CN114191390A

CN114191390A - 一种基于响应面法优化的氟比洛芬酯长循环脂微球及其制备工艺和应用

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Publication number: CN114191390A
Application number: CN202111551017.2A
Authority: CN
Inventors: 钟志容; 卞铁荣; 刘中兵; 林燕; 陈振宇; 万钰洁; 杜兴杰; 柏孝生; 张子君
Original assignee: Southwest Medical University
Current assignee: Southwest Medical University
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2022-03-18

Abstract

本发明公开了一种基于响应面法优化的氟比洛芬酯长循环脂微球FA‑SLM及其制备工艺和应用，属于医药技术领域。本发明先采用单因素实验初筛出对FA‑SLM影响最显著的因素，再利用DesignExpert8.0软件进行中心组合设计，优化处方及工艺条件。最优处方和工艺条件具体如下：大豆油占比(X₁)＝11.11％，卵磷脂占比(X₂)＝1.29％，均质压力(X₃)＝104.84Mpa。为了使药物在体内的稳定性更好，发挥更长时间的作用，本发明利用聚乙二醇衍生化磷脂制备FA‑SLM，制剂表面因有一层“隐形”外衣而不被RES所识别；同时磷脂可以给制剂提供亲水性长链，显著改变药物的药物代谢动力学特征，增强EPR效应。本发明FA‑SLM可用于制备治疗类风湿性关节炎的药物和/或镇痛药物，其在体内能达到长循环目的，药物毒性小。

Description

一种基于响应面法优化的氟比洛芬酯长循环脂微球及其制备工艺和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于响应面法优化的氟比洛芬酯长循环脂微球及其制备工艺和应用。

背景技术

非甾体类抗炎药(non-steroid anti-inflammatory drug,NSAIDs)在临床上使用已经超过一百多年，并且到目前为止，临床上对这类药物的使用已经越来越广泛，如早期的类风湿性关节炎，强直性脊柱炎，以及术后镇痛等。据不完全统计，全球每天大约有3000万人服用NSAIDs，在中国约占门诊总数的1/3～1/4的人用它来缓解各种原因引发的急慢性疼痛。又因为疼痛往往伴随着发炎的症状，常用的阿片类镇痛药物没有抗炎的药效，并且长期使用会伴有成瘾性，所以NSAIDs无疑成为发炎，疼痛症状的首选药物。

氟比洛芬是一类NSAIDs，具有非常明显的镇痛抗炎的作用，其抗炎作用是阿司匹林的250倍，镇痛作用是阿司匹林的50倍，抗炎和镇痛作用强于布洛芬，且毒性更低。由于NSAIDs口服大多都具有胃肠道毒性，会引起胃肠道的不良反应，并且氟比洛芬的钠盐用于静脉注射会产生剧烈疼痛，因此导致了临床上使用的不便。而氟比洛芬酯(flurbiprofenaxetil，FA)为氟比洛芬的前体药物，为非甾体类抗炎新药，在体内可被血中的血脂酶及同工酶迅速水解成活性物质氟比洛芬，在炎症部位抑制环氧合酶而减少前列腺素的合成达到抗炎镇痛的作用。

氟比洛芬酯可制备成脂质微球制剂用于临床的静脉注射。1992年，科研制药株式会社生产的氟比洛芬酯注射液(脂微球)首先在日本上市(商品名：

)，氟比洛芬酯注射液用于术后镇痛药效更强，起效迅速，没有中枢抑制作用，不易引起胃粘膜损伤等不良反应，不影响处于麻醉状态患者的苏醒，可在术后立即使用。北京泰德制药股份有限公司生产的氟比洛芬酯注射液自2004年在中国上市以来，销售数量及金额持续增长，2017年销售额达15.7亿人民币。市场前景较好(预计约30亿销售额)，国内目前只有北京泰德和武汉大安两家上市，市场发展潜力较大。

脂微球(Lipid microsphere,LM)作为一种纳米制剂，其自身的稳定性对治疗效果存在较大的影响。这就需要对目前的制剂处方进行优化，优化配方的传统方法被认为是费时费力的，并且总是找不到最佳配方。并且，作为一种静脉注射的制剂，脂微球在体内的稳定性也是需要考究的重点，目前已有研究发现，亲脂性的载体会优先被网状内皮系统(reticuloendothelial system,RES)所捕获，然后迅速被体循环所清除，导致无法在作用部位聚集。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题或缺陷，本发明的目的在于提供一种基于响应面法优化的氟比洛芬酯长循环脂微球及其制备工艺和应用，解决或至少部分解决现有技术中存在的上述技术缺陷。

为了实现本发明的上述其中一个目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于响应面法优化的氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM的制备工艺，具体包括如下步骤：

(1)以泊洛沙姆占比、大豆油占比、卵磷脂占比、初乳剪切时间、均质次数、均质压力为变量进行单因素实验，用于筛选出影响FA-SLM包封率的因素和水平范围；

(2)根据单因素筛选实验结果，选择3个对包封率影响较为显著的因素作为考察对象，即大豆油占比(X₁)、卵磷脂占比(X₂)、均质压力(X₃)为自变量，以FA-SLM的平均粒径(Y₁)和包封率(Y₂)为因变量(响应值)进行中心组合实验设计；

(3)采用软件Design Expert对步骤(2)所得实验结果进行多元线性回归和多项式拟合，得到方差分析结果和各指标的二阶多项式拟合方程；

(4)根据各指标的拟合方程，固定其中一个因素的水平不变，使用软件DesignExpert，分别绘制出各考察指标与另外两个实验因素的三维响应曲面关系图；根据拟合方程和响应曲面关系图，确定制备FA-SLM的最优处方和工艺条件。

进一步地，上述技术方案，步骤(1)的实验方法如下：

精密称取优化处方量FA原料药，适量DSPE-PEG₂₀₀₀，控制大豆油的用量，混合加热至65℃，恒温磁力搅拌使其充分溶解，得油相；称取处方量甘油，控制卵磷脂用量，磷酸氢二钠，控制泊洛沙姆用量，油酸钠适量(0～0.2％)，分散于注射用水中，65℃恒温水浴，得水相；将油相缓慢加入到水相中，高剪切制备初乳，控制剪切时间；冰水浴将所得初乳降至室温，高压均质得终乳，控制均质次数和均质压力；调节pH，即得FA-SLM，利用HPLC法对FA-SLM进行分析，进而计算出FA-SLM包封率。

具体地，上述技术方案，步骤(1)中所述泊洛沙姆占比是指泊洛沙姆的质量与注射用水的体积百分比；所述大豆油占比是指大豆油的质量与注射用水的体积百分比；所述卵磷脂占比是指卵磷脂的质量与注射用水的体积百分比；其中：所述质量与体积是以g和mL作为基准的。

进一步地，上述技术方案，步骤(1)中各因素的水平范围：泊洛沙姆占比为0.1～0.3％；大豆油占比为5～15％；卵磷脂占比为0.5～2％；初乳剪切时间为4～8min；均质次数为4～8次；均质压力为80～120MPa。

进一步地，上述技术方案，步骤(3)中所述二阶多项式拟合方程如下：

Y₁＝236.77-17.99X₁+7.71X₂-12.33X₃+1.43X₁X₂+0.54X₁X₃+2.72X₂X₃+22.07X₁ ²+22.68X₂ ²+16.83X₃ ²；

Y₂＝95.77+2.60X₁+3.80X₂+1.32X₃-2.17X₁X₂-1.12X₁X₃+1.10X₂X₃-3.44X₁ ²-5.24X₂ ²-2.75X₃ ²；

其中：X₁为大豆油占比，X₂为卵磷脂占比，X₃为均质压力。

进一步地，上述技术方案，步骤(4)中，所述制备FA-SLM的最优处方和工艺条件具体如下：大豆油占比(X₁)＝11.11％，卵磷脂占比(X₂)＝1.29％，均质压力(X₃)＝104.84Mpa。

本发明的第二个目的在于提供采用上述所述方法制备得到的氟比洛芬酯长循环脂微球。

本发明的第三个目的在于提供采用上述所述方法制备的氟比洛芬酯长循环脂微球在制备治疗类风湿性关节炎药物和/或镇痛药物中的应用。

一种治疗类风湿性关节炎的药物，所述药物包括上述所述方法制备得到的氟比洛芬酯长循环脂微球。

一种镇痛药物，所述药物包括上述所述方法制备得到的氟比洛芬酯长循环脂微球。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

相比于传统的正交实验，响应面方法(response surface methodology,RSM)是一个统计和数学方法的集合，RSM的主要目的是优化各工艺参数影响下的响应面，量化了可控输入参数与得到的响应面之间的关系，以达到制剂的最佳处方。就体外稳定性的研究，本发明拟通过中心组合设计来得到稳定性及其它条件最佳的处方。

并且，为了使药物在体内的稳定性更好，发挥更长时间的作用，本发明利用聚乙二醇衍生化磷脂制备PEG修饰的长循环脂微球(Stealth lipid microsphere LM，即SLM)，SLM载运氟比洛芬酯后(FA-SLM)，制剂表面因有一层“隐形”外衣而不被RES所识别；同时，磷脂可以给制剂提供亲水性长链，显著改变药物的药物代谢动力学特征，增强EPR效应。

本发明在处方中增加了DSPE-PEG₂₀₀₀，对传统脂微球制剂进行改造修饰，在药物载体表面加上聚合物“隐身”外衣，从而有效减少药物和血液成分点相互作用，降低检疫系统对药物的识别。相比于传统氟比洛芬酯脂微球注射液中使用的F-68，本发明使用的聚乙二醇(PEG)是在药物传递领域中应用最多的一种“隐身”聚合物，PEG在很早以前就被FDA收录进入GRAS(Generally Regarded as Safe)数据库，其安全性已得到公认。

综上所述，本发明利用RSM筛选出稳定性及包封率最佳的脂微球处方，用PEG对制剂表面进行修饰增强其体内稳定性，以此达到增加药物疗效，减小药物毒性，减少给药剂量的目的。本发明的侧重点在于：PEG对于氟比洛芬酯脂微球表面进行修饰，使之在体内能达到长循环目的，从而减少药物毒性。

附图说明

图1为实施例1中的六种因素对制剂的影响结果考察表；其中：泊洛沙姆占比(A)、大豆油占比(B)、卵磷脂占比(C)、剪切时间(D)、均质次数(E)、均质压力(F)；P代表具有统计学差异(**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001)；

图2为X₁，X₂，X₃交互作用的响应曲面和等高线图；其中：A-C为X₁，X₂，X₃交互作用对平均粒径影响的响应曲面和等高线图；D-F为X₁，X₂，X₃交互作用对包封率影响的响应曲面和等高线图；

图3为脂微球粒径分布及透射电镜图；其中：A依次为LM、SLM、FA-SLM的粒径分布图；B依次为LM、SLM、FA-SLM的透射电镜图；

图4为不同制剂对溶血率的影响对比图；

图5为细胞毒性结果对比图；

图6为RAW264.7的细胞摄取结果图；

图7为血浆中FA，FA-LM，Control-FA-LM和FA-SLM的药物代谢动力学曲线对比图；

图8为各组制剂不同时间点在健康大鼠(A)和CIA模型大鼠(B)的组织分布对比图；

图9为健康大鼠和CIA造模大鼠的体内荧光成像对比图；

图10为不同制剂对于CIA模型大鼠的治疗效果对比图。

具体实施方式

下面通过实施案例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。

本发明下述实施例采用的DSPE-PEG₂₀₀₀来源于西安瑞禧生物科技有限公司。本发明中所采用的设备和原料等均可从市场购得，或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

以下各种制剂中：LM为未加入DSPE-PEG₂₀₀₀和原料药但其余成分及工艺与处方优化后的氟比洛芬酯长循环脂微球完全相同而制备的空白脂微球。

SLM为未加入原料药但其余成分及工艺与处方优化后的氟比洛芬酯长循环脂微球完全相同而制备的空白长循环脂微球。

Control-FA-LM为市售氟比洛芬酯脂微球。

FA-LM为未加入DSPE-PEG₂₀₀₀但其余成分及工艺与处方优化后的氟比洛芬酯长循环脂微球完全相同而制备的氟比洛芬脂微球。

FA-SLM为本专利所申请的氟比洛芬酯长循环脂微球。

FA-SLM药物传递系统的表征方法如下：

(1)粒径及分布、zeta电位考察

利用激光粒度分析仪测定SLM、LM、FA-SLM的粒径、Zeta电位及分布。

(2)目标递药系统的包封率、载药量测定

取2mL的制剂加入到超滤离心管中，以4000rpm离心30min，取下层滤液0.5mL，无水乙醇定容到5mL制备样品，另取0.5mL制剂加入无水乙醇定容至5mL，超声破乳5min制备样品，分别取样品20μL溶液进行HPLC分析。FA-SLM的包封率(Encapsulation efficiency,EE,％)由以下公式计算得出：EE(％)＝[1－(脂微球水相中FA含量/制剂中FA的总药量)]×100％。

FA-SLM中FA的载药量：取1mL制剂，加无水乙醇定容至5mL，超声破乳5min制备样品，吸取20μL溶液进行HPLC分析，计算出1mL制剂中FA的含量。

(3)形态学考察

利用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)分别观察SLM、LM、FA-SLM的表面形态。

FA-SLM药物传递系统体外实验研究

(1)溶血实验

取正常大鼠全血，在700×g的离心力下离心10min，再加入生理盐水混匀后重复上述步骤直至上清液变得澄清。弃去上清液后，余下的为积压的红细胞。然后取一滴红细胞和九滴生理盐水制备10％红细胞悬液，再取其中两滴，滴加八滴生理盐水，此时得到2％的红细胞悬液。分别制备5、60、240μg/mL三种浓度的FA、SLM、Control-FA-LM、FA-LM、FA-SLM。按一定比例混合制剂与红细胞悬液，水浴(37℃)3h后，700×g离心10min，于96孔板中加入离心后样品上清液100μL。设置生理盐水和UP水作为阴性和阳性对照。在540nm波长下用酶标仪检测吸光度，按下述公式计算溶血率(Hemolysis ratio,HR,％)。

HR％＝A sample-A negative control/A positive control-A negativecontrol

其中，A sample为样品，A negative control为生理盐水，A positive control为UP水。

(2)细胞毒性实验

分别在96孔板中接种100μL的RAW264.7细胞悬液(2×10⁴cells/mL)，转移至37℃，5％CO₂的培养箱进行培养，培养24h后，加入100μL不同浓度的药物(FA、LM、SLM、FA-LM、Control-FA-LM、FA-SLM)，使之终浓度为(5、20、60、120、240μg/mL)，每种浓度设置3个复孔。同时设置0加药组和空白培养基组。分别孵育24h、48h、72h后，吸取孔内溶液，用PBS洗涤3遍后，加入10μL MTT溶液和90μL培养液，再将培养板放入培养箱内培养4h，吸取板内溶液，每孔加入150μL DMSO，置于37℃的摇床振荡10min。在490nm处用酶标仪测定其吸光度。按下述公式计算其细胞活性。

细胞活性(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100％

A(加药)：具有细胞、药物溶液的孔的吸光度。

A(空白)：具有培养基和而没有细胞的孔的吸光度。

A(0加药)：具有细胞而没有药物溶液的孔的吸光度。

(3)细胞摄取实验

1)激光共聚焦

为了考察细胞对FA-LM、FA-SLM的摄取情况，用香豆素6绿色荧光探针对FA-LM、FA-SLM进行标记。

将生长状态良好并处于对数生长期的RAW264.7细胞悬液浓度调整为3×10⁵cells/mL，于24孔培养板放入爬片，每孔加入细胞1mL单细胞悬液，每孔细胞数约为3×10⁵个，设3个复孔，待细胞贴壁后(约2h)，在一半孔内加入LPS进行活化24h。24h后弃去原有培养液，用PBS冲洗3遍，再分别加入荧光标记的FA-LM、FA-SLM稀释液100μL和无血清无抗体的培养基900μL，置于培养箱培养2h，除去培养液，用PBS充分洗涤3次，然后加入4％多聚甲醛固定15min，弃去液体，再用PBS洗涤3次，然后用DAPI染色5min，再把染液吸除，用PBS清洗，取出细胞爬片，用50％甘油封片，利用激光共聚焦断层扫描技术观察细胞内荧光标记的的分布情况。

2)细胞流式

将处于对数生长期的RAW264.7细胞消化，计数，按照每孔1×10⁵cells接种于24孔板，并每孔加入1.5mL完全培养基，待细胞完全贴壁后(约2h)，需LPS刺激的组加入LPS储备液至培养体系终浓度为100ng/mL。24h后，吸除培养基，并用预热的PBS缓冲液清洗三遍，按分组加入不同荧光制剂(FA-LM和FA-SLM)100μL，每孔补加900μL的无血清无抗生素培养基，并设置不加荧光制剂的细胞组作为对照。细胞培养箱培养两小时后，吸除培养基，每孔加0.5mL胰酶消化细胞，1min后加入1mL PBS终止消化，收集细胞悬液，700×g离心4min后去除上清，并继续用PBS离心洗涤两次。用300μL PBS缓冲液重悬细胞后转至流式管进行检测。

FA-SLM药物传递系统体内实验研究

(1)大鼠佐剂型关节炎模型的建立及确认

1)大鼠关节炎模型的建立

健康雄性SD大鼠实验期自由进食，饮水，室内环境SPF级。适应饲养一周后于第0天，各大鼠尾根部皮下注射等体积的牛二型胶原蛋白与完全弗式佐剂(Complete Freund'sadjuvant,CFA)充分乳化后的乳剂，每只大鼠注射100μL。初次免疫后第7天，每只大鼠第二次注射等体积的牛二型胶原蛋白与不完全弗式佐剂(Incomplete Freund's adjuvant,IFA)充分乳化后的乳剂100μL。

2)大鼠关节炎的评价

有关关节炎实验动物研究的文献报道多数采用关节炎指数评定或用游标卡尺测量足拓部肿胀度作为评价关节炎症程度的依据，前者的评价标准为5级评分法：0分，无关节炎；1分，个别足趾发红、肿胀；2分，大部分足趾及足底肿胀；3分，踝关节及以下肿胀；4分肿胀累及踝关节以上且不能负重。每一只大鼠最终关节炎指数评分为四肢评分之和，最大分为16分。

(2)FA-SLM的药代动力学研究

取健康和造模的雄性SD大鼠各15只，分别随机分为5组(FA、FA-LM、FA-SLM、阳性对照)，每组3只。按1.0mg/kg(FA/体重)尾静脉注射给药。上述5组均于给药后5min，10min，30min，60min，120min，240min，480min和720min，心脏取血，全血于2500×g离心3min，取血浆按上述“生物样品预处理方法”处理后，取上清液进样，记录FA的色谱峰面积，计算各组药物浓度。采用Graphpad 6.01软件作曲线图。

运用DAS3.0统计软件计算FA、FA-LM、FA-SLM、阳性对照组静脉给药后血浆中时量曲线下面积AUC_0-t(mg/L*h)、药峰浓度C_max(mg/L)、半衰期T_1/2z(h)等药物代谢动力学参数。

(3)HPLC法考察药物组织分布

取健康和造模的雄性SD大鼠各45只，分别随机分5组(FA、FA-LM、FA-SLM、阳性对照)，每组3个时间点，每个时间点3只平行样大鼠。按1.0mg/kg(FA/体重)尾静脉注射给药。上述5组均于给药后10min，240min和480min将大鼠处死，立即分离心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏，关节组织，精确称重后，各加入两倍量的生理盐水匀浆，按上述“生物样品预处理方法”处理后，HPLC进样检测，记录FA的色谱峰面积，计算出各样品药物浓度。采用Graphpad6.01软件作柱状图。

(4)荧光标记法考察体内分布

1)活体成像法考察FA-LM和FA-SLM在大鼠上的分布

用DID红色荧光探针对FA-LM和FA-SLM进行标记，然后分别通过尾静脉注射给正常SD大鼠和CIA模型大鼠体内(5μgDID/只)，用实时荧光成像系统进行分析，并照相记录。观察在10min，240min和480min其在体内的荧光情况，并以游离DID在正常大鼠和CIA模型大鼠中的分布，以及空白正常大鼠和CIA模型大鼠作为对照。

2)利用离体器官考察FA-LM和FA-SLM在大鼠的分布

上述在体实验考察完毕后，立即心脏取血，处死大鼠，全血2500×g离心3min，取血浆于2mLEP管中备用。迅速分离出各组大鼠的心、肝、脾、肺和肾以及关节组织，用实时荧光成像系统进行分析上述480min离体血浆、脏器及关节的荧光强度，并照相记录。

(5)FA-SLM的类风湿性关节炎治疗效果评价

1)一般性评价

如前所述，采用关节炎指数评定或用游标卡尺测量足拓部肿胀度作为评价关节炎症程度的依据。

2)FA-SLM的镇痛效果评价

镇痛效果评价主要采取热板法和扭体法实验进行评价。首先将CIA造模大鼠分成4组(每组5只)：空白对照组(生理盐水)、FA-SLM组和Control-FA-LM组。

①热板法

先将水浴槽加满水，使水面接触热板，调节恒温装置，使水温控制在55±0.5℃，热板预热10min。每次一只放在热板上，大鼠在热板上开始至出现舔足时止所需时间(s)为该鼠痛阈值，跳跃一次(含)以上者踢出数值，每只大鼠重复测其痛阈值3次(每次间隔5min)取三次平均值。将SD大鼠进行上述分组，给药3d，阴性对照组给予等量生理盐水，最后一次给药后15、30、60min分别测每组大鼠痛阈值。

②扭体法

醋酸扭体法：按上述分组连续给药3d，阴性对照组给予等量生理盐水，最后一次给药后1h后，给大鼠腹腔注射0.8％醋酸0.2mL/10g，记录各组大鼠注射5min后15min内的扭体(腹部收缩内陷，四肢伸展)次数。

由于影响FA-SLM粒径、包封率、稳定性等的因素较多，故本发明先采用单因素实验初筛出对其影响最显著的因素，再利用Design Expert 8.0软件进行中心组合设计，优化处方及工艺条件。

下述实施例1中的原料百分比，具体是指原料的质量(w)与注射用水的体积(v)的百分比。

实施例1

本实施例的一种基于响应面法优化的氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM的制备工艺，具体包括如下步骤：

(1)处方筛选

1)泊洛沙姆的用量

在FA-SLM的制备过程中，当其他工艺及处方条件一定时，只改变泊洛沙姆的用量进行制备。

除泊洛沙姆用量改变外，其余条件不变：精密称量大豆油10g(w/v，10％)，FA原料药0.1g(w/v，0.1％)，DSPE-PEG₂₀₀₀0.03g(w/v，0.03％)，加热至65℃，恒温磁力搅拌使其充分溶解，得油相；称量甘油10g(w/v，10％)、蛋黄卵磷脂1.1g(1.1％)，控制泊洛沙姆的用量分别为0.1g(w/v，0.1％)，0.15g(w/v，0.15％)，0.3g(w/v，0.3％)，磷酸氢二钠0.03g(w/v，0.03％)，油酸钠0.1g(w/v，0.1％)分散于100mL注射用水中，65℃恒温磁力搅拌，得水相；将油相缓慢加入到水相中，12000rpm剪切5min制备初乳，冰水浴降至室温，100Mpa高压均质5次得终乳，调节pH至7，即得氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM。用HPLC测定其包封率，泊洛沙姆的用量对包封率的影响见图1A。由图可以反映出，随着泊洛沙姆的用量增多，制剂的包封率先增大后减小，在用量为1.5％时为较好。

2)大豆油的用量

在FA-SLM的制备过程中，大豆油作为药物基质，肯定不能少也不能过多。当其他工艺及处方条件一定时，只改变大豆油的用量进行制备。

除大豆油用量改变外，其余条件不变：控制大豆油的用量分别为5g(w/v，5％)，10g(w/v，10％)，15g(w/v，15％)，FA原料药0.1g(w/v，0.1％)，DSPE-PEG₂₀₀₀ 0.03g(w/v，0.03％)，加热至65℃，恒温磁力搅拌使其充分溶解，得油相；称量甘油10g(w/v，10％)，蛋黄卵磷脂1.1g(w/v，1.1％)，磷酸氢二钠0.03g(w/v，0.03％)，泊洛沙姆0.15g(w/v，0.15％)，油酸钠0.1g(w/v，0.1％)分散于100mL注射用水中，65℃恒温磁力搅拌，得水相；将油相缓慢加入到水相中，12000rpm剪切5min制备初乳，冰水浴降至室温，100Mpa高压均质5次得终乳，调节pH至7，即得氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM。用HPLC测定其包封率，结果如图1B所示。当大豆油的用量太少或者太多，FA-SLM制剂的包封率都不太高，当大豆油用量为10％时的包封率较高。

3)蛋黄卵磷脂的用量

蛋黄卵磷脂在该制剂中作为主要的表面活性剂及乳化剂对制剂的包封率有着重要的作用。通过改变蛋黄卵磷脂的用量来制备FA-SLM。

除蛋黄卵磷脂用量改变外，其余条件不变：精密称量FA原料药0.1g(w/v，0.1％)，DSPE-PEG₂₀₀₀ 0.03g(w/v，0.03％)，大豆油10g(w/v，10％)，加热至65℃，恒温磁力搅拌使其充分溶解，得油相；称量甘油10g(w/v，10％)，控制蛋黄卵磷脂用量分别为0.5g(w/v，0.5％)，1g(w/v，1％)，2g(w/v，2％)，磷酸氢二钠0.03g(w/v，0.03％)，泊洛沙姆0.15g(w/v，0.15％)，油酸钠0.1g(w/v，0.1％)分散于100mL注射用水中，65℃恒温磁力搅拌，得水相；将油相缓慢加入到水相中，12000rpm剪切5min制备初乳，冰水浴降至室温，100Mpa高压均质5次得终乳，调节pH至7，即得氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM。用HPLC测定其包封率，其包封率如图1C所示。当卵磷脂的用量为1％时得到的包封率最高。

(2)工艺筛选

1)初乳剪切时间

制备FA-SLM时需要剪切机进行高速剪切，使油相和水相得到初步乳化。而剪切的时间的长短会对FA-SLM的稳定性及包封率具有一定程度的影响。

在只改变初乳剪切时间的情况下，精密称量FA原料药0.1g(w/v，0.1％)，DSPE-PEG₂₀₀₀ 0.03g(w/v，0.03％)，大豆油10g(w/v，10％)，加热至65℃，恒温磁力搅拌使其充分溶解，得油相；称量甘油10g(w/v，10％)，蛋黄卵磷脂1g(w/v，1％)，磷酸氢二钠0.03g(w/v，0.03％)，泊洛沙姆0.15g(w/v，0.15％)，油酸钠0.1g(w/v，0.1％)分散于100mL注射用水中，65℃恒温磁力搅拌，得水相；将油相缓慢加入到水相中，12000rpm分别剪切4min，6min，8min制备初乳，冰水浴降至室温，100Mpa高压均质5次得终乳，调节pH至7，即得氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM。作出的FA-SLM制剂的包封率大小如图1D所示，剪切时间太短或太长，包封率都不太理想，在6min时FA-SLM的包封率较高。

2)均质次数

FA-SLM制剂在做完初乳后需要进行高压均质。而均质的次数会对FA-SLM的包封率具有一定程度的影响。

在只改变均质次数的情况下，制备FA-SLM：精密称量FA原料药0.1g(w/v，0.1％)，DSPE-PEG₂₀₀₀ 0.03g(w/v，0.03％)，大豆油10g(w/v，10％)，加热至65℃，恒温磁力搅拌使其充分溶解，得油相；称量甘油10g(w/v，10％)，蛋黄卵磷脂1g(w/v，1％)，磷酸氢二钠0.03g(w/v，0.03％)，泊洛沙姆0.15g(w/v，0.15％)，油酸钠0.1g(w/v，0.1％)分散于100mL注射用水中，65℃恒温磁力搅拌，得水相；将油相缓慢加入到水相中，12000rpm剪切6min制备初乳，冰水浴降至室温，100Mpa分别进行高压均质4次、6次、8次得终乳，调节pH至7，即得氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM。作出的FA-SLM制剂的包封率大小如图1E所示，均质次数过长或过短包封率都不太高，在均质6次时的包封率最好。

3)均质压力

均质压力在制备过程中对其包封率有着明显的影响。在只改变均质压力的情况下，制备FA-SLM：精密称量FA原料药0.1g(w/v，0.1％)，DSPE-PEG₂₀₀₀ 0.03g(w/v，0.03％)，大豆油10g(w/v，10％)，加热至65℃，恒温磁力搅拌使其充分溶解，得油相；称量甘油10g(w/v，10％)，蛋黄卵磷脂1g(w/v，1％)，磷酸氢二钠0.03g(w/v，0.03％)，泊洛沙姆0.15g(w/v，0.15％)，油酸钠0.1g(w/v，0.1％)分散于100mL注射用水中，65℃恒温磁力搅拌，得水相；将油相缓慢加入到水相中，12000rpm剪切6min制备初乳，冰水浴降至室温，分别在80Mpa、100Mpa、120Mpa高压条件下均质6次得终乳，调节pH至7，即得氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM。作出的FA-SLM制剂的包封率大小如图1F所示。可以看出，均质压力在80～100MPa时，包封率的大小变化明显，并且有显著性差异，而均质压力在100～120MPa变化时，包封率逐渐变小，并且无显著性差异。其中压力在100MPa时的包封率最佳。

(3)中心组合设计法优化处方

1)中心组合实验设计

根据前面已经获得的单因素筛选实验的结果，本设计选择了3个对包封率有较为显著影响的因素作为考察对象，分别为大豆油占比(X₁)、卵磷脂占比(X₂)、均质压力(X₃)，中心组合实验设计各因素水平见表1。

表1实验考察变量及实验水平编码的实际值

X₁:大豆油占比；

X₂:卵磷脂占比；

X₃:均质压力(MPa)；

表2 CCD实验设计表和考察指标实验结果

X₁:大豆油占比；

X₂:卵磷脂占比；

X₃:均质压力(MPa)；

Y₁:平均粒径(nm)；

Y₂:包封率(EE).

根据中心组合设计中所要求的试验次数标准为2^f+2f+1(f为所研究的因素的数量)的要求，本试验为3因素中心组合设计，因此所需的试验次数应为15次。另外，为了考察试验的误差大小，对中心点进行了5次重复试验。其他实验条件采用单因素实验所确定的实验方案。以脂微球的粒径和包封率作为筛选最佳处方条件的指标，实验设计方案和结果见表2。

2)数据处理和方程拟合

以脂微球的平均粒径和包封率作为评价指标(因变量)，使用统计学软件DesignExpert 8.0分别对各个因素(自变量)进行多元线性回归和多项式拟合，所得回归方程的准确性用F检验、Lack of fit和R-Squared等统计学指标进行考察，结果见表3、表4。

表3 Y₁拟合方程方差分析结果

表4 Y₂拟合方程方差分析结果

通过对各拟合方程F检验，P值，Lackoffit项的综合考察，拟合方程如下：

Y₁＝236.77-17.99X₁+7.71X₂-12.33X₃+1.43X₁X₂+0.54X₁X₃+2.72X₂X₃+22.07X₁ ²+22.68X₂ ²+16.83X₃ ²

Y₁＝95.77+2.60X₁+3.80X₂+1.32X₃-2.17X₁X₂-1.12X₁X₃+1.10X₂X₃-3.44X₁ ²-5.24X₂ ²-2.75X₃ ²

各方程拟合度和统计学检验结果表明，所考察的2项指标均可以用多项式方程进行较好的拟合。

3)响应曲面优化及验证

根据各指标的拟合方程，固定其中一个因素的水平不变，使用统计学软件DesignExpert 8.0，分别绘制出各考察指标与另外两个实验因素的三维响应曲面关系图，如图2。

表5优化处方的平均粒径和包封率的预测值和实测值对比结果表

根据拟合方程和响应曲面关系图，可以确定制备氟比洛芬长循环脂微球的最优处方为：大豆油占比(X₁)＝11.11％，卵磷脂占比(X₂)＝1.29％，均质压力(X₃)＝104.84Mpa。按此处方制备样品，测定其平均粒径和包封率，各指标预测值和实测值，结果如表5所示。

由表5的结果可以看出，优化后的各指标实测值均接近优化预测值，说明上述拟合方程能较好的描述本实验因素与指标的关系。

响应曲面图能够直观地说明各因素对指标的影响和因素之间的交互效应关系，曲率越高，表明各个因素之间交互作用的影响就越显著；等高线的形状也可反映交互效应的强弱，椭圆形表明因素之间的交互作用显著，而圆形则反之，等高线中的最小椭圆的中心点即是响应面的最高点。

由图2(A-C)可知，大豆油的用量比和卵磷脂的用量比对脂微球粒径的影响较大，同时大豆油的用量比和卵磷脂的用量比的交互影响最为显著，卵磷脂的用量比与均质压力的交互影响次之。

由图2(D-E)可知大豆油的用量比和均质压力大小对脂微球的包封率影响较大，同时大豆油的用量比和均质压力大小的交互影响最为显著，大豆油的用量比和卵磷脂的用量比的交互影响次之。

4)处方的确定

经过中心组合设计的优化，该脂微球处方可确定为：精密称量大豆油11.11g(w/v，11.11％)，FA原料药0.1g(w/v，0.1％)，DSPE-PEG₂₀₀₀ 0.03g(w/v，0.03％)，加热至65℃，恒温磁力搅拌使其充分溶解，得油相；称量甘油10g(w/v，10％)、蛋黄卵磷脂1.29g(1.29％)，泊洛沙姆0.15g(w/v，0.15％)，磷酸氢二钠0.03g(w/v，0.03％)，油酸钠0.1g(w/v，0.1％)分散于100mL注射用水中，65℃恒温磁力搅拌，得水相；将油相缓慢加入到水相中，12000rpm剪切6min制备初乳，冰水浴降至室温，104.84Mpa高压均质6次得终乳，调节pH至7，即得即得处方优化后的氟比洛芬酯长循环脂微球。

处方优化后的FA-SLM药物递送系统的表征

(1)氟比洛芬酯长循环脂微球粒径、Zeta电位、PDI的测定

经粒度仪测定，LM的粒径为196.63±2.56nm，Zeta电位为-1.79±0.22mV，PDI为0.16±0.003；SLM的粒径为223.26±2.82nm，Zeta电位为-1.67±0.03mV，PDI为0.17±0.003；FA-SLM的粒径为245.05±2.36nm，Zeta电位为-1.15±0.08mV，PDI为0.187±0.006。从结果可以看出这几种制剂的粒径均小于300nm，符合静脉注射的标准，并且PDI均小于0.3，表明制剂中脂微球分散均匀。(结果见表6，该结果与图一致。)

(2)氟比洛芬酯长循环脂微球包封率和药物含量的测定

FA-SLM的包封率为(97.63±0.14)％，药物含量为(97.32±1.03)％。由此结果可以看出，FA-SLM的包封率较高，可见经过星点设计优化后的处方可以明显改善包封率，结果见表6。

表6脂微球的表征结果

(3)氟比洛芬酯脂微球形貌特征的测定

从图3可以看出，脂质微球形态较规则，呈球形或椭圆形态，分散均匀，空白脂质微球在经过修饰后，粒径变大。也可以猜测我们修饰脂微球成功。

4.3 FA-SLM药物传递系统体外实验研究结果

(1)溶血结果

图4为不同制剂对溶血率的影响对比图。将各组制剂FA、SLM、FA-LM、Control-FA-LM、FA-SLM、滴加于健康SD大鼠的红细胞悬液于37℃孵育、离心后的溶血实验图(A)，以生理盐水为阴性对照，以UP水作为阳性对照。各制剂的溶血活性(B)。

由图4可以看出，各组药物在不同浓度下的溶血率均未超过5％，在体内的溶血率在安全范围内，可以用于后期实验大鼠的静脉注射。

(2)细胞毒性结果

图5为细胞毒性结果对比图。用MTT法在24h(A)、48h(B)、和72h(C)测定体外细胞毒性结果，分别用不同浓度的SLM，FA-LM，Control-FA-LM，FA-SLM和FA处理RAW264.7细胞，**P<0.01,***P<0.001and****P<0.0001用来评价每组结果与FA组比较的显著性差异。

RAW264.7在给予不同浓度的SLM、FA-LM、FA-SLM、Control-FA-LM和FA后，采用MTT法测定细胞在24h，48h，72h的体外存活率，其结果如图5所示。

从图上来看，RAW264.7在给药24h后(图5A)，在15μg/mL的浓度，制剂组与FA组进行比较，此时无显著性差异，但在30μg/mL的浓度时，FA-SLM组的细胞存活率显著高于FA组(**P<0.01)，60μg/mL、120μg/mL、240μg/mL时，FA-SLM组的细胞存活率也明显增高(**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)；给药48h后(图5B)，FA-SLM组的细胞存活率都显著高于FA组(***P<0.001，****P<0.0001)，并且当浓度在60μg/mL之后，非PEG修饰组FA-LM组和市售制剂Control-FA-LM组相比于FA组的存活率也具有了明显的增加(*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001)；在给药72h后(图5C)，除了浓度在15μg/mL时的FA-LM组，其余浓度各组相比较FA组的细胞存活率都具有明显的增高(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。

从图中可以看出，随着给药时间与给药浓度的增加，各制剂组与FA组细胞存活率的差异性也是越来越大，说明，脂质微球制剂的确可以明显的降低药物毒性；经过PEG修饰的长循环制剂普遍要比非长循环制剂的细胞存活率要高，因为PEG本身是有一定程度的可以避免RSE系统清除和巨噬细胞的吞噬摄取的，且自制FA-LM组与市售制剂Control-FA-LM组相比无显著性差异；对于SLM组，从图中可以看出给药浓度和给药时间的不同，对于细胞的存活率影响并不大，因为脂质微球制剂在临床上本身就是属于营养乳，并不具有什么毒性。

(3)细胞摄取结果

图6为RAW264.7的细胞摄取结果图。将RAW264.7细胞用LPS刺激后生成的M1型RAW264.7细胞和正常RAW264.7细胞分别与FA-LM、FA-SLM于37℃共同孵育后的激光共聚焦图片(A)和细胞流式图(B)。

如图6A所示，在激光共聚焦下，正常巨噬细胞摄取FA-LM要比FA-SLM，摄取的更多，这一点从图6B中正常巨噬细胞组中也可以清楚的看出。这一结果可以清晰的反应PEG在制剂中能够发挥的“隐身”作用，可以避免被正常巨噬细胞发现进行摄取。而在活化的巨噬细胞中，激光共聚焦的视野里，细胞数明显减少，可能是因为在刺激的过程中导致细胞的死亡；从图6B中活化的巨噬细胞组可以看出，RAW264.7细胞是否活化对于其摄取没有显著影响。

处方优化后的FA-SLM药物传递系统体内实验研究结果

(1)药动学参数计算

图7为血浆中FA，FA-LM，Control-FA-LM和FA-SLM的药物代谢动力学曲线对比图。在给药后不同时间点健康大鼠(A)和CIA大鼠(B)血浆中的FA，FA-LM，Control-FA-LM和FA-SLM的浓度-时间曲线。结果表示为Mean±SD(n＝3)。

如图7所示，游离的原料药FA在6分钟左右达到峰浓度，未经PEG修饰的FA-LM，Control-FA-LM组在15分钟左右达到峰浓度，而经PEG修饰的FA-SLM，则在半小时后才达到峰浓度，说明经PEG修饰的制剂可以减缓其释放速度。且Healthy组和CIA组老鼠的药时曲线没有明显差别，所以大鼠的CIA模型对于药物在体内的代谢无明显影响。

表7静脉注射后正常大鼠血浆中FA、FA-LM、Control-FA-LM和FA-SLM的药动学参数

*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001,与FA组比较.^###P<0.001,^####P<0.0001,与FA-LM组进行比较.

表8静脉注射后CIA模型大鼠血浆中FA、FA-LM、Control-FA-LM和FA-SLM的药动学参数

***P<0.001,****P<0.0001,与FA组比较.^###P<0.001,^####P<0.0001,与FA-LM组比较

从表7和表8可以看出，脂微球FA-LM组相比于原料药FA组，其半衰期T_1/2z、时量曲线下面积AUC_0-t及平均驻留时间MRT_0-t均有显著性的提高(*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001)，说明脂质微球的包载可以提高药物在体内的循环时间；同时经PEG修饰的长循环脂微球组FA-SLM相比于为修饰的FA-LM组，其半衰期T_1/2z又进一步得到了显著性提高(^####P<0.0001)，说明PEG的修饰使制剂达到了长循环的作用。

(2)HPLC法考察组织分布

图8为各组制剂不同时间点在健康大鼠(A)和CIA模型大鼠(B)的组织分布。图A中***P<0.001，****P<0.0001用于评估各制剂组在健康大鼠肝中分布的显著性差异，^###P<0.001，^####P<0.0001用于评估各制剂组在健康大鼠肺中分布的显著性差异；图B中*P<0.05用于评价Control-FA-LM组和FA-SLM组在CIA模型大鼠关节中分布的显著性差异。

药物在健康大鼠和CIA大鼠的分布中，除了关节组织，血浆和其他脏器均没有明显差异。图8A中，5种制剂在健康大鼠的关节组织中的分布无明显差异，但在富有RES系统的肝和肺中，经PEG修饰的FA-SLM组浓度比未修饰的FA-LM组有着显著的降低(***P<0.001，****P<0.0001；^###P<0.001，^####P<0.0001)。图8B中，通过分析5种制剂在造模大鼠炎症关节组织内的浓度差异，可以看出经PEG修饰的FA-SLM组浓度要比未修饰的Control-FA-LM组显著增多(*P<0.05)。

(3)荧光标记法考察体内分布

图9为健康大鼠和CIA造模大鼠的体内荧光成像对比图。静脉注射DiR和包载荧光的FA-LM和FA-SLM，使用AniView小动物成像系统在给药后0.2h，4h和8h观察不同给药组大鼠的体内荧光分布以及在8h后处死大鼠解剖分离心、肝、脾、肺、肾和关节组织，在动物活体成像系统下观察组织荧光分布(A)。通过AniView软件对大鼠活体关节荧光(B)及内脏组织荧光强度(C)进行半定量分析。结果表示为Mean±SD(n＝3)；*P<0.05，****P<0.0001用来评估各组之间的统计学差异。

如图9A所示，相比于Blank组，其余组的荧光都可在仪器中有效呈现出来，在正常大鼠和造模大鼠中，游离DiR组中的荧光主要集中在肺部。在各个时间点时，FA-LM和FA-SLM在CIA模型大鼠关节中的荧光强度均显著高于其在正常大鼠关节中的荧光强度。且从Exvivo可以看出，因为肝和肺富有RES系统，所以肝和肺的荧光强度也较强。从图9B可以看出，在正常大鼠关节中，FA-LM和FA-SLM的荧光强度和DIR没有明显差异；在CIA模型大鼠中FA-SLM对比于FA-LM组在关节中的荧光强度有明显差异(****P<0.0001)，说明PEG修饰组的靶向性要比原制剂更强。图9C可以看出FA-SLM组在肝和肺的荧光强度要显著低于DiR和FA-LM组(*P<0.05，****P<0.0001)，，说明PEG能显著减少肝肺中RES的清除，使更多的制剂靶向至关节炎症部位。

(4)FA-SLM的类风湿性关节炎治疗效果评价

图10为不同制剂对于CIA模型大鼠的治疗效果对比图。于第34天拍摄具有代表性的SD大鼠后腿(A)、每间隔2天记录的体重变化(B)、足踝直径(C)、足体积(D)、和关节指数评分(E)。结果表示为Mean±SD(n＝5)；

各组大鼠造模前的一般体征状况平稳正常、精神状态表现良好、毛发具有光泽，饮食活动量及其排便正常。在关节炎诱导期间，模型组大鼠各方面状态都出现明显变化，如精神不振、毛发泛黄、饮食活动量减少以及大便变稀等现象。从图10A可以大概看出，SD大鼠在经过造模后随着用药组的不同，呈现出不同的肿胀程度；大鼠体重如图10B所示，健康老鼠的体重随着时间缓慢上升趋于平稳，Saline和SLM组老鼠因为没有得到任何有效治疗，体重随时间日渐减少；与Saline组比较，其余治疗组大鼠体重随着时间先减少后增加。大鼠的踝关节直径和足容积如图10C-D所示，由于正常老鼠的体重增加，其踝关节直径与容积也随之缓慢增加，但不明显，Saline和SLM组老鼠因为没有药物治疗，其踝关节直径和容积随着时间大幅度增加。与Saline组和SLM组相比较，各药物组大鼠踝关节肿胀程度相对较轻，尤其是FA-SLM组症状缓解更明显。

(5)FA-SLM的镇痛效果评价

CIA造模大鼠由于脚部关节的发炎，脚掌对于温度会更加敏感。如表9所示，在15min时，经过尾静脉注射药物制剂的组的痛阈值要显著高于生理盐水的阴性对照组(****P<0.0001)，并且相比于经过PEG修饰的FA-SLM组，阳性对照组Control-FA-LM组的痛阈值要明显低一些(**P<0.01)，说明经过PEG修饰的制剂避免了RES系统的清除，使更多的药物发挥了疗效；经过了60min，经过PEG修饰的FA-SLM的痛阈值没有明显变化，但阳性对照组Control-FA-LM的痛阈值确有明显降低。

对大鼠进行腹腔注射醋酸会诱发大鼠的扭体反应。如表10所示，与阴性对照Saline组相比，给药组都能够一定程度的减少大鼠扭体次数，和热板法相似，经PEG修饰的FA-SLM组的扭体次数要比阳性对照Control-FA-LM明显减少(*P<0.05)。

表9静脉注射Saline、Control-FA-LM、FA-SLM后对CIA大鼠热反应的痛阈值

**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001每一组都与FA-SLM组比较.

表10静脉注射Saline、Control-FA-LM、FA-SLM后对CIA大鼠扭体反应的次数

*P<0.05,****P<0.0001每一组都与FA-SLM组比较。

Claims

1.一种基于响应面法优化的氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM的制备工艺，其特征在于：具体包括如下步骤：

(4)根据各指标的拟合方程，固定其中一个因素的水平不变，使用软件Design Expert，分别绘制出各考察指标与另外两个实验因素的三维响应曲面关系图；根据拟合方程和响应曲面关系图，确定制备FA-SLM的最优处方和工艺条件。

2.根据权利要求1所述的基于响应面法优化的氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM的制备工艺，其特征在于：步骤(1)的实验方法如下：

精密称取优化处方量FA原料药，适量DSPE-PEG₂₀₀₀，控制大豆油的用量，混合加热至65℃，恒温磁力搅拌使其充分溶解，得油相；称取处方量甘油，控制卵磷脂用量，磷酸氢二钠，控制泊洛沙姆用量，油酸钠，分散于注射用水中，65℃恒温水浴，得水相；将油相缓慢加入到水相中，高剪切制备初乳，控制剪切时间；冰水浴将所得初乳降至室温，高压均质得终乳，控制均质次数和均质压力；调节pH，即得FA-SLM，利用HPLC法对FA-SLM进行分析，进而计算出FA-SLM包封率。

3.根据权利要求1所述的基于响应面法优化的氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM的制备工艺，其特征在于：步骤(1)中各因素的水平范围：泊洛沙姆占比为0.1～0.3％；大豆油占比为5～15％；卵磷脂占比为0.5～2％；初乳剪切时间为4～8min；均质次数为4～8次；均质压力为80～120MPa。

4.根据权利要求1所述的基于响应面法优化的氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM的制备工艺，其特征在于：步骤(3)中所述二阶多项式拟合方程如下：

5.根据权利要求1所述的基于响应面法优化的氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM的制备工艺，其特征在于：步骤(4)中，所述制备FA-SLM的最优处方和工艺条件具体如下：大豆油占比(X₁)＝11.11％，卵磷脂占比(X₂)＝1.29％，均质压力(X₃)＝104.84Mpa。

6.权利要求1～5任一项所述的基于响应面法优化的氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM的制备工艺制备得到的氟比洛芬酯长循环脂微球FA-SLM。

7.权利要求1～5任一项所述工艺制备得到的氟比洛芬酯长循环脂微球在制备治疗类风湿性关节炎药物和/或镇痛药物中的应用。

8.一种治疗类风湿性关节炎的药物，其特征在于：所述药物包括权利要求1～5任一项所述工艺制备得到的氟比洛芬酯长循环脂微球。

9.一种镇痛药物，其特征在于：所述药物包括权利要求1～5任一项所述工艺制备得到的氟比洛芬酯长循环脂微球。