CN114181948A

CN114181948A - 用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法

Info

Publication number: CN114181948A
Application number: CN202111506682.XA
Authority: CN
Inventors: 吴双; 吴敏亮
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2041-12-10
Also published as: WO2023103267A1; CN114181948B

Abstract

本发明提供了用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法。通过突变/沉默/超量表达一个或多个表皮毛发育相关基因，调控植物不同类型多细胞表皮毛细胞的分化。超量表达LFS；或者敲除/沉默Slwox3b、MX1基因中的一个或两个；或同时敲除/沉默Slwox3b、MX1、MTR1、MTR2和MTR3基因；或者敲除/沉默Slwox3b、MX1基因的同时超量表达Wo^P635R和/或Wo^I692RD695Y基因能促进植物盾状分泌型表皮毛的形成。敲除/沉默LFS基因或者MTR1、MTR2、MTR3基因中的一个或多个，促进植物指状多细胞表皮毛分化。该方法对于增强植物的抗逆性，增强植物合成分泌代谢产物能力具有重要意义。

Description

用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法。

背景技术

植物表皮毛能够增强植物的抗逆能力(Li, L.. et al. The Plant cell, 2004,16, 126-143.)。多数陆生植物的地上组织表皮上都具有多细胞表皮毛。按照形态特征，将多细胞表皮毛分为指状多细胞表皮毛（Digitate trichome）和盾状分泌型多细胞表皮毛（Peltate trichome）（图1）。

因为植物表皮毛是植物表皮上独立的细胞群体，存储和分泌代谢物对植物其它组织的生长发育没有影响(Sirikanta ramas et al. Plant Cell Physiol, 2005, 46:1578-1582)，因此分泌型多细胞表皮毛被认为是植物的“代谢物合成工厂”。在一些植物（如烟草、番茄和大麻)的叶子上的分泌型表皮毛上合成和累计的代谢物可占其叶干重的多达10-15％(Wagner et al. Ann.Bot. 2004, 93:3-11）。在不同类型表皮毛中往往可以合成和分泌不同的次级代谢产物(Schilmiller et al. Plant Journal, 2008, 54, 702-711)。如番茄指状多细胞表皮毛种的I和IV型毛可以合成和分泌酰基糖(McDowell et al.Plant physiology, 2011, 155, 523-439; Schilmiller et al. PNAS, 2012, 109,16377-16382)，番茄的盾状分泌型表皮毛VI型毛可以合成大量烯萜类代谢产物(Schilmiller et al. Plant physiology, 2010, 153, 1212-1223; Bergau et al.,BMC plant biology, 2015, 15)；青蒿（Artemisia annua）的盾状分泌型表皮毛是合成和分泌的青蒿素重要组织(Graham et al. Science, 2010, 327, 328-331)；同样的，大麻（Cannabis sativa L .）盾状分泌型表皮毛也是是合成和分泌的大麻素重要组织（Brenneisen R. Chemistry and analysis of phytocannabinoids and other Cannabisconstituents. Marijuana and the Cannabinoids: Springer; 2007. p. 17–49.）。为此，控制植物不同类型多细胞表皮毛的分化，对于增强植物的抗逆能力，以及增强植物合成分泌代谢产物能力具有重要意义。

发明内容

本发明提供了用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法为突变植物细胞中的表皮毛发育相关基因；所述表皮毛发育相关基因包括：MTR1基因、MTR2基因、MTR3基因、LFS基因、Slwox3b基因、MX1基因、Wo^P635R基因和Wo^I692RD695Y；

所述MTR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述MTR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述MTR3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述LFS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述Slwox3b基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述MX1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；

所述Wo^P635R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；

所述Wo^I692RD695Y基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示；

所述方法为通过基因敲除方法，或基因沉默方法（RNAi），或基因超表达方法。

进一步的，所述表皮毛发育相关基因具有与上述表皮毛发育相关基因MTR1基因、MTR2基因、MTR3基因、LFS基因、Slwox3b基因、MX1基因和Wo^P635R基因至少70%相似度的核苷酸序列或者氨基酸序列。

进一步的，用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法：敲除/沉默LFS基因，或者敲除/沉默MTR1、MTR2、MTR3基因中的一个或多个，促进植物指状多细胞表皮毛分化，同时抑制盾状分泌型表皮毛的形成。

进一步的，用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法：超表达LFS基因，或者敲除/沉默Slwox3b基因和MX1基因中的一个或两个，促进盾状分泌型表皮毛的形成。

进一步的，用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法：同时敲除/沉默Slwox3b基因、MX1基因、MTR1基因、MTR2基因和MTR3基因，促进植物盾状分泌型表皮毛的形成。

进一步的，用于一种调控植物多细胞表皮毛分化的方法：敲除/沉默Slwox3b基因、MX1基因的同时超表达Woolly基因功能获得型突变等位基因Wo^P635R和/或Wo^I692RD695Y，促进植物盾状分泌型表皮毛的形成。

进一步的，一种表达载体：所述表达载体含有上述方法中的表皮毛发育相关基因。所述植物表达载体包括重组转化所形成的突变体，以及由此产生的外源基因表达产物；所述突变体包括茄科、桑科和其他具有多细胞表皮毛的植物，包括但不限于烟草、番茄、大麻。

上述用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法在促进或抑制植物多细胞表皮毛分化中的应用。

本发明的有益之处在于：本发明提供了多种调控植物多细胞表皮毛分化的方法。本发明提供了MTR1基因、MTR2基因、MTR3基因、LFS基因、Slwox3b基因、MX1基因、Wo^P635R基因和Wo^I692RD695Y基因，共8个表皮毛发育相关基因；通过改变植物细胞中的一个或多个表皮毛发育相关基因的表达调控植物植物不同类型多细胞表皮毛的分化。（1）敲除/沉默LFS基因或者敲除/沉默MTR1、MTR2、MTR3基因中的一个或多个，促进植物指状多细胞表皮毛分化，同时抑制盾状分泌型表皮毛的形成；（2）超量表达LFS基因或者敲除/沉默Slwox3b基因和MX1基因中的一个或两个，促进盾状分泌型表皮毛的形成。（3）同时敲除/沉默Slwox3b基因、MX1基因、MTR1基因、MTR2基因和MTR3基因等基因，促进植物盾状分泌型表皮毛的形成。（4）敲除/沉默Slwox3b基因和MX1基因的同时超量表达Woolly基因功能获得型突变等位基因Wo^P635R和/或Wo^I692RD695Y，促进植物盾状分泌型表皮毛的形成。本发明的方法对于增强植物的抗逆能力，以及增强植物合成分泌代谢产物能力具有重要意义。本发明的方法适用于与番茄具有类似表皮毛结构的植物中使用，其中包括烟草和大麻，以及具有相似表皮毛细胞结构的茄科、桑科植物。

附图说明

图1：盾状表皮毛细胞和指状表皮毛细胞的分类。I、II、III、IV、V 5种表皮毛细胞归类为指状多细胞表皮毛，VI、VII这两种具有盾状分泌细胞的分泌型表皮毛归类为盾状分泌型表皮毛。

图2:敲除MTR1、MTR2、MTR3基因可以增加指状表皮毛细胞的密度。(A) MTR1、MTR2、MTR3基因多靶点CRISPR/CAS9敲除载体示意图；(B) 野生型（WT）、单独突变MTR1、MTR2、MTR3基因转基因植株叶片表皮毛扫描电镜图；(C) 同时突变MTR1、MTR2、MTR3基因转基因植株叶片表皮毛扫描电镜图；标尺为500μm。

图3:敲除LFS基因可以抑制分泌型表皮毛细胞的形成。(A) LFS基因CRISPR/CAS9敲除载体示意图；(B)野生型（WT）、LFS基因突变转基因植株叶片表皮毛扫描电镜图；标尺为500μm。

图4:敲除Slwox3b和MX1基因可以促进盾状表皮毛细胞的分化。(A) Slwox3b、MX1基因多靶点CRISPR/CAS9敲除载体示意图；(B) 野生型（WT）、单独突变Slwox3b、MX1基因转基因植株叶片表皮毛扫描电镜图；(C) 同时突变Slwox3b、MX1基因转基因植株叶片表皮毛扫描电镜图；标尺为500μm。

图5:超量表达LFS基因可以促进盾状表皮毛细胞的形成。(A) LFS基因超量表达载体示意图；(B) 野生型（WT）、LFS基因超量表达转基因植株叶片表皮毛扫描电镜图；标尺为200μm。

图6:同时敲除MTR1、MTR2、MTR3、Slwox3b和MX1等基因可以极显著增加状表皮毛细胞的数量。野生型（WT）、CR-MTR1/2/3、CR-Slwox3b/MX1、CR-MTR1/2/3/Slwox3b/MX1等转基因植株叶片表皮毛扫描电镜图，标尺为500μm。

图7:在同时敲除Slwox3b和MX1基因的材料中表达Wo^P635R基因可以极显著增加状表皮毛细胞的数量。（A）Woolly基因启动子序列驱动Wo^P635R表达的载体示意图；（B）野生型（WT）、pwo: Wo ^P635R、CR-Slwox3b/MX1、pwo: Wo ^P635R ×Slwox3b/MX1等转基因植株叶片表皮毛扫描电镜图，标尺为500μm。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

盾状不同类型的多细胞表皮毛往往具有不同的功能。本发明中公开的方法中，同时沉默或者敲除在SEQ ID NO.1-2，3-4，5-6所列出的MTR1、MTR2、MTR3基因，可以显著增加指状多细胞表皮毛的数量，同时抑制盾状分泌型表皮毛的形成，这对于指状多细胞表皮毛的功能研究和运用将会有很大帮助。

沉默或者敲除在SEQ ID NO.7-8所列出的LFS基因，同样可以极显著的减少包括盾状多细胞表皮毛在内的所有分泌型表皮毛的形成，而促进指状非分泌型多细胞表皮毛分化，这对于指状多细胞表皮毛的功能研究和运用将会有很大帮助。

盾状分泌型表皮毛是植物合成和分泌代谢产物的重要场所，因此，增加盾状分泌型多细胞表皮毛的分化和密度，相当于增加了合成和分泌植物代谢产物的产量。而且，本文公开的增加盾状分泌型多细胞表皮毛分化的方法对植物自身的生长发育几乎没有影响，这极大地增加了本发明的实用性。

其中，在沉默或者敲除在SEQ ID NO.9-12所列出的Slwox3b和MX1基因核苷酸和蛋白氨基酸序列，以及与SEQ ID NO.9-12所列序列具有至少约70%相似度的核苷酸或者氨基酸序列基因，可以极显著增加头状分泌型表皮毛的密度。

或者，通过组成型表达或者诱导表达或者在表皮中特异表达如SEQ ID NO.10所列LFS基因，或者与SEQ ID NO.10所列核苷酸序列具有至少约70%相似度的核苷酸序列，可以极显著增加头状分泌型表皮毛的密度。

或者，同时沉默或者敲除SEQ ID NO.1-2，3-4，5-6，9-12所列出的MTR1、MTR2、MTR3、Slwox3b和MX1基因核苷酸和蛋白氨基酸序列，以及与SEQ ID NO.1-2，3-4，5-6，9-12所列序列具有至少约70%相似度的核苷酸或者氨基酸序列，也可以极显著增加头状分泌型表皮毛的密度。

或者，在沉默或者敲除在SEQ ID NO.9-12所列出的Slwox3b和MX1基因核苷酸和蛋白氨基酸序列，以及与SEQ ID NO.9-12所列序列具有至少约70%相似度的核苷酸或者氨基酸序列的遗传材料中，再组成型表达或者诱导表达或者在植物表皮上特异表达SEQ IDNO.13-14 所列的已公开的Woolly基因功能获得型突变等位基因Wo^P635R或者SEQ ID NO.15-16所列已公开的Woolly 基因功能获得型突变等位基因Wo^I692RD695Y。或者在SEQ ID NO.13-16所列Woolly 基因功能获得型突变等位基因Wo^P635R和Wo^I692RD695Y相同或者序列具有至少约70%相似度的核苷酸或者氨基酸序突变体材料中，再沉默或者敲除在SEQ ID NO.9-12所列出的Slwox3b和MX1基因核苷酸和蛋白氨基酸序列，以及与SEQ ID NO.9-12所列序列具有至少约70%相似度的核苷酸或者氨基酸序列，都可以极显著增加头状分泌型表皮毛的密度。

说明

仅以说明的方式而不是以限制性的方式提供以下实施案例。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本相同或相似结果。这些实施案例绝不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。

在一些近源种植物中，它们的多细胞表皮毛的调控机制往往具有很高的相似性，比如烟草、番茄、大麻等植物。本发明要求的遗传工程转化植物或植物细胞包括茄科、桑科和其他具有上述表皮毛的植物，这其中包括了烟草、番茄、大麻等常见植物。本文提供实施案例中仅展示在番茄中的遗传转化结果，这只是为了展示我们的发明方法的可行性，而不是限制本发明的实施，也不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。

本发明所描述的“I、II、III、IV、V、VI、VII”，“指状多细胞表皮毛”（Digitatetrichome）,“盾状多细胞表皮毛”（Peltate trichome）等术语是其它文献中已经报道的多细胞表皮毛分类（Simmons,A.T. and Gurr, G.M. Agr Forest Entomol, 2005, 7, 265–276.）。为了方便展示本发明的成果，我们也在本发明附图1中定义了“指状多细胞表皮毛”和“盾状多细胞表皮毛”，在不同茄科和桑科等植物中，其多细胞表皮毛亚型和形态可能与文中所列表皮毛细胞存在部分差异，但是这不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。

敲除或者沉默一个基因的方法有很多，其目的是为了让目的基因的无法表达或者表达量降低，只要能够达到抑制目的基因表达的方法都可以视为具有敲除或者沉默目的基因表达作用。这里面包括RNAi技术、CASPR/CAS9技术、诱变或者表观遗传修饰等。本发明中只展示CRISPR/CAS9敲除用于敲除目的基因，是为了证明本发明方法的可靠性，而不是限制本发明的实施，也不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。

目前敲除或者沉默载体构建:敲除或者沉默载体的构建已经是公开多年的成熟技术，本文提供实施案例中仅使用CRISPR/CAS9敲除载体对靶标基因进行敲除。一个基因往往具有多个CRISPR/CAS9敲除靶位点，本文只选择其中的一个位点进行敲除实验展示。这些是为了展示说明我们的发明方法的结果，而不是限制本发明的实施，也不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。

同时，组成型表达或者诱导表达或者再植物表皮上特异表达载体有很多，其构建技术也是已经公开的技术，本文提供实施案例中仅使用烟草花叶病毒35S启动子，以及woolly基因启动子载体是用于展示我们的发明方法的结果，而不是限制本发明的实施，也不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。

植物的遗传转化：目前已公开的植物遗传转化方法有很多种。本文提供实施案例中仅使用农杆菌介导的遗传转化方法，这只是为了展示我们的发明方法的可行性，而不是限制本发明的实施，也不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。

实施例1用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法

（1）载体构建：以番茄基因组中的MTR1、MTR2、MTR3基因为例，从公开的CRISPR/CAS9靶点设计在线网站上（CRISPR-P v2.0 (hzau.edu.cn)）设计SEQ ID NO.1，3，5所列出的MTR1、MTR2、MTR3基因的敲除靶位点扩增引物 (Hao Liu, et al. Mol Plant, 2017, 10(3): 530-532.)，其引物分别为CR-MTR1-F: 5’-GATTATGAGCAGGAGAAATGGAAA-3’, CR-MTR1-R: 5’-AAACTTTCCATTTCTCCTGCTCAT-3’；CR-MTR2-F: 5’ -GATTGTTCAAAATGAACTACAGGA-3，CR-MTR2-R: 5’- AAACTCCTGTAGTTCATTTTGAAC-3’；CR-MTR3-F: 5’-GATTATGAGTAGAAGGAATGGAAA -3’, CR-MTR3-R: 5’ -AAACTTTCCATTCCTTCTACTCAT-3’。通过退火延伸将引物聚合成引物二聚体。再通过酶切链接（BsaI酶切位点）将靶序列插入到pU6-M载体中的sgRNA骨架上，sgRNA骨架的启动子为番茄U6启动子。用热激法将连接产物转入DH5α感受态细胞中，并用含有100mg/L氨苄霉素的LB培养基进行筛选，在在37℃培养箱中过夜培养后，第二天挑单菌落进行PCR鉴定，并将阳性克隆在含有相应抗性的LB液体培养基中大摇16小时，提质粒送测序公司进行测序分析。将测序正确的阳性质粒进行酶切（SpeI和SalI），并将切下来的sgRNA片段切胶回收，最后再通过酶切连接（SpeI和SalI酶切位点）插入35S启动子驱动的CRISPR/CAS9终载中。用热激法将连接产物转入DH5α感受态细胞中，并用含有100mg/L卡那霉素的LB培养基进行筛选，经过PCR鉴定后，将阳性克隆在含有相应抗性的LB液体培养基中大摇16小时，提质粒送测序公司进行测序分析。

本实施例中还使用了CRISPR/CAS9多基因敲除方法。实施步骤如下：先分别构建分别单独敲除MTR1、MTR2、MTR3基因的pU6-M载体。再用NheI和SalI酶对单独敲除MTR1基因的pU6-M载体进行酶切，并通过电泳切胶回收切开的载体骨架备用。同时使用SpeI和SalI酶对单独敲除MTR2基因的pU6-M载体进行酶切，并回收切下来的sgRNA-MTR2片段。通过酶切连接将单独敲除MTR2的sgRNA-MTR2片段插入单独敲除MTR1基因的pU6-M载体中，构建完成同时敲除MTR2和MTR2的pU6-M载体。使用NheI和SalI酶对同时敲除MTR1和MTR2的pU6-M载体进行酶切，并切胶回收作为骨架载体备用。同时使用SpeI和SalI酶对单独敲除MTR3基因的pU6-M载体进行酶切，并回收切下来的sgRNA-MTR3片段。通过酶切连接将单独敲除MTR3的sgRNA-MTR3片段插入到同时敲除MTR1和MTR2基因的pU6-M载体中，构建完成同时敲除MTR1、MTR2和MTR3的pU6-M载体。最后再通过酶切连接（SpeI和SalI酶切位点）将3个串联了sgRNA的DNA片段插入35S启动子驱动的CRISPR/CAS9终载中，完成多基因敲除载体构建（图2A）。

（2）遗传转化：通过浓杆菌介导的遗传转化方法进行遗传转化，操作步骤参考前人已报道的方法（Hyeon-Jin Sun, Sayaka Uchii, Shin Watanabe, Hiroshi Ezura. Plantand Cell Physiology, March 2006, Volume 47, Issue 3, Pages 426–431.）。步骤如下：首先，将阳性克隆质粒通过热激法转入C58感受态细胞中，通过含有卡那霉素（100mg/L）和利福平（50mg/L）的固体LB筛选培养基进行筛选，在28℃培养箱中培养48小时后。将经过PCR鉴定的阳性克隆，使用含有卡那霉素（100mg/L）和利福平（50mg/L）的LB液体培养基进行扩繁。待菌浓度OD值达到0.6时，将菌体离心后收集后用KC液体培养基(含1.5 mg/L zeatin的MS培养基)重悬，继而进行农杆菌侵染番茄子叶（时间5分钟）。侵染结束后，将子叶转移到KC固体培养基中，黑暗室温条件下共培养48小时，再将子叶转移至筛选培养基（含1.5 mg/Lzeatin和300mg/L的特美丁，植物筛选抗生素根据使用载体的植物抗性决定，如果使用载体的植物抗性基因为潮霉素基因，则加入10 mg/L的潮霉素，如果是卡那霉素抗性，则再加入100 mg/L的卡那霉素）进行筛选，温度26℃，光照16小时，黑暗8小时。生长2-3周后，转入含1mg/L zeatin的筛选培养基（其它成分不变）继续筛选；待转基因植株幼芽长出来后，将幼芽用手术刀切下来，并转移到生根培养基中进行生根培养（1/2MS，300mg/L的特美丁以及植物抗性10 mg/L的潮霉素或者100 mg/L的卡那霉素）。最终获得了单独突变或者同时突变MTR1、MTR2、MTR3基因的突变材料。从扫描电镜图片可以清楚的看到，单独突变MTR1、MTR2、MTR3基因就可以引起植物指状多细胞表皮毛密度的增加，以及盾状分泌型表皮毛细胞的减少（图2B）。同时突变MTR1、MTR2、MTR3基因则可以极显著增加指状多细胞表皮毛的密度，同时抑制盾状分泌型多细胞表皮毛的形成（图2C）。

实施例2用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法

（1）载体构建：以番茄基因组中的LFS基因为例，从公开的CRISPR/CAS9靶点设计在线网站上（CRISPR-P v2.0 (hzau.edu.cn)）设计SEQ ID NO.7所列出的LFS基因的敲除靶位点扩增引物，其引物分别为CR-LFS-F: 5’-GATTCCCTCCGCGGTGCGATACCG-3’, CR-LFS-R:5’-AAACCGGTATCGCACCGCGGAGGG-3’。通过通过退火延伸将引物聚合成引物二聚体。再通过酶切链接（BsaI酶切位点）将靶靶序列插入到pU6-M载体中的sgRNA骨架上。并将测序正确的阳性质粒进行酶切（SpeI和SalI），并将切下来的sgRNA片段切胶回收，最后再通过酶切连接（SpeI和SalI酶切位点）插入，将sgRNA片段插入最终的CRISPR/CAS9载体中（图3A）。用热激法将连接产物转入DH5α感受态细胞中，并用含有100mg/L卡那霉素的LB培养基进行筛选，经过PCR鉴定后，提取阳性克隆质粒送测序公司进行测序分析。

（2）遗传转化：通过浓杆菌介导的遗传转化方法进行遗传转化（转化步骤参考具体实施案例1）。经过筛选，最终获得了敲除LFS基因的突变材料。从扫描电镜图片可以清楚地看到，敲除LFS基因就可以引起植物包括盾状多细胞表皮毛细胞在内的所有分泌型表皮毛细胞消失，同时指状多细胞表皮毛密度增加（图3B）。

实施例3用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法

（1）载体构建：以番茄基因组中的Slwox3b和MX1基因为例，从公开的CRISPR/CAS9靶点设计在线网站上（CRISPR-P v2.0 (hzau.edu.cn)）设计SEQ ID NO.9、11所列出的Slwox3b和MX1基因的敲除靶位点扩增引物。其引物序列如下：CR-Slwox3b-F: 5’ -GATTGTTTCAAAACCATAAAGCTA-3’,CR-Slwox3b-R:5’-AAACTAGCTTTATGGTTTTGAAAC-3’;CR-MX1-F:5’-GATTGTGCTTTGCCAACTAAAGCCGG-3’,CR-MX1-R:5’-AAACCCGGCTTTAGTTGGCAAAGCAC-3’。通过退火延伸将引物聚合成引物二聚体，再通过酶切链接（BsaI酶切位点）将靶靶序列插入到pU6-M载体中的sgRNA骨架上。用热激法将连接产物转入DH5α感受态细胞中，初步筛选阳性sgRNA骨架载体。并将测序正确的阳性质粒进行酶切（SpeI和SalI），并将切下来的sgRNA片段切胶回收，最后再通过酶切连接（SpeI和SalI酶切位点）插入35S启动子驱动的CRISPR/CAS9终载中。用热激法将连接产物转入DH5α感受态细胞中，并用含有100mg/L卡那霉素的LB培养基进行筛选，经过PCR鉴定后，将阳性克隆质粒送测序公司进行测序分析。同时敲除Slwox3b和MX1基因基因的CRISPR/CAS9载体构建参考实施列1中的方法，构建所得载体示意图如图4A。

（2）遗传转化：通过浓杆菌介导的遗传转化方法进行遗传转化（转化步骤参考具体实施案例1）。最终获得敲除Slwox3b和MX1基因的突变材料（图4B）。从扫描电镜图片可以清楚地看到，单独敲除Slwox3b和MX1就可以引起指状多细胞表皮毛细胞密度减少，盾状多细胞表皮毛细胞增加的表型。同时敲除Slwox3b和MX1基因则可以完全抑制指状多细胞表皮毛细胞的分化，导致所以表皮毛细胞都转变为盾状多细胞表皮毛细胞（图4C）。

实施例4用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法

（1）载体构建：以番茄基因组中的LFS基因为例。使用高保真酶，PCR扩增将SEQ IDNO.7所列出的LFS基因核苷酸片段。其扩增引物为：LFS-EcoRI-F: 5’-ACCGGTACCAAGCTTGAATTCATGGAAGATGCAATGAGAAGACTTA-3’，LFS-EcoRI-R: 5’-CCCTTGCTCACCATGAATTCAGCATTTTGCAGCTTGGCTGCAAAA-3’。切胶回收PCR产物，再通过infusion连接方法，将回收到的LFSDNA片段插入到由烟草花叶病毒35S启动子驱动的表达载体中（图5A）。

（2）遗传转化：通过浓杆菌介导的遗传转化方法进行遗传转化（转化步骤参考具体实施案例1）。最终获得了LFS基因超量表达转基因植株。从扫描电镜图片可以清楚的看到，超量表达LFS基因，可以极显著地增加植物表皮上盾状多细胞表皮毛细胞的密度（图5B）。

实施例5用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法

（1）载体构建：与实施案例1和3中相同的方法构建载体，获得MTR1、MTR2、MTR3、Slwox3b和MX1基因的多靶点CRISPR/CAS9敲除载体。

（2）遗传转化：以实施案例3中同时敲除Slwox3b和MX1基因的不带CRISPR/CAS9载体的突变体材料为遗传转化背景材料。通过农杆菌介导的遗传转化（转化步骤参考具体实施案例1），筛选同时敲除MTR1、MTR2、MTR3基因的转基因植株，最终获得了MTR1、MTR2、MTR3、Slwox3b和MX1基因的多突变材料。从扫描电镜图片可以清楚地看到，同时敲除MTR1、MTR2、MTR3、Slwox3b和MX1基因的突变体材料上的盾状表皮毛细胞极显著高于Slwox3b和MX1基因的双突变材料上的盾状表皮毛细胞密度（图6）。

实施例6用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法

（1）载体构建：

用pWo-SacI-F: 5'-AACGCGTTGGGAGCTCTACATACAGAACTTATGAGGGAAT-3'和pWo-XbaI-R: 5'-CATTAAAGCAGGACTCTAGACTTGAATACCTTCTCGATCTTCTT-3'引物扩增Woolly基因启动子（pWo）序列（SEQ ID NO. 17），并将目的条带切胶回收。同时通过SacI和EcoRI内切酶将表达载体上的35S启动子切除，再将切胶回收的Woolly基因启动子序列通过infusion方法插入表达载体中，构建Woolly基因启动子pWo驱动的表达载体。再使用Wo-XbaI-F: 5' -AGAAGGTATTCAAGTCTAGAATGTTTAATAACCACCAGCACTTGC-3'和Wo-XbaI-R: 5'-CATTAAAGCAGGACTCTAGATCACTGCATTTGCGGAAGTTACAGCA-3'引物扩增Woolly基因功能获得型突变等位基因Wo^P635R，切胶回收目的片段。同时用XbaI内切酶将pWo驱动的表达载体切开，再使用infusion方法将Wo^P635R基因片段插入到pWo启动子后面，最终构建形成pWo：Wo^P635R的表达载体（图7A）。

（2）遗传转化：以实施案例3中获得的Slwox3b和MX1双突变体为背景材料，通过农杆菌介导的遗传转化（转化步骤参考具体实施案例1），筛选获得Woolly基因功能获得型突变等位基因Wo^P635R的转基因植株。从扫描电镜图片可以清楚的看到，在Slwox3b和MX1的双突变体材料上，用Woolly基因启动子驱动Woolly基因功能获得型突变等位基因Wo^P635R（基因序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14 所示）的表达，可以极显著促进盾状多细胞表皮毛在Slwox3b和MX1基因的双突变材料上的分化（图7B）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法

<130> 35

<160> 35

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 321

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.1

<400> 1

atgagcagga gaaatggaaa tggttcaagg cttgacctaa aattgaattt gtcaccacca 60

cctagagtga accacgtggg gccacaagtg gagtcgccga caaggtcgct gacaatgtcc 120

ccgacgaatt catgtgtatc atctgataat tcgtcggggg gacaacgtgg ttccaacagc 180

cccgaagcgg tgacttcgat gctgttggtt ggttgtcaaa ggtgtctaat gtatgttatg 240

gtatcggaag ttaatgatcc accaaggtgc ccaaaatgca agagtacttg tttgcttgaa 300

gttatctatg agaaaaaata a 321

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.2

<400> 2

Met Ser Arg Arg Asn Gly Asn Gly Ser Arg Leu Asp Leu Lys Leu Asn

1 5 10 15

Leu Ser Pro Pro Pro Arg Val Asn His Val Gly Pro Gln Val Glu Ser

20 25 30

Pro Thr Arg Ser Leu Thr Met Ser Pro Thr Asn Ser Cys Val Ser Ser

35 40 45

Asp Asn Ser Ser Gly Gly Gln Arg Gly Ser Asn Ser Pro Glu Ala Val

50 55 60

Thr Ser Met Leu Leu Val Gly Cys Gln Arg Cys Leu Met Tyr Val Met

65 70 75 80

Val Ser Glu Val Asn Asp Pro Pro Arg Cys Pro Lys Cys Lys Ser Thr

85 90 95

Cys Leu Leu Glu Val Ile Tyr Glu Lys Lys

100 105

<210> 3

<211> 360

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.3

<400> 3

atgaactaca ggagggagag tattcatgat ccaaagcttg atttgaagct gaatttatca 60

ccccctaggg aaaataataa tatgtttcca atattatcac caagcagatc atcgtcttcg 120

tatacttctt caatggagag atcaccagca agttcatgtg tttcaaggga accaactcca 180

gatcatcaag aattttttgg tagccctgaa gcaacaacaa cttctatgat gttagtagga 240

tgtccaagat gcttaatgta tgttatgtta tcagcggaag atccaaaatg ccccaaatgt 300

aagagctctg ttttgcttga ttttttccgc gaggatcgaa tcaataatcc aaagaattga 360

<210> 4

<211> 119

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.4

<400> 4

Met Asn Tyr Arg Arg Glu Ser Ile His Asp Pro Lys Leu Asp Leu Lys

1 5 10 15

Leu Asn Leu Ser Pro Pro Arg Glu Asn Asn Asn Met Phe Pro Ile Leu

20 25 30

Ser Pro Ser Arg Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Met Glu Arg Ser

35 40 45

Pro Ala Ser Ser Cys Val Ser Arg Glu Pro Thr Pro Asp His Gln Glu

50 55 60

Phe Phe Gly Ser Pro Glu Ala Thr Thr Thr Ser Met Met Leu Val Gly

65 70 75 80

Cys Pro Arg Cys Leu Met Tyr Val Met Leu Ser Ala Glu Asp Pro Lys

85 90 95

Cys Pro Lys Cys Lys Ser Ser Val Leu Leu Asp Phe Phe Arg Glu Asp

100 105 110

Arg Ile Asn Asn Pro Lys Asn

115

<210> 5

<211> 381

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.5

<400> 5

atgagtagaa ggaatggaaa tggtcctaaa cttgacttga ggttgaattt atcaccacca 60

agggttgtta accatcagga ccaacaccag caccagtacc agtaccacat tgatcaacaa 120

gagtcgttat cgcctaatag atcattggca acatcaccaa caagctcatg tgtgtcctca 180

gaggattcgc catctcatca acgccgcgat cctaatagcc ctgaaacaac aacatccatg 240

gtgctagttg gatgtccaag gtgtatgatg tatgtcatgt tagctgaggt tgatccaaga 300

tgccctaaat gcaaaagcac ttgtttgctt gatgtaattc atgaatccaa caattgtact 360

actaggagaa ggatcactta a 381

<210> 6

<211> 126

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.6

<400> 6

Met Ser Arg Arg Asn Gly Asn Gly Pro Lys Leu Asp Leu Arg Leu Asn

1 5 10 15

Leu Ser Pro Pro Arg Val Val Asn His Gln Asp Gln His Gln His Gln

20 25 30

Tyr Gln Tyr His Ile Asp Gln Gln Glu Ser Leu Ser Pro Asn Arg Ser

35 40 45

Leu Ala Thr Ser Pro Thr Ser Ser Cys Val Ser Ser Glu Asp Ser Pro

50 55 60

Ser His Gln Arg Arg Asp Pro Asn Ser Pro Glu Thr Thr Thr Ser Met

65 70 75 80

Val Leu Val Gly Cys Pro Arg Cys Met Met Tyr Val Met Leu Ala Glu

85 90 95

Val Asp Pro Arg Cys Pro Lys Cys Lys Ser Thr Cys Leu Leu Asp Val

100 105 110

Ile His Glu Ser Asn Asn Cys Thr Thr Arg Arg Arg Ile Thr

115 120 125

<210> 7

<211> 1161

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.7

<400> 7

atggaagatg caatgagaag acttaatcaa gaaactgatg ttccactcca aaacactaca 60

aactcttcca ctgttaataa aactagatct tcttgttcat caaacaaaag atcactcaaa 120

gatactgcta ctggtccctc cgcggtgcga taccgcggag ttcgtcgtcg tccttgggga 180

cgttatgcag ctgaaattcg tgaccctcaa tcaaaagaaa gaaggtggct cggtactttt 240

gataccgctg aagaagctgc ttgtgcttat gattgcgctg ctagagcaat gcgcggtgtt 300

aaagcacgta ctaatttcgt ctacccacct tgtcctactc ctacccaacc cacttctacc 360

aatgacgctt tgtttaatat tcattcgtct tataaattaa catcgcctta ctatcatcag 420

agttctaata ctcttaagga tttgtctaat agaccctttt ttcattcctc cagtccttat 480

ggttctacgg ggcgtgctca tgtgattggt cagaaaagca atgattcttt gaatatgctc 540

ctgtttcgtg aactcctgag ttcaaattcc agcaacaata ctaataattt gaacgtgact 600

agtagtatga acatgcctaa tttgtacgaa cagctgccga atttcacgat gaatcgtaat 660

accaacagct tcggttcgta tttgcctaat agcagcaacc ccgtgattcc cagttcttct 720

gtcatgacta ctcaggtccc caaattcgat aacactgtcc actgtactat caacaacaat 780

aacagtagta gtggtgctac cgcaaatgat gattctgctg cagggatgga ttttttccca 840

tctgagtcat ctgattctgg attattagaa gaggctttaa atggtttttt cccaaagccc 900

aagcccatta aatctgtacc atcatcatta cctaattacg aattttgcaa tattttctct 960

caacaaccgc aacaacagga gcagattaat aatggtggtt taaacagtga ttttggatta 1020

ttatcatcgt cattgtcatc atttccagtg gattattttc caggaaatct tcaggtagca 1080

ccaggagaca acataatggg agacatattt cagtatccag atcttctcag tatttttgca 1140

gccaagctgc aaaatgctta a 1161

<210> 8

<211> 386

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.8

<400> 8

Met Glu Asp Ala Met Arg Arg Leu Asn Gln Glu Thr Asp Val Pro Leu

1 5 10 15

Gln Asn Thr Thr Asn Ser Ser Thr Val Asn Lys Thr Arg Ser Ser Cys

20 25 30

Ser Ser Asn Lys Arg Ser Leu Lys Asp Thr Ala Thr Gly Pro Ser Ala

35 40 45

Val Arg Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Pro Trp Gly Arg Tyr Ala Ala

50 55 60

Glu Ile Arg Asp Pro Gln Ser Lys Glu Arg Arg Trp Leu Gly Thr Phe

65 70 75 80

Asp Thr Ala Glu Glu Ala Ala Cys Ala Tyr Asp Cys Ala Ala Arg Ala

85 90 95

Met Arg Gly Val Lys Ala Arg Thr Asn Phe Val Tyr Pro Pro Cys Pro

100 105 110

Thr Pro Thr Gln Pro Thr Ser Thr Asn Asp Ala Leu Phe Asn Ile His

115 120 125

Ser Ser Tyr Lys Leu Thr Ser Pro Tyr Tyr His Gln Ser Ser Asn Thr

130 135 140

Leu Lys Asp Leu Ser Asn Arg Pro Phe Phe His Ser Ser Ser Pro Tyr

145 150 155 160

Gly Ser Thr Gly Arg Ala His Val Ile Gly Gln Lys Ser Asn Asp Ser

165 170 175

Leu Asn Met Leu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Ser Ser Asn Ser Ser Asn

180 185 190

Asn Thr Asn Asn Leu Asn Val Thr Ser Ser Met Asn Met Pro Asn Leu

195 200 205

Tyr Glu Gln Leu Pro Asn Phe Thr Met Asn Arg Asn Thr Asn Ser Phe

210 215 220

Gly Ser Tyr Leu Pro Asn Ser Ser Asn Pro Val Ile Pro Ser Ser Ser

225 230 235 240

Val Met Thr Thr Gln Val Pro Lys Phe Asp Asn Thr Val His Cys Thr

245 250 255

Ile Asn Asn Asn Asn Ser Ser Ser Gly Ala Thr Ala Asn Asp Asp Ser

260 265 270

Ala Ala Gly Met Asp Phe Phe Pro Ser Glu Ser Ser Asp Ser Gly Leu

275 280 285

Leu Glu Glu Ala Leu Asn Gly Phe Phe Pro Lys Pro Lys Pro Ile Lys

290 295 300

Ser Val Pro Ser Ser Leu Pro Asn Tyr Glu Phe Cys Asn Ile Phe Ser

305 310 315 320

Gln Gln Pro Gln Gln Gln Glu Gln Ile Asn Asn Gly Gly Leu Asn Ser

325 330 335

Asp Phe Gly Leu Leu Ser Ser Ser Leu Ser Ser Phe Pro Val Asp Tyr

340 345 350

Phe Pro Gly Asn Leu Gln Val Ala Pro Gly Asp Asn Ile Met Gly Asp

355 360 365

Ile Phe Gln Tyr Pro Asp Leu Leu Ser Ile Phe Ala Ala Lys Leu Gln

370 375 380

Asn Ala

385

<210> 9

<211> 630

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.9

<400> 9

atgggaaggc caacaagatg gagtccaaca ccagaacaac ttatgttctt agaagaaatg 60

tatagaaaag gtttaagaaa tccaaatgct acacaaatac aaagtattac ttgtcatttg 120

tcttcatttg gtaaaattga agggaaaaat gtgttttatt ggtttcaaaa ccataaagct 180

agggatagac aaaaacttaa gaaaaaactt cttgcacaaa tgaatcaaca acaaatatta 240

gctcaatatc ctattgatgc tcatagtaca actactacta ctaccaactc caataacaat 300

accctatttc attgccccac tactgatcag taccaaatat gtcctttgac atctactact 360

gcccttcttc aagagggtga aatcaaagaa gcatcatctc aagtaatgac ttatctatat 420

ccaatggatc tctcaaaacc agctgatcaa aatatggaaa attgcatgat aagaccctat 480

ggaaaagatt ggatcgtgat gatgaatatt aatccaaata acttaccata ttgtgtcaat 540

cgacccctca aaaccctacc actttttcct ataacaacaa ccgatgacct caaagaccaa 600

acaacatctt ccactagttt aagtctttga 630

<210> 10

<211> 209

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.10

<400> 10

Met Gly Arg Pro Thr Arg Trp Ser Pro Thr Pro Glu Gln Leu Met Phe

1 5 10 15

Leu Glu Glu Met Tyr Arg Lys Gly Leu Arg Asn Pro Asn Ala Thr Gln

20 25 30

Ile Gln Ser Ile Thr Cys His Leu Ser Ser Phe Gly Lys Ile Glu Gly

35 40 45

Lys Asn Val Phe Tyr Trp Phe Gln Asn His Lys Ala Arg Asp Arg Gln

50 55 60

Lys Leu Lys Lys Lys Leu Leu Ala Gln Met Asn Gln Gln Gln Ile Leu

65 70 75 80

Ala Gln Tyr Pro Ile Asp Ala His Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Asn

85 90 95

Ser Asn Asn Asn Thr Leu Phe His Cys Pro Thr Thr Asp Gln Tyr Gln

100 105 110

Ile Cys Pro Leu Thr Ser Thr Thr Ala Leu Leu Gln Glu Gly Glu Ile

115 120 125

Lys Glu Ala Ser Ser Gln Val Met Thr Tyr Leu Tyr Pro Met Asp Leu

130 135 140

Ser Lys Pro Ala Asp Gln Asn Met Glu Asn Cys Met Ile Arg Pro Tyr

145 150 155 160

Gly Lys Asp Trp Ile Val Met Met Asn Ile Asn Pro Asn Asn Leu Pro

165 170 175

Tyr Cys Val Asn Arg Pro Leu Lys Thr Leu Pro Leu Phe Pro Ile Thr

180 185 190

Thr Thr Asp Asp Leu Lys Asp Gln Thr Thr Ser Ser Thr Ser Leu Ser

195 200 205

Leu

<210> 11

<211> 1005

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.11

<400> 11

atgggaagat caccatgttg tgagaaagtg ggattgaaga aaggaccatg gactcctgaa 60

gaagaccaaa aactcatgga ttacattgaa aaaaatggat gtggtagttg gcgtgctttg 120

ccaactaaag ccggactcaa gagatgtgga aaaagttgca gattaagatg gataaattat 180

ttaagacctg atattaagag aggaaaattc agtttgcaag aagaacagac aatcattcaa 240

ctccatgccc ttcttggtaa cagatggtca gctattgcga ctcatttggc taacagaacg 300

gacaatgaaa ttaagaatta ttggaacacg cacttgaaga agaggttaac caagatgggc 360

attgatccaa atactcataa accaaaatcc aacatctttg gttccgcaaa cctaagccac 420

atggctcagt gggaaaaggc tcgtttagaa gctgaagctc gacttgttcg cgaatccaaa 480

aaacaacacc aacaaattat ttcgaacaat aacaataaca ttaataatta taataatatc 540

cactttagtc ctaataattt gactactact acaacaacaa atgttttacc accccttcaa 600

acaaaattac cctctccacc ttgtcttgat gtgttaaaag catggcaagg aggggcaaat 660

tggtcaatta tgccaaaaat taccaaagat aattttttcg ataaccctcc aatatccact 720

tcaaatttat ctctaatcat ggtaccaaat aataatagta ttacaggggc tggattaatt 780

gataattcat gtttgattgg tactgaaaat ttcatggaga ataacattaa tggcatttca 840

tattctaatt atccaaattt gaatactatt caagggttta cacacttgga ccatgttctt 900

ggaagtcgtg aagaagaaga cgacaacgac aacaacgaca acacttattg gaacactata 960

ctaaaatctt gtacttcatt tgttgatggt tcatcagtat tttaa 1005

<210> 12

<211> 334

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.12

<400> 12

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Lys Val Gly Leu Lys Lys Gly Pro

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Lys Leu Met Asp Tyr Ile Glu Lys Asn

20 25 30

Gly Cys Gly Ser Trp Arg Ala Leu Pro Thr Lys Ala Gly Leu Lys Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Lys Phe Ser Leu Gln Glu Glu Gln Thr Ile Ile Gln

65 70 75 80

Leu His Ala Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Ala Ile Ala Thr His Leu

85 90 95

Ala Asn Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu

100 105 110

Lys Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Ile Asp Pro Asn Thr His Lys Pro

115 120 125

Lys Ser Asn Ile Phe Gly Ser Ala Asn Leu Ser His Met Ala Gln Trp

130 135 140

Glu Lys Ala Arg Leu Glu Ala Glu Ala Arg Leu Val Arg Glu Ser Lys

145 150 155 160

Lys Gln His Gln Gln Ile Ile Ser Asn Asn Asn Asn Asn Ile Asn Asn

165 170 175

Tyr Asn Asn Ile His Phe Ser Pro Asn Asn Leu Thr Thr Thr Thr Thr

180 185 190

Thr Asn Val Leu Pro Pro Leu Gln Thr Lys Leu Pro Ser Pro Pro Cys

195 200 205

Leu Asp Val Leu Lys Ala Trp Gln Gly Gly Ala Asn Trp Ser Ile Met

210 215 220

Pro Lys Ile Thr Lys Asp Asn Phe Phe Asp Asn Pro Pro Ile Ser Thr

225 230 235 240

Ser Asn Leu Ser Leu Ile Met Val Pro Asn Asn Asn Ser Ile Thr Gly

245 250 255

Ala Gly Leu Ile Asp Asn Ser Cys Leu Ile Gly Thr Glu Asn Phe Met

260 265 270

Glu Asn Asn Ile Asn Gly Ile Ser Tyr Ser Asn Tyr Pro Asn Leu Asn

275 280 285

Thr Ile Gln Gly Phe Thr His Leu Asp His Val Leu Gly Ser Arg Glu

290 295 300

Glu Glu Asp Asp Asn Asp Asn Asn Asp Asn Thr Tyr Trp Asn Thr Ile

305 310 315 320

Leu Lys Ser Cys Thr Ser Phe Val Asp Gly Ser Ser Val Phe

325 330

<210> 13

<211> 2193

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.13

<400> 13

atgtttaata accaccagca cttgctcgat atatcgtcct cagctcaacg aacacctgat 60

aacgagttgg atttcattcg tgatgaagag tttgatagca actctggtgc tgataacatg 120

gaagctccca attcaggtga tgacgatcaa gctgatccaa accaacctcc aaacaagaag 180

aagcgttatc atcgccacac tcagaatcag attcaggaaa tggagtcctt ttacaaggaa 240

tgcaatcatc cagatgacaa gcaaaggaag gaattgggaa gaagacttgg tttggagcca 300

ttacaagtga aattttggtt ccagaacaag cgtactcaga tgaaggctca acatgagcga 360

tgtgagaaca cacagttgag gaatgaaaat gagaagcttc gcgctgagaa cataaggtac 420

aaagaagctt tgagtaatgc agcatgccca aattgtggag ggccagcagc tataggagag 480

atgtcatttg atgagcatca gttgaggatt gaaaatgctc gtcttagaga tgagattgac 540

aggataactg gaatagctgg aaagtatgtt ggtaaatcag cccttggata ttctcatcaa 600

cttcctcttc ctcagcccga agctcctcgg gttctggatc ttgcttttgg gcctcaatcg 660

ggcctgcttg gagaaatgta cgctgctggt gaccttctaa gaactgctgt tacgggcctt 720

acagatgctg agaagcccgt ggtcattgag cttgctgtta ctgcaatgga ggaacttata 780

aggatggctc aaactgaaga gccattatgg ttgccaagct caggctctga gactttatgt 840

gagcaagaat atgctcgtat tttccctcga ggccttggac ctaagccagc tacactcaat 900

tctgaagcct cacgagaatc tgctgttgtg attatgaatc atatcaattt agttgagatt 960

ttgatggatg tgaaccaatg gactactgtt tttgctggtc tggtgtcaaa agcaatgact 1020

cttgaagtct tatcaactgg tgtcgcagga aatcacaatg gagcattgca agtgatgaca 1080

gcagaatttc aagttccatc tccacttgtt ccaactcggg agaactattt cttaagatac 1140

tgtaaacaac atggtgaagg gacttgggta gtggttgatg tttccctgga caacttgcgc 1200

actgtttcag ttccgcgttg cagaagaagg ccatctggtt gtttaatcca agaaatgcca 1260

aatggttact caagggttat atgggttgaa cacgttgagg tggatgaaaa tgctgtccat 1320

gacatctaca aacctcttgt caattctggg attgcatttg gagcaaaacg ctgggtagca 1380

actttagata gacaatgtga acgccttgca agtgtgttgg cgcttaacat cccaacagga 1440

gatgttggaa tcattactag tccagctggt cgaaagagta tgctaaaact tgctgagaga 1500

atggtgatga gcttttgtgc tggagttggt gcatcgacaa ctcacatatg gacaactttg 1560

tctggaagtg gtgcggatga tgttagagtc atgactagga agagtatcga tgatccaggg 1620

agacctcctg gtattgtgct gagtgctgca acatcttttt ggcttccagt ttctcctaag 1680

agagtgtttg attttctccg cgatgagaac tctagaaatg agtgggatat tctttcaaat 1740

ggtgggattg ttcaggaaat ggcacacatt gcaaatggtc gtgatccagg aaactgtgtt 1800

tctctactcc gtgtcaatac tggaacaaac tctaaccaga gtaacatgct gatactccaa 1860

gagagcacaa ctgatgtaac aggatcttac gtcatttacg ctcgagttga tattgctgca 1920

atgaacgtgg tgttaggtgg gggtgaccct gactatgttg ctctgttgcc atctggtttt 1980

gctattcttc cagacggacc gatgaattat catggtggag gtaattcaga aattgattct 2040

cctggtggat cgctactaac tgtagcattt cagatattgg ttgattcagt cccaactgca 2100

aagctttccc ttggctctgt tgcgactgtt aatagtctca tcaaatgcac cgttgaaaag 2160

atcaaaggtg ctgtaacttc cgcaaatgca tga 2193

<210> 14

<211> 730

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.14

<400> 14

Met Phe Asn Asn His Gln His Leu Leu Asp Ile Ser Ser Ser Ala Gln

1 5 10 15

Arg Thr Pro Asp Asn Glu Leu Asp Phe Ile Arg Asp Glu Glu Phe Asp

20 25 30

Ser Asn Ser Gly Ala Asp Asn Met Glu Ala Pro Asn Ser Gly Asp Asp

35 40 45

Asp Gln Ala Asp Pro Asn Gln Pro Pro Asn Lys Lys Lys Arg Tyr His

50 55 60

Arg His Thr Gln Asn Gln Ile Gln Glu Met Glu Ser Phe Tyr Lys Glu

65 70 75 80

Cys Asn His Pro Asp Asp Lys Gln Arg Lys Glu Leu Gly Arg Arg Leu

85 90 95

Gly Leu Glu Pro Leu Gln Val Lys Phe Trp Phe Gln Asn Lys Arg Thr

100 105 110

Gln Met Lys Ala Gln His Glu Arg Cys Glu Asn Thr Gln Leu Arg Asn

115 120 125

Glu Asn Glu Lys Leu Arg Ala Glu Asn Ile Arg Tyr Lys Glu Ala Leu

130 135 140

Ser Asn Ala Ala Cys Pro Asn Cys Gly Gly Pro Ala Ala Ile Gly Glu

145 150 155 160

Met Ser Phe Asp Glu His Gln Leu Arg Ile Glu Asn Ala Arg Leu Arg

165 170 175

Asp Glu Ile Asp Arg Ile Thr Gly Ile Ala Gly Lys Tyr Val Gly Lys

180 185 190

Ser Ala Leu Gly Tyr Ser His Gln Leu Pro Leu Pro Gln Pro Glu Ala

195 200 205

Pro Arg Val Leu Asp Leu Ala Phe Gly Pro Gln Ser Gly Leu Leu Gly

210 215 220

Glu Met Tyr Ala Ala Gly Asp Leu Leu Arg Thr Ala Val Thr Gly Leu

225 230 235 240

Thr Asp Ala Glu Lys Pro Val Val Ile Glu Leu Ala Val Thr Ala Met

245 250 255

Glu Glu Leu Ile Arg Met Ala Gln Thr Glu Glu Pro Leu Trp Leu Pro

260 265 270

Ser Ser Gly Ser Glu Thr Leu Cys Glu Gln Glu Tyr Ala Arg Ile Phe

275 280 285

Pro Arg Gly Leu Gly Pro Lys Pro Ala Thr Leu Asn Ser Glu Ala Ser

290 295 300

Arg Glu Ser Ala Val Val Ile Met Asn His Ile Asn Leu Val Glu Ile

305 310 315 320

Leu Met Asp Val Asn Gln Trp Thr Thr Val Phe Ala Gly Leu Val Ser

325 330 335

Lys Ala Met Thr Leu Glu Val Leu Ser Thr Gly Val Ala Gly Asn His

340 345 350

Asn Gly Ala Leu Gln Val Met Thr Ala Glu Phe Gln Val Pro Ser Pro

355 360 365

Leu Val Pro Thr Arg Glu Asn Tyr Phe Leu Arg Tyr Cys Lys Gln His

370 375 380

Gly Glu Gly Thr Trp Val Val Val Asp Val Ser Leu Asp Asn Leu Arg

385 390 395 400

Thr Val Ser Val Pro Arg Cys Arg Arg Arg Pro Ser Gly Cys Leu Ile

405 410 415

Gln Glu Met Pro Asn Gly Tyr Ser Arg Val Ile Trp Val Glu His Val

420 425 430

Glu Val Asp Glu Asn Ala Val His Asp Ile Tyr Lys Pro Leu Val Asn

435 440 445

Ser Gly Ile Ala Phe Gly Ala Lys Arg Trp Val Ala Thr Leu Asp Arg

450 455 460

Gln Cys Glu Arg Leu Ala Ser Val Leu Ala Leu Asn Ile Pro Thr Gly

465 470 475 480

Asp Val Gly Ile Ile Thr Ser Pro Ala Gly Arg Lys Ser Met Leu Lys

485 490 495

Leu Ala Glu Arg Met Val Met Ser Phe Cys Ala Gly Val Gly Ala Ser

500 505 510

Thr Thr His Ile Trp Thr Thr Leu Ser Gly Ser Gly Ala Asp Asp Val

515 520 525

Arg Val Met Thr Arg Lys Ser Ile Asp Asp Pro Gly Arg Pro Pro Gly

530 535 540

Ile Val Leu Ser Ala Ala Thr Ser Phe Trp Leu Pro Val Ser Pro Lys

545 550 555 560

Arg Val Phe Asp Phe Leu Arg Asp Glu Asn Ser Arg Asn Glu Trp Asp

565 570 575

Ile Leu Ser Asn Gly Gly Ile Val Gln Glu Met Ala His Ile Ala Asn

580 585 590

Gly Arg Asp Pro Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Arg Val Asn Thr Gly

595 600 605

Thr Asn Ser Asn Gln Ser Asn Met Leu Ile Leu Gln Glu Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Val Thr Gly Ser Tyr Val Ile Tyr Ala Arg Val Asp Ile Ala Ala

625 630 635 640

Met Asn Val Val Leu Gly Gly Gly Asp Pro Asp Tyr Val Ala Leu Leu

645 650 655

Pro Ser Gly Phe Ala Ile Leu Pro Asp Gly Pro Met Asn Tyr His Gly

660 665 670

Gly Gly Asn Ser Glu Ile Asp Ser Pro Gly Gly Ser Leu Leu Thr Val

675 680 685

Ala Phe Gln Ile Leu Val Asp Ser Val Pro Thr Ala Lys Leu Ser Leu

690 695 700

Gly Ser Val Ala Thr Val Asn Ser Leu Ile Lys Cys Thr Val Glu Lys

705 710 715 720

Ile Lys Gly Ala Val Thr Ser Ala Asn Ala

725 730

<210> 15

<211> 2193

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.15

<400> 15

atgtttaata accaccagca cttgctcgat atatcgtcct cagctcaacg aacacctgat 60

aacgagttgg atttcattcg tgatgaagag tttgatagca actctggtgc tgataacatg 120

gaagctccca attcaggtga tgacgatcaa gctgatccaa accaacctcc aaacaagaag 180

aagcgttatc atcgccacac tcagaatcag attcaggaaa tggagtcctt ttacaaggaa 240

tgcaatcatc cagatgacaa gcaaaggaag gaattgggaa gaagacttgg tttggagcca 300

ttacaagtga aattttggtt ccagaacaag cgtactcaga tgaaggctca acatgagcga 360

tgtgagaaca cacagttgag gaatgaaaat gagaagcttc gcgctgagaa cataaggtac 420

aaagaagctt tgagtaatgc agcatgccca aattgtggag ggccagcagc tataggagag 480

atgtcatttg atgagcatca gttgaggatt gaaaatgctc gtcttagaga tgagattgac 540

aggataactg gaatagctgg aaagtatgtt ggtaaatcag cccttggata ttctcatcaa 600

cttcctcttc ctcagcccga agctcctcgg gttctggatc ttgcttttgg gcctcaatcg 660

ggcctgcttg gagaaatgta cgctgctggt gaccttctaa gaactgctgt tacgggcctt 720

acagatgctg agaagcccgt ggtcattgag cttgctgtta ctgcaatgga ggaacttata 780

aggatggctc aaactgaaga gccattatgg ttgccaagct caggctctga gactttatgt 840

gagcaagaat atgctcgtat tttccctcga ggccttggac ctaagccagc tacactcaat 900

tctgaagcct cacgagaatc tgctgttgtg attatgaatc atatcaattt agttgagatt 960

ttgatggatg tgaaccaatg gactactgtt tttgctggtc tggtgtcaaa agcaatgact 1020

cttgaagtct tatcaactgg tgtcgcagga aatcacaatg gagcattgca agtgatgaca 1080

gcagaatttc aagttccatc tccacttgtt ccaactcggg agaactattt cttaagatac 1140

tgtaaacaac atggtgaagg gacttgggta gtggttgatg tttccctgga caacttgcgc 1200

actgtttcag ttccgcgttg cagaagaagg ccatctggtt gtttaatcca agaaatgcca 1260

aatggttact caagggttat atgggttgaa cacgttgagg tggatgaaaa tgctgtccat 1320

gacatctaca aacctcttgt caattctggg attgcatttg gagcaaaacg ctgggtagca 1380

actttagata gacaatgtga acgccttgca agtgtgttgg cgcttaacat cccaacagga 1440

gatgttggaa tcattactag tccagctggt cgaaagagta tgctaaaact tgctgagaga 1500

atggtgatga gcttttgtgc tggagttggt gcatcgacaa ctcacatatg gacaactttg 1560

tctggaagtg gtgcggatga tgttagagtc atgactagga agagtatcga tgatccaggg 1620

agacctcctg gtattgtgct gagtgctgca acatcttttt ggcttccagt ttctcctaag 1680

agagtgtttg attttctccg cgatgagaac tctagaaatg agtgggatat tctttcaaat 1740

ggtgggattg ttcaggaaat ggcacacatt gcaaatggtc gtgatccagg aaactgtgtt 1800

tctctactcc gtgtcaatac tggaacaaac tctaaccaga gtaacatgct gatactccaa 1860

gagagcacaa ctgatgtaac aggatcttac gtcatttacg ctccagttga tattgctgca 1920

atgaacgtgg tgttaggtgg gggtgaccct gactatgttg ctctgttgcc atctggtttt 1980

gctattcttc cagacggacc gatgaattat catggtggag gtaattcaga aattgattct 2040

cctggtggat cgctactaac tgtagcattt cagagattgg tttattcagt cccaactgca 2100

aagctttccc ttggctctgt tgcgactgtt aatagtctca tcaaatgcac cgttgaaaag 2160

atcaaaggtg ctgtaacttc cgcaaatgca tga 2193

<210> 16

<211> 730

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.16

<400> 16

Met Phe Asn Asn His Gln His Leu Leu Asp Ile Ser Ser Ser Ala Gln

1 5 10 15

Arg Thr Pro Asp Asn Glu Leu Asp Phe Ile Arg Asp Glu Glu Phe Asp

20 25 30

Ser Asn Ser Gly Ala Asp Asn Met Glu Ala Pro Asn Ser Gly Asp Asp

35 40 45

Asp Gln Ala Asp Pro Asn Gln Pro Pro Asn Lys Lys Lys Arg Tyr His

50 55 60

Arg His Thr Gln Asn Gln Ile Gln Glu Met Glu Ser Phe Tyr Lys Glu

65 70 75 80

Cys Asn His Pro Asp Asp Lys Gln Arg Lys Glu Leu Gly Arg Arg Leu

85 90 95

Gly Leu Glu Pro Leu Gln Val Lys Phe Trp Phe Gln Asn Lys Arg Thr

100 105 110

Gln Met Lys Ala Gln His Glu Arg Cys Glu Asn Thr Gln Leu Arg Asn

115 120 125

Glu Asn Glu Lys Leu Arg Ala Glu Asn Ile Arg Tyr Lys Glu Ala Leu

130 135 140

Ser Asn Ala Ala Cys Pro Asn Cys Gly Gly Pro Ala Ala Ile Gly Glu

145 150 155 160

Met Ser Phe Asp Glu His Gln Leu Arg Ile Glu Asn Ala Arg Leu Arg

165 170 175

Asp Glu Ile Asp Arg Ile Thr Gly Ile Ala Gly Lys Tyr Val Gly Lys

180 185 190

Ser Ala Leu Gly Tyr Ser His Gln Leu Pro Leu Pro Gln Pro Glu Ala

195 200 205

Pro Arg Val Leu Asp Leu Ala Phe Gly Pro Gln Ser Gly Leu Leu Gly

210 215 220

Glu Met Tyr Ala Ala Gly Asp Leu Leu Arg Thr Ala Val Thr Gly Leu

225 230 235 240

Thr Asp Ala Glu Lys Pro Val Val Ile Glu Leu Ala Val Thr Ala Met

245 250 255

Glu Glu Leu Ile Arg Met Ala Gln Thr Glu Glu Pro Leu Trp Leu Pro

260 265 270

Ser Ser Gly Ser Glu Thr Leu Cys Glu Gln Glu Tyr Ala Arg Ile Phe

275 280 285

Pro Arg Gly Leu Gly Pro Lys Pro Ala Thr Leu Asn Ser Glu Ala Ser

290 295 300

Arg Glu Ser Ala Val Val Ile Met Asn His Ile Asn Leu Val Glu Ile

305 310 315 320

Leu Met Asp Val Asn Gln Trp Thr Thr Val Phe Ala Gly Leu Val Ser

325 330 335

Lys Ala Met Thr Leu Glu Val Leu Ser Thr Gly Val Ala Gly Asn His

340 345 350

Asn Gly Ala Leu Gln Val Met Thr Ala Glu Phe Gln Val Pro Ser Pro

355 360 365

Leu Val Pro Thr Arg Glu Asn Tyr Phe Leu Arg Tyr Cys Lys Gln His

370 375 380

Gly Glu Gly Thr Trp Val Val Val Asp Val Ser Leu Asp Asn Leu Arg

385 390 395 400

Thr Val Ser Val Pro Arg Cys Arg Arg Arg Pro Ser Gly Cys Leu Ile

405 410 415

Gln Glu Met Pro Asn Gly Tyr Ser Arg Val Ile Trp Val Glu His Val

420 425 430

Glu Val Asp Glu Asn Ala Val His Asp Ile Tyr Lys Pro Leu Val Asn

435 440 445

Ser Gly Ile Ala Phe Gly Ala Lys Arg Trp Val Ala Thr Leu Asp Arg

450 455 460

Gln Cys Glu Arg Leu Ala Ser Val Leu Ala Leu Asn Ile Pro Thr Gly

465 470 475 480

Asp Val Gly Ile Ile Thr Ser Pro Ala Gly Arg Lys Ser Met Leu Lys

485 490 495

Leu Ala Glu Arg Met Val Met Ser Phe Cys Ala Gly Val Gly Ala Ser

500 505 510

Thr Thr His Ile Trp Thr Thr Leu Ser Gly Ser Gly Ala Asp Asp Val

515 520 525

Arg Val Met Thr Arg Lys Ser Ile Asp Asp Pro Gly Arg Pro Pro Gly

530 535 540

Ile Val Leu Ser Ala Ala Thr Ser Phe Trp Leu Pro Val Ser Pro Lys

545 550 555 560

Arg Val Phe Asp Phe Leu Arg Asp Glu Asn Ser Arg Asn Glu Trp Asp

565 570 575

Ile Leu Ser Asn Gly Gly Ile Val Gln Glu Met Ala His Ile Ala Asn

580 585 590

Gly Arg Asp Pro Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Arg Val Asn Thr Gly

595 600 605

Thr Asn Ser Asn Gln Ser Asn Met Leu Ile Leu Gln Glu Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Val Thr Gly Ser Tyr Val Ile Tyr Ala Pro Val Asp Ile Ala Ala

625 630 635 640

Met Asn Val Val Leu Gly Gly Gly Asp Pro Asp Tyr Val Ala Leu Leu

645 650 655

Pro Ser Gly Phe Ala Ile Leu Pro Asp Gly Pro Met Asn Tyr His Gly

660 665 670

Gly Gly Asn Ser Glu Ile Asp Ser Pro Gly Gly Ser Leu Leu Thr Val

675 680 685

Ala Phe Gln Arg Leu Val Tyr Ser Val Pro Thr Ala Lys Leu Ser Leu

690 695 700

Gly Ser Val Ala Thr Val Asn Ser Leu Ile Lys Cys Thr Val Glu Lys

705 710 715 720

Ile Lys Gly Ala Val Thr Ser Ala Asn Ala

725 730

<210> 17

<211> 2719

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.17

<400> 17

tacatacaga acttatgagg gaatttatgt ataagttata cagaataaaa gatggaataa 60

gttatgtgaa tattagtaat tatacatgta ttagaaagat aaattacaca tttatctcta 120

ttaatttatt tttaattttt ttattgaaaa ctttacataa ctattctatt ttctaaccta 180

ttttcatttc tttttttatg caaacaactt tttatttgtt ttcatttaaa atcagaaaat 240

atttattaat attatgaata ggaatgtata attttgatag cacatatgtt aattatatat 300

ttgctttata tattatatat tcacatattt aattatcatg tattaatttt tatttagaaa 360

gtgaatttat ataatattta taaatttggt atattaaaac taggggtgta caaactgaat 420

tattaagtca aatcgaaccg acgaaccaaa tcaaatcgaa aataatcgac ttgtggtttg 480

gcgattgaaa aaaaactcga ccactcttga tttggtttgg tattagaaaa aaaaaatcaa 540

accgaactca accccccccc ccccccccac aaacacaatt tattttattt atagataaaa 600

aatattatct acatataatc tactttggta atatgtattt ttttttgtta attcatgatt 660

ttcaatttta tatatttatg tcaaatttta gattttgtaa aattttgtat atatacacat 720

atatataatt tattttattt atagctaaaa aatattattt ataatgtatt tgctaatata 780

tttttagtta atttatagtt ttcaacgtgt gtatatatat atgtgtgtat atatatatat 840

atatatataa aatcaataac caaacgtccc ttactctcca tatatccagt ttcctacttt 900

aaattagttg ccatcaaaca gttctaagta tgaatttgta atctactcat gatcctaata 960

ctcaacctac tctcctcctt ttaatttata atgatcatac tcgaactaaa tttcataatc 1020

aacacactat tattaagttt atcaattact ctccttaata gtagtttcct tctataaatt 1080

agttgccatc aaataatttc aattatgaat ttataatcta ctcatgatcc taatactcaa 1140

tctactttcc tcctcctaat ttataatgat cctagtcaag ctcgatttca taatcaatac 1200

actattatta agttaatcaa tactttactt atatcttgtt taaatttgtt gccatcaaat 1260

acttcttgag aaagaatttg taatgatcct actcaaatta cttgccttct tttaatctac 1320

aatgatccta ctcaaattaa ataggagtat tagattgaag tcataattaa gttgtttcta 1380

ccatattccc tatattagaa aatttaaaca tcaaagatga gttgctgcca acttctcatt 1440

ttctctctca acaacagcat taacacctcc cattaatgct atttcttcct ctcaataacc 1500

tctgctataa taataactcc cttcatcttc tccacctgtt ccctataatc cctctttttt 1560

cccctcttct ccatagctcc tttaattctc ttcacaataa acttttttga acacacacac 1620

acaaaaaaaa aaatcagact ccaaaaagtt tgactagatc tggattaatt ttctacactt 1680

gttgtttttt taatccaaag gcttcacaga tagtaagttt actgttccat cattctctta 1740

cttgctttct tctttttttc cctctcttga attgtttgct cagatgaaca tccttcgtca 1800

aaaaattata ccacagcaaa ataaattatt gttttttcat gtgtcgagag acttgtatag 1860

aagtgaagtt tggactttac cagatattag ttgttgagag ctatatatat gttttaccca 1920

tttttgaaaa aggaaaagaa aaaagagaag accctgtgtc cgtgttcaca cattgagtca 1980

actttatgtt ttgttattat tccaaaattt tctcattgca cttttaacac agtcaaaaag 2040

aaataaattt tattttcctt tgtcacatca agacatagaa aaaaatagaa taaaaacaaa 2100

cacgtcccaa aataaaatga ggtaaaaaga attaaagttt attttacata gagacaagaa 2160

agtcagtaga aaatgtggtg ggggttggag gttggggggg tgggtttagg gtttgaggag 2220

atttttttgt gtatatatat atcatacagt gagaagtgaa attctaccat cacatcaaca 2280

atgccttctt gagaagctca gtttcttgag taagtccatt tgttctttaa acgttttttt 2340

ttcttttttt gtgttatttg tatactatct tcagctaatt ctcaacaaca aatacactga 2400

ttttgatttt taaaccatgg tggcatgacg aattaaggaa ccctagagca aaaaatgtaa 2460

atttataagt cgtcacatcc taaaaatgaa tcacttttaa ccatttagta catgtttgtg 2520

aatttttatt tttttttata aaaaaaaaat cctgaacata tgttgttgag cttttgcttt 2580

tgtccacgct tccgtatata taatctttag catgtgtatg gtttttgtaa atcataaaca 2640

tgggcgtttt tttttttttt tgcagatgaa ataatttatc agagaaatta ttttgaagaa 2700

gatcgagaag gtattcaag 2719

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> CR-MTR1-F

<400> 18

gattatgagc aggagaaatg gaaa 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> CR-MTR1-R

<400> 19

aaactttcca tttctcctgc tcat 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> CR-MTR2-F

<400> 20

gattgttcaa aatgaactac agga 24

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> CR-MTR2-R

<400> 21

aaactcctgt agttcatttt gaac 24

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> CR-MTR3-F

<400> 22

gattatgagt agaaggaatg gaaa 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> CR-MTR3-R

<400> 23

aaactttcca ttccttctac tcat 24

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> CR-LFS-F

<400> 24

gattccctcc gcggtgcgat accg 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> CR-LFS-R

<400> 25

aaaccggtat cgcaccgcgg aggg 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> CR-Slwox3b-F

<400> 26

gattgtttca aaaccataaa gcta 24

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> CR-Slwox3b-R

<400> 27

aaactagctt tatggttttg aaac 24

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> CR-MX1-F

<400> 28

gattgtgctt tgccaactaa agccgg 26

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> CR-MX1-R

<400> 29

aaacccggct ttagttggca aagcac 26

<210> 30

<211> 46

<212> DNA

<213> LFS-EcoRI-F

<400> 30

accggtacca agcttgaatt catggaagat gcaatgagaa gactta 46

<210> 31

<211> 45

<212> DNA

<213> LFS-EcoRI-R

<400> 31

cccttgctca ccatgaattc agcattttgc agcttggctg caaaa 45

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> pWo-SacI-F

<400> 32

aacgcgttgg gagctctaca tacagaactt atgagggaat 40

<210> 33

<211> 44

<212> DNA

<213> pWo-XbaI-R

<400> 33

cattaaagca ggactctaga cttgaatacc ttctcgatct tctt 44

<210> 34

<211> 45

<212> DNA

<213> Wo-XbaI-F

<400> 34

agaaggtatt caagtctaga atgtttaata accaccagca cttgc 45

<210> 35

<211> 46

<212> DNA

<213> Wo-XbaI-R

<400> 35

cattaaagca ggactctaga tcactgcatt tgcggaagtt acagca 46

Claims

1.用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法，其特征在于：所述方法为突变植物中的表皮毛发育相关基因；所述表皮毛发育相关基因包括：MTR1基因、MTR2基因、MTR3基因、LFS基因、Slwox3b基因、MX1基因、Wo^P635R基因和Wo^I692RD695Y；

所述Wo^I692RD695Y基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

2.根据权利要求1所述的用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法，其特征在于：所述突变方法包括基因敲除方法，或者基因沉默表达方法，或基因超量表达方法。

3.根据权利要求1所述的用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法，其特征在于：所述表皮毛发育相关基因具有与上述表皮毛发育相关基因MTR1基因、MTR2基因、MTR3基因、LFS基因、Slwox3b基因、MX1基因和Wo^P635R基因，至少70%相似度核苷酸序列或者氨基酸序列的基因。

4.根据权利要求1所述的用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法，其特征在于：敲除或者沉默LFS基因；或者敲除或沉默MTR1、MTR2、MTR3基因中的一个或多个，促进植物指状多细胞表皮毛分化，同时抑制盾状分泌型表皮毛的形成。

5.根据权利要求1所述的用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法，其特征在于：超表达LFS基因；或者敲除或沉默Slwox3b基因和MX1基因中的一个或两个，促进盾状分泌型表皮毛的形成。

6.根据权利要求1所述的用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法，其特征在于：同时敲除或者沉默Slwox3b基因、MX1基因、MTR1基因、MTR2基因和MTR3基因，促进植物盾状分泌型表皮毛的形成。

7.根据权利要求1所述的用于调控植物多细胞表皮毛分化的方法，其特征在于：敲除或者沉默Slwox3b基因、MX1基因的同时通过特异表达或者超量表达Woolly基因功能获得型突变等位基因Wo^P635R和/或Wo^I692RD695Y，促进植物盾状分泌型表皮毛的形成。

8.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体含有权利要求1所述方法中的表皮毛发育相关基因。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于：包括重组转化所形成的突变体；所述突变体包括茄科、桑科和其他具有多细胞表皮毛的植物，包括但不限于烟草、番茄、大麻。

10.权利要求1所述方法在促进或抑制植物多细胞表皮毛分化中的应用。