome, APS)和系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus, SLE)等自身免疫性疾病诊断和监测的有价值的生物标志物。多项报告证实，对磷脂蛋白复合物的自身抗体具有很高的临床相关性，但对单独的磷脂没有相关性，这是由于自身抗体不识别磷脂本身，而是识别磷脂与大量血浆蛋白的复合物；例如，针对磷脂、新型心磷脂和磷酸乙醇胺与β2-糖蛋白I(β2GPI)和凝血酶原的非共价复合物产生的自身抗体；这些自身抗体是APS的标志，在SLE和自身免疫性神经系统疾病患者中也可以观察到，如果不及早诊断和治疗，这些情况可能导致严重的健康并发症，甚至死亡。
多项报告证实磷脂蛋白复合物的生物活性及其在自身免疫中的作用，然而，大多数诊断分析分别应用脂质和相应的蛋白质，因为合成具有明确结构和纯度的共轭物以前是无法实现的。此外，磷脂自身抗体结合对孵育温度和光照等检测条件高度敏感，这些因素可能导致测定的重复性较低，且结果与疾病的临床表现相关性较弱；应用脂质和蛋白质作为单独的抗原是由于以前无法实现的合成结合物的明确的结构和纯度。
事实上，蛋白质的脂化是一个具有挑战性的化学过程，可能会导致低产量和产品纯度不足。生物偶联的最新进展，包括铜催化叠氮化物-炔环加成或CuAAC点击化学的发展，为利用合成生物分子创造此类试剂提供了令人兴奋的机会。与天然类似物相比，合成抗原的优点是化学和生物稳定性高，纯度高，生物偶联产物的化学结构明确。
现有技术报道了CuAAC方法在合成凝血酶原和β2GPI磷酸乙醇胺缀合物方面的高效率。然而，将氧化的新型心磷脂与相同的蛋白质结合，会导致产物的低产量和低生物活性；显然，新型心磷脂的制备需要优化。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种心磷脂衍生物及其制备方法和应用，本发明中的心磷脂衍生物用于TP-非特异性抗体检测试剂盒时具有更高的特异性和精确性，同时表现出良好的梯度。
本发明提供了一种心磷脂衍生物，具有式I结构：
式I。
本发明提供了一种心磷脂衍生物的制备方法，包括：
将心磷脂、K2CO3、NaIO4和KMnO4在溶剂中进行第一反应，得到反应产物；
将所述反应产物和偏二亚硫酸钠、H2SO4在水中进行第二反应，得到心磷脂衍生物。
优选的，所述第一反应完成后还包括：
将得到的反应产物和补加的KMnO4进行反应。
优选的，所述心磷脂和补加的KMnO4的摩尔比为1：（0.3~0.8）。
优选的，所述溶剂选自叔丁醇、甲醇、二甲亚砜、四氢呋喃和乙醇中的一种或几种。
优选的，所述心磷脂、K2CO3、NaIO4和KMnO4的摩尔比为1：（1.1~1.5）：（1.1~1.5）：（1.1~1.5）。
优选的，所述心磷脂、偏二亚硫酸钠和H2SO4的摩尔比为1：（0.3~0.5）：（0.3~0.5）。
优选的，所述第一反应的温度为20~40℃；
所述第二反应的温度为20~40℃。
本发明提供了一种上述技术方案所述的心磷脂衍生物或上述技术方案所述的方法制备的心磷脂衍生物在制备TP抗体检测试剂中的应用。
本发明提供了一种上述技术方案所述的心磷脂衍生物或上述技术方案所述的方法制备的心磷脂衍生物在制备试剂盒中的应用。
本发明提供的方法制备心磷脂含有羧基的衍生物可达到95%以上的收率，产物纯度达到98%以上，整个方法合成路线短、时间少，操作简单，构型单一。
本发明提供了一种心磷脂含有羧基的衍生物，能够作为TP-非特异性抗体检测试剂盒原料，制备过程简单，作为抗原的反应效果好，具备较佳的特异性和精确性，同时表现出良好的梯度；本发明提出一种心磷脂衍生物在TP-非特异性抗体检测试剂盒的应用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种心磷脂衍生物，具有式I结构：
式I。
在本发明中，所述式I中未给出的端基为甲基。
本发明提供了一种心磷脂衍生物的制备方法，包括：
将心磷脂、K2CO3、NaIO4和KMnO4在溶剂中进行第一反应，得到反应产物；
将所述反应产物和偏二亚硫酸钠、H2SO4在水中进行第二反应，得到心磷脂衍生物。
在本发明中，所述心磷脂的结构式如式II所示：
式II。
在本发明中，所述式II中未给出的端基为甲基。
在本发明中，所述心磷脂可由市场购买获得，如采用Sigma提供的产品。
在本发明中，所述溶剂对反应底物心磷脂具有较好溶解性，优选选自叔丁醇、甲醇、二甲亚砜、四氢呋喃和乙醇中的一种或几种。
在本发明中，为提高心磷脂的转化率和反应效率，所述第一反应过程中的心磷脂、K2CO3、NaIO4和KMnO4的摩尔比优选为1：（1.1~1.5）：（1.1~1.5）：（1.1~1.5），更优选为1：（1.2~1.4）：（1.2~1.4）：（1.2~1.4），最优选为1：1.3：1.3：1.3。
在本发明中，所述溶剂的用量比例优选为心磷脂（nmol）：溶剂（ml）优选为1:（20~100），更优选为1:（30~90），更优选为1:（40~80），更优选为1:（50~70），最优选为1:60。
在本发明中，所述第一反应的温度优选为20~40℃，更优选为25~35℃，最优选为25~30℃；所述第一反应的时间优选为10~30小时，更优选为15~25小时，最优选为15~20小时。
在本发明中，所述第一反应完成后为使心磷脂尽可能完全转化，优选还包括：
将得到的反应产物与补加的KMnO4进行反应。
在本发明中，所述心磷脂和补加的KMnO4的摩尔比优选为1：（0.3~0.8），更优选为1：（0.4~0.6），最优选为1：0.5。
在本发明中，所述反应的温度优选为20~40℃，更优选为25~35℃，最优选为25~30℃；所述反应的时间优选为6~10小时，更优选为7~9小时，最优选为8小时。
在本发明中，为除掉多余的高锰酸钾，所述第二反应过程中心磷脂、偏二亚硫酸钠和H2SO4的摩尔比优选为1：（0.3~0.5）：（0.3~0.5），更优选为1：（0.35~0.45）：（0.35~0.45），最优选为1：0.4：0.4。
在本发明中，所述水的用量比例优选为心磷脂（nmol）：水（ml）优选为1:（5~50），更优选为1:（10~40），更优选为1:（20~30），最优选为1:25。
在本发明中，所述第二反应的温度优选为20~40℃，更优选为25~35℃，最优选为25~30℃；所述第二反应的时间优选为40~60min，更优选为40~55min，更优选为40~50min，最优选为40~45min。
在本发明中，所述心磷脂衍生物的制备方法过程中发生的反应为氧化还原反应：
。
在本发明中，所述第二反应完成后优选还包括：
将得到的反应产物进行萃取、干燥和纯化，得到心磷脂衍生物。
在本发明中，所述萃取的试剂优选包括：乙酸乙酯和水。
在本发明中，所述干燥优选将萃取后的有机相进行干燥；所述干燥优选为无水硫酸钠干燥。
在本发明中，所述纯化优选为过层柱纯化。
在本发明中，所述过层柱纯化过程中的洗脱剂优选包括：
石油醚（PE）、乙酸乙酯（EA）和甲醇（MeOH）。
在本发明中，所述石油醚、乙酸乙酯和甲醇的体积比优选为1:1:0.2。
在本发明中，所纯化后得到的心磷脂衍生物的纯度优选≥95%。
本发明提供了一种上述技术方案所述的心磷脂衍生物或上述技术方案所述的方法制备的心磷脂衍生物在制备TP抗体检测试剂中的应用。
本发明提供了一种TP抗体检测试剂，包括：上述技术方案所述的心磷脂衍生物包被的磁珠；或上述技术方案所述的方法制备的心磷脂衍生物包被的磁珠。
本发明提供了一种上述技术方案所述的心磷脂衍生物或上述技术方案所述的方法制备的心磷脂衍生物在制备试剂盒中的应用。
在本发明中，所述试剂盒优选为梅毒螺旋体抗体（treponema pallidumantibody,TP）的检测试剂盒。本发明所述的试剂盒可用于梅毒感染的诊断。
本发明提供了一种试剂盒，包括：上述技术方案所述的心磷脂衍生物包被的磁珠；或上述技术方案所述的方法制备的心磷脂衍生物包被的磁珠。
在本发明中，所述试剂盒的制备方法优选包括：
将羧基磁性纳米微粒、EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）溶液和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）溶液进行第一反应，得到第一反应产物；
将所述第一反应产物、心磷脂衍生物溶液和缓冲液进行第二反应，得到第二反应产物；
将所述第二反应产物和封保液混合。
在本发明中，所述羧基磁性纳米微粒的浓度优选为80~120mg/ml，更优选为90~110mg/ml，最优选为100mg/ml；所述羧基磁性纳米微粒可由市场购买获得，如可采用默克厂家提供的产品。
在本发明中，优选对所述羧基磁性纳米微粒进行清洗后在用于制备试剂盒；所述清洗优选采用缓冲液，更优选采用PBS缓冲液；所述清洗后优选去除上清液；所述清洗的次数优选为2~4次，更优选为3次。在本发明中，所述清洗过程中羧基磁性纳米微粒和缓冲液的体积比优选为（20~40）：（250~350），更优选为（25~35）：（280~320），最优选为30：300。
在本发明中，所述EDC溶液中的溶剂优选为PBS缓冲液；所述EDC溶液的浓度优选为15~25mg/ml，更优选为18~22mg/ml，最优选为20mg/ml。
在本发明中，所述NHS溶液中的溶剂优选为PBS缓冲液；所述NHS溶液的浓度优选为15~25mg/ml，更优选为18~22mg/ml，最优选为20mg/ml。
在本发明中，所述磁性纳米微粒、EDC溶液和NHS溶液的体积比优选为（20~40）：（40~60）：（40~60），更优选为（25~35）：（45~55）：（45~55），最优选为30：50：50。
在本发明中，所述第一反应优选为震荡反应；所述第一反应的时间优选为0.3~0.7小时，更优选为0.4~0.6小时，最优选为0.5小时。
在本发明中，所述第一反应完成后优选去除上清，得到第一反应产物。
在本发明中，所述心磷脂衍生物溶液中的心磷脂衍生物与上述技术方案一致，在此不再赘述；所述心磷脂衍生物溶液中的溶剂优选为水，更优选为纯化水；所述心磷脂衍生物溶液的浓度优选为10~20mg/ml，更优选为13~18mg/ml，最优选为15mg/ml。
在本发明中，所述第二反应过程中的缓冲液优选为PBS缓冲液。
在本发明中，所述羧基磁性纳米微粒、心磷脂衍生物溶液和缓冲液的体积比优选为（20~40）：（10~20）：（80~90），更优选为（25~35）：（13~17）：（83~87），最优选为30：15：85。
在本发明中，所述第二反应优选进行震荡；所述第二反应的时间优选为1~3小时，更优选为1.5~2.5小时，最优选为2小时。
在本发明中，所述第二反应完成后优选还包括：
去除上清，得到第二反应产物。
在本发明中，所述封保液优选包括：
PBS缓冲液、牛血清白蛋白、吐温-20和叠氮化钠。
在本发明中，所述PBS缓冲液、牛血清白蛋白、吐温-20和叠氮化钠的用量比例优选为1000mL:（9.8~10.2）g: （0.98~1.02）mL: （0.98~1.02）mL，更优选为1000mL:10g: 1mL:1mL。
在本发明中，所述心磷脂衍生物溶液和封保液的体积比优选为（10~20）μl：（2~4）ml，更优选为（13~17）μl：（2.5~3.5）ml，最优选为15μl：3ml。
在本发明中，所述混合优选为震荡混匀。
本发明提供的方法制备心磷脂含有羧基的衍生物可达到95%以上的收率，产物纯度达到98%以上，整个方法合成路线短、时间少，操作简单，构型单一。本发明提供的心磷脂含有羧基的衍生物，能够作为TP-非特异性抗体检测试剂盒的制备原料，制备过程简单，制备的心磷脂衍生物作为抗原的反应效果好，具备较佳的特异性和精确性，同时表现出良好的梯度。
实施例1
在50mL的锥形瓶中加入无水叔丁醇（30ml），将1nmol心磷脂化合物（Sigma提供，式II结构）融入其中，依次加入K2CO3（1.3nmol），NaIO4（1.3nmol）和KMnO4（1.3nmol），室温搅拌16h；补加KMnO4（0.5nmol），再反应8h，加入偏二亚硫酸钠（0.4nmol），H2SO4（0.4nmol）和10mL水，室温搅拌40min；用乙酸乙酯和水进行萃取，萃取三次（乙酸乙酯：水=50ml：50ml）；将得到的产物通过层析柱进行纯化，（洗脱剂PE:EA:MeOH=1:1:0.2），得到心磷脂衍生物，收率96%，通过高效液相质谱，仅发现一根单峰，分子量为1156.1243。
实施例2
将羧基磁性纳米微粒（30μl，100mg/ml，默克厂家）用PBS缓冲液（300μl）清洗后去除上清液，如此重复三次，加入50μl EDC溶液（20mg/ml，PBS缓冲液做溶剂）和50μl NHS溶液（20mg/ml，PBS缓冲液做溶剂），震荡反应0.5h，去除上清，向其中加入15μl的实施例1制备的心磷脂衍生物溶液（15mg/ml，纯化水为溶剂）和85μl的PBS缓冲液，震荡，反应2h，去上清，向其中加入3ml封保液，震荡混匀，得到试剂盒；
所述封保液包括：PBS缓冲液、牛血清白蛋白、吐温-20和叠氮化钠，用量比为1000mL:10g: 1mL: 1mL。
性能检测
梯度测试
用阴性血清稀释抗心磷脂抗体IgG阳性样本，配制浓度为0、10、30、80、120、150pg/ml 的6个校准品；将上述配制好的人造血清作为校准品进行ELISA实验进行梯度测试，检测结果如表1所示。
表1 梯度测试结果
由表1可知，实施例2制备的心磷脂衍生物所配制的试剂盒的校准品的梯度T0/T1，T0/T5值均高于市售商品试剂盒（郑州安图生物工程股份有限公司提供的TP非特异性抗体检测试剂盒）。
精密度测试
取浓度为30pg/ml，120pg/ml的两个血清标准样品，分别用市售商品（郑州安图生物工程股份有限公司提供的TP非特异性抗体检测试剂盒）与实施例2制备的心磷脂衍生物制备的试剂盒重复测定这两个样品25次，统计异常数的百分比，结果见表2。
表2 精密度检测结果
结果表明：采用实施例1制备的心磷脂衍生物的精密度均低于5%，且低于市售商品，尤其在低值区，明显改善精密性。
临床样本检测
分别用市售商品（郑州安图生物工程股份有限公司提供的TP非特异性抗体检测试剂盒）、实施例2制备的心磷脂衍生物制备的化学发光免疫分析试剂盒对500份临床血清样本进行测试，并测两次复孔，与高效液相所测试的结果进行对比，结果见表3。
表3 临床样本检测结果
结果表明：市售商品与高效液相的相关性R2=0.9312，明显低于实施例2所制备试剂盒与高效液相的R2；并且实施例2所制备的试剂盒对跳值、异常样本有很大改善。
稳定性试验
将市售商品（郑州安图生物工程股份有限公司提供的TP非特异性抗体检测试剂盒）、实施例2所制备的化学发光免疫分析试剂盒放置37℃环境下，分别做0、5、7和10天的考核，统计各时间点，ELISA实验发光值的测试结果，相对于0天的降幅百分比，升降幅较小说明试剂盒较为稳定，结果见表4。
表4 稳定性试验检测结果
结果表明，实施例2所制备的化学发光免疫分析试剂盒加速稳定性较在产试剂盒偏好。
本发明提供的方法制备心磷脂含有羧基的衍生物可达到95%以上的收率，产物纯度达到98%以上，整个方法合成路线短、时间少，操作简单，构型单一。本发明提供的心磷脂含有羧基的衍生物，能够作为TP-非特异性抗体检测试剂盒制备原料，制备过程简单，作为抗原的反应效果好，具备较佳的特异性和精确性，同时表现出良好的梯度。
虽然已参考本发明的特定实施例描述并说明本发明，但是这些描述和说明并不限制本发明。所属领域的技术人员可清晰地理解，在不脱离如由所附权利要求书定义的本发明的真实精神和范围的情况下，可进行各种改变，以使特定情形、材料、物质组成、物质、方法或过程适宜于本申请的目标、精神和范围。所有此类修改都意图在此所附权利要求书的范围内。虽然已参考按特定次序执行的特定操作描述本文中所公开的方法，但应理解，可在不脱离本发明的教示的情况下组合、细分或重新排序这些操作以形成等效方法。因此，除非本文中特别指示，否则操作的次序和分组并非本申请的限制。
Claims (2)
1.一种心磷脂衍生物的制备方法，包括：
将心磷脂、K2CO3、NaIO4和KMnO4在溶剂中进行第一反应，得到反应产物；
所述心磷脂、K2CO3、NaIO4和KMnO4的摩尔比为1：（1.1~1.5）：（1.1~1.5）：（1.1~1.5）；
将所述反应产物和偏二亚硫酸钠、H2SO4在水中进行第二反应，得到心磷脂衍生物；
所述心磷脂的结构式如式II所示：
式II；
所述心磷脂衍生物具有式I结构：
式I；
所述第一反应完成后还包括：将得到的反应产物和补加的KMnO4进行反应；
所述心磷脂和补加的KMnO4的摩尔比为1：（0.3~0.8）；
所述心磷脂、偏二亚硫酸钠和H2SO4的摩尔比为1：（0.3~0.5）：（0.3~0.5）；
所述第一反应的温度为20~40℃；
所述第二反应的温度为20~40℃。
2.根据权利要求1所述的心磷脂衍生物的制备方法，其特征在于，所述溶剂选自叔丁醇、甲醇、二甲亚砜、四氢呋喃和乙醇中的一种或几种。
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