CN114177357A - 一种生物仿生人工皮的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物仿生人工皮的制备方法，属于生物科技技术领域，包括如下步骤：将原料使用纯化水浸泡，清洗去除杂质，清洗；然后使用过氧化氢溶液浸泡消毒，清洗；采用有机溶剂或盐溶液常温下对原料进行浸泡脱脂处理，清洗备用；将处理后的原料加入含有胃蛋白酶的醋酸溶液的反应釜中溶解；通过反应釜对溶解液进行搅拌，搅拌速度大于100r/min，搅拌时间大于8h，降解组织纤维间的共价键，并进行离心分离，然后弃上清液取沉淀；将离心分离得到的沉淀通过不锈钢过滤器过滤得到胶原；取过滤后胶原检测固含量，根据检测数值配制目标浓度，搅拌均匀后待用；将配置后的胶原制备形成薄膜状生物膜人工皮或海绵状生物膜人工皮，并分切、包装即可。
Description
技术领域
本发明涉及生物科技技术领域，具体为一种生物仿生人工皮的制备方法。
背景技术
皮肤是覆盖和保护体表的重要组织器官，由于各种疾病或者手术，常常造成皮肤的缺损和异常，目前对于这种皮肤缺损和异常的质量方法常常采用自体皮肤移植进行治疗，但是，自体皮肤移植会对完好的皮肤处造成新的伤疤，且自体皮肤数量有限，当创伤面积大时难以完全移植，而目前的人工皮的弹性低，质脆难以与真实皮肤相比，移植效果差，为此我们提出一种生物仿生人工皮的制备方法用于解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物仿生人工皮的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种生物仿生人工皮的制备方法，包括如下步骤：
S1、前处理：将原料使用纯化水浸泡，清洗去除杂质，清洗；然后使用过氧化氢溶液浸泡消毒，清洗；采用有机溶剂或盐溶液常温下对原料进行浸泡脱脂和消味处理，清洗备用；
S2、胶原提取
S201、溶解：将处理后的原料加入含有0.01-0.1％胃蛋白酶的醋酸溶液的反应釜中，在5-15℃条件下溶解时间20-48小时；
S202、萃取：通过反应釜对溶解液进行搅拌，搅拌速度大于100r/min，搅拌时间大于8h，降解组织纤维间的共价键，并进行离心分离；
S203、过滤：将离心分离得到的溶液通过不锈钢过滤器过滤得到胶原溶液；
S204、配制：取过滤后胶原检测固含量，根据检测数值配制目标浓度，搅拌均匀后待用；
S3、人工皮制备：将配置后的胶原制备形成薄膜状生物膜人工皮或海绵状生物膜人工皮，并分切、包装即可。
优选的一种实施案例，步骤S1中，所述原料为哺乳动物的皮质或肌腱，去除筋膜，切成-2cm长的小段，所述过氧化氢溶液的浓度为5-10％，浸泡时间6-24小时；所述有机溶剂为异丙醇、无水乙醇和正丁醇中的一种，且质量浓度为5-10％，浸泡时间为6-24小时；所述盐溶液为氯化钠溶液或碳酸钠溶液中的一种，质量浓度为5-10％，浸泡时间为6-24小时。
优选的一种实施案例，步骤S1中，所述原料与过氧化氢溶液、有机溶剂或盐溶液的质量质量体积比为1:20-50，单位为g：ml。
优选的一种实施案例，步骤S201中，将经预处理的原料放入组织捣碎机中充分捣碎处理，捣碎后原料长度小于3mm，经捣碎的牛跟腱放入反应釜中，加入4℃、pH＝2的醋酸溶液，再添加胃蛋白酶，胃蛋白酶的添加量为按重量计醋酸溶液的3％-10％，反应20-48h，所述醋酸浓度为0.1-1mol/L，所述胃蛋白酶的醋酸溶液与原料的体积质量比为10000mL/(500-1000g)。
优选的一种实施案例，步骤S203中，所述不锈钢过滤器的过滤网目数大于40目，过滤前将胶原溶液稀释至料液比1:150，过滤收集滤液，将不滤物按步骤S201和S202进行2次提取，滤液混合后加入过氧化氢溶液灭酶，将经过灭酶处理的胶原溶液经4000r/min离心，取上清液的胶原溶液；步骤S204中，配制胶原浓度的方法为：采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的pH值在5.5-6.5，配制固含量0.5-1.5％。
优选的一种实施案例，步骤S3中，将配置后的胶原制备形成薄膜状生物膜人工皮的方法包括如下步骤：
S31、干燥：取步骤S204配制后的固含量0.5-1.5％的胶原溶液，搅拌均匀，胶原量500-2000g离心后倒入不锈容器，振荡平整，采用真空冷冻干燥技术干燥形成海绵块状制品；
S32、压实：从冷冻干燥机取出海绵状制品，采用四柱压力机反复2-4次压制，压力在10-50T，压制5-12小时；
S33、中和交联：将压实后的制品放入水浴锅内，加入交联剂溶液进行交联反应，再加入3-10％丙酮萃取，浸泡2-12小时，经过高速离心处理，过滤清洗至中性；
S34、成型：将清洗后的制品采用真空冷冻干燥技术干燥，分切包装得到薄膜状生物膜人工皮。
优选的一种实施案例，步骤S31中，所述不锈容器为长30-40cm、宽30-40cm、高2-5cm的四方体结构；步骤S33中，选取压实后的制品质量的0.01-2％的交联剂混合蒸馏水至与压实后的制品重量相等形成交联剂溶液，然后将压实后的制品加入交联剂溶液内，搅拌均匀，水浴加热35-60℃开始交联反应，反应2-10小时，再加入5-20％的氨水反应1-2小时，然后将反应液中加入3-10％丙酮萃取，所述交联剂为酯类、醛类、多糖类和胺类中的一种。
优选的一种实施案例，步骤S3中，将配置后的胶原制备形成海绵状生物膜人工皮的方法，包括如下步骤：
S301、取步骤S204配制后的固含量0.5-1.5％的胶原溶液，搅拌均匀；
S302、生物交联：将胶原溶液放入水浴锅内，加入交联剂进行交联反应，进行搅拌均匀；
S303、干燥：交联反应后使得胶原量为300-1000g离心后倒入不锈容器(容器为四方体长30-50cm、宽30-50cm、高2-5cm)，振荡平整，采用真空冷冻干燥技术干燥形成海绵块状制品；
S304、根据酸碱度，吹风滤除生物膜中多余挥发性酸，控制酸碱度pH5-7；
S305、定型冻干成为0.1-10mm生物膜，分切包装得到海绵状生物膜人工皮。
优选的一种实施案例，步骤S302中，所述交联剂在胶原总量计算浓度为0.01-2％，将交联剂加入胶原溶液中，搅拌均匀，水浴加热25-50℃开始交联反应，反应2-10小时，所述交联剂为酯类、醛类、多糖类和胺类中的一种。
本发明的有益效果在于：通过选取哺乳动物的皮质或肌腱作为原料，其结构成分与人体皮肤成分类似，通过清洗、消毒、脱脂等前处理后，通过含有胃蛋白酶的醋酸溶液对原料进行溶解，并通过离心分离配制得到胶原溶液，通过交联反应、冷冻干燥的技术，使得胶原形成薄膜状生物膜人工皮或海绵状生物膜人工皮，与人体皮肤具有良好的相容性，具有良好的弹性、韧性和强度，适用于人体皮肤修复，工艺简便，具有推广价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种生物仿生人工皮的制备方法的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：如图1，本发明提供了一种生物仿生人工皮的制备方法，包括如下步骤：
S1、前处理：将原料使用纯化水浸泡，清洗去除杂质，清洗；然后使用过氧化氢溶液浸泡消毒，清洗；采用有机溶剂或盐溶液常温下对原料进行浸泡脱脂和消味处理，清洗备用；
S2、胶原提取
S201、溶解：将处理后的原料加入含有0.01-0.1％胃蛋白酶的醋酸溶液的反应釜中，在5-15℃条件下溶解时间20-48小时；
S202、萃取：通过反应釜对溶解液进行搅拌，搅拌速度大于100r/min，搅拌时间大于8h，降解组织纤维间的共价键，并进行离心分离；
S203、过滤：将离心分离得到的溶液通过不锈钢过滤器过滤得到胶原溶液；
S204、配制：取过滤后胶原检测固含量，根据检测数值配制目标浓度，搅拌均匀后待用；
S3、人工皮制备：将配置后的胶原制备形成薄膜状生物膜人工皮，包括如下步骤：
S31、干燥：取步骤S204配制后的固含量0.5-1.5％的胶原溶液，搅拌均匀，胶原量500-2000g离心后倒入不锈容器，振荡平整，采用真空冷冻干燥技术干燥形成海绵块状制品；
S32、压实：从冷冻干燥机取出海绵状制品，采用四柱压力机反复2-4次压制，压力在10-50T，压制5-12小时；
S33、中和交联：将压实后的制品放入水浴锅内，加入交联剂溶液进行交联反应，再加入3-10％丙酮萃取，浸泡2-12小时，经过高速离心处理，过滤清洗至中性；
S34、成型：将清洗后的制品采用真空冷冻干燥技术干燥，分切包装得到薄膜状生物膜人工皮。
进一步的，步骤S1中，原料为哺乳动物的皮质或肌腱，去除筋膜，切成-2cm长的小段，过氧化氢溶液的浓度为5-10％，浸泡时间6-24小时；有机溶剂为异丙醇，且质量浓度为5-10％，浸泡时间为6-24小时；盐溶液为氯化钠溶液，质量浓度为5-10％，浸泡时间为6-24小时。
进一步的，步骤S1中，原料与过氧化氢溶液、有机溶剂或盐溶液的质量质量体积比为1:20-50，单位为g：ml。
进一步的，步骤S201中，将经预处理的原料放入组织捣碎机中充分捣碎处理，捣碎后原料长度小于3mm，经捣碎的牛跟腱放入反应釜中，加入4℃、pH＝2的醋酸溶液，再添加胃蛋白酶，胃蛋白酶的添加量为按重量计醋酸溶液的3％-10％，反应20-48h，所述醋酸浓度为0.1-1mol/L，所述胃蛋白酶的醋酸溶液与原料的体积质量比为10000mL/(500-1000g)。
进一步的，步骤S203中，不锈钢过滤器的过滤网目数大于40目，过滤前将胶原溶液稀释至料液比1:150，过滤收集滤液，将不滤物按步骤S201和S202进行2次提取，滤液混合后加入过氧化氢溶液灭酶，将经过灭酶处理的胶原溶液经4000r/min离心，取上清液的胶原溶液；步骤S204中，配制胶原浓度的方法为：采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的pH值在5.5-6.5，配制固含量0.5-1.5％。
进一步的，步骤S3中，将配置后的胶原制备形成薄膜状生物膜人工皮的方法包括如下步骤：
进一步的，步骤S31中，不锈容器为长30-40cm、宽30-40cm、高2-5cm的四方体结构；步骤S33中，水浴锅的水浴温度为20-25℃，交联剂溶液中按质量分数包括0.01-2％的交联剂、5-20％的氨水，其余为水选取压实后的制品质量的0.01-2％的交联剂混合蒸馏水至与压实后的制品重量相等形成交联剂溶液，然后将压实后的制品加入交联剂溶液内，搅拌均匀，水浴加热35-60℃开始交联反应，反应2-10小时，再加入5-20％的氨水反应1-2小时，然后将反应液中加入3-10％丙酮萃取，交联剂为酯类。
实施例2：如图1，本发明提供了一种生物仿生人工皮的制备方法，包括如下步骤：
S1、前处理：将原料使用纯化水浸泡，清洗去除杂质，清洗；然后使用过氧化氢溶液浸泡消毒，清洗；采用有机溶剂或盐溶液常温下对原料进行浸泡脱脂和消味处理，清洗备用；
S2、胶原提取
S201、溶解：将处理后的原料加入含有0.01-0.1％胃蛋白酶的醋酸溶液的反应釜中，在5-15℃条件下溶解时间20-48小时；
S202、萃取：通过反应釜对溶解液进行搅拌，搅拌速度大于100r/min，搅拌时间大于8h，降解组织纤维间的共价键，并进行离心分离；
S203、过滤：将离心分离得到的沉淀通过不锈钢过滤器过滤得到胶原；
S204、配制：取过滤后胶原检测固含量，根据检测数值配制目标浓度，搅拌均匀后待用；
S3、人工皮制备：将配置后的胶原制备形成海绵状生物膜人工皮，包括如下步骤：
S301、取步骤S204配制后的固含量0.5-1.5％的胶原溶液，搅拌均匀；
S302、生物交联：将胶原溶液放入水浴锅内，加入交联剂进行交联反应，进行搅拌均匀；
S303、干燥：交联反应后使得胶原量为300-1000g离心后倒入不锈容器(容器为四方体长30-50cm、宽30-50cm、高2-5cm)，振荡平整，采用真空冷冻干燥技术干燥形成海绵块状制品；
S304、根据酸碱度，吹风滤除生物膜中多余挥发性酸，控制酸碱度pH5-7；
S305、定型冻干成为0.1-10mm生物膜，分切包装得到海绵状生物膜人工皮。
进一步的，步骤S1中，原料为哺乳动物的皮质或肌腱，去除筋膜，切成-2cm长的小段，过氧化氢溶液的浓度为5-10％，浸泡时间6-24小时；有机溶剂为正丁醇，且质量浓度为5-10％，浸泡时间为6-24小时；盐溶液为碳酸钠溶液，质量浓度为5-10％，浸泡时间为6-24小时。
进一步的，步骤S1中，原料与过氧化氢溶液、有机溶剂或盐溶液的质量质量体积比为1:20-50，单位为g：ml。
进一步的，步骤S201中，将经预处理的原料放入组织捣碎机中充分捣碎处理，捣碎后原料长度小于3mm，经捣碎的牛跟腱放入反应釜中，加入4℃、pH＝2的醋酸溶液，再添加胃蛋白酶，胃蛋白酶的添加量为按重量计醋酸溶液的3％-10％，反应20-48h，所述醋酸浓度为0.1-1mol/L，所述胃蛋白酶的醋酸溶液与原料的体积质量比为10000mL/(500-1000g)。
进一步的，步骤S203中，不锈钢过滤器的过滤网目数大于40目，过滤前将胶原溶液稀释至料液比1:150，过滤收集滤液，将不滤物按步骤S201和S202进行2次提取，滤液混合后加入过氧化氢溶液灭酶，将经过灭酶处理的胶原溶液经4000r/min离心，取上清液的胶原溶液；步骤S204中，配制胶原浓度的方法为：采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的pH值在5.5-6.5，配制固含量0.5-1.5％。
进一步的，步骤S302中，交联剂在胶原总量计算浓度为0.01-2％，将交联剂加入胶原溶液中，搅拌均匀，水浴加热25-50℃开始交联反应，反应2-10小时，交联剂为多糖类。
综上所述，通过选取哺乳动物的皮质或肌腱作为原料，其结构成分与人体皮肤成分类似，通过清洗、消毒、脱脂等前处理后，通过含有胃蛋白酶的醋酸溶液对原料进行溶解，并通过离心分离配制得到胶原溶液，通过交联反应、冷冻干燥的技术，使得胶原形成薄膜状生物膜人工皮或海绵状生物膜人工皮，与人体皮肤具有良好的相容性，具有良好的弹性、韧性和强度，适用于人体皮肤修复，工艺简便，具有推广价值。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种生物仿生人工皮的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将原料使用纯化水浸泡，清洗去除杂质，清洗；然后使用过氧化氢溶液浸泡消毒，清洗；采用有机溶剂或盐溶液常温下对原料进行浸泡脱脂和消味处理，清洗备用；S2、胶原提取；S3、将配置后的胶原制备形成薄膜状生物膜人工皮或海绵状生物膜人工皮，并分切、包装即可。
所述S2包括：
S201、将处理后的原料加入含有0.01-0.1％胃蛋白酶的醋酸溶液的反应釜中，在5-15℃条件下溶解时间20-48小时；
S202、通过反应釜对溶解液进行搅拌，搅拌速度大于100r/min，搅拌时间大于8h，降解组织纤维间的共价键，并进行离心分离；
S203、将离心分离得到的溶液通过不锈钢过滤器过滤得到胶原溶液；
S204、取过滤后胶原检测固含量，根据检测数值配制目标浓度，搅拌均匀后待用。
2.如权利要求1所述的一种生物仿生人工皮的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述原料为哺乳动物的皮质或肌腱，去除筋膜，切成-2cm长的小段，所述过氧化氢溶液的浓度为5-10％，浸泡时间6-24小时；所述有机溶剂为异丙醇、无水乙醇和正丁醇中的一种，且质量浓度为5-10％，浸泡时间为6-24小时；所述盐溶液为氯化钠溶液或碳酸钠溶液中的一种，质量浓度为5-10％，浸泡时间为6-24小时。
3.如权利要求1所述的一种生物仿生人工皮的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述原料与过氧化氢溶液、有机溶剂或盐溶液的质量质量体积比为1:20-50，单位为g：ml。
4.如权利要求1所述的一种生物仿生人工皮的制备方法，其特征在于：步骤S201中，将经预处理的原料放入组织捣碎机中充分捣碎处理，捣碎后原料长度小于3mm，经捣碎的牛跟腱放入反应釜中，加入4℃、pH＝2的醋酸溶液，再添加胃蛋白酶，胃蛋白酶的添加量为按重量计醋酸溶液的3％-10％，反应20-48h，所述醋酸浓度为0.1-1mol/L，所述胃蛋白酶的醋酸溶液与原料的体积质量比为10000mL/(500-1000g)。
5.如权利要求1所述的一种生物仿生人工皮的制备方法，其特征在于：步骤S203中，所述不锈钢过滤器的过滤网目数大于40目，过滤前将胶原溶液稀释至料液比1:150，过滤收集滤液，将不滤物按步骤S201和S202进行2次提取，滤液混合后加入过氧化氢溶液灭酶，将经过灭酶处理的胶原溶液经4000r/min离心，取上清液的胶原溶液；步骤S204中，配制胶原浓度的方法为：采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的pH值在5.5-6.5，配制固含量0.5-1.5％。
6.如权利要求1所述的一种生物仿生人工皮的制备方法，其特征在于，步骤S3中，将配置后的胶原制备形成薄膜状生物膜人工皮的方法包括如下步骤：
S31、干燥：取步骤S204配制后的固含量0.5-1.5％的胶原溶液，搅拌均匀，胶原量500-2000g离心后倒入不锈容器，振荡平整，采用真空冷冻干燥技术干燥形成海绵块状制品；
S32、压实：从冷冻干燥机取出海绵状制品，采用四柱压力机反复2-4次压制，压力在10-50T，压制5-12小时；
S33、中和交联：将压实后的制品放入水浴锅内，加入交联剂溶液进行交联反应，再加入3-10％丙酮萃取，浸泡2-12小时，经过高速离心处理后过滤，清洗至中性；
S34、成型：将清洗后的制品采用真空冷冻干燥技术干燥，分切包装得到薄膜状生物膜人工皮。
7.如权利要求6所述的一种生物仿生人工皮的制备方法，其特征在于：步骤S31中，所述不锈容器为长30-40cm、宽30-40cm、高2-5cm的四方体结构；步骤S33中，选取压实后的制品质量的0.01-2％的交联剂混合蒸馏水至与压实后的制品重量相等形成交联剂溶液，然后将压实后的制品加入交联剂溶液内，搅拌均匀，水浴加热35-60℃开始交联反应，反应2-10小时，再加入5-20％的氨水反应1-2小时，然后将反应液中加入3-10％丙酮萃取，所述交联剂为酯类、醛类、多糖类和胺类中的一种。
8.如权利要求1所述的一种生物仿生人工皮的制备方法，其特征在于，步骤S3中，将配置后的胶原制备形成海绵状生物膜人工皮的方法，包括如下步骤：
S301、取步骤S204配制后的固含量0.5-1.5％的胶原溶液，搅拌均匀；
S302、生物交联：将胶原溶液放入水浴锅内，加入交联剂进行交联反应，进行搅拌均匀；
S303、干燥：交联反应后使得胶原量为300-1000g离心后倒入不锈容器(容器为四方体长30-50cm、宽30-50cm、高2-5cm)，振荡平整，采用真空冷冻干燥技术干燥形成海绵块状制品；
S304、根据酸碱度，吹风滤除生物膜中多余挥发性酸，控制酸碱度pH5-7；
S305、定型冻干成为0.1-10mm生物膜，分切包装得到海绵状生物膜人工皮。
9.如权利要求8所述的一种生物仿生人工皮的制备方法，其特征在于：步骤S302中，所述交联剂在胶原总量计算浓度为0.01-2％，将交联剂加入胶原溶液中，搅拌均匀，水浴加热25-50℃开始交联反应，反应2-10小时，所述交联剂为酯类、醛类、多糖类和胺类中的一种。
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