CN114191340A - 山葵叶汁液用于改善肌肤的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种山葵叶汁液用于减缓皮肤老化及改善皮肤状态的组合物的用途，其中该组合物用于抑制醣化终产物生成、增加肌肤含水量、改善肌肤紧致度、减少肌肤皱纹、抑止肌肤皱纹生成、抑制皮肤斑点生成、抑制皮肤黑色素生成、抑制痤疮生成。

Description

山葵叶汁液用于改善肌肤的用途
技术领域
本案是关于一种山葵叶汁液的用途，特别是关于山葵叶用于制备减缓皮肤老化或改变皮肤状态之组合物的用途。
背景技术
皮肤对于人类个体之保护具有不可或缺之重要性，其提供了对抗阳光中紫外线辐射、病原体、摩擦力等环境因子的第一阶段保护。皮肤由外向内依序包含表皮层、主要由结缔组织所构成的真皮层、及皮下组织。其中，真皮层包含有充足的胶原蛋白(collagen)、弹力蛋白(elastin)、及玻尿酸(hyaluronic acid) 等分子，因此年轻的肌肤具有较佳的支撑性以及弹性。
随着年龄增长或环境因子的影响，皮肤会老化并产生各种受损的状态。举例而言，皮肤可能会因为胶原蛋白裂解，导致肌肤弹力下降、保水度不足(肌肤较为干燥、无光泽)、毛孔粗大、皱纹等现象；以及例如因黑色素沉淀，使肌肤产生斑点及/或整体较为暗沈、蜡黄等老化态样。
另外，可能因血液中多余的糖分与蛋白质结合，形成加速老化的物质——醣化终产物(Advanced Glycation End-Products，AGE)。这些体内AGE的累积亦会造成皮肤呈现老化受损状态。特别是现代生活中，人们常摄取过多糖分，加上缺乏运动或代谢缓慢等因素，造成肌肤老化更明显、快速。
发明内容
有鉴于此，研究或开发一种可减缓皮肤老化及损害的组合物，来维持或改善肌肤外观乃有其必要。
缘此，本发明的一目的在于提供一种山葵叶汁液用于制备减缓皮肤老化及改变皮肤状态的组合物之用途。山葵(Wasabia japonica)又称为山嵛菜」，是一种属于十字花科山萮菜属的植物。山葵具有浓烈刺激味，然其辛辣与辣椒不同，辣椒的辣味刺激舌头，而山葵的辣味却刺激鼻窦。山葵叶可以食用，且具有山葵茎的辣味。山葵叶的料理方式包括用盐醋酱汁腌制过夜后制成山葵色拉，用酱油开水烹煮以作为下饭、下酒的小菜或卷寿司的材料食用，甚至可以蘸上淀粉浆后炸成天妇罗。
具体而言，本发明的一目的在于提供一种山葵叶汁液用于制备抑制醣化终产物生成、增加肌肤含水量、改善肌肤紧致度、减少肌肤皱纹、抑止肌肤皱纹生成、抑制皮肤斑点生成、抑制皮肤黑色素生成以及抑制痤疮生成的组合物的用途。
在一些实施例中，该组合物系为医药组合物。
在一些实施例中，该组合物系进一步制备成保养品组合物、食品、保健食品组合物、或化妆品组合物。
在一些实施例中，该组合物系用于制备一抑制皮肤痤疮形成之组合物的用途。
在一些实施例中，该山葵叶汁液系以一含水之溶剂提取一山葵叶所获得。
在一些实施例中，该山葵叶汁液系透过降低AGE之形成以达到该减缓皮肤老化。
在一些实施例中，该山葵叶汁液系透过调控抗发炎相关基因表现量达到该抑制皮肤痤疮形成。
在一些实施例中，该山葵叶汁液之浓度至少为0.5mg/mL。
在一些实施例中，该山葵汁液可降低透过皮肤散失之水量、提升肌肤含水量、提升肌肤弹性增加、提升肌肤紧实度、淡化肌肤斑点、淡化肌肤紫外线斑点、改善肌肤纹理、改善肌肤毛孔状态、淡化肌肤皱纹、减少肌肤原生紫质、或前述之任一组合。
如先前所述，血液内多余的糖分会与蛋白质结合，形成AGE。AGE的不断累积会导致发炎反应，进而产生自由基，攻击肌肤，造成皮肤相关蛋白硬化、纤维断裂，使得肌肤失去弹性，暗沉发黄、皱纹、粗糙并严重下垂而加速皮肤老化。
同时，当皮肤上之油脂与老废细胞堆积时，细菌会滋生，造成皮肤轻微发炎。而随着时间推移若不处理，皮肤之毛囊壁会受损，造成严重发炎，形成痤疮，或俗称之「青春痘」。在发炎反应中很重要的一环为前发炎细胞激素，若能减缓其分泌量，便能减缓发炎反应，达到抗痘之效果。
另一方面，紫外线与蓝光亦会诱发肌肤中的黑色素细胞产生黑色素，使得肌肤产生斑点及/或整体较为暗沈、蜡黄，此亦为肌肤老化的常见现象之一。
而由于本案证实山葵叶汁液可抑制AGE的形成、抑制前发炎细胞激素，特别是透过调控IL-8基因表现量抑制该前发炎细胞激素以及抑制黑色素生成，故本案之山葵叶汁液可有效推迟皮肤老化以及抑制皮肤痤疮之形成，亦可达到美白及对抗多种肌肤老化之现象。
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。
附图说明
图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着。
图1为空白控制组及实验组的醣化终产物相对生成量比例之结果比较图。
图2为空白控制组及实验组的IL-8基因相对表现量比例之结果比较图。
图3为空白控制组、紫外线-B(Ultra Violet-B，UVB)对照组及实验组之 IL-8相对分泌量比例之结果比较图。
图4为空白控制组、对照组及实验组之黑色素相对含量比例之结果比较图。
图5为空白控制组及实验组之酪胺酸相对抑制性之结果比较图。
图6为受试者在饮用含本发明之山葵叶汁液之饮品前后，肌肤状态(经皮水分散失率、肌肤保湿度、肌肤弹性、肌肤紧实度、斑点、紫外线色斑、肌肤纹理、肌肤毛孔、肌肤皱纹、原生紫质(痤疮杆菌分泌物))改善比例之比较图。
具体实施方式
以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下，本案尚可以多种不同形式之态样来实践，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。
本案使用Excel软件进行统计分析。资料以平均值±标准偏差(SD)表示，各组之间的差异以学生t检验(student's t-test)进行分析。
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。
本案所称之山葵，其学名为Wasabia japonica，又称为「山嵛菜」，是一种属于十字花科山萮菜属的植物。
在一些实施例中，山葵叶汁液可用于减缓皮肤老化、抑制皮肤痤疮形成、增加肌肤含水量、改善肌肤紧致度、减少肌肤皱纹、抑止肌肤皱纹生成、抑制皮肤斑点生成、抑制皮肤黑色素生成。因此，山葵叶汁液可用于制备减缓皮肤老化、抑制皮肤痤疮形成、增加肌肤含水量、改善肌肤紧致度、减少肌肤皱纹、抑止肌肤皱纹生成、抑制皮肤斑点生成、抑制皮肤黑色素生成的组合物。
在一些实施例中，山葵叶汁液可透过降低AGE之形成、调控抗发炎相关基因表现量、调控IL-8基因表现量、调控MTF基因表现量、抑制酪胺酸酶的形成。
在一些实施例中，前述的组合物可为医药组合物、保养品组合物、食品组合物、保健食品组合物。。
医药组合物可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于经肠地道(enterally)、非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型。例如可为：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution) 或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)或其他类似物。
医药组合物可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术之医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，医药上可接受的载剂可包含下列一种或多种载剂：乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。有关这些载剂的选用与数量是熟习此项技术人员可视情况进行选择的。
在一些实施例中，医药上可接受的载剂可包含下列一种溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及其他任何合适的溶剂。
在一些实施例中，该医药组合物可由下列所述的任一种非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。
在一些实施例中，医药组合物可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)。举例而言，其可为下列所述的任一种，但不限于此：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带 (bandage)。
在一些实施例中，外部制剂是藉由将医药组合物与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而制成。
在一些实施例中，该基底可包含下列一种或多种的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、接口活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸如
Figure RE-GDA0002756195360000051
974P (
Figure RE-GDA0002756195360000052
974P)、微结晶纤维素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、螯合剂(chelating agents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants) 以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术之人士的专业素养与例行技术范畴内。
在一些实施例中，保养品中可包含有一被广泛地使用于保养品制造技术之可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含下列一种或多种佐剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。可根据实际需求对这些试剂的选用与数量进行合适的调整。
在一些实施例中，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，其可为下列中的任一种，但不限于此：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution) 或油性溶液(oilysolution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型之乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯 (mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansing products)等。
在一些实施例中，保养品亦可与下列中之已知活性的外用剂(external useagents)的一种或多种一起合并使用：美白剂(whitening agents)[诸如维生素 A酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素C]、保湿剂、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[诸如芦荟萃取物(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂(antipsoriatic agents)、抗老化剂(antiaging agents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术之人士的专业素养与例行技术范畴内。
在一些实施例中，医药组合物可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。
在一些实施例中，食品的种类可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods) 以及膳食补充品(dietary supplements)。
在一些实施例中，「山葵叶汁液」可为山葵的叶经一溶剂提取而得，该溶剂可为水或含水之溶液。在一些实施例中，该提取系于70℃～100℃进行，提取时间为30分钟。在一些实施例中，「山葵叶汁液」系山葵的叶子经适当溶剂提取后，再挤压并去除叶渣与较细小的悬浮物后，再将其浓缩至一定浓度而得。
在一些实施例中，「山葵叶汁液」亦可由山葵之叶子直接经碾碎、挤压并去除叶渣与较细小的悬浮物后，再将其浓缩至一定浓度而得。
下列范例中的实验步骤若无特别叙明，即在室温(25±5℃)、常压(1atm) 下进行。
[例1]山葵叶汁液之制备
将山葵(产地：中国台湾阿里山及成都大邑县)的叶经粉碎(Osterizer品牌的10speed blender)并以10目数(mesh)的筛网将其过筛，去除过大颗粒后取得山葵叶粉。在另一些实施例中，筛网的目数可为8目或12目。
接着，加热程序中，以水为溶剂与山葵叶粉以15:1的重量比混合，并于85 ±5℃下进行提取约30分钟以形成含有固体的第一提取液。
在另一些实施例中，溶剂与山葵叶的重量比亦可为10:1～20:1，浸泡时的温度可为70℃-100℃，时间可为15-45分钟。若溶剂过少或浸泡时间过短，则提取效率将会明显下降；若浸泡时间过长，则汁液中的有效成分可能会产生降解。
将前述第一提取液以浓缩机(厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100)，在 60℃±5℃下进行减压浓缩至溶液的白利糖度值(Degrees Brix)为8±0.5时停止浓缩，得到本案之山葵叶汁液。在另一些实施例中，可于45℃-70℃下进行减压浓缩。
[例2]山葵叶汁液抑制胶原蛋白醣化量检测
当蛋白质经醣化反应后将生成多种醣化终产物(Advanced glycation endproducts，AGEs)，其为不可还原之物质，并能改变及影响蛋白质的正常功能，进而加速皮肤老化。因此，若能抑止胶原蛋白醣化则可有效地降低胶原蛋白的流失速度，达到推迟皮肤老化之功效。而为确认山葵叶汁液是否具有抑止胶原蛋白醣化的功效，进行胶原蛋白醣化量测试如下。
药品配制：
使用前方例1中所制得山葵叶汁液，以浓度200mM的磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate-Buffered Saline，PBS，系以NaH2PO3(Honeywell，#04269)、Na2HPO4(Sigma，#V900061)与水配制而成，其pH值为7.4)作为溶剂，配制出浓度0.4mg/mL的山葵叶提取溶液。
使用前述浓度200mM的磷酸盐缓冲生理盐水以及胶原蛋白粉末(胶原蛋白购自Rousselot，型号#P2000HD)，配制浓度为60mg/mL的胶原蛋白溶液。另加入迭氮化钠于胶原蛋白溶液中，使胶原蛋白溶液中含有0.06wt％的迭氮化钠。(迭氮化钠购自Sigma，#S2002)
使用前述浓度200mM的磷酸盐缓冲生理盐水与果糖(果糖购自Sigma， #F0127)，配制浓度为1.5M的果糖溶液。
胶原蛋白醣化测试：
将前述山葵叶提取溶液0.2mL，分别与0.2mL前述胶原蛋白溶液以及0.2 mL前述果糖溶液进行混合，配制出样品溶液。
将0.2mL的去离子水与0.2mL前述胶原蛋白溶液以及0.2mL前述果糖溶液进行混合，配制出空白溶液作为控制组。
将样品溶液以及空白溶液于进行胶原蛋白醣化反应前，使用分光荧光计(spectrofluorometer，厂商/型号：BioTek FLx 800)测量其荧光强度(激发波长360nm，放射波长460nm)。
将样品溶液以及空白溶液置于50℃反应24小时，使溶液进行胶原蛋白醣化反应。
将反应后的样品溶液以及空白溶液，同样以分光荧光计测量其荧光强度(激发波长360nm，放射波长460nm)。
依下列公式计算蛋白质醣化终产物相对生成率：
[(样品荧光强度反应后-样品荧光强度反应前)/(控制组荧光强度反应后-控制组荧光强度反应前)]×100％
样品相对于控制组的蛋白质醣化终产物相对生成率显示于图1。而如图1 所示，山葵叶汁液具有抑止胶原蛋白的醣化终产物产生的效果。具体而言，蛋白质醣化终产物相对生成率仅为控制组的41％。显示山葵叶汁液确实可抑止胶原蛋白的醣化反应，减少醣化终产物的生成，进而降低体内胶原蛋白的流失，达到减缓肌肤老化的功效。
例3]细胞实验-山葵叶汁液调控IL-8基因表现量
于此，培养基采用VIVOTM 10Serum-free hematopoietic cell medium(购自Lonza，瑞士，编号BE02-055Q)。首先，将人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial Cells，HUVEC)(由生物资源保存及研究中心获得，BRBC编号 H-UV001)进行血管内皮细胞IL-8基因表现量之实验。首先以每孔1×105个细胞量培养于含有2mL上述培养液之六孔培养盘中，并在37℃下培养16小时，然后将HUVEC细胞分为以下二组：实验组与控制组。
实验组：依照每毫升培养液含有1毫克由实施例1之方式制备而成之山葵叶汁液的比例(即，浓度为1mg/ml)制得含汁液的培养液，将HUVEC细胞更换为含汁液的培养液中继续培养。
控制组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含有培养后的HUVEC 细胞的培养液中。
实验组与控制组于培养48小时后，将培养后的实验组及控制组细胞以细胞裂解液分别破细胞膜以形成二组的细胞溶液。
接着，使用RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Lot No.FC24015-G)分别收集二组细胞溶液内之RNA。接着，每组取2000奈克(ng) 所萃取出的RNA为范本，藉由
Figure RE-GDA0002756195360000092
III反转录酶(购自Invitrogene 公司，美国，编号18080-051)以表一中之引子黏合进行反转录作用产生相应之cDNA。后续利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCRsystem(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，以及KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)将二组反转录后产物分别以表一之组合引子进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chainreaction)以观察实验组和控制组的HUVEC细胞的基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应1秒，60℃反应20 秒，总共40个循环，并使用2-ΔCt方法进行基因定量。于此，藉由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量各基因的mRNA表现量，进而推断各基因编码的蛋白质的表现量。
表一
Figure RE-GDA0002756195360000091
Figure RE-GDA0002756195360000101
下文述及之图式中显示的各基因的相对基因表现系以相对倍率呈现，其中使用Excel软件之STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾学生t 检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显着差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着。
如图2，当控制组的IL-8基因的表现量被视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的IL-8基因的表现量为0.258(即25.8％)，代表实验组的IL-8基因的表现量为控制组的0.258倍。
由此可知，当HUVEC细胞经山葵叶汁液处理后，HUVEC细胞内IL-8基因的基因表现量降低，代表细胞内的发炎反应能有效被抑制，因而能有效地抑制痤疮的形成，达到抗痘的效果。
[例4]细胞实验-山葵叶汁液在抗皮肤发炎上的效用评估
已知介白素-8(interleukin-8，IL-8)为一种细胞激素，具有促进发炎反应之功能。当发炎反应产生时，发炎组织会释放出该细胞激素以吸引特定功能的细胞至发炎部位。同时，发炎反应产生时，该部位会产生红肿，甚至是疼痛现象。因此，若能抑制介白素-8之分泌量，便能缓和发炎反应，进而达到抑制皮肤痤疮之效果。
于此，以人类CXCL8/IL8之ELISA分析套组、紫外线照射室配合酵素免疫分析仪(ELISA reader)，测定人类初代皮肤角质细胞HPEK-50经山葵叶汁液处理后，其细胞中抗发炎因子的变化。
材料与仪器
细胞株：人类初代皮肤角质细胞(Human primary epidermal keratinocytes)HPEKp(CELLnTEC公司(瑞士)，HPEK-50)。
培养基：无血清之角质细胞培养液(keratinocyte-SFM)(Gibco公司，美国，编号为#10724-011)。
紫外线照射室(Vilber公司，产品编号BLX254)
人类CXCL8/IL8之ELISA分析套组：购自R&D systems，型号 D8000CD8000C，此套组中包含以下试剂：
(1)捕获抗体(capture antibody)
(2)侦测抗体(detection antibody)
(3)链霉亲和素-HRP(Streptavidin-HRP)
(4)清洗溶液(Washing buffer)：为磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)
(5)受质溶液(四甲基联苯胺tetramethyl-benzidine,TMB)
(6)终止溶液(stop solution)
酵素免疫分析仪(ELISA reader)，购自BioTek公司。
Substrate solution(R&D systems)。
H2SO4，购自Sigma-Aldrich公司
细胞培养箱，购自Astec公司
振荡器(shaker)，购自GenePure公司
山葵叶汁液：此实验中所使用的山葵叶汁液是透过如上实施例1之置被方式所获得。
实验步骤
实验将会分为1个对照组、1个UVB照射组、1个实验组共三组进行，各组分别进行三重复试验：
将人类初代皮肤角质细胞以每孔5×104个的方式，接种于每孔培养于每孔含0.5ml培养基之24孔培养盘中。
将培养盘置于细胞培养箱，于37℃下培养24小时后，移除培养基。
使用紫外线照射室，以300mJ/cm2的强度对UVB照射组、实验组，诱发发炎反应，并同时将1mg/mL山葵叶汁液样品添加至实验组的细胞中，至于对照组的细胞则不做任何处理(不照UVB，亦不添加山葵叶汁液)。前述之「山葵叶汁液样品」系将以例1之方式所制备之山葵叶汁液以培养基稀释，配制成每毫升含1毫克之山葵叶汁液的溶液。
各组细胞在37℃下培养24小时后，吸取120μL的细胞培养上清液做为样品，使用人类CXCL8/IL8之ELISA分析套组对此些样品中IL8进行分析。
首先，以PBS稀释捕获抗体(capture antibody)，将经稀释的捕获抗体以每孔100μL的量涂布至96孔微盘底部，并于4℃作用过夜。
接着，以200μL的清洗缓冲液(含0.05％吐温20(Tween 20)，制备于PBS) 清洗96孔微盘3次。
以300μL的阻断缓冲液(Block buffer)(1％BSA制备于PBS)进行阻断，接着于37℃下作用3小时。
之后，以200μL的清洗缓冲液清洗96孔微盘3次。
添加100μL的样品及标准品(配置于稀释液(0.1％BSA配于PBS))，接而于37℃下与捕捉抗体进行结合2小时。
接着，以200μL的清洗缓冲液清洗96孔微盘3次。
然后添加100μL的侦测抗体(detection antibody)，接而于37℃下侦测捕捉抗体2小时。
之后，以200μL的清洗缓冲液清洗96孔微盘3次。
添加100μL的链霉亲和素-HRP(Streptavidin-HRP)，接而于室温下作用 20分钟。
之后，以200μL的清洗缓冲液清洗96孔微盘3次。
然后添加100μL的受质溶液(substrate solution)(R&D systems)，于室温下作用20分钟。
接着，添加50μL的终止溶液(stop solution)来中止反应，最后以酵素免疫分析仪测量其450nm之吸光值。再以Excel软件进行统计分析。
各组之间的统计学显着差异是藉由史徒登氏t-试验(Student’s t-test)来决定。本实施例的结果显示于图3。
图3是本发明山葵叶汁液在抗皮肤发炎上的功效之数据图。由图3可见，与对照组相较之下，UVB组的IL-8产生量有显着的提升，这表示UVB会对人类初代皮肤角质细胞产生发炎反应。而与UVB组相较之下，实验组的IL-8产生量降低14.3％。本实施例的结果显示，本发明山葵叶汁液具有抗皮肤发炎的功效，进而达到抑制皮肤痤疮之形成，以及抗痘之效果。
[例5]细胞实验-山葵叶汁液降低黑色素生成
于此，以ELISA读盘机(enzyme-linked immunosorbent assay reader)测定黑色素瘤细胞株B16F10经山葵叶汁液处理后，其黑色素含量的变化。
材料与仪器
细胞株：小鼠黑色素瘤细胞株B16F10(ATCC CRL-6475)，购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。
培养基：将Dulbecco's modified minimal essential medium(DMEM，购自Gibco)添加额外成分使其含有1vol％的抗生素溶液(Antibiotic AntimycoticSolution，购自Gibco，15240-062)、10vol％的FBS(fetal bovine Serum，购自 Gibco，10437-028)。
磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)：购自Gibco，产品编号10437-028。
以二次蒸馏水配制1N NaOH(购自Sigma，产品编号221465)溶液。
ELISA reader(BioTek，FLx 800)
山葵叶汁液：以实施例1之制备方式而得。
实验步骤
实验将会分为实验组、空白控制组(未添加山葵叶汁液、二组进行，各组分别进行三重复试验：
将B16F10细胞以每孔1.5×105个的方式，接种于每孔含2ml培养基之6孔培养盘中。
将培养盘置于5％CO2、37℃环境下，培养24小时。
而后，在不干扰附着细胞的情况下，移除每孔之培养基。
实验组：于每孔中加入山葵叶汁液样品0.0225mL后，于37℃下培养48小时。其中，山葵叶汁液样品系将以例1之方式所制备之山葵叶汁液以培养基稀释配制成每毫升含1毫克之山葵叶提取液的溶液。
空白控制组：在37℃下，添加2ml的培养基至每孔中，使其于37℃下培养48小时。
对照组：在37℃下，添加2ml的培养基至每孔中，使其于37℃下培养48 小时。
而后，移除培养基，并以PBS溶液清洗细胞2次。
将200μl胰蛋白酶(Trypsin-EDTA(10X)，购自Gibco；产品编号15400-054) 加至每孔中反应3分钟。反应后，添加6mL培养基溶液终止反应。而后收集各孔中之悬浮细胞与培养基至对应的15ml离心试管内，将各离心试管以400xg 离心5分钟使细胞沉淀。
以PBS溶液清洗沉淀细胞二次后，再以200μL PBS溶液重新悬浮细胞。
将细胞悬浮液以液态氮冷冻10分钟，再置于室温约30分钟至完全解冻。
完全解冻后，将试管以12,000g离心3分钟。
移除上清液，再以120μL 1N氢氧化钠溶液重新悬浮细胞沉淀后，使试管于60℃干浴1小时，以获得待检测样本。
将100μL待检测样本移入一96孔盘，使用ELISA读盘机测量细胞溶液在 450nm的光密度值(optical density，OD450)，作为吸亮度。
实验结果
实验组、空白控制组、以及对照组的黑色素相对表现量系依下列公式计算：黑色素相对表现量(％)＝(各组OD450值/空白控制组OD450值)×100％。因实验系进行三重复，故将三重复实验之结果平均后，显示于图4。
如图4所示，由空白控制组、对照组的结果可知，在经过蓝光照射后，细胞中的黑色素表现量将明显增加，显示蓝光照射确实会促使黑色素瘤细胞产生黑色素，而这将使得肌肤产生斑点、或使肌肤整体较为暗沈。而另一方面，根据对照组以及实验组的结果可知，当细胞经过山葵叶汁液处理后，其在蓝光下的黑色素表现量将低于未经过山葵叶汁液处理的对照组(降低约21％)，显示山葵叶汁液可有效减少黑色素细胞因蓝光所生成之黑色素。
[例6]细胞实验-山葵叶汁液抑制酪胺酸之形成
准备一6孔盘，于每一孔中种入2ml含B16F10细胞(ATCC:CRL:6475)的培养液[Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)、1％青霉素-链霉素 (Penicillin-streptomycin，Gibco)、10％胎牛血清(Gibco)]，使每孔具有1.5x 105个细胞，于37℃下，培养24小时。
之后，小心移除培养液而不要干扰到贴附之细胞。再于对照组(其中三孔) 加入2ml的新鲜DMEM培养液，并于实验组(另外三孔)加入2ml浓度为1 mg/ml之山葵叶提取液物样品，反应48小时。前述之「山葵叶汁液样品」系将以例1之方式所制备之山葵叶汁液以培养基与前述的稀释山葵叶提取液，配制成每毫升含1毫克之稀释山葵叶提取液的溶液。
接着，将培养液移除后，以1x PBS(Gibco)清洗两次。再加入胰蛋白酶-EDTA 对细胞作用3分钟，回收悬浮的细胞于15ml离心管，以400xg离心5分钟使细胞沉淀。
而后，再将沉淀细胞以1x PBS清洗两次后，以200μl细胞裂解液让细胞悬浮，震荡混合后以12,000xg离心20分钟。
将上清液后取出至1.5ml离心管中，进行蛋白质浓度的检测：A.将Bio-rad 染剂与去离子水混合(体积比为1:4)，分装500μl至微量离心管中；B.分别于前述微量离心管中，加入10、8、6、4、2、1与0μl 2mg/ml的BSA以制备标准浓度蛋白质；C.加入2μl测试样本进行检测。取出前述反应后之测试样本200 μl于96孔盘中，以ELISA读取仪(BioTek)测定595nm的吸光值。
之后于每孔中加入400μg蛋白质，再加入90μl细胞裂解液，包括控制组。在避光环境下，在37℃下加入10ul 10M的L-Dopa，每10分钟观察一次，直到悬浮液变黑。之后再测定405nm的吸光值。
酪胺酸酶含量的分析公式为：酪胺酸酶抑制性(％)＝(样本吸光值/控制组吸光值)×100％。所得数值再以微软EXCEL软件，利用Student t检定进行统计分析，其结果如图5所示。
由图5之结果可知，在含有本发明实施例之山葵叶汁液的情况下，酪胺酸酶活性降低约24％。因此，藉由本发明实施例之山葵叶汁液，确实可降低酪胺酸酶活性，进而可减少黑色素的生成，因而可应用于减少皮肤黑斑，使皮肤白净的相关组合物的成分中。
[例7]人体实验-以内服方式使用山葵叶汁液
使用样品：含本发明之山葵叶汁液之饮品50g/瓶(以水以及山葵叶汁液所配制成每50g的饮品中含有3g的山葵叶提取，即占6wt％)。在另一些其他的实施例中，每人一日可摄取山葵叶汁液至多5g。其中，此山葵叶汁液系由实施例1之方法所制备而成。其白利糖度值(Degrees Brix)为8。
受试者人数：10位25-40岁之受试者。
实验方式：受试者每日饮用一瓶含本发明之山葵叶汁液之饮品(每瓶含有 3g山葵叶汁液)，共饮用56日(即8周)。并于开始饮用前(脸部已清洁，第0周)以及饮用56日后，依据不同检测项目，使用对应的仪器及测量方式，纪录脸部肌肤之数值、并拍摄饮用前、后的照片。(于饮用前、后进行检测时，受试者所在的测试区域的温度与湿度为一致，以减少外界的温湿度等因素会对皮肤所造成的影响)。
检测项目：将分别对肌肤进行1.经皮水分散失率、2.肌肤含水量、3.肌肤弹性、4.肌肤紧实度、5.肌肤斑点、6.肌肤紫外线色斑、7.肌肤纹理、8.肌肤毛孔、 9.肌肤皱纹、10.原生紫质(痤疮杆菌分泌物)。
1.经皮水分散失率
使用购自德国Courage+Khazaka electronic公司之肌肤水分散失检测探头
Figure RE-GDA0002756195360000151
TM 300(C+K Multi Probe Adapter System,Germany)进行检测。该检测探头系使用两端开放的圆柱形腔体在皮肤表面形成相对稳定的测试环境，通过测定不同两点的水蒸气压梯度，计算出经表皮蒸发的水分量，以此来衡量皮肤表面水分流失情况。
2.肌肤含水量
使用购自德国Courage+Khazaka electronic公司之肌肤含水量检测探头
Figure RE-GDA0002756195360000161
CM825(C+K Multi Probe Adapter System,Germany)进行检测。该检测探头系基于电容的原理进行测量。当水分含量发生变化时，皮肤的电容值亦发生变化，故可通过测定皮肤电容值，分析皮肤表面的含水量。
3.肌肤弹性(Elasticity)及4.紧实度(Firmness)
使用购自德国Courage+Khazaka electronic公司之肌肤弹力检测探头
Figure RE-GDA0002756195360000162
MPA580(C+K Multi Probe Adapter System,Germany)进行检测。测试原理是基于吸力和拉伸原理，在被测试的皮肤表面产生一个负压将皮肤吸进一个测试探头内，透过光学测试系统检测皮肤被吸进探头内的深度，并以软件分析计算皮肤弹性与紧实度。
5.肌肤斑点
使用美国Canfield所贩卖之VISIA高阶数字肤质检测仪进行检测，透过可见光拍摄高分辨率之肌肤图像，比对饮用前、饮用后的面部肌肤，并以内建软件根据肉眼可见的色素斑点数量与面积进行分析。测量数值越高，说明可见斑点越多。
6.肌肤紫外线色斑
同样使用美国Canfield所贩卖之VISIA高阶数字肤质检测仪进行检测，其系以UV光进行脸部肌肤拍摄。紫外线可被黑色素吸收，提高色素斑的显现度，侦测肉眼不可见的表皮层黑色素斑。测量数值越高，说明紫外线色斑越多。
7.肌肤纹理
肌肤纹理亦系使用美国Canfield所贩卖之VISIA高阶数字肤质检测仪进行检测，其原理乃以可见光拍摄高分辨率之肌肤影像，并以内建软件根据皮肤的凹陷与凸起进行粗糙度分析。测量数值越高，说明皮肤越越粗糙。
8.肌肤毛孔状态
使用美国Canfield所贩卖之VISIA高阶数字肤质检测仪进行检测，透过高分辨率之相机镜头对饮用前、饮用后的面部肌肤进行拍摄。藉由标准白光照射，造成毛孔凹陷处产生阴影，毛孔会比周围的肤色更黑，故可以此侦测毛孔，然后利用软件根据毛孔数目、面积分析得到一数值，而数值越高则显示其毛孔数量、面积较多。
9.肌肤皱纹
使用美国Canfield所贩卖之VISIA高阶数字肤质检测仪进行检测，透过高分辨率之相机镜头对饮用前、饮用后的面部肌肤进行拍摄，藉由标准白光照射、侦测皮肤阴影的变化，即可侦测纹理位置并得到一数值，可代表皮肤的平滑程度。
10.原生紫质(痤疮杆菌分泌物)
痤疮杆菌在生长时会分泌紫质，紫质在紫外线照射中会产生荧光反应，因此可使用美国Canfield所贩卖之VISIA高阶数字肤质检测仪进行检测。该仪器以UV光进行脸部肌肤拍摄，侦测皮肤紫质含量。测量数值越高，说明痤疮杆菌生长旺盛，易产生痤疮。
请参阅图6。该图系受试者在饮用含本案山葵叶汁液之饮品8周后之皮肤状态之平均改善百分比，而改善比例占总受试人数之100％。其中，经皮水分散失率改善12.9％、肌肤含水量增加12.6％、肌肤弹性增加5.1％、肌肤紧实度增加7.4％、肌肤斑点改善14％、肌肤紫外线斑改善16％、肌肤纹理改善20％、肌肤毛孔状态改善13％、肌肤皱纹改善10％、肌肤原生紫质(痤疮杆菌分泌物) 改善16％。由此可见，本发明之山葵叶汁液据具淡斑、保湿及改善皮肤细致度之功效，且可帮助抑制痤疮之生成。
综合前述，本案除证实山葵叶汁液可抑制醣化终产物之生成，有效推迟皮肤老化之外，亦可透过抑制IL-8基因之表现量及IL-8之分泌量达到抗发炎以及抑制痤疮生成之效果。因此，本发明之山葵叶汁液具抗醣化与抗痘之效果。同时，本案亦证实山葵叶汁液可抑制酪胺酸脢，进而达到美白及抑制黑色素形成之功效。在人体试验方面，本案证实了山葵叶汁液能有效改善众多皮肤老化之状态，如降低透过皮肤散失之水量、提升肌肤含水量、提升肌肤弹性增加、提升肌肤紧实度、淡化肌肤斑点、淡化肌肤紫外线斑点、改善肌肤纹理、改善肌肤毛孔状态、淡化肌肤皱纹及减少肌肤原生紫质。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
Figure RE-GDA0002756195360000191
Figure RE-GDA0002756195360000201
【序列表】
<110> 大江生医股份有限公司
<120> 山葵叶汁液用于改善肌肤之用途
<130> N/A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-8-F
<400> 1
ttttgccaag gagtgctaaa ga 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-8-F
<400> 2
aaccctctgc acccagtttt c 21

Claims (10)

1.一种山葵叶汁液用于减缓皮肤老化的用途，其特征在于，所述山葵叶汁液是以一含水的溶剂提取一山葵叶所获得。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该山葵叶汁液是通过降低醣化终产物的形成以达到所述减缓皮肤老化。
3.一种山葵叶汁液用于制备一抑制皮肤痤疮形成的组合物的用途，其特征在于，且其中所述山葵叶汁液系以一含水的溶剂提取一山葵叶所获得。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述山葵叶汁液通过调控抗发炎相关基因表现量达到所述抑制皮肤痤疮形成。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述抗发炎基因为介白素-8基因。
6.一种山葵叶汁液用于制备一改善皮肤状态的组合物的用途，其特征在于，所述山葵叶汁液以一含水的溶剂提取一山葵叶所获得，且其中所述改善皮肤状态为降低通过皮肤散失的水量、提升肌肤含水量、提升肌肤弹性增加、提升肌肤紧实度、淡化肌肤斑点、淡化肌肤紫外线斑点、改善肌肤纹理、改善肌肤毛孔状态、淡化肌肤皱纹、减少肌肤原生紫质、预防皮肤黑色素生成、抑制皮肤黑色素生成或其组合。
7.如权利要求1、3或6中任一项所述的用途，其特征在于，所述山葵叶汁液的白利糖度值为7.5～8.5。
8.如权利要求1、3或6中任一项所述的用途，其特征在于，所述组合物进一步制备成食品组合物、保养品组合物、保健食品组合物、或化妆品组合物。
9.如权利要求1、3或6中任一项所述的用途，其特征在于，所述含水的溶剂与该山葵叶的液固比为10:1～20:1。
10.如权利要求1、3或6中任一项所述的用途，其特征在于，所述提取是于70℃～100℃进行。
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